CN110296982B - 基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物检测传感器技术领域,公开了一种基于G4‑Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器。在吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中,单独的Cu2+对H2O2氧化TMB并无明显的催化作用,当加入人端粒DNA后,人端粒可以形成G‑四链体,同时与Cu2+结合,形成G4‑Cu2+仿酶复合物,大大提高了催化能力,当遇到H2S之后,Cu2+与H2S具有好的特异性,生成CuS沉淀进而降低了G4‑Cu2+的酶催化能力,随着H2S浓度的增大,TMB显色逐渐由蓝色变为无色。本发明利用其体系颜色的变化定性定量检测H2S。由于G‑四链体的加入,提高了该传感体系对H2S检测的灵敏度,实现了7.5nM的检测限,该传感体系对H2S具有好的选择性。
Description
技术领域
本发明属生物检测传感器技术领域,涉及一种基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器。
背景技术
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)被发现后的第三种气体信号分子,是一种无色、有毒、有臭鸡蛋味的气体,H2S在人体内通过酶促和非酶促过程生成,可以作为许多组织的细胞保护物质和气体递质,可以调节血管张力以及脑神经。许多研究已经发现H2S的异常水平可能会引起一些疾病的发生,例如:缺血性中风,老年痴呆症,帕金森病,唐氏综合症,创伤性脑损伤等等。因此,实时监测生物体内H2S的含量变化有利于相关疾病的早期诊断及治疗。目前已经构建的检测H2S的方法有很多,例如:气相色谱法,液相色谱法,电化学方法,荧光法,表面增强拉曼扫描法以及比色法等。荧光法中荧光探针的合成较复杂;其他几种方法需要复杂的仪器以及样品制备过程,与这些检测方法相比,比色法简单方便,易于操作,不需要繁琐的过程,且近年来向试纸检测方面发展,受到了广泛的关注。Il-Doo Kim课题组构建了一种基于Pb(Ac)2纳米纤维传感器用于H2S的比色检测方法,但Pb(Ac)2纳米纤维合成过程复杂,需要大量的表征;D.Amilan Jose课题组基于指示剂取代反应通过Ves-1.Cu实现了H2S的比色检测,但该方法灵敏度不高,因此,构建一种高灵敏度、高选择性的H2S比色传感器目前仍是一个很大的挑战。
近年来,DNA被设计成各种各样的人造金属酶用于一系列基于DNA催化的化学反应,其中富G序列因其可与配体选择性地结合而备受关注,富G序列易形成 G四链体,G四链体可以被用作结构骨架用于提高催化能力。另外,Cu2+可以通过 Fenton反应产生高活性的羟基自由基,因此具有仿辣根过氧化酶的特性。G4-Cu2+仿酶复合物在化学,生物,纳米技术方面受到了青睐。李灿课题组通过将G四链体与Cu2+结合,生成G4-Cu2+复合物,将其用于催化F-C反应,进而证明了G4-Cu2+复合物具有仿辣根过氧化酶活性。付雁课题组基于G4-Cu2+的酶催化作用,设计了一种通过酶催化H2O2氧化TMB实现ALP检测的传感器,结果令人满意。由于 Cu2+与S2-之间具有大的结合常数,通过金属离子取代法(MDA)实现对H2S检测的传感器近年来出现了很多,但是基于G4-Cu2+仿酶复合物用于H2S检测的比色传感器目前未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种基于G4-Cu2+仿酶复合物用于H2S检测的比色传感器,实现高灵敏度、高选择性H2S的检测。
为实现本发明目的,技术方案如下:
在吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液中,单独的Cu2+对H2O2氧化TMB并无明显的催化作用,当加入人端粒DNA后,人端粒可以形成G-四链体,同时与Cu2+结合,形成G4-Cu2+仿酶复合物,大大提高了催化能力,当遇到H2S之后,Cu2+与H2S具有好的特异性,生成CuS沉淀进而降低了G4-Cu2+的酶催化能力,随着H2S浓度的增大,3,3,5,5-四甲基连苯胺(TMB)显色逐渐由蓝色变为无色。本发明利用此原理进行H2S检测比色传感器的设计。利用其体系颜色的变化定性定量检测H2S。
