-
1. HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
Mikrogele für
die Verwendung in der medizinischen Diagnose, insbesondere für die Sequenzierung
von Nukleinsäuren,
und Verfahren der Herstellung und Verwendung solcher Gele.
-
Die Sequenzierung von DNA kann mit
Hilfe automatischer Systeme erfolgen, die für den Laboreinsatz ausgelegt
sind. Verfahren und Vorrichtungen für die Sequenzierung von DNA
sind in den US-Patenten Nr. 4,811,218, 4,823,007, 5,062,942, 5,091,652,
5,119,316 und 5,122,345 beschrieben.
-
Die allgemeine Methodik, die in diesen
Systemen angewendet wird, beinhaltet das Aufbrechen der DNA-Probe
mit Hilfe von Restriktions-Endonukleasen, das Vergrößern (beispielsweise
mittels Polymerase-Kettenreaktion) des zu untersuchenden Restriktionsfragments,
das Kombinieren der vergrößerten DNA
mit einem Sequenzierungsprimer, der gleich den oder verschieden
von den Vergrößerungsprimern
sein kann, die Extension des Sequenzierungsprimers in Anwesenheit
normalen Nukleotids (A, C, G und T) und eines kettenbeendenden Nukleotids,
beispielsweise eines Dideoxynukleotids, das eine weitere Extension
des Primers nach seiner Inkorporierung verhindert, und das Analysieren
des Produktes im Hinblick auf die Länge der erhaltenen extendierten
Fragmente. Die Analyse der Fragmente kann mittels Elektrophorese,
beispielsweise auf einem Polyacrylamidgel, erfolgen.
-
Die internationale Patentschrift
Nr. WO93/00986 beschreibt Elektrophoresegels mit einer Dicke von
25 bis 250 Mikrometern. Die Gele werden zwischen zwei zusammen geklammerten
Platten gebildet, von denen eine bis zu einer Tiefe, die der gewünschten
Geldicke entspricht, eingekerbt ist, um parallele Bahnen auszubilden,
die dann mit Gel gefüllt
werden.
-
Bei der Durchführung der Sequenzanalyse einer
Nukleinsäure
auf einem Gel haben die Merkmale des Gels, einschließlich Größe und Dicke,
Einfluss auf die Zeit und die Kosten, die für die Analyse notwendig sind. Da
es wünschenswert
ist, die Zeit und die Kosten von Sequenzanalysen zu vermindern,
um die Verfügbarkeit der
Sequenzierung als diagnostischem Instrument zu verbessern, wäre es vorteilhaft, über ein
Gel zu verfügen,
das die Analyse sehr kleiner Mengen von Oligonukleotidfragmenten
in sehr kurzer Zeit gestattet. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde,
ein solches Gel zu schaffen.
-
Der Erfindung liegt weiterhin die
Aufgabe zugrunde, Einweg- bzw. Wegwerf-Gelhalter zu schaffen, die einfach
mit dem Gel zu füllen
sind, um ein Gel für
die rasche Analyse kleiner Proben bereitzustellen.
-
Der Erfindung liegt weiterhin die
Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der Herstellung von Gelen zu schaffen,
die eine hohe Auflösung
von Oligonukleotidfragmenten in kurzer Zeit erreichen.
-
Der Erfindung liegt weiterhin die
Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der Bewertung einer Probe zu schaffen,
die unterschiedlich lange Oligonukleotidfragmente enthält.
-
II. ZUSAMMENFASSUNG DER
ERFINDUNG
-
Diese und andere Aufgaben der Erfindung
werden mit Hilfe eines Elektrophoresemikrogels gelöst, das in
einem Gelhalter gebildet wird. Der Gelhalter umfasst
- (a) ein oberes Substrat;
- (b) ein unteres Substrat;
- (c) Mittel zum dichten Verbinden des oberen Substrats mit dem
unteren Substrat zum Ausbilden eines Gelraumes mit einer Dicke von
250 Mikrometern oder weniger, wobei die Mittel zum dichten Verbinden
eine durch sie hindurch verlaufende Öffnung zum Füllen des
Gelraumes mit einem nichtpolymerisierten Gel aufweisen; und
- (c) eine Vielzahl fester Partikel, die zwischen dem oberen Substrat
und dem unteren Substrat angeordnet sind und deren mittlerer Durchmesser
im Wesentlichen der Dicke des Gelraumes entspricht.
-
Der Abstandhalter stellt einen Abstand
von 250 Mikrometern oder weniger, vorzugsweise 25 bis 250 Mikrometer,
zwischen dem oberen Substrat und dem unteren Substrat her. Die Ausbildung
eines Gelraumes erfolgt durch das teilweise dichte Verbinden des
oberen Substrats mit dem unteren Substrat, wobei eine Öffnung zum
Einbringen des nichtpolymerisierten Gels gelassen wird. Dann wird der
Gelraum mit einem nichtpolymerisierten oder teilpolymerisierten
Gel gefüllt,
das in dem Gelraum polymerisiert wird. Elektroden können auf
die Substrate gedruckt sein, können
in Kontakt mit einer exponierten Kante des Gels stehen, oder durch in
eines der Substrate geschnittene Fenster anliegen.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden sortierte Kügelchen
mit einem Durchmesser von 250 Mikrometern oder weniger, vorzugsweise
25 bis 250 Mikrometer, die in einem Klebstoff, beispielsweise einem
Acrylklebstoff oder einem mit ultraviolettem Licht aktivierten Klebstoff,
aufgeschlämmt
sind oder mit Hilfe eines niedrig schmelzenden Glases mit dem Substrat
verbunden sind, als Abstandhalter verwendet. Die Aufschlämmung wird
auf die Oberfläche
eines oder beider Substrates) gedruckt, um einen Abstandhalter mit
der gewünschten
Gestalt auszubilden, und dann mit Hilfe von Wärme oder Licht gehärtet. Auf Wunsch
kann ein Klebstoff oder ein niedrig schmelzendes Glas, der/das feste
Partikel enthält,
auch verwendet werden, um Bahnen innerhalb des Gels auszubilden.
