CN114807146B - 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用 - Google Patents

一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114807146B
CN114807146B CN202210738626.7A CN202210738626A CN114807146B CN 114807146 B CN114807146 B CN 114807146B CN 202210738626 A CN202210738626 A CN 202210738626A CN 114807146 B CN114807146 B CN 114807146B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
nanoenzyme
sequence
double
stranded nucleic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210738626.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114807146A (zh
Inventor
许文涛
杜再慧
王鹏飞
朱龙佼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202210738626.7A priority Critical patent/CN114807146B/zh
Publication of CN114807146A publication Critical patent/CN114807146A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114807146B publication Critical patent/CN114807146B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用。本研究通过高温一步自组装的方法合成了两种核酸纳米酶，分别是单链核酸纳米酶和双链核酸纳米酶。单链核酸纳米酶是通过核酸序列为模板，加入金属盐溶液，在高温条件下孵育几分钟获得；双链双链核酸纳米酶是在单链核酸纳米酶的基础上增加一条杂交互补核酸序列，通过高温退火获得。该核酸纳米酶不仅具有类过氧化物酶活性，同时具有酶活可调控性，即通过对核酸序列、反应浓度、银铂比、孵育温度和孵育时间等反应条件优化，实现核酸纳米酶的酶活调控；还将双链核酸纳米酶利用到重金属离子的特异性传感检测中。

Description

一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用
技术领域
本发明属于材料合成领域，具体涉及一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用。
背景技术
天然酶因其高效、专一的催化特性被广泛应用在化学和生化反应，但天然酶制备、纯化过程复杂，酶活性受环境影响，进而限制了其在更多领域中应用。纳米酶是一类具有类酶活性的纳米材料，它们表现出类似天然酶的酶促反应动力学和催化机理，具有稳定性好、成本低和易于制备等优点，是天然酶的等效替代品。自2007年阎锡蕴院士首次发现Fe3O4纳米颗粒具有类过氧化物酶活性以来，包括贵金属、金属氧化物、金属硫化物、金属有机框架和碳纳米材料等数百种具有类酶催化活性的纳米材料被发现。
发明内容
本发明公开一种单链核酸纳米酶，以核酸序列作为模板，加入金属盐溶液，通过高温一步自组装的方法合成单链核酸纳米酶；
所述单链核酸纳米酶具有类过氧化物酶活性，且酶活可调。
所述核酸序列为特定碱基的寡核苷酸序列；
所述寡核苷酸序列为SEQ ID NO.1，所示序列为：5’-CCCCCTAACTCCCCC-3’；
所述金属盐溶液为银盐和铂盐；
所述高温一步自组装的方法是在高温条件下短时孵育；
所述酶活可调的条件包括：模板核酸序列、缓冲液、银铂比、孵育温度、孵育时间。
本发明公开一种单链核酸纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
1）将10-100 μM的核酸模板、0.5-5 mM K2PtCl4、0.5-5 mM AgNO3加入到柠檬酸钠中混匀；
2）剧烈震荡1-5 min；
3）放入金属浴，70-95 ℃加热，3-20 min。
优选的，将100 μL 20 μM 模板序列、200 μL 1 mM K2PtCl4和100 μL 1 mM AgNO3加入到600 μL的10 mM柠檬酸钠中，剧烈震荡1 min后，放入金属浴95℃加热10 min，得到单链核酸纳米酶。
本发明公开一种双链核酸纳米酶，即在单链核酸纳米酶上增加一条杂交互补核酸序列，通过高温退火形成双链核酸纳米酶；
所述双链核酸纳米酶具有类过氧化物酶活性，且酶活可调。
所述单链核酸纳米酶是以SEQ ID NO.19为模板生成的纳米酶，序列为：5’-CCCCCTTAATCCCCCTATAATAAATTTTAAATATTATTTATTAAT-3’；
所述杂交互补核酸序列是SEQ ID NO.37，序列为：5’-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGGATTAAGGG-3’。
本发明公开一种双链核酸纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
1）将10-100 μM的核酸模板、0.5-5 mM K2PtCl4、0.5-5 mM AgNO3加入到柠檬酸钠中混匀；
2）剧烈震荡1-5 min；