由于DNA-Cu2+模拟酶的活性与DNA模板的序列组成有很大的关系,且按以下顺序逐渐降低:G20>C20>A20>T20。由于G20价格昂贵,不易合成,且合成后不能保证其纯度,因此,本发明选择其他几条非常经典的富G-DNA链进行研究,分别是人端粒DNA,AGRO100,TBA15,T30695,PS2.M,T20(其DNA见序列表)。首先研究了单独的不同类型DNA催化H2O2氧化TMB的能力,如图2a所示,结果表明:DNA对H2O2氧化TMB的反应具有结构选择性,单链基本没有催化能力,G4 有较强催化能力,另不同G-rich的序列均有催化,催化能力差别不显著。又研究了不同类型DNA-Cu2+仿酶复合物对H2O2氧化TMB的催化能力,如图2b所示,可以看出不同类型G-rich的DNA-Cu2+仿酶复合物具有不同的催化能力,如图2c,通过计算ADNA-Cu2+/(ADNA+ACu2+),得出22AG的信背比好,TBA15和PS2.M信背比以及催化能力也较好,但由于22AG是人端粒DNA,价格低廉,容易合成,且对体内的端粒酶有影响,可以达到抑制癌症的效果,因此选择22AG用于后续的检测。
圆二光谱是用来表征DNA二级结构强有力的工具之一,通过圆二色谱可以定性DNAG-四链体的形成和转换。如图4所示,在295nm有一个正峰,260nm有一负峰,此为反平行G四链体的特征峰,表明单独的吗啉乙磺酸(MES)自身可以诱导22AG ssDNA形成反平行G四链体;随着Cu2+的加入,反平行G四链体的特征峰逐渐减弱,当Cu2+浓度为8.8uM时,反平行G四链体的特征峰消失,然而在 260nm又出现一个正峰,240nm一个负峰,此为平行G四链体的特征峰,表明此时反平行G四链体逐渐转变为了平行G四链体。
本发明基于信号放大作用的铜离子取代法用于检测H2S的原理:图1展示了 H2S检测的传感策略。提出的基于铜离子取代法检测H2S的关键是Cu2+与S2-具有非常好的结合常数,强的结合力可以使得S2-快速取代DNA-Cu2+仿酶复合物中的 Cu2+生成CuS沉淀,以达到灵敏检测H2S的目的。如图1所示,22AG单链DNA在 MES缓冲中可以形成G-四链体,加入Cu2+后,Cu2+可以与G碱基结合,起到稳定 G-四链体的作用,并且此时形成的DNA-Cu2+具有仿酶活性,其催化能力大大增强,可以有效催化H2O2氧化3,3,5,5-四甲基连苯胺(TMB),使TMB从无色变为蓝色;若在显色之前加入H2S,在酸性条件下H2S会与Cu2+结合生成CuS沉淀,从而抑制了DNA-Cu2+模拟酶的催化活性,使得H2O2氧化TMB的能力减弱,随着H2S浓度的增加,DNA-Cu2+模拟酶的催化活性逐渐降低,颜色逐渐变浅直至无色。该传感体系具有好的灵敏度,这归功于DNA-Cu2+模拟酶的信号放大作用。
Cu2+与G-rich DNA可以结合形成DNA-Cu2+仿酶复合物,为了排除其他离子的干扰,研究了不同的金属离子,如图3a,单独的2uM Cu2+、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、 Ni2+、Co3+、Co2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Cd2+、Hg2+、Pd2+对H2O2氧化TMB均无催化能力。向以上离子中分别加入相同浓度的DNA后,如图3b所示,只有Cu2++DNA复合物具有最好的催化作用,Fe3++DNA复合物催化作用次之。可通过加入掩蔽剂SHPP 除掉Fe3+的干扰,其他金属离子并无明显的催化作用。
为提高传感性能,优化了传感条件,包括钠钾离子浓度,Cu2+浓度,[Cu2+]:[base],TMB和H2O2浓度以及pH。如图5a,分别是含有不同钠钾离子浓度的缓冲体系,其中DNA-Cu2+仿酶复合物催化H2O2氧化TMB的吸光度,结果表明有钠钾离子时其催化能力进一步提高,但效果不明显,其催化能力与所试离子种类无关。如图5b所示为单独Cu2+,单独DNA,以及DNA-Cu2+复合物分别在MES缓冲和 MES+NaCl缓冲中的催化能力,结果表明在MES缓冲溶液中(无钠钾离子),单独 Cu2+催化作用很弱,加入DNA后,形成的DNA-Cu2+复合物明显增强了其对TMB/H2O2的催化能力,使得信背比较高,而在含有Nacl的MES中,单独的Cu2+其自身有很强的催化能力,可能离子的共存影响了其催化能力,加入DNA后仅稍微增强,造成信背比很低,影响灵敏度,因此选择不含钠钾离子的MES缓冲溶液;Cu2+的浓度对该传感体系的灵敏度和线性范围有较大的影响,Cu2+浓度的优化如图5c, 2uM Cu2+对H2O2氧化TMB几乎没有催化能力,随着Cu2+浓度的增加,催化能力逐渐增强,当Cu2+浓度大于100uM时,其催化能力不再明显增加;又优化了[Cu2+]: [base],如图5d,当[Cu2+]:[base]=0.05时,在20min达到平台,继续降低比例,催化能力没有明显增加,此时其催化能力相当于100uM单独Cu2+的催化能力, Cu2+用量可以降低50倍,减小环境污染。TMB和H2O2的浓度也被优化了,如图5e 和5f表明,TMB和H2O2的最佳浓度分别为0.25mM和125mM,其中A0表示未加 Na2S之前的吸光度,A表示加100uM Na2S之后的吸光度;pH对TMB的显色有很大的影响,为了研究其实际应用,pH对该传感体系检测H2S的影响如图5g,结果表明该传感体系的最佳pH为4.0。