-
Der Abstand zwischen den Substraten
kann auch mit Hilfe einer Vielzahl von Kügelchen hergestellt werden,
die auf der Oberfläche
der Substrate in dem Gelraum angeordnet sind. In diesem Fall können die
Kanten mittels Klebstoff oder klebstoffbeschichtetem Kunststofffilm
mit einer geeigneten Dicke dicht verbunden werden. Es ist ebenfalls
möglich,
dass Partikel sowohl in dem Klebstoff als auch in dem Gelraum angeordnet sind.
-
III. KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Es zeigt/zeigen:
-
1 in
schematischer Form eine auseinander gezogene Ansicht einer ersten
Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Mikrogels;
-
2 in
schematischer Form eine zweite Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikrogels;
-
3 in
schematischer Form eine dritte Ausführungsform der Erfindung;
-
4A und 4B eine weitere Ausführungsform der Erfindung;
-
5A und 5B einen Gelbildungseinsatz, der für die praktische
Umsetzung der beanspruchten Erfindung von Nutzen ist;
-
6 einen
erfindungsgemäßen Aufbringeinsatz;
-
7A und 7B weitere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Aufbringeinsätze und
Gelbildungseinsätze;
-
8 eine
Vorrichtung zur Verwendung bei der erfindungsgemäßen Analyse von Oligonukleotidmischungen;
-
9 eine
Vorrichtung zur Verwendung bei der erfindungsgemäßen Analyse von Oligonukleotidmischungen;
-
10 die
Ergebnisse einer Analyse einer Mischung eines 30-mers und eines
31-mers mit Hilfe der vorliegenden Erfindung; und
-
11A–11F die Ergebnisse einer Analyse der ddT-Sequenzierungsreaktionen
einer M13-DNA-Schablone.
-
IV. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
1 zeigt
eine auseinander gezogene Ansicht einer ersten Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Mikrogels.
Wie gezeigt, wird das Mikrogel aus einem unteren Substrat 1,
einem oberen Substrat 2 und einem Abstandhalter 3,
der zwischen den beiden Substraten angeordnet ist, gebildet. Der
Abstandhalter 3 und die Innenflächen der beiden Substrate 1, 2 definieren
einen Gelraum 4. In das obere Substrat 2 ist ein
Schlitz 5 geschnitten, um das Aufbringen einer Probe auf
das Gel zu gestatten, und die Schlitze 6 und 7 geschnitten, durch
die hindurch Elektroden in Kontakt mit dem Gel gebracht werden können.
-
Das in 1 gezeigte
Mikrogel kann mittels eines "Quetschfüll"-Verfahrens wie folgt hergestellt
werden: Zuerst wird der Abstandhalter 3 an dem unteren
Substrat befestigt. Dann wird der Bereich des Gelraumes 4 mit
nichtpolymerisiertem oder teilpolymerisiertem Gel gefüllt, und
das obere Substrat 2 über
die Oberseite nach unten gedrückt.
Das nichtpolymerisierte Gel füllt
den Gelraum 4, wobei überschüssiges Gel
allseitig zwischen den Kanten des Substrats heraus gedrückt wird.
Das Gel wird dann polymerisiert, und überschüssiges Gel abgeschnitten.
-
2 zeigt
eine auseinander gezogene Ansicht einer zweiten Ausführungsform
eines erfindungsgemäßen Mikrogels,
die für
eine andere Fülltechnik
angepasst ist. In 2 erstreckt
sich der Abstandhalter 23 nur entlang von drei Seiten des
unteren Substrats 1 und lässt eine Öffnung 24 entlang
der vierten Kante. Als Alternative zu den in 1 gezeigten Elektrodenschlitzen 6 und 7 können die
Elektroden 26 und 27 in Form eines Films direkt
auf dem oberen oder unteren Substrat angeordnet werden. Geeignete
Elektrodenmaterialien sind dünne
Filme aus leitenden Materialien, beispielsweise Indium-Zinn-Oxid
(ITO) oder Platin. Lösungsgepufferte
Elektroden, d. h. Elektroden, bei denen der elektrische Kontakt
zwischen einer herkömmlichen
metallischen (z. B. Platin-) Elektrode und dem Gel indirekt ist
und durch eine konzentrierte Elektrolytlösung vermittelt wird, können ebenfalls
verwendet werden.
-
Die Herstellung eines Mikrogels der
in 2 gezeigten Art kann
erfolgen, indem zuerst das untere Substrat 1, der Abstandhalter 23 und
das obere Substrat 2 miteinander verbunden werden, so dass
sie ein Gelhaltergefüge
bilden. Dann wird das Gelhaltergefüge in einen Raum eingebracht
und senkrecht angeordnet, so dass die Öffnung 24 nach unten
gerichtet und über
einem Vorratsbehälter
mit nichtpolymerisiertem Gel befindlich ist. Der Raum wird dann
entleert, das Gelhaltergefüge
wird nach unten bewegt, so dass die Öffnung in das nichtpolymerisierte
Gel eintaucht, und in den Raum wird mit positivem Druck wieder ein
Gas eingeleitet, um das Gel in den Gelraum 4 des Gelhaltergefüges zu befördern. Im
oberen Substrat dieser Ausführungsform sind
keine Schlitze notwendig, da das Gel durch die Öffnung 24 hindurch
exponiert ist, was ein Aufbringen über die Kante des Gels gestattet,
wenngleich in dem oberen Substrat auf Wunsch ein oder mehrere Schlitze)
für das
Einbringen einer Probe oder der Elektroden vorgesehen sein kann/können.
-
Eine dritte Ausführungsform der Erfindung ist
in 3 gezeigt. In diesem
Fall wurden Abstandhalter verwendet, um Bahnmarkierer 30 innerhalb
des Gelkörpers
zu schaffen. Solche Bahnmarkierer können inkorporiert werden, um
jede Bahn abzutrennen, jede vierte Bahn abzutrennen, oder in anderen
solchen Intervallen, wie sie der Nutzer bevorzugt. In einer bevorzugten
Konfiguration, in der Bahntrenner verwendet werden, ist das Gel
in eine Anzahl gleich breiter Bahnen getrennt. Die Anzahl dieser
Bahnen wird durch die Formel (A/4) bestimmt, worin A die Anzahl
der nutzbaren Probeaufbringorte in dem Gel ist.