3）放入金属浴，70-95 ℃加热，3-20 min；
4）离心收集上清，加入10-100 μM的杂交互补核酸序列，高温退火。
优选的，将100 μL 20 μM 模板序列、200 μL 1 mM K2PtCl4和100 μL 1 mM AgNO3加入到600 μL的10 mM柠檬酸钠中，剧烈震荡1 min后，放入金属浴95℃加热10 min，得到单链核酸纳米酶；13500 rpm 10 min离心收集900 μL上清液，随后加入100 μL 20 μM 杂交互补核酸序列，95℃ 2 min，缓慢冷却至30℃，制得双链核酸Ag@Pt纳米酶。
本发明公开一种铅离子检测方法，包括以下步骤：
1）利用上述双链核酸纳米酶的制备方法制备具有铅离子特异性的双链核酸纳米酶；
2）上述双链核酸纳米酶与等体积的铅离子待测溶液室温下孵育10-40 min；
3）通过双链核酸纳米酶的类过氧化物酶活性，催化TMB发生颜色变化，并根据标准曲线判断铅离子浓度。
所述的铅离子特异性的双链核酸纳米酶是以SEQ ID NO.19为模板的单链核酸纳米酶，在该单链核酸纳米酶上通过高温退火上杂交上互补核酸序列；
所述互补核酸序列为SEQ ID NO.41，序列为：5’-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGAGGGTGGGTGGGA-3’。
所述铅离子检测方法在食品安全铅离子检测试剂盒中的应用。
如上所述的双链核酸纳米酶在铅离子检测中的应用。
本发明提供一种核酸纳米酶合成方法，在类过氧化物纳米酶合成中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明公开了一种酶活可调的核酸纳米酶的制备方法及应用。本研究通过高温一步自组装的方法合成了两种核酸纳米酶，一种是单链核酸纳米酶，另一种是双链核酸纳米酶。单链核酸纳米酶是通过核酸序列为模板，加入金属盐溶液，在高温条件下孵育几分钟获得；双链双链核酸纳米酶是在单链核酸纳米酶的基础上增加一条杂交互补核酸序列，通过高温退火获得。该核酸纳米酶不仅具有类过氧化物酶活性，同时具有酶活可调控性，即通过对核酸序列、反应条件以及银铂比等反应条件优化实现核酸纳米酶的酶活调控；并将其利用到重金属离子的特异性检测。
1）高温一步自组装的方法简单、快速、高效，仅通过一步混合高温即可生成单链核酸纳米酶，且该纳米酶的活性与模板序列直接相关；
2）通过模板核酸序列、缓冲液、银铂比、孵育温度、孵育时间可以调控单链核酸纳米酶的活性；
3）在单链核酸纳米酶的基础上增加杂交互补核酸序列可以增强类过氧化物酶的活性，形成双链核酸纳米酶，且酶活可以通过序列的碱基组成调控；
4）通过修改双链核酸纳米酶中的杂交互补核酸序列可以实现Pb2+的特异性检测。
附图说明
图1为单链核酸纳米酶的合成与表征。a) 合成过程；b) ssDNA Ag@Pt纳米酶的紫外吸收光谱，对照组无核酸模板；c) ssDNA Ag@Pt纳米酶催化TMB吸光谱。
图2为高温一步自组装合成方法与化学还原法生成的纳米酶酶活测定结果。
图3为不同缓冲液对单链核酸Ag@Pt纳米酶酶活的影响。SSC为柠檬酸盐缓冲液，PBS为磷酸盐缓冲生理盐水，PB磷酸盐缓冲液，MES为2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液，MOPS是丙磺酸缓冲液。
图4为ssDNA-Ag@Pt 纳米酶的合成条件优化。 a) 不同单链核酸生成Ag@Pt纳米酶催化TMB的效果；b) 不同pH SSC对酶活的影响；c) 核酸模板的初始浓度；d) Ag:Pt比例；e)合成温度；f) 合成时间。
图5为dsDNA-Ag@Pt纳米酶的合成与表征。a) dsDNA Ag@Pt纳米酶的紫外吸收光谱，对照组无核酸模板；b) dsDNA Ag@Pt纳米酶催化TMB的吸光谱。
图6为互补碱基加入对ssDNA-Ag@Pt nanozyme的影响。
图7为ssDNA-Ag@Pt nanozyme的合成序列优化。a) dsDNA Ag@Pt nanozyme的合成原理；b) 成核序列优化；c) 激发序列优化；d) NS为增加有AT结合臂的成核序列，AS为加入互补结合臂的激发序列；e) d图OD652nm的差值。
图8为dsDNA-Ag@Pt纳米酶的Pb2+检测原理图。
图9为Pb2+检测条件优化。a)缓冲溶液pH优化；b)缓冲液中盐离子浓度优化；c)TMB浓度优化；d)H2O2浓度优化；e)孵育时间。
图10 a）图是Pb2+检测的灵敏度；b)图是Pb2+检测的特异性验证。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 核酸纳米酶的合成方法
通过高温一步自组装的方法（HTOSA）合成核酸Ag@Pt纳米酶，具体操作如下：将DNA模板序列（20 μM，100 μL）、K2PtCl4（1 mM，200 μL）和AgNO3（1 mM，100 μL）加入到600 μL的10 mM柠檬酸钠中，剧烈震荡1 min后，放入金属浴95℃加热10 min，得到单链核酸Ag@Pt纳米酶（ssDNA-Ag@Pt nanozyme），4℃储存备用。具体的合成过程如图1a所示。
在上述1 mL单链核酸Ag@Pt纳米酶的基础上，13500 rpm 10 min离心收集900 μL上清液，随后加入激发DNA序列（20 μM，100 μL），95℃ 2 min，缓慢冷却至30℃，由此制得1mL双链核酸Ag@Pt纳米酶（dsDNA-Ag@Pt nanozyme，以核酸浓度表示终浓度，终浓度为2 μM），4℃储存备用。具体的合成过程如图7a所示。
