CN108613972A - 一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法 - Google Patents

一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法。取氯化铁溶液、铁氰化钾溶液和酶溶液混合，将混合溶液分别加入已知不同浓度的目标物溶液反应，并利用紫外‑可见光谱定量检测获得各个浓度下对应的紫外‑可见光的吸光度值，得到目标物浓度和吸光度之间的线性关系；待测目标物溶液加入到混合溶液中并检测吸光度值，计算得到待测目标物溶液中目标物浓度。本发明方法直接采用普鲁士蓝作为比色探针，构建的比色传感方法具有快速，简单，成本低廉，灵敏度高，选择性好等优点，实施于应用获得满意结果，具有广阔的应用前景。

Description

一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法
技术领域
本发明属于一种定量检测的比色生物传感技术，具体涉及一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法。
背景技术
葡萄糖作为大多数饮料中存在的主要还原糖，与总糖含量有直接关系。因此，检测食品工业中的葡萄糖含量对于确保良好的食品质量具有重要意义。通常，通过常规方法如滴定和色谱法检测葡萄糖。但是，滴定方法的终点难以判断，特别是对于初学者来说难度更大。用于检测食品中葡萄糖的标准方法为色谱法，如液相色谱/高效液相色谱，具有很高的灵敏度，特异性和可重复性，但费时，需要昂贵的仪器和高水平技术人员。对于简单、快速和经济的检测，色谱等常规方法显然不能满足需要。因此，有必要开发一种新的现场检测方法来检测葡萄糖应用于生物和食品监测领域，如小型工厂、市场和厨房。
比色法在常规检测应用中已显示出巨大的潜力，因为这类方法具有简单明了的优点，成本低廉，并且不需要昂贵的仪器。此外，颜色变化可以通过肉眼观察。例如，金纳米粒子比色生物传感检测法在许多商业应用中因其简单性和多功能性而备受关注。普鲁士蓝(PB)具有由于其高度可分辨的蓝色，被广泛地用作染料、油漆和印刷油墨，已有数百年的历史。PB是一种混合价态化合物，可以通过简单地将三价铁离子(Fe3+)和亚铁氰根(Fe(CN)6 4-)混合，或者将二价铁离子(Fe2+)和铁氰根(Fe(CN)6 3-)混合反应得到。因此，PB作为一种比色探针已经被开发用于检测各种目标物如苯酚、抗坏血酸盐、吗啡和肼苯哒嗪。已有的生成PB的比色方法主要基于这些靶标与PB前驱体之间的反应。但是，对于与PB前体无反应活性的目标物，目前仍难以进行检测，限制了PB作为比色方法的应用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，针对酶催化诱导生成PB进行显色，生成普鲁士蓝颗粒，尤其能对葡萄糖进行快速定量检测。
本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的：
本发明以氯化铁和铁氰化钾作为显色底物，在酶催化作用下直接检测目标物，产生普鲁士蓝纳米颗粒，引起颜色变化，通过肉眼可以直接观察，利用紫外-可见光谱定量检测目标物。
所述方法具体包括以下步骤：
1)分别取氯化铁溶液、铁氰化钾溶液和酶溶液混合，获得混合溶液；
2)将混合溶液分别加入已知不同浓度的目标物溶液反应，并利用紫外-可见光谱定量检测获得各个浓度下对应的紫外-可见光的吸光度值，得到目标物浓度和吸光度之间的线性关系；
3)针对未知浓度的待测目标物溶液，加入到混合溶液中并利用紫外-可见光谱定量检测紫外-可见光的吸光度值，根据步骤(2)获得的目标物浓度和吸光度之间的线性关系计算得到待测目标物溶液中目标物浓度。
所述的氯化铁溶液、铁氰化钾溶液、酶溶液和目标物溶液均采用缓冲溶液配置，缓冲溶液为MES缓冲溶液，浓度为5-50mM，pH值为2.5-7。
所述的缓冲溶液的pH值为2.5-7，优化的pH值为3。
优选的缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸(2-Morpholinoethanesulfonic Acid，MES)缓冲溶液，pH 3.0。
所述的酶采用酶促诱导催化的酶。