-
Ist das obere Substrat kürzer als
das untere Substrat, wie in 3 gezeigt,
hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass sich die Bahnen über das
Ende des oberen Substrats hinaus erstrecken, über zumindest einen Teil des
sich weiter erstreckenden Abschnitts des unteren Substrats. Dies
hat zur Folge, dass sich alle Bahnen individuell von unten nach
oben füllen,
und schließt
die Möglichkeit
aus, dass nichtpolymerisiertes Gel aus einer Bahn in eine benachbarte
Bahn überläuft und
bewirkt, das sich in der Mitte dieser Bahn eine Blase bildet.
-
4A und 4B zeigen eine Abwandlung eines oberen
Substrats 2, in das ein Fenster 5' geschnitten ist,
um das Aufbringen einer Probe zu gestatten. Die Kanten des Fensters
sind alle in einem Winkel von 90° geschnitten,
ausgenommen die untere Kante 31, die mit einer Schrägung von
30 bis 60°,
vorzugsweise 45°, geschnitten
ist, wie am deutlichsten in 4B gezeigt
ist. Diese Gestaltung gestattet ein verbessertes Aufbringen der
Probe.
-
Insbesondere ein Mikrogel, in dem
ein oberes Substrat verwendet wird, das wie in 4A und 4B gezeigt, geschnitten ist, wird vorzugsweise
mit Hilfe eines Gelbildungseinsatzes der in 5A gezeigten
Art gebildet. Dieser Einsatz weist einen Basisabschnitt 1 und
einen Einsatzabschnitt 52 auf. Der Einsatzabschnitt ist an
jedem Ende eingekerbt, so dass er schmaler ist als der Basisabschnitt.
Die Größe jeder
Einkerbung beträgt vorzugsweise
2–4 mm
bis 5 mm. Die freie Kante des Einsatzabschnitts ist schräg, so dass
sie zu der Schrägung
passt, die in der Unterkante 31 des Fensters 5' ausgebildet
ist, und die Gesamtgröße des Einsatzes
ist so gewählt,
dass sie das Einsetzen des Einsatzes in das Fenster 5' gestattet.
Geeignete Abmessungen sind beispielsweise eine Breite von 12,5 cm,
eine Gesamthöhe
von 1,5 cm und eine Dicke von 1 mm. Auf einer Oberfläche des
Basisabschnitts 31 kann ein Band oder ein Griff angeordnet
sein, um die Entfernung zu erleichtern.
-
Der Gelbildungseinsatz wird vor der
Polymerisation des Gels, vorzugsweise vor dem Füllen des Gelraumes, in dem
Fenster angeordnet, wie in 5B gezeigt.
Es kann Klebeband verwendet werden, um den Gelbildungseinsatz daran
zu hindern, sich zu bewegen, und ihn dadurch gegenüber dem
unteren Substrat festzustellen, so dass er nicht auf der injizierten
Lösung
schwimmt.
-
Wird die korrekte Menge polymerisierbarer
Lösung
in den Mikrogelhalter injiziert, füllt die Lösung den Mikrogelraum bis hinauf
zu dem Gelbildungseinsatz, wo die Lösung teilweise um die Kanten
des Gelbildungseinsatzes herum fließt und durch die Luftlöcher aus
dem Mikrogelhalter austreten kann. Wird ein erheblicher Überschuss
an Lösung
in den Gelhalter injiziert, kann die Lösung auch über die Oberseite austreten.
Das überschüssige Gel
hat keine wesentlichen Auswirkungen für die Wirksamkeit der Polymerisation,
das Aufbringen der Probe oder die Verwendung des Gels und kann auf
Wunsch abgeschnitten werden.
-
Nach der UV-katalysierten Polymerisation
ist es für
die erfolgreiche Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikrogels wichtig, den
Gelbildungseinsatz vorsichtig zu entfernen, ohne das Gel zu beschädigen. Wird der
Gelhalter nach der Polymerisation in die Ebene seiner Fläche geneigt,
neigt der Gelbildungseinsatz dazu, nach vorn zu fallen. Es kann
notwendig sein, leicht auf die untere Platte zu klopfen, um eine
Entfernung des Gelbildungseinsatzes zu bewirken. Sobald sich eine
Kante des Gelbildungseinsatzes aus der Ebene des oberen Substrates
heraus gelöst
hat, kann er ergriffen werden und vorsichtig von allem polymerisierten
Gel abgezogen werden, das in Kontakt mit dem Gelbildungseinsatz
ist. Alternativ dazu kann Klebeband, das auf der Außenseite
des Gelbildungseinsatzes angebracht ist, verwendet werden, um den
Gelbildungseinsatz von seiner Position weg zu ziehen. In beiden
Fällen
ist darauf zu achten, dass die glatte Gelkante, die sich entlang der
Unterseite des Fensters des oberen Substrats gebildet hat, erhalten
bleibt.
-
Die Entfernung des Gelbildungseinsatzes
hat die Bildung einer Mulde zur Folge, die über die Breite des Gels verläuft und
durch die schräge
Kante des Fensters, das Gel selbst und das untere Substrat begrenzt wird
und in welche die Probe eingebracht werden kann. In diese Mulde
wird die Probe zum Zweck der Elektrophorese eingebracht.
-
Da diese Mulde ohne Unterbrechung über die
Breite des Gels verläuft,
fehlen die Schlitze, die normalerweise beim Aufbringen einer Probe
auf ein Gel verwendet werden. Es ist daher wünschenswert, einen speziell
angepassten Aufbringeinsatz der in 6 gezeigten
Art zu verwenden, wenn eine Probe auf ein Gel aufgebracht wird,
das wie vorstehend beschrieben gebildet wurde. Der Einsatz weist
einen im Wesentlichen rechteckigen Basisabschnitt 61, der
zwei lange Kanten und zwei kurze Kanten aufweist, und eine Vielzahl
von Fingern 62, die sich von einer langen Kante des Basisabschnitts
aus erstrecken, auf. Jeder der Finger hat vorzugsweise eine Breite
von 0,5 bis 3 mm. Die Finger sind in gleichmäßigen Abständen von 2 bis 7 mm in einem Bereich
entlang der langen Kante des Basisabschnitts angeordnet, der an
einem Punkt beginnt und endet, der 2 bis 4 mm von der benachbarten
kurzen Kante des Basisabschnitts entfernt ist, so dass die Finger
in die Mulde passen. Die Finger weisen an ihrem distalen Ende weiterhin
eine Schrägung
von 30 bis 60° auf,
so dass sie zur Schrägung
des Aufbringeinsatzes und der Unterkante des Fensters passen. Der
Einsatz wird in der Mulde angeordnet, die mittels des Gelbildungseinsatzes
ausgebildet wurde, und dann wird eine Probe in die Zwischenräume zwischen
den Fingern eingebracht.