此外化学还原方法(CRM)作为检测的对照方法，具体操作如下：称量准确的415.08μg的 K2PtCl4溶于1 mL去离子水中，混合均匀得到1 mM K2PtCl4橘黄色液体，4℃储存备用；将169.87 μg AgNO3溶于1 mL去离子水中，混合均匀得到1 mM AgNO3无色液体，4℃储存备用。随后将DNA模板序列（20 μM，100 μL）、K2PtCl4（1 mM，200 μL）和AgNO3（1 mM，100 μL）加入到600 μL的柠檬酸钠（SSC）缓冲液中，剧烈震荡1 min后，黑暗孵育10 min。随后加入新鲜制得的NaBH4（200 μM，1 mL），剧烈震荡3min，制得还原型Ag@Pt纳米酶，4℃储存备用。
实施例2 核酸纳米酶酶活性质
1. 单链核酸Ag@Pt纳米酶合成
根据实施例1所述的单链核酸Ag@Pt纳米酶的合成方法，首先通过紫外可见光谱表征，由图1b高温一步自组装方法生成的纳米酶在500-600 nm处无明显的吸收峰，而在350nm处有明显的吸收峰，表明形成了粒径较小的纳米簇，而对照组中无明显的特征峰。总体来说核酸的存在对于纳米材料的合成起到抑制聚集的作用，更利于大比表面积的纳米酶生成。由图1c可知生成的单链核酸Ag@Pt纳米酶具有类过氧化物酶活性，能够催化TMB发生颜色变化。同时，将高温一步自组装合成的纳米酶与化学还原法合成的纳米酶酶活进行比较，由图2可知，高温一步自组装合成的纳米酶具有更高的催化活性。
2. 单链核酸Ag@Pt纳米酶酶活调控
为了获得更高催化活性的纳米酶，首先对缓冲液进行了优化，结果如图3所示。因此后续选择10 mM SSC 继续进行优化。由于不同的核酸序列与金属离子之间的配位能力不一样，所以优化核酸序列，采用已经报道的核酸序列S1-S6进行实验（表1），实验结果显示S1序列能够形成更好的纳米酶酶活（图4a），而单一碱基寡核苷酸序列的结果比较可以知道C15>A15>G15>T15，这与AgNPs与核酸作用的亲和性一致。并对缓冲液的pH、核酸模板浓度、金属离子配比、反应温度和时间进行优化，结果如图4b-f所示。与此同时，将最优的SSC pH为7.3，且随着核酸浓度的增加酶活也逐渐增加，当浓度达到20 μM时，即核酸模板终浓度达到1 μM时，酶活逐渐达到最高，考虑到绿色合成的经济适用性，我们选择20 μM作为最佳的核酸浓度。最优的Ag:Pt比为4:1；随着孵育温度从60℃增加到95℃，纳米材料的酶活明显增加，当温度达到85-95℃时，催化能力趋平。这可能是由于当温度达到该范围时，DNA的构象更利于银铂离子的团聚成核。因此，在后续的实验中，我们选择95℃的孵育温度进行合成。当时间达到4min时，合成的纳米材料可以达到最佳酶活。
3. 双链核酸Ag@Pt纳米酶合成
按照高温一步自组装的方法合成双链核酸Ag@Pt 纳米酶，具体的合成过程如图7a所示。由图5a的紫外可见光谱图可知与ssDNA-Ag@Pt纳米酶一致在350nm左右有明显的吸收峰，表明形成了更小的纳米簇。总体来说核酸的作用与单链核酸Ag@Pt纳米酶的作用是一致的。由图5b可知生成的核酸Ag@Pt纳米酶能够催化TMB在652nm处出现明显吸收峰，即核酸Ag@Pt纳米酶具有类过氧化物酶活性，催化TMB发生颜色变化，且互补链的加入能够明显增加酶活。
4. 双链核酸Ag@Pt纳米酶酶活调控
在dsDNA-Ag@Pt nanozyme的合成过程中直接在ssDNA-Ag@Pt nanozyme纳米酶的基础上增加互补碱基，即以S1为模板生成ssDNA-Ag@Pt nanozyme后加入互补碱基S3, 以S4为模板生成ssDNA-Ag@Pt nanozyme后加入互补碱基S5, 以A15为模板生成ssDNA-Ag@Ptnanozyme后加入互补碱基T15, 以G15为模板生成ssDNA-Ag@Pt nanozyme后加入互补碱基C15,结果发现并不能促进Ag@Pt 纳米酶底物酶活（图6）。但发现如果增加结合臂不影响其成核位点时，增加互补碱基能够提高酶活，原理如图7所示。首先固定激发序列优化成核序列激发序列S30-HC-15G，改变了成核序列的C碱基的排列、长度及占比，优化了纳米材料的成核序列，序列如表1所示。结果表明，S15-4作为成核序列合成的dsDNA-Ag@Pt纳米酶具有更加优秀的催化效果（图7b），因此我们选择S15-4序列作为链激发dsDNA-Ag@Pt纳米酶的模板序列。相较于序列S30-HC-12A（激发序列部分为PolyA）、序列S30-HC-12T（激发序列部分为PolyT）而言，序列S30-HC-G12、序列S30-HC-12C都具有明显的增强效应（图7c）。鸟嘌呤在四种核苷酸中表现出最低的氧化电位，因此，可能作为电子供体，将氧化的纳米材料还原为酶活更强的纳米材料。结合臂的A、T碱基含量及长度可能影响dsDNA-Ag@Pt纳米酶的形成及催化效果。由于A、T碱基占比将影响双链的Tm值，当Tm值过低时，会影响双链稳定性及刚性结构，这可能引起dsDNA-Ag@Pt纳米酶的过氧化物酶活的降低。同时，结合臂过长可能引起冗余的结合臂对纳米材料缠绕，从而阻碍其酶活位点，引起酶活的降低。因此，选择合适的结合臂长度是有必要的，我们选取了不同的结合臂长度（20 bp、25 bp、30 bp、35 bp）作为优化条件。从图7c-d中可以看出，随着结合臂长度的增加，未添加激发序列的ssDNA-Ag@Pt纳米酶长度达到25 bp时，酶活最强，随后当长度超过25 bp时，酶活逐渐降低，这印证了结合臂过长阻碍其活性位点的猜测。而当添加与各自互补的激发序列后，不同结合臂长度的dsDNA-Ag@Pt 纳米酶的酶活之间的差异并不明显。因此，我们取dsDNA-Ag@Pt 纳米酶与ssDNA-Ag@Pt 纳米酶的吸光度的差值作为选择最佳结合臂长度的结果，最终确定最佳的结合臂长度为30 bp。最终，我们得到的最优合成序列确定为S15-4-H30（S15-4），最优激发序列为HC-3-30（S30-HC-3）。
表1 实验过程中用到的核酸序列
Figure 872891DEST_PATH_IMAGE001
Figure 993293DEST_PATH_IMAGE002