对所提出的DNA-Cu2+(2uM)/H2O2/TMB传感体系检测H2S的能力。图6a表明了随着H2S浓度的增加,DNA-Cu2+仿酶复合物催化H2O2氧化TMB的吸收光谱。如预测的一样,随着H2S浓度从0.1uM增加到200uM,吸光度A有一个明显的降低,这主要是由于S2-与Cu2+结合生成CuS沉淀,降低了DNA-Cu2+的仿酶催化作用。当 H2S浓度继续增加大于200uM时,没有明显的吸光度的降低,且会达到一个平台 (图6a内插图)。在最佳实验条件下,吸光度A与[Na2S]在0.1uM~150uM范围内表现出了良好的线性关系,回归方程为y=-0.005c+0.8,相关系数R=-0.993,如图6b。检出限(LOD)基于3σ/k规则(σ是空白溶液的标准偏差,n=11,k是线性方程的斜率)被测定为7.5nM。如此低的LOD和3个数量级宽的动态范围比现有的基于酶催化比色检测H2S的方法要好得多。另外,可以通过调节Cu2+的浓度来调控体系的灵敏度,1uM Cu2+所制备的传感体系的灵敏度确实如预测的一样有所提高,此为该传感体系的优点之一。吸收光谱的变化也可以通过可见光肉眼看到。如图6c,随着H2S浓度从0uM到200uM,体系的颜色从蓝色逐渐变为了无色。为了更加简单方便,我们将该传感体系应用到了试纸检测,如图6d,随着H2S浓度的增加,试纸颜色也是逐渐由蓝色变为了无色。
由于生物样品的复杂性,所设计的传感体系对目标物的选择性识别非常关键,因此,对所提出的比色传感器的选择性进行了研究。研究了一些能够和Cu2+发生类似反应的生物分子和阴离子,包括L-cys, S2O3 2-,SO4 2-,SCN-,HCO3 -,ClO3 -,NO3 -,NO2 -,CO3 2-,H2PO4 -,HPO4 2-,Cl-,CH3COO-,如图7a所示,可以看出只有硫化物的加入才能引起吸光信号的明显下降,而其它均不能使吸光信号发生明显的变化。图7b为相应的颜色对照图,这些结果表明该传感器对H2S有很好的选择性。
本发明优点:制备了DNA-Cu2+过氧化物模拟酶,构建了一个比色方法用于检测人血清中的H2S检测体系,DNA-Cu2+仿酶复合物的活性明显高于单独Cu2+的催化能力,通过信号放大从而提高了该传感器的灵敏度,其检测限低至7.5nM。在缓冲以及血清中,该传感器都能高灵敏度、高选择性的对H2S产生响应。实现高效灵敏地检测目标物,为研发和设计新的分子或者离子传感器打下良好的基础。
本发明涉及的DNA序列见序列表。
附图说明
图1为本发明原理图;
图2为TMB的催化对照图;a不同类型的G-rich在H202存在下对TMB的催化,b 不同类型的DNA-Cu2+仿酶复合物在H2O2存在下对TMB的催化;c对照柱状图;
图3为催化能力对比图;a不同类型的单独金属离子的催化能力,1为Cu2+;b 不同类型的DNA-金属离子复合物的催化能力,1为Cu2+,2为Fe3+,3为其他金属离子;其他所述金属为:
Na+ K+ Ca2+ Zn2+ Ni2+ Co2+ Mn2+ Ag2+ Fe2+ Cd2+ Hg2+ Pd2+;
图4为不同感应体系的圆二色谱图;
图5为条件优化图,a不同浓度的Cu2+在H2O2存在下对TMB的催化;b不同比例的[Cu2 +]:[base]在H2O2存在下对TMB的催化;c不同浓度NaCl、KCl的MES缓冲溶液对DNA-Cu2+/TMB/H2O2的催化能力;d Cu2+、base、Cu2++base分别在MES 和MES+NaCl缓冲中的催化能力;e[Cu2 +]:[base]=0.05,[H2O2]=125mM时,不同浓度的TMB对Na2S的紫外响应;f[Cu2+]:[base]=0.05,[TMB]=0.25mM时,不同浓度的H2O2对Na2S的紫外响应;g[Cu2+]:[base]=0.05,[H2O2]=125mM, [TMB]=0.25mM时,不同的pH对Na2S的紫外响应。
图6为本发明检测结果图;a DNA-Cu2+/TMB/H2O2传感体系对不同浓度Na2S的紫外响应;b线性关系图;c可见光下颜色对比结果(Na2S浓度依次为0、10、50、 100、150、200uM);d试纸检测图(Na2S浓度依次为0、10、50、100、150、 200uM);
图7为DNA-Cu2+/TMB/H2O2传感体系对不同类型阴离子的紫外响应(a)及可见光颜色对照图(b)。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明,举实施例如下:
本实验中用到的DNA序列
实施例1
(1)溶液的配制
称取吗啉乙磺酸(MES)溶于水中,配制成10mM 3,3,5,5-四甲基连苯胺(TMB) 缓冲溶液,通过pH计来调节所需要的pH;DNA(序列1)样品在10mM MES缓冲中(pH7.0)95℃下退火5min,然后缓慢冷却到室温,冷冻待用。