-
Ein zweites, alternatives Verfahren
zum Bereiten eines Mikrogels und zum Aufbringen auf dasselbe erfordert
das Bilden des Mikrogels in der Anwesenheit eines Polymerisationskammeinsatzes,
der eine Reihe von flachen Fortsätzen
aufweist, die Vertiefungen für
das Aufbringen der Probe auf das Gel ausbilden. Der Polymerisationskammeinsatz
ersetzt während
des Mikrogeleinfüll-
und Polymerisationsprozesses den Gelbildungseinsatz. Die Abmessungen
des Polymerisationskammeinsatzes entsprechen dem Gelbildungseinsatz, mit
der Ausnahme, dass anstelle einer flachen Unterkante, die in einem
Winkel von 45° schräg verläuft, um komplementär zu der
Unterkante des Fensters in dem oberen Substrat zu sein, eine Kerbe
von etwa 2 mm Breite und etwa 5 mm Tiefe in Abständen von z. B. 7 mm entlang
der Unterkante angebracht wird. Das Ergebnis ist eine Reihe von
Zähnen,
wobei jeder Zahn eine Unterkante aufweist, die in einem Winkel von
45° schräg verläuft, um
komplementär
zu der Unterkante des Fensters in dem oberen Substrat zu sein. Nach
seiner Anordnung in dem offenen Fenster des Mikrogelhalters kann
der Polymerisationskammeinsatz mittels Klebeband an seinem Platz
gehalten werden, so dass das gesamte Fenster komplett bedeckt ist.
Dann wird in dem Klebeband eine Öffnung
für die
Luftlöcher
angebracht. Anschließend
wird Lösung
in den Mikrogelhalter injiziert. Die Lösung füllt den Mikrogelraum und fließt in die
Zwischenräume
in den Zähnen
des Polymerisationskammes. Überschüssige Lösung tritt
aus den Luftlöchern
aus. Die Lösung
kann dann mittels UV-induzierter Katalyse polymerisiert wer den,
wie in der Erfindung beschrieben. Nach Abschluss der Polymerisation
werden das Klebeband und der Polymerisationskammeinsatz vorsichtig
entfernt, und zurück
bleibt eine Reihe von Gelsäulen,
die senkrecht gegen das untere Substrat angeordnet sind. Die Gelsäulen bewirken
die Definition von Vertiefungen, die verwendet werden können, um
Proben, die mittels der herkömmlichen
Verfahren aufgebracht wurden, zu trennen. Es hat sich gezeigt, dass
Mikrogele verbesserte Aufbringungs- und Verwendungseigenschaften
haben, wenn vor dem Bau des Mikrogelhalters die Gelraumseiten des
oberen Substrats und des unteren Substrats mit Bind Silane (Pharmacia)
behandelt werden.
-
7A und 7B zeigen alternative Ausführungsformen
für Füllstopfen
und Aufbringkämme,
die von Nutzen sind, wenn die Bahntrenner auf dem überstehenden
Abschnitt des unteren Substrats (3)
vorhanden sind. In diesen Fall sind entlang einer Oberfläche der
Einsätze
Kerben 101 ausgebildet, um die Bahntrenner aufzunehmen.
Vorteilhaft sind die Kerben etwas breiter als die Bahntrenner, um
zu gestatten, dass Luft und überschüssiges Gel
während
des Füllprozesses
entweichen.
-
Das obere und das untere Substrat
der erfindungsgemäßen Mikrogele
sind vorzugsweise transparente Glasplatten. Beispielsweise ist 1
mm dickes, wenig fluoreszierendes Glas ein bevorzugtes Material
für die Verwendung
als oberes und unteres Substrat der Erfindung. Borsilikatglas mit
einer Dicke von 1 mm, das eine größere UV-Licht-Durchlässigkeit
aufweist, ist ein anderes bevorzugtes Material. Andere Materialien,
beispielsweise Kunststoffe, können
ebenfalls verwendet werden, unter der Voraussetzung, dass sie nicht
in einem Bereich stark fluoreszieren, der die Erfassung einer lumineszierenden
Markierung auf dem Nukleinsäurepolymer,
das sequenziert wird, behindern oder die Polymerisation des Gels
verhindern würde.
-
Die Abstandhalter 3 in den
erfindungsgemäßen Mikrogelen
dienen zur Schaffung eines Zwischenraumes zwischen dem oberen und
dem unteren Substrat zum Zweck der Herstellung des Gelraumes. Erfindungsgemäß werden
die Abstandhalter vorzugsweise so ausgewählt, dass dieser Zwischenraum
etwa 25 bis 250 μm,
vorzugsweise 25 bis 100 μm,
groß ist.
Kleinere Zwischenräume
sind nicht wirklich praktisch, da dann eine größere Sorgfalt während der
Herstellung erforderlich ist, beispielsweise die Verwendung von
Reinraumverfahren, um zu verhindern, dass Staubpartikel, die bezogen
auf den gewünschten
Zwischenraum groß sein
können,
die Oberfläche
des Substrats kontaminieren. Auch das Ausmaß, in dem beide Substrate flach
sind, gewinnt mit abnehmender Größe der Zwischenräume an Bedeutung.
Schließlich
kann es notwendig sein, die Menge der Probe, die auf das Gel aufgebracht
wird, zu vermindern, um einen Verlust der Auflösungsfähigkeit des Gels zu verhindern,
der bedeutet, dass ein kleineres ausgesandtes Signal von der Probe
zu erfassen ist. Zwischenräume,
die größer sind
als 250 mm, können
verwendet werden, können
jedoch weniger wünschenswert
sein, da der elektrische Widerstand eines Gels jeder gegebenen Zusammensetzung
zunimmt, je größer der
Zwischenraum ist. Das heißt,
dass in einem dickeren Gel für
eine gegebene elektrische Feldstärke
größere Ströme und somit
eine größere widerstandsbedingte
Aufheizung des Gels auftreten. Wird der Abstandhalter durch das
Auftragen von Klebstoff auf ein oder beide Substrate) ausgebildet,
ist es darüber
hinaus notwendig, eine Klebschicht aufzubauen, die im Wesentlichen
die gleiche Dicke aufweist wie der Zwischenraum. Es kann schwierig
sein, einen Klebstoff zu finden, der viskos genug ist, um die Öffnungen
zwischen den Partikeln des Abstandhalters zu überbrücken, nur minimal austritt,
das Niederlassen des Substrats auf die Abstandhalter gestattet und
Leerstellen minimiert, die im Zuge des Aufbringungsprozesses gebildet
werden.