注：*标记的序列有不同的命名，但是序列一样。
实施例3 核酸纳米酶用于重金属的检测
Ⅰ）实验设计原理：
主要利用高温一步自组装合成的dsDNA-Ag@Pt纳米酶的表面催化活性建立Pb2+检测方式。如图8所示，以S15-4作为合成模板，在高温的条件下快速合成ssDNA-Ag@Pt纳米酶，当体系中存在与结合臂互补且3’端为富G序列时，可明显激发纳米材料的催化效果，而Pb2+的某些适体序列也是富G序列，且能够形成G4链体结构，因此选择Pb2+适配体序列作为激发序列构建Apt-HC-Pb（表1），与ssDNA-Ag@Pt纳米酶结合构成dsDNA-Ag@Pt纳米酶，体系中存在靶标离子Pb2+时，Pb2+与激发序列上的G4形成纳米螯合笼，此结构可提升反应介质之间的亲和性，促进dsDNA-Ag@Pt纳米酶氧化底物TMB产生肉眼可见的蓝色，最终使溶液增色并伴随着TMB特征吸收峰值的增加。因为适体的高特异性，因此，实验中仅含Pb2+的样品可以显著增强dsDNA-Ag@Pt纳米酶的类酶活性。最终，可以通过反应体系颜色的改变和TMB氧化产物特征吸收峰信号的强弱变化对重金属是否超标做出评定。
具体步骤如下：于200 μL离心管中加入dsDNA Ag@Pt纳米酶（1 μM，5 μL）和5 μLPb2+标准液，其中空白对照组则加入等量去离子水，震荡摇匀后在室温下孵育30 min。反应完毕，加入90 μL提前混合好的TMB显色液，并测定其吸光值。具体的以500 μM Pb2+浓度作为加入靶标的最终浓度，分别优化缓冲溶液、pH、反应时间等参数，以ΔOD652nm值确定最优参数。
Ⅱ）实验条件优化：
由图9a可知，随着pH的增加(3.0-4.0)，检测传感信号观察到逐渐增强；当pH增至4.0时，检测体系达到最高吸光值；当pH突破4.0时，检测溶液并未观察到颜色变化，说明检测信号的消失。这可能是因为，pH＞4.0的溶液的氢离子浓度不足以提供足够的电子密度，从而无法为dsDNA Ag@Pt纳米酶提供适宜的催化环境。而pH为4.0的缓冲溶液更易于激发酶的活力，促进纳米材料与底物之间的反应。因此，最佳缓冲溶液pH为4.0。由图9b可知，随着盐离子浓度从1 mM增加到10 mM，ΔOD652nm也有了明显升高；当盐离子浓度达到10 mM时，传感信号达到最强；当盐离子浓度≥25 mM时，观察到检测信号的减弱。这可能是由于体系中的盐离子浓度过高时会阻碍纳米材料与底物的接触面积，从而对传感信号造成抑制。因此，在接下来的实验中我们以10 mM盐离子浓度的NaAc-HAc 作为缓冲溶液。由图9c可知，TMB浓度从5 mM逐渐增加至40 mM的过程中，伴随着吸光差值逐渐增大，检测信号逐渐增强。当底物TMB浓度达增加40 mM时，吸光差值ΔOD652nm达到最大，因此我们选择40 mM作为最佳的TMB浓度。由图9d可知，随着H2O2浓度从150 mM增加到750 mM，ΔOD652nm逐渐增加直至在750 mM时达到最大。而当H2O2浓度达到900 mM时，检测信号不再变化，基本维持稳定。因此，在检测过程中我们选择750 mM浓度的H2O2进行实验。由图9e可知，在10-30 min内，随孵育时间的增加ΔOD652nm逐渐增加，孵育时间为30 min时，吸光差值达到最大，因此，我们以30min作为靶标与dsDNA Ag@Pt 纳米酶共孵育的最佳时长。
Ⅲ）检测灵敏度和特异性：
由图10a所示，随着Pb2+浓度的增加，检测信号也随之增大，且当Pb2+浓度超过50 μM后，检测信号开始趋平。在0.1-5 μM范围内的存在线性关系，线性回归方程为：y=0.665+0.01179x（R2=0.9956）（标准曲线），检测限为21.7 nM（3σ/slope）。此外利用As3+、Hg2+、Cd2+、K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ni+和Co2+进行特异性验证，由图10b可知，只有Pb2+有明显的增强作用，而其他金属离子则没有。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用
<130> 1
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccccctaact ccccc 15
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccctaattc cc 12
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggggagtta ggggg 15
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgccccta atcccccgcg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcgcggggat tagggggcgc 20
<210> 6
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggtcgccgc cc 12
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaaaaaaaa aaaaa 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tttttttttt ttttt 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gggggggggg gtttt 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccccccccc ccccc 15