所述的酶采用但不限于葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶(horse radishperoxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、尿酶(urease)、漆酶(laccase)或者[辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶]、[辣根过氧化物酶和胆碱酶]、[碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶]、[碱性磷酸酶和胆碱酶]、[尿酶和葡萄糖氧化酶]、[尿酶和胆碱酶]、[漆酶和葡萄糖氧化酶]、[漆酶和胆碱酶]组成的复合酶体系。
所述的目标物为与所用酶对应特异性催化的底物，采用但不限于与辣根过氧化物酶HRP对应的过氧化氢(H2O2)、与碱性磷酸酶ALP对应的对硝基苯磷酸二钠(pNPP)、与尿酶对应的尿素、与漆酶对应的对苯二酚、葡萄糖氧化酶对应的葡萄糖、胆碱酶对应的乙酰胆碱或者上述组成的复合物。
所述的酶为葡萄糖氧化酶，所述的目标物为葡萄糖。
所述步骤1)中，氯化铁溶液的浓度为0.5-1.5mM，铁氰化钾溶液的浓度为0.5-1.5mM，葡萄糖氧化酶溶液的浓度为0.05-8.8mg/mL；
所述步骤2)中，加入葡萄糖溶液反应后2分钟产生蓝色变化，可以通过肉眼观察到这种颜色变化，反应2-30分钟(优选时间为10分钟)后利用紫外-可见光谱定量检测600-900nm波长范围内(优选的波长范围为700-740nm)吸光度值。
本发明由氯化铁和铁氰化钾构成了PB基底物，由与所用酶对应特异性催化的底物和PB基底物构成了反应底物，并且在加入待测目标物溶液后能够通过吸光度变化实现检测，通过肉眼直接观察到这种颜色变化，判断到是否含有目标物，可以无需进一步的化学检测。
本发明所涉及催化还原氯化铁或者铁氰化钾的反应包括但不限于葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应。
本发明能够实现比色传感的检测原理是：采用三价铁离子和铁氰化钾作为显色底物，在葡萄糖氧化酶催化作用下通过两种途径生成显色的普鲁士蓝纳米粒子：一方面在氧气参与下葡萄糖被氧化生成产物过氧化氢，过氧化氢还原三价铁离子为亚铁离子，亚铁离子与铁氰化钾相互作用生成蓝色的普鲁士蓝纳米颗粒；另一方面在没有氧气参与下，氧化态葡萄糖氧化酶与葡萄糖结合，葡萄糖氧化后，葡萄糖氧化酶转变为还原态，然后与铁氰根离子反应，恢复到氧化态，后者还原成亚铁氰根离子；最后，亚铁氰根离子与三价铁离子反应形成普鲁士蓝纳米颗粒。有氧气和无氧气催化生成普鲁士蓝纳米颗粒这两种途径协同作用，能提高普鲁士蓝纳米颗粒的生成效率，提高检测灵敏度。对反应生成的普鲁士蓝进行紫外-可见吸收强度测定就能定量检测葡萄糖。同时，反应后溶液颜色发生变化，呈现明显的蓝色，可以用肉眼直接观察。
本发明结合比色传感和酶催化沉积的优势发展简单、快速、灵敏地分析监测葡萄糖具有重要的意义，为开发能应用于在日常家庭和不同市场的食品检测和环境监测的灵敏检测方法提供理论依据。
本发明的有益效果是：
本发明结合酶催化效率高和PB颜色的优势，利用比色方法直接检测葡萄糖含量。
与常规方法基于单种变色途径比较，本发明方法为双变色途径，PB产率更高，变色时间更快，检测性能更好。
同时本发明方法步骤简单，所需时间短，可裸眼实现半定量检测，抗干扰性好，灵敏度高。在成本方面本发明方法所需试剂配制简便，不需要复杂的材料和装置，成本低，检测吸光度来测定葡萄糖含量。
附图说明
图1为比色法的原理示意图。
图2为几种反应系统的紫外-可见光谱和数字图像。
图2(a)为几种反应体系的紫外可见光谱和数字图像(插图)：氯化铁/铁氰化钾(1)，氯化铁/铁氰化钾/葡萄糖(2)，氯化铁/铁氰化钾/葡萄糖氧化酶(3)和氯化铁/铁氰化钾/葡萄糖氧化酶/葡萄糖(4)。反应条件：在25℃下，在50mMMES(pH 3.0)中0.25mM氯化铁，0.25mM铁氰化钾,0.05mg/mL葡萄糖氧化酶和1mM葡萄糖，反应10分钟。
图2(b)为氯化铁/铁氰化钾(5)，氯化亚铁/铁氰化钾(6)和氯化铁/铁氰化钾/过氧化氢(7)的紫外可见光谱和数字图像。反应条件：在25℃下，在50mMMES(pH 3.0)中的0.25mM氯化亚铁，0.25mM氯化铁，0.25mM铁氰化钾和1mM H2O2，反应10分钟。
图2(c)为空气和氮气下氯化铁/铁氰化钾/葡萄糖氧化酶/葡萄糖的紫外-可见光谱。反应条件：在25℃下，在50mM MES(pH 3.0)中0.25mM氯化铁，0.25mM铁氰化钾,0.05mg/mL葡萄糖氧化酶和1mM葡萄糖，反应10分钟。
图3为几种反应系统的扫描电镜图，反应条件：在25℃，在50mM MES(pH 3.0)中的0.25mM氯化铁，0.25mM铁氰化钾,0.05mg/mL葡萄糖氧化酶，1mM葡萄糖和1mM过氧化氢。比例尺：20nm。
图3(a)为由氯化亚铁和铁氰化钾制备的PBNPs的TEM图像。