-
Eine Art von Abstandhalter, die bei
der Erfindung von Nutzen ist, ist ein Polymerfilm, der mittels eines Klebstoffes
auf dem oberen oder unteren Substrat angebracht wird. Beispielsweise
kann ein mit einem Acrylatklebstoff beschichteter Vinylfilm auf
die/das gewünschte
Größe und Muster
zugeschnitten werden, um Abstandhalter auszubilden. Geeignete Vinylfilme
sind beispielsweise 1, 2 und 4 Milli-Inch dicke Filme, die von 3 M
unter den Handelsnamen SCOTCHCAL verkauft werden.
-
Abstandhalter können auch durch Siebdrucken
einer Aufschlämmung
von Partikeln in einem härtbaren
Material in dem gewünschten
Muster auf das obere oder das untere Substrat ausgebildet werden.
Beispielsweise ist ein UV-härtbarer
und/oder wärmehärtbarer
Acrylatklebstoff in dem sortierte Silikapartikel, die eine geeignete
Größe zum Definieren
des gewünschten
Zwischenraumes zwischen den Substraten aufweisen, aufgeschlämmt wurden,
ein bevor zugtes Material für
die Verwendung bei der Ausbildung eines Abstandhalters mittels diese
Mechanismus. Geeignete Klebstoffe sind beispielsweise CHIPBONDERTM # 346, 347, 360 und 3603, IMPRUVTM 349, 363, 365 und 366 und General Purpose
Ultraviolet Adhesive 352 von Loctite und der Acrylatklebstoff Minico® M07950-R.
-
Eine Alternative zur Verwendung eines
Klebstoffes ist das Bilden einer Mischung aus pulverisiertem niedrig
schmelzendem Glas und festen Partikeln mit geeigneter Größe, um den
Abstandhalter auszubilden. Dieses Gemisch wird mittels Siebdruck
in dem gewünschten
Muster auf das Substrat aufgebracht, beispielsweise so, dass Bahnen
in dem Gelraum ausgebildet werden, und dann erwärmt, um das pulverisierte niedrig schmelzende
Glas zu schmelzen. Nach dem Abkühlen
erstarrt das niedrig schmelzende Glas wieder und verbindet so die
festen Partikel mit dem Substrat. Zusätzlich kann das niedrig schmelzende
Glas allein oder zusammen mit einem Klebstoff verwendet werden,
um das obere und das untere Substrat miteinander zu verbinden.
-
Vorteilhaft hat das Glaspulver oder
die "Fritte" einen Schmelztemperatur von etwa 400 bis 500°C, während die
Schmelztemperaturen der festen Partikelkügelchen und der Substrate zwischen
600 und 800°C
liegen. Ungeachtet dieses Unterschiedes in der Schmelztemperatur
sollte Sorgfalt darauf verwendet werden, die Wärmeausdehnungskoeffizienten
des Glaspulvers, der Substrate und der festen Partikel aufeinander
abzustimmen, um Brüche
oder Leerstellen infolge des Schrumpfens beim Abkühlen zu
verhindern. Akzeptable Ergebnisse werden erzielt, wenn die Wärmeausdehnungskoeffizienten
der Materialien in einem Bereich von etwa 10% voneinander liegen.
-
Dispersionen von Partikeln in einem
Klebstoff können
auch mit Hilfe einer Roboter-Leimpistole aufgetragen werden, die
den Klebstoff in dem gewünschten
Muster auf das Glassubstrat aufzeichnet. Dies hat gegenüber dem
Siebdrucken den Vorteil, dass das Substrat mit nichts anderem in
Berührung
kommt als dem Klebstoff.
-
Abstandhalter können ausgebildet werden, indem
dieses Verfahren auf einem einzigen Substrat zum Einsatz kommt.
Es wird jedoch bevorzugt, dass zueinander passende Muster sowohl
auf das obere als auch das untere Substrat gedruckt werden, die
dann ausgerichtet und zusammengedrückt werden, um den Abstandhalter
zwischen den beiden Substraten auszubilden. Dieses Verfahren bedingt
zwar die Notwendigkeit einer sorgfältigen Ausrichtung, es hat
sich jedoch gezeigt, dass es den Vorteil hat, die Bildung von Blasen
und Leerstellen in den Abstandhalterlinien zu vermindern, und so
ein einheitlicheres Produkt ergibt.
-
Der Abstand zwischen den beiden Substraten
kann weiterhin durch eine Dispersion fester Kügelchen in dem Gel an sich
definiert und aufrecht erhalten werden. Dies kann erreicht werden,
indem vor der Ausbildung des Gelhalters eine Aufschlämmung von
Kügelchen,
beispielsweise Glaskügelchen,
der geeigneten Größe in einem
flüchtigen
Lösungsmittel
gleichmäßig auf
der Innenfläche
eines der Substrate verteilt wird. Das Lösungsmittel wird verdampft,
und zurück
bleiben die festen Partikel, die auf der Oberfläche des Substrats verteilt
sind.
-
Die erfindungsgemäßen Gele bieten weiterhin den
Vorteil einer hohen Einheitlichkeit von einem Gel zum nächsten.
Dieser Vorteil leitet sich im Prinzip aus der Verwendung sorgfältig kontrollierter
Abstandhalterdicken in einem Massenproduktionsverfahren ab.
-
Erfindungsgemäße Mikrogele können verwendet
werden, um schnell und genau eine Mischung unterschiedlich langer,
fluoreszierend markierter Oligonukleotidfragmente zu analysieren.
Im Wesentlichen beinhaltet dieser Prozess zunächst das Aufbringen der Mischung
auf einen Ursprungsort auf einem erfindungsgemäßen Mikrogel und das Anlegen
eines Potenzials an das Elektrophoresegel, wodurch ein Strom durch
das Elektrophoresegel fließt
und die Oligonukleotidfragmente in der Mischung von dem Ursprungsort
weg und durch einen Überwachungsort
transportiert, der sich entfernt von dem Ursprungsort auf dem Gel
befindet. Dann wird die fluoreszierende Emission von den Oligonukleotiden,
die den Überwachungspunkt
passieren, erfasst.