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccctaactcc cctataataa attttaaata ttatttatta at 42
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccctttaacc cctataataa attttaaata ttatttatta at 42
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccctcttaac cctataataa attttaaata ttatttatta at 42
<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccttaatcc cctataataa attttaaata ttatttatta at 42
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctccttcct cctataataa attttaaata ttatttatta at 42
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccccctaact ccccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ccccctttaa ccccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccccctctta acccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cccccttaat ccccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cccctccttc ctccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccccctcccc tcccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccccctccc tcccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 23
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccccccctc cctcctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cccccccccc tcccctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cccccccccc cctcctataa taaattttaa atattattta ttaat 45
<210> 26
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
attaataaat aatatttaaa atttattata gggg 34
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
attaataaat aatatttaaa atttattata gggtgggg 38
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
attaataaat aatatttaaa atttattata gggtggggtg ggg 43
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
attaataaat aatatttaaa atttattata gggtggggtg gggtgg 46
<210> 30
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
attaataaat aatatttaaa atttattata gggtggggtg gggtgggg 48
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
attaataaat aatatttaaa atttattata aaaaaaaaaa aa 42
<210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
attaataaat aatatttaaa atttattata tttttttttt tt 42
<210> 33
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
attaataaat aatatttaaa atttattata cccccccccc cc 42
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
attaataaat aatatttaaa atttattata gggggggggg gg 42
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
attaataaat aatatttaaa atttattata ggggagttag gg 42
<210> 36
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
attaataaat aatatttaaa atttattata gggttaagag gg 42
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