图3(b)为由氯化铁，铁青化钾，葡萄糖和葡萄糖氧化酶制备的PBNPs的TEM图像。
图3(c)为氯化铁，铁青化钾和过氧化氢制备的PBNPs的TEM图像。
图4为实施例1中不同浓度的葡萄糖反应后得到的紫外-可见吸收光谱图及相应校准曲线图。
图4(a)为在存在0.05mg/mL葡萄糖氧化酶，0.75mM氯化铁和0.75mM铁氰化钾的50mM MES(pH 3.0)反应中，加入不同浓度葡萄糖反应10分钟的UV-可见光谱(a)。从顶部到底部(1到12)的葡萄糖浓度(全部以mM表示)：2，1，0.5，0.2，0.1，0.05，0.02，0.01，0.008，0.004，0.001和0。插图代表相应的样品。
图4(b)为图4(a)中对应葡萄糖的吸光度和浓度之间的线性关系。
图5为实施例2中红酒样品中半甜型红酒的紫外-可见吸收光谱图和实施例3中红酒样品中甜型红酒的紫外-可见吸收光谱图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明做详细描述，但并不是限制本发明。
本发明的实施例如下：
实施例1：
先利用超纯水配制50mM MES缓冲溶液，用稀盐酸和氢氧化钾调节pH至3.0。利用50mM MES缓冲溶液分别配制0.5mM、1.5mM氯化铁溶液和0.5mM、1.5mM铁氰化钾溶液，0.5mM氯化亚铁溶液，1.1mg/mL葡萄糖氧化酶溶液，22mM葡萄糖溶液溶液和21mM H2O2溶液。
首先为了验证该方法如图1存在两种途径共同增强效应。分别取0.5mM氯化铁50μL和0.5mM铁氰化钾溶液50μL，准备4份，分别不加(样品1)、加入22mM葡萄糖溶液5μL(样品2)、加入1.1mg/mL葡萄糖氧化酶溶液5μL(样品3)、加入22mM葡萄糖溶液5μL和1.1mg/mL葡萄糖氧化酶溶液5μL(样品4)。反应10分钟后测量紫外-可见吸收光谱，如图2所示。从图2(a)可以看出，对照组样品1，样品2，样品3的紫外-可见光谱在500-1000nm没有吸收峰，而样品4中在706nm处有1个吸收峰。同时图片也有明显的颜色，样品4样品为蓝色，而对照组(样品1，样品2，样品3)均为浅黄色。表明是由于葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖反应生成PB纳米粒子。
为了验证葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的产物过氧化氢同样能引起生成PB的反应，取0.5mM氯化铁50μL和0.5mM铁氰化钾50μL(样品5)，0.5mM氯化亚铁50μL和0.5mM铁氰化钾50μL(样品6)、取0.5mM氯化铁50μL，0.5mM铁氰化钾50μL和21mM过氧化氢5μL(样品7)。反应10分钟后测量紫外-可见吸收光谱，如图2(b)所示。样品5为浅黄色，紫外-可见光谱图在500-1000nm没有吸收峰。传统方法得到的样品6和样品7为蓝色，紫外-可见光谱图在706nm处有吸收峰。表明过氧化氢同样能引起氯化铁和铁氰化钾生成PB。
同时发现在没有氧气存在情况下，葡萄糖氧化酶也能催化葡萄糖，在氯化铁和铁氰化钾作用下产生PB如图2(c)所示。
同时也利用扫描电镜图进行验证，传统方法氯化亚铁和铁氰化钾生成PB纳米粒子(图3(a))，在氯化铁和铁氰化钾溶液中分别加入葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖(图3(b))和过氧化氢(图3(c))均能生成PB纳米粒子，而且形貌类似。表明在没有氧气参与反应下也能很好的生成PB。本方法的两种途径均能产生PB，这会明显提高检测性能。
实施例1再对不同浓度的葡萄糖的检测并建立标准曲线，具体操作为：每次取1.5mM氯化铁溶液50μL，1.5mM铁氰化钾溶液50μL和1.1mg/mL葡萄糖氧化酶溶液5μL混合，向混合物中加入葡萄糖溶液，反应10分钟后测量紫外可见光谱，并取706nm处的吸光值，对浓度-吸光值进行线性回归如图4。图4表明这种方法在0.004-0.5mM间存在良好的线性关系，回归方程式y＝0.87x+0.01，相关系数为0.998。计算得到检测限为3.29μM。表明该方法有很好的检测性能。
实施例2：
从超市购买半甜型红酒，首先将红酒通过0.2μm孔径的滤膜过滤3次，然后用50mMMES缓冲溶液稀释1倍。取1.5mM氯化铁50μL，1.5mM铁氰化钾50μL和1.1mg/mL葡萄糖氧化酶5μL混合物，取5μL稀释后的红酒溶液加入其中，反应10分钟后测量紫外可见吸光度值，如图5。取706nm处的吸光值，根据实施例1中的方程和稀释倍数，计算葡萄糖含量为27.52±0.04mM。
实施例3：