-
Wie vorstehend angemerkt, können Elektrodenkonfigurationen
zum Anlegen des Potenzials an das Gel verschiedener Art sein. Durch
diese Elektroden wird unter Verwendung einer standardmäßigen Elektrophorese-Stromquelle
ein Feld von bis zu 350 V/cm, vorzugsweise 150–350 V/cm, angelegt. Diese
hohe Feldstärke
bietet den Vorteil, dass die Fragmente rasch durch das Gel wandern,
was zur Folge hat, dass weniger Zeit für die Analyse der Fragmente
notwendig ist. Die schnelle Wanderung vermindert auch den Einfluss
der Diffusion von Fragmenten in dem Gel, was eine bessere Auflösung ergibt.
Feldstärken
dieser Größenordnung sind
in einem Makrogel, d. h. einem Gel mit einer Dicke von 0,35 mm (350
mm) oder mehr, nicht praktikabel, wegen des enormen Stromflusses
und der resultierenden Aufheizung, die auftreten würden.
-
8 zeigt
eine Vorrichtung für
die Verwendung bei der Analyse von Oligonukleotidmischungen. In 8 sendet eine Lichtquelle 41,
beispielsweise ein Argon-Ionenlaser, einen Anregungsstrahl 40 etwa
parallel zur Oberfläche
des Mikrogels 42 aus. Der Anregungsstrahl passiert einen
Strahlausweiter 43 und einen Interferenzfilter 44,
der unerwünschte
Lichtwellenlängen
entfernt, und trifft dann auf einen beugenden Spiegel 45, der
so ausgewählt
ist, dass er Licht mit der Anregungswellenlänge reflektiert, und Licht
mit der Wellenlänge, welche
die fluoreszierende Markierung aussendet, durch ihn hindurch tritt.
Der beugende Spiegel 45 reflektiert den Anregungsstrahl 40 auf
das Mikrogel 42. Passieren fluoreszierend markierte Oligonukleotide
den Strahl, wird Licht in alle Richtungen ausgesandt, einschließlich zurück zu dem
beugenden Spiegel 45. Dieses Licht 46 passiert
den beugenden Spiegel 45, einen Interferenzfilter 47,
der so ausgewählt
ist, dass er die Emissionswellenlänge von Streu- und unspezifischer
Fluoreszenz isoliert, und eine Linse 48, die den Strahl 46 auf einer
Photovervielfacherröhre 49 fokussiert.
-
9 zeigt
eine alternative Vorrichtung für
die Analyse von Oligonukleotidmischungen gemäß der Erfindung. Wie gezeigt,
trifft der Anregungsstrahl 80 von der Lichtquelle 81 in
einem Winkel a, der im Allgemeinen zwischen 45 und 65° beträgt, auf
die Oberfläche
des Mikrogels 82. Licht 86, das in Richtung einer
Photovervielfacherröhre 89 ausgesandt
wird, passiert optional Sammellinsen und Filter (nicht gezeigt).
-
Andere Vorrichtungen und Vorrichtungskonfigurationen
können
ebenfalls verwendet werden. Während
beispielsweise die in 8 und 9 gezeigten Vorrichtungen
Photovervielfacherröhren
als Detektor verwenden, können
auch andere Arten von Detektoren, beispielsweise Photodioden, verwendet
werden. Photodioden können
insbesondere in einer Vorrichtung von Nutzen sein, die eine Anordnung
von Detektoren verwendet, die bezogen auf die erwarteten Bahnen
einer Vielzahl von Proben auf einem einzelnen Gel ausgerichtet sind.
-
Dem Fachmann ist weiterhin klar,
dass die Erfindung nicht auf die Verwendung von Argon-Ionenlasern als
Lichtquelle beschränkt
ist. Der Argon-Ionenlaser
ist günstig,
da seine Emission bei 488 nm wirksam ist, um Fluoreszein anzuregen,
jedoch kann die Verwendung anderer Markierungen mit abweichenden
Absorptionsmaxima für
die Verwendung einer anderen Art von Laser oder für die Verwendung
herkömmlicher
Lichtquellen, beispielsweise Quecksilber- oder Xenonlampen, in Kombination
mit geeigneten Filtern sprechen.
-
Die erfindungsgemäßen Mikrogelhalter können im
Prinzip verwendet werden, um Mikrogele mit Hilfe jeder Art von gelbildendem
Material, einschließlich
Agarosegele, zu bilden. Bevorzugtes Gelmaterial ist jedoch ein Polyacrylamidgel.
Erfindungsgemäße Polyacrylamidmikrogele
können
entweder mit Hilfe eines Katalysators, der eine chemische Vernetzung
bewirkt, beispielsweise TEMED und Ammoniumpersulfat, oder eines photoaktivierten
Vernetzungssystems, beispielsweise Riboflavin und ultraviolettes
Licht oder Methylenblau und blaues (450 nm) Licht, gebildet werden.
-
Werden photopolymerisierte Gele in
Kombination mit lichthärtbarem
Klebstoff verwendet, kann es vorteilhaft sein, das Gel und den Klebstoff
so auszuwählen,
dass die Polymerisationswellenlängen
für die
beiden Systeme verschieden sind. Dies ergibt sich aus der Beobachtung,
dass einige UV-aktivierte Klebstoffe Materialien enthalten, die
das anschließende
Härten
von UV-gehärteten Gelen
auslöschen,
entweder durch Absorption des anregenden Lichts oder durch Auslöschen der
angeregten Zustände
des Gelpolymerisationsinitiators. Durch das Verlagern der Gelpolymerisation
zu einer anderen Wellenlänge
wird dieser Auslöscheffekt vermindert
oder eliminiert.
-
Vor der Verwendung eines Gels für die Analyse
von Oligonukleotidfragmenten kann es wünschenswert sein, bezüglich des
Gels eine Vorlauf durchzuführen,
d. h. ein Potenzialgefälle
mit Laufpuffer anzulegen, jedoch keine Probe aufzubringen. Mit einem
solchen Vorlauf können überschüssige, aus
der Polymerisationsreaktion stammende Reaktanden entfernt werden,
welche die Wanderung oder die Erfassung der Oligonukleotide behindern
könnten.