attaataaat aatatttaaa atttattata ggggattaag gg 42
<210> 38
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
attaataaat aatatttaaa atttattata gggggattaa ggggg 45
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
attaataaat aatatttaaa atttattata gggaggaagg agggg 45
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
attaataaat aatatttaaa atttattata gggggagtta ggggg 45
<210> 41
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
attaataaat aatatttaaa atttattata gggagggtgg gtggga 46
<210> 42
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cccccttaat ccccctataa taaattttaa atattattta ttaataaatt 50
<210> 43
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
aatttattaa taaataatat ttaaaattta ttatagggga ttaaggg 47
<210> 44
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cccccttaat ccccctataa taaattttaa atattattta 40
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
taaataatat ttaaaattta ttatagggga ttaaggg 37
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cccccttaat ccccctataa taaattttaa atatt 35
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatatttaaa atttattata ggggattaag gg 32

Claims (8)

1.一种单链核酸纳米酶，其特征在于，以核酸序列作为模板，加入金属盐溶液，通过高温一步自组装的方法合成单链核酸纳米酶；
所述单链核酸纳米酶具有类过氧化物酶活性，且酶活可调，
所述核酸序列为特定碱基的寡核苷酸序列；
所述寡核苷酸序列为SEQ ID NO.1，序列如5’-CCCCCTAACTCCCCC-3’所示；
所述金属盐溶液为K2PtCl4溶液和AgNO3溶液；
所述高温一步自组装的方法是在70-95 ℃条件下短时孵育；
所述酶活可调的条件包括：模板核酸序列、缓冲液、银铂比、孵育温度、孵育时间。
2.一种根据权利要求1所述的单链核酸纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
1）将10-100 μM的核酸模板、0.5-5 mM K2PtCl4、0.5-5 mM AgNO3加入到柠檬酸钠中混匀；
2）剧烈震荡1-5 min；
3）放入金属浴，70-95 ℃加热，3-20 min。
3.一种双链核酸纳米酶，其特征在于，在权利要求1的单链核酸纳米酶上增加一条杂交互补核酸序列，通过高温退火形成双链核酸纳米酶；
所述双链核酸纳米酶具有类过氧化物酶活性，且酶活可调；
所述单链核酸纳米酶是以SEQ ID NO.19为模板生成的纳米酶，序列如5’-CCCCCTTAATCCCCCTATAATAAATTTTAAATATTATTTATTAAT-3’所示；
所述杂交互补核酸序列是SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.41，其中SEQ ID NO.37序列如5’-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGGATTAAGGG-3’所示，SEQ ID NO.41序列如5’-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGAGGGTGGGTGGGA-3’ 所示。
4.一种根据权利要求3所述的双链核酸纳米酶的制备方法，包括以下步骤：
1）将10-100 μM的核酸模板、0.5-5 mM K2PtCl4、0.5-5 mM AgNO3加入到柠檬酸钠中混匀；
2）剧烈震荡1-5 min；
3）放入金属浴，70-95 ℃加热，3-20 min；
4）离心收集上清，加入10-100 μM的杂交互补核酸序列，高温退火。
5.一种铅离子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）利用制备权利要求3所述的双链核酸纳米酶的方法制备具有铅离子特异性的双链核酸纳米酶；
2）上述双链核酸纳米酶与等体积的铅离子待测溶液室温下孵育10-40 min；
3）通过双链核酸纳米酶的类过氧化物酶活性，催化TMB发生颜色变化，并根据标准曲线判断铅离子浓度。
6.根据权利要求5所述的铅离子检测方法，其特征在于，所述的铅离子特异性的双链核酸纳米酶是由单链核酸纳米酶上增加一条杂交互补核酸序列，通过高温退火形成双链核酸纳米酶；
所述单链核酸纳米酶以SEQ ID NO.19为模板；
所述互补核酸序列为SEQ ID NO.41，如5’-ATTAATAAATAATATTTAAAATTTATTATAGGGAGGGTGGGTGGGA-3’所示。