从超市购买甜型红酒，首先将红酒通过0.2μm孔径的滤膜过滤3次，然后用50mMMES缓冲溶液稀释1倍。取1.5mM氯化铁50μL，1.5mM铁氰化钾50μL和1.1mg/mL葡萄糖氧化酶5μL混合物，取5μL稀释后的红酒溶液加入其中，反应10分钟后测量紫外可见吸光度值，如图5。取706nm处的吸光值，根据实施例1中的方程和稀释倍数，计算葡萄糖含量为34.62±0.07mM。
采用高效液相色谱法(HPLC method)对实施例2和实施例3中的红酒葡萄糖进行检测，如下：
上述结果可见，两种样品的相对标准偏差(RSD)小于1％，说明该方法可用于食品样品中葡萄糖的检测。这些结果证实了用于测量食物样本中葡萄糖的传感器的准确性。
综上实施例，该方法提供了检测葡萄糖的良好灵敏度，不需要使用先进的或复杂的读出设备，经验证能成功应用于红葡萄酒中的葡萄糖监测，具有其突出显著的技术效果。
本发明方法直接采用普鲁士蓝作为比色探针，构建的比色传感方法具有快速，简单，成本低廉，灵敏度高，选择性好等优点，实施于应用获得满意结果，有望应用于在日常家庭和不同市场的食品检测和环境监测。

Claims (7)

1.一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于：
以氯化铁和铁氰化钾作为显色底物，在酶催化作用下直接检测目标物，产生普鲁士蓝纳米颗粒，引起颜色变化，利用紫外-可见光谱定量检测目标物。
2.根据权利要求1所述的一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于所述方法具体包括以下步骤：
1)分别取氯化铁溶液、铁氰化钾溶液和酶溶液混合，获得混合溶液；
2)将混合溶液分别加入已知不同浓度的目标物溶液反应，并利用紫外-可见光谱定量检测获得各个浓度下对应的紫外-可见光的吸光度值，得到目标物浓度和吸光度之间的线性关系；
3)针对待测目标物溶液，加入到混合溶液中并利用紫外-可见光谱定量检测紫外-可见光的吸光度值，根据步骤(2)获得的目标物浓度和吸光度之间的线性关系计算得到待测目标物溶液中目标物浓度。
3.根据权利要求1所述的一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于：所述的氯化铁溶液、铁氰化钾溶液、酶溶液和目标物溶液均采用缓冲溶液配置，缓冲溶液为MES缓冲溶液，浓度为5-50mM，pH值为2.5-7。
4.根据权利要求1所述的一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于：所述的酶采用但不限于葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶(horse radishperoxidase，HRP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、尿酶(urease)、漆酶(laccase)或者[辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶]、[辣根过氧化物酶和胆碱酶]、[碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶]、[碱性磷酸酶和胆碱酶]、[尿酶和葡萄糖氧化酶]、[尿酶和胆碱酶]、[漆酶和葡萄糖氧化酶]、[漆酶和胆碱酶]组成的复合酶体系。
5.根据权利要求1所述的一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于：所述的目标物为与所用酶对应特异性催化的底物，采用但不限于与辣根过氧化物酶HRP对应的过氧化氢(H2O2)、与碱性磷酸酶ALP对应的对硝基苯磷酸二钠(pNPP)、与尿酶对应的尿素、与漆酶对应的对苯二酚、葡萄糖氧化酶对应的葡萄糖、胆碱酶对应的乙酰胆碱或者上述组成的复合物。
6.根据权利要求1所述的一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于：所述的酶为葡萄糖氧化酶，所述的目标物为葡萄糖。
7.根据权利要求6所述的一种基于酶催化诱导生成无机纳米颗粒的比色传感方法，其特征在于：所述步骤1)中，氯化铁溶液的浓度为0.5-1.5mM，铁氰化钾溶液的浓度为0.5-1.5mM，葡萄糖氧化酶溶液的浓度为0.05-8.8mg/mL；
所述步骤2)中，加入葡萄糖溶液反应后产生蓝色变化，反应2-30分钟后利用紫外-可见光谱定量检测600-900nm波长范围内吸光度值。
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