Da einige in dem Laufpuffer verwendete Bestandteile, vor allem Harnstoff,
dazu tendieren können,
Acrylamidgele abzubauen, kann zusätzlich die Lagerbeständigkeit
des Mikro gels verbessert werden, indem diese Komponenten erst vor
der tatsächlichen
Durchführung
der Analyse eingebracht werden.
-
Der Einsatz der Erfindung wird nunmehr
durch die folgenden, nichtbeschränkenden
Beispiele näher erläutert.
-
BEISPIEL 1
-
Es erfolgte die Bereitung von Gelen
unter Verwendung von 6% Acrylamid (19 : 1 Acrylamid : Bis-acrylamid,
7 M Harnstoff, 0,6 × TBE)
in Gelhaltern aus 1 mm dickem kalandriertem Glas. Die untere Platte
wies eine 50 mm dicke Dichtung auf, welche die Kante der Platte
umgab und eine mittige, 15 mm breite und 75 mm lange Öffnung ausbildete.
In die Öffnung
wurde nichtpolymerisiertes Gel eingebracht, und die obere Platte
darüber angeordnet,
um das Gel in seine gewünschte
Dicke von 50 mm, wie durch den Dichtungsabstandhalter definiert,
zu quetschen. Nach der Polymerisation wurde überschüssiges Gel rund um die Kanten
der Glasplatte abgeschnitten.
-
Es wurde eine Testprobe bereitet,
die eine Mischung von 0,1 ng/ml eines 30-mers mit der Sequenz
und 0,1 ng/ml eines 31-mers
mit der Sequenz
enthielt.
-
Diese Oligonukleotide wurden durch
einen kommerziellen Anbieter speziell hergestellter Oligonukleotide
(Oligos etc.) gemäß den Anweisungen
des Erfinders synthetisiert und an dem 5'-Ende mit Fluoreszein markiert.
-
100 nl der Testprobe (mit einem Gehalt
von ~ 100 Femtomol eines jeden Oligonukleotids) wurde mit Hilfe
einer Kapillare über
die Kante auf die Oberseite des Gels aufgebracht. Dann wurde ein
Feld von 100 V/cm an das Gel angelegt, indem über jedes Ende des polymerisierten
Gels eine Elektrode aus einem 0,25 mm dicken Streifen Indium-Zinn-Oxid
mit einer Größe von 35
mm × 8
mm gelegt wurde und die Elektroden dann an eine Elektrophorese-Stromquelle
angeschlossen wurden. Es wurde ein Argon-Ionenlaser-Erfassungssystem der
in 8 gezeigten Art verwendet,
um den Durchtritt der mit Fluoreszein markierten Oligonukleotide
durch einen Punkt zu erfassen, der 55 bis 65 mm vom Ur sprungsort
entfernt war. Das von der Photovervielfacherröhre erfasste Signal ist in 10 gezeigt. Das Signal wurde
innerhalb einer Laufzeit von 3 Minuten in zwei Höchstwerte aufgelöst, die
dem 30-mer (Höchstwert
A) und dem 31-mer (Höchstwert
B) entsprechen.
-
BEISPIEL 2
-
Es erfolgte die Bereitung einer UV-aktivierten
Klebematrix unter Verwendung des Acrylatklebstoffes Minico® M07950-R
von Emerson & Cuming
Inc., Woburn, MA, gemischt mit 2 Gew.-% Sigma®-Glaskügelchen (106 Mikrometer und
kleiner), die gefiltert wurden, um Kügelchen mit einer Größe von 45
bis 53 Mikrometer zu selektieren. Die Klebematrix wurde durch Siebdrucken
in dem in 3 gezeigten
Muster auf das untere Substrat aufgebracht. Dann wurde das obere
Substrat auf dem unteren Substrat angeordnet, wie in 3 dargestellt. Die Substrate
wurden anschließend
20 Watt starkem UVA-Licht (Wellenlänge 315–385 nm) ausgesetzt, um das
Härten
des Klebstoffs zu initiieren und die beiden Substrate miteinander
zu verbinden.
-
Nach dem Härten des Klebstoffs wurde der
Gelhalter waagerecht in einer rechteckigen Füllvorrichtung der Art angeordnet,
wie sie in der US-Patentanmeldung
Nr. 08/332,892 und der gleichzeitig eingereichten bibliographischen
Kurzbeschreibung (CIP) derselben, die durch Bezugnahme hierin eingeschlossen
werden, beschrieben ist. Kurz gesagt, wurde der Mikrogelhalter waagerecht
in einen vierseitigen Füllrahmen
gelegt und auf dem obersten Einlegeboden eines Füllraumes angeordnet. In dem
Raum wurde eine ein Polyacrylamidgel bildende Lösung in den Gelhalter geleitet,
der dann für
einen Zeitraum, der ausreichte, um das Gel zu polymerisieren, ultraviolettem
Licht von 20 Watt starken UVA-Lampen ausgesetzt wurde, die im Inneren
des Füllraumes
angeordnet waren.
-
Die eingesetzte gelbildende Lösung enthielt
6% Acrylamid (19 : 1 Bis-Acrylamid),
7 M Harnstoff in 0,6 × TBE
und 10 ppm Riboflavin. Die Einbringung des Riboflavins erfolgte
durch die Zugabe von 10 μl
einer 0,4%-igen wässrigen
Riboflavinlösung
zu 25 ml Acrylamidlösung.
-
BEISPIEL 3
-
Eine UV-aktivierte Klebematrix der
Art, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde durch Siebdrucken in
dem in 2 gezeigten Muster
auf das untere Substrat aufgebracht. Es wurde 1 ml einer Aufschlämmung aus
100% Ethanol und 1 Gew.-% Glaskügelchen
(45 bis 53 Mikrometer) auf das untere Substrat aufgebracht und gleichmäßig auf
demselben verteilt. Nach fünf
Minuten bei Raumtemperatur wurde das obere Substrat über dem
unteren Substrat angeordnet, wie in 2 dargestellt,
und die Substrate wurden zusammengedrückt. Anschließend wurden
die Substrate 20 Watt starkem UV-Licht (315–385 nm) ausgesetzt, um das
Härten
des Klebstoffs zu initiieren und die beiden Substrate zwecks Bildung
eines Gelhalters miteinander zu verbinden.