7.根据权利要求3所述的双链核酸纳米酶在食品安全铅离子检测中的应用。
8.根据权利要求5所述的铅离子检测方法在食品安全铅离子检测试剂盒中的应用。
CN202210738626.7A 2022-06-28 2022-06-28 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用 Active CN114807146B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210738626.7A CN114807146B (zh) 2022-06-28 2022-06-28 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210738626.7A CN114807146B (zh) 2022-06-28 2022-06-28 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114807146A CN114807146A (zh) 2022-07-29
CN114807146B true CN114807146B (zh) 2022-09-02

Family

ID=82523021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210738626.7A Active CN114807146B (zh) 2022-06-28 2022-06-28 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114807146B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116689012B (zh) * 2023-06-08 2024-03-12 合肥工业大学 一种基于适配体调控氧化酶类纳米酶催化活性检测全氟辛酸的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102414557A (zh) * 2009-03-11 2012-04-11 新加坡科技研究局 用于超灵敏的核酸检测的电传感器
CN105675519A (zh) * 2016-04-01 2016-06-15 江南大学 一种汞离子检测方法
CN106092930A (zh) * 2016-06-14 2016-11-09 江南大学 铜离子检测方法及铜离子检测试剂盒

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2090305A4 (en) * 2006-12-08 2012-12-26 Katayama Chemical Ind Co Ltd LIPOSOME ENCAPSULATING HIGH-CONCENTRATION <O> AMINE </ O> COMPLEX, AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
SG183793A1 (en) * 2010-03-30 2012-10-30 Agency Science Tech & Res Nanocomposites

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102414557A (zh) * 2009-03-11 2012-04-11 新加坡科技研究局 用于超灵敏的核酸检测的电传感器
CN105675519A (zh) * 2016-04-01 2016-06-15 江南大学 一种汞离子检测方法
CN106092930A (zh) * 2016-06-14 2016-11-09 江南大学 铜离子检测方法及铜离子检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Colorimetric assay of l-cysteine based on peroxidase-mimickingDNA-Ag/Pt nanoclusters;Liang-Liang Wu等;《Sensors and Actuators B: Chemical》;20161231;第235卷;第110-116页 *
荧光铜纳米簇介导的生物传感器的研究进展;刘星雨等;《生物技术通报》;20191231;第35卷(第1期);第170-186页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114807146A (zh) 2022-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yuan et al. Fluorescent silver nanoclusters stabilized by DNA scaffolds
Zhou et al. Metal sensing by DNA
Vilcáez et al. Bioleaching of chalcopyrite with thermophiles: temperature–pH–ORP dependence
Wei et al. DNAzyme-based colorimetric sensing of lead (Pb2+) using unmodified gold nanoparticle probes
CN114807146B (zh) 一种核酸纳米酶的制备方法及传感应用