(2)圆二色谱测定
含有不同物质的五种10mM MES缓冲混合液(pH4.0):(1)Blank;(2)单独 DNA即0uMCu2+;(3)2.2uM Cu2+;(4)4.4uM Cu2+;(5)8.8uM Cu2+,在220nm~320nm 范围内测定圆二色谱,光谱扫描速度为100nm/min,响应时间为0.5s,扫描所得光谱为三次扫描的平均值。缓冲溶液背景已从CD数据中扣除。
(3)比色检测
在上述缓冲溶液中加入CuCl2和DNA(序列1),使得[Cu2+]:[base]=0.05,搅拌制备DNA-Cu2+仿酶复合物,然后分别加入不同浓度的Na2S孵育几分钟后,分别加入TMB和H2O2,反应30min后,进行紫外扫描并对其进行拍照保存用于可视检测。扫描速度为,体系的吸收范围为525nm~775nm。
(4)试纸条检测
制备好G4-Cu2+/Na2S体系后,加入TMB和H2O2,同时将定量试纸放入传感体系中孵育30min,之后取出自然晾干,然后拍照进行保存。
应用例1实际样品应用
对人血清进行处理,把人血清与乙醇以1:1的比例混合震荡,放于冰箱冷藏 (0-4℃)过夜,第二天取出,15,000r/min离心10min,取上清液于超滤离心管,分子截留量(Amicon Ultra-0.5mL,Millipore)3kDa,13,000r /min 4℃冷冻离心20min后取过滤液,并冷冻于冰箱中待用。取1%人血清于10mM MES缓冲溶液中,加入CuCl2和DNA(序列1),不断搅拌制得G4-Cu2+仿酶复合物,然后分别加入不同浓度的Na2S,使其最终浓度为10,50,100uM,孵育几分钟后,向其中分别加入TMB和H2O2,反应30min后,用紫外分光光度计进行扫描测定。
如图6a,随着H2S浓度的增加,吸光度表现出逐渐降低的趋势,与在缓冲溶液中的响应一致,且吸光度与H2S浓度在0.1uM~120uM表现出良好的线性关系,相关系数r=-0.993,见图6b。然后分别添加三个已知浓度的Na2S(10uM,50 uM,100uM)到1%的人血清中进行加标回收实验,回收率在96%~105%之间,如表 1,表示该传感体系在人血清中检测H2S是可应用的。这些结果有力地证明了基于信号放大作用的铜离子取代法的检测方法用于实际复杂生物样品中H2S的检测是非常可靠的。
表1:人血清中H2S的加标回收
序 列 表
< 110> 商丘师范学院
<120>基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器
<160> 6
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>人端粒
<400> 1
agggttaggg ttagggttag gg 22
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> AGRO100
<400>2
ggtggtggtg gttgtggtgg tggtgg 26
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> TBA15
<400>3
ggttggtgtg gttgg 15
<210>4
<211>16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> T30695
<400>4
gggtgggtgg gtgggt 16
<210>5
<211> 18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221> PS2.M
<400>5
gtgggtaggg cgggttgg 18
<210>6
<211>13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> T20
<400>6
tttttttttt tttttttttt 20
Claims (1)
1.基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器,其特征在于,通过如下方法构建成检测体系:
在吗啉乙磺酸MES缓冲溶液中,加入人端粒DNA和Cu2+,形成G4-Cu2+仿酶复合物,再加入双氧水和3,3,5,5-四甲基连苯胺TMB,形成G4-Cu2+/H2O2/TMB传感体系;
所述的人端粒DNA序列见序列表中序列1;
吗啉乙磺酸MES缓冲溶液pH为4;TMB和H2O2在溶液中的浓度分别为0.25 mM和125 mM;Cu2+与人端粒DNA碱基浓度比=0.05:1。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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