-
Acrylamidlösung wurde in den Mikrogelhalter
injiziert und polymerisiert, wie in Beispiel 2 beschrieben. Durch
die Kraft der Injektion wurde ein Teil der kleinsten Glaskügelchen
ausgewaschen. Diese Kügelchen
ließen
sich vor dem Einsetzen des Aufbringeinsatzes problemlos von der
Oberseite des Gels entfernen.
-
BEISPIEL 4
-
Es erfolgte die Bereitung eines Mikrogels
wie in Beispiel 2, unter Verwendung der Einsatzplatte während der
Polymerisation des Mikrogels. Die Einsatzplatte wurde vorsichtig
entfernt und durch den Aufbringeinsatz ersetzt. Der Mikrogelhalter
wurde senkrecht in einer Elektrophoresevorrichtung angeordnet. Mit
einer Pipette wurden 3 μl
einer vorbereiteten Lösung,
welche die Produkte einer vollständigen,
mit Fluoreszein markierten ddT-DNA-Sequenzierungsreaktion von DNA
der Schablone M13 enthielt, zusammen mit Methylenblau und Xylencyanol
als zusätzlichen
optischen Trennungsmarkierern in eine Einbringvertiefung eingebracht.
-
Durch Abdichten des Mikrogelfensters
gegenüber
einem TBE-Vorratsbehälter, der
eine Platinelektrode enthielt, wurde eine TBE-Lösungs-Elektrode gebildet. Die "Unterseite"
des Mikrogels wurde in einen TBE-Vorratsbehälter getaucht,
der eine Platinelektrode enthielt. Die Rückseite des Mikrogelhalters
wurde mittels Vakuumansaugung an einer Aluminiumplatte befestigt,
um während
der Elektrophorese Wärme
abzuleiten. Zwischen den bei den Elektroden wurde ein elektrisches
Potenzial angelegt und so ein elektrisches Feld von 300 V/cm durch
das Mikrogel hindurch erzeugt.
-
Unter dem Einfluss der elektromotorischen
Kraft, wanderten DNA-Fragmente
durch das Mikrogel und durch die Erfassungszone. Es wurde ein Argon-Ionenlaser-Erfassungssystem
der in 8 gezeigten Art
verwendet, um den Durchtritt der mit Fluoreszein markierten Fragmente
durch einen Punkt zu erfassen, der 100 mm vom Ursprungsort entfernt
war. Das durch die Photovervielfacherröhre von den ddT-Reaktionen
in Abhängigkeit
von der Zeit erfasste Signal ist in 11A–11F dargestellt. Wie in 11A–11F zu sehen ist, werden ddT-Extensionsprodukte
von 1 Nukleotid über
den Primer hinaus 4,9 Minuten nach dem Beginn der Elektrophorese
beobachtet. Fragmente von mindestens 300 Nukleotiden können innerhalb
von 13,8 Minuten nach dem Beginn der Elektrophorese klar aufgelöst werden.
-
BEISPIEL 5
-
Es erfolgt die Bildung eines Mikrogels
wie in Beispiel 2, mit der Ausnahme, dass anstelle von Riboflavin
ein Methylenblau-Initiatorsystem verwendet wird. Dieses Initiatorsystem
besteht aus 100 μM
Methylenblau, 1 mM Natriumtoluensulfinat und 50 μM Diphenyliodoniumchlorid. Das
Gel wird mit Hilfe einer Quelle blauen (450 nm) Lichts, beispielsweise
einer Quarzhalogenlampe, polymerisiert.
-
BEISPIEL 6
-
Es erfolgt die Bereitung einer durch
Siebdrucken aufbringbaren niedrig schmelzenden Glaszusammensetzung
durch Kombinieren des Glases Nr. 7570, bezogen von der Ferro Corporation
(Cleveland, Ohio), mit einem Bindemittel, identifiziert als Produkt
Nr. 80 863 und verkauft von der Cerdec Corporation (Frankfurt, Deutschland),
in einem Verhältnis
von 10 : 3 oder 1 : 1, und 1 bis 10 Gew.-% fester Partikel in Form
von Glaskügelchen,
die wie in Beispiel 2 bereitet wurden. Das Glas Nr. 7570 hat eine
Teilchengröße D50 von 30,99 Mikrometern, einen Wärmeausdehnungskoeffizienten
(25–260°C) von 82,6 × 10–7/°C, eine Dichte
von 5,36 g/cm3 und einen Erweichungspunkt
von 449°C.
Das Produkt Nr. 80 683 ist ein wasserlösliches Bindemittel, der üblicherweise
für das
Aufbringen von Glasuren auf Porzellan oder Keramik verwendet wird.
Andere Pro dukte, die in dieser Eigenschaft verwendet werden können, sind
beispielsweise METHOCEL-Bindemittel von Dow Chemical.
-
Nach dem Vermischen der drei Komponenten
der Paste wird die Paste durch Siebdrucken in dem gewünschten
Muster, beispielsweise den in 2 oder 3 gezeigten Mustern, auf
eine Glassubstratplatte aufgebracht. Anschließend wird das Substrat 10 Minuten
lang auf 125°C
und 10 Minuten lang auf 320°C
erhitzt, um die Paste für
das dichte Verbinden vorzubereiten. Zum Zweck des dichten Verbindens
wird die Platte 25 Minuten lang in einen 450°C heißen Ofen eingebracht, um das
Glaspulver vorzuschmelzen. Dann wird auf der Oberseite der ersten
Platte eine zweite Substratplatte angeordnet, so dass das vorgeschmolzene
Material zwischen beiden angeordnet ist. Das Ganze wird dann weitere
25 Minuten lang in einen 470°C
heißen
Ofen eingebracht, wodurch eine endgültige Verbindung der Platten
bewirkt wird. Um die Gleichmäßigkeit
des Zwischenraumes zwischen den Platten sicherzustellen, wird auf
die Außenseiten
der Platten Druck ausgeübt.
Dieser Druck kann durch Klammern, durch das Anordnen eines Gewichts
auf dem obersten Substrat oder mit Hilfe eines luftgetriebenen,
von oben einwirkenden Kolbens nach unten auf die Substrate ausgeübt werden.
-
-
-
enthielt.