Liu et al. Electrochemical DNA biosensor fabrication with hollow gold nanospheres modified electrode and its enhancement in DNA immobilization and hybridization
Shen et al. Ce-based metal-organic frameworks and DNAzyme-assisted recycling as dual signal amplifiers for sensitive electrochemical detection of lipopolysaccharide
Chen et al. Effect of nanometer particles on the adsorbability and enzymatic activity of glucose oxidase
Wang et al. Label-free colorimetric biosensing of copper (II) ions with unimolecular self-cleaving deoxyribozymes and unmodified gold nanoparticle probes
Chau et al. Platinum nanoparticles on reduced graphene oxide as peroxidase mimetics for the colorimetric detection of specific DNA sequence
Du et al. Coordination‐Driven One‐Step Rapid Self‐Assembly Synthesis of Dual‐Functional Ag@ Pt Nanozyme
CN111992732B (zh) 一种钯铜双金属纳米花类过氧化物的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用
Liu et al. Electrochemical biosensor for sensitive detection of Hg2+ baesd on clustered peonylike copper-based metal-organic frameworks and DNAzyme-driven DNA Walker dual amplification signal strategy
Moon et al. Zn2+‐Dependent DNAzymes: From Solution Chemistry to Analytical, Materials and Therapeutic Applications
CN109722481B (zh) 基于无底物、非标记的电催化放大生物传感器检测肺癌细胞中microRNA的方法
Khataee et al. Superior peroxidase mimetic activity of tungsten disulfide nanosheets/silver nanoclusters composite: colorimetric, fluorometric and electrochemical studies
CN110296982B (zh) 基于G4-Cu2+仿酶体系的硫化氢比色传感器
Huang et al. Enhancing the peroxidase-like activity and stability of gold nanoparticles by coating a partial iron phosphate shell
US11655505B2 (en) Short-chain nucleic acid elongation primer set, assay kit, and short-chain nucleic acid elongation, amplification and detection methods
Hu et al. Formation of copper nanoparticles on poly (thymine) through surface-initiated enzymatic polymerization and its application for DNA detection
Wu et al. Ultrasensitive electrochemical biosensor for microRNA-377 detection based on MXene-Au nanocomposite and G-quadruplex nano-amplification strategy
Dong et al. A sensitive electrochemical sensor based on PtNPs@ Cu-MOF signal probe and DNA walker signal amplification for Pb2+ detection
CN110646486A (zh) 基于杂交链反应及TdT调控双重信号放大的铅离子交流阻抗传感器研究
Xing et al. Ag-β-cyclodextrin-graphene oxide ternary nanostructures with peroxidase-mimicking activity for Hg2+ detection
Alipour et al. Development of dual-emission cluster of Ag atoms for genetically modified organisms detection

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant