DE4313367A1 - Elektrophoresegerät - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Elektrophoresegerät zum Trennen und Messen einer Nukleinsäure, eines Proteins oder eines Zuckers, das insbesondere zum Erfassen von DNS (Nukleinsäu­ re) und ähnlicher Substanzen geeignet ist.

Ein Elektrophoresegerät, das Elektrophorese für molekularge­ wichtsmäßige Trennung und zur Analyse von mit Fluoreszenz­ stoffen markierten Proben nutzt, ist z. B. ein Bestimmungs­ system für eine DNS-Basensequenz, das Fluoreszenzstoffe als Markierungen verwendet, wobei die Bestimmung der Basense­ quenz vom wohlbekannten Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren abhängt, wie es von Sanger und seinem Kollegen erfunden wur­ de, und die molekulargewichtsmäßige Trennung erfolgt durch ein Elektrophoreseverfahren unter Verwendung von Polyacryl­ amidgel. Normalerweise wird die Elektrophorese mit einem auf einer zwischen zwei Glasplatten angeordneten Platte vorhan­ denen Polyacrylamidgel ausgeführt. In den letzten Jahren wurde ein Kapillar-Gelelektrophoreseverfahren entwickelt, bei dem Gel in der Kapillare ausgebildet wird. Beim Kapil­ lar-Gelelektrophoreseverfahren ist der Kapillardurchmesser im allgemeinen sehr klein, und die Fläche pro Volumen des Gels ist groß; dieses Merkmal erleichtert die Abfuhr Joule­ scher Wärme und ermöglicht das Anlegen einer hohen Spannung und damit das Erzielen sehr schneller Trennung.

Das erste Beispiel eines Kapillar-Gelelektrophoreseverfah­ rens ist in Nucleic Acid Research, Bd. 18, S. 1415 bis 1419 (1990) beschrieben, das sehr schnelle und hochqualitative Trennung von DNS-Fragmenten und Verwendung einer Kapillare mit einem Innendurchmesser von 75 µm und einer Hochspannung von 9 kV vorstellt, wie dies in Fig. 13 dargestellt ist.

Beim Detektor gemäß diesem Verfahren sind die Kapillarachse und die Laserlichtachse in vertikaler Richtung um etwa 25° verdreht, und das auf einen Durchmesser von 20 µm gebündelte Laserlicht wird in der Mitte der Kapillare eingestrahlt. Dann wird die sich ergebende Fluoreszenzstrahlung durch Spektralanalyse mit einem Bandpaß-Interferenzfilter oder einer ähnlichen Vorrichtung ermittelt. Fig. 13 ist eine ver­ einfachte Darstellung dieses herkömmlichen Beispiels des oben angegebenen Gerätes, um das Verständnis für dieses zu erleichtern.

Ein zweites Beispiel aus dem Stand der Technik ist in Jour­ nal of Chromatography, Bd. 516, S. 61-67 (1990) beschrie­ ben. Dieses verwendet ein Kapillar-Gelelektrophoreseverfah­ ren für die Bestimmung einer DNS-Basensequenz. Dieses Ver­ fahren verwendet eine Kapillare mit einem Innendurchmesser von 50 µm für molekulargewichtsmäßige Trennung von DNS-Frag­ menten. Das bei diesem Beispiel verwendete Meßinstrument ist im wesentlichen dasjenige, wie es in Science, Bd. 242, S. 562-564 (1988) beschrieben ist. Zum Vereinfachen der in Science vorgestellten Vorrichtung zeigt Fig. 14 eine mit einer Laserstrahlquelle und einer Ummantelungsströmungspumpe versehene Vorrichtung, wie beschrieben.

Zum Erfassen von DNS-Fragmenten wird die abgetrennte Flüs­ sigkeit nach der molekulargewichtsmäßigen Trennung in eine Quarzströmungskammer (Innenabmessung: 250×250 µm) einge­ leitet, und es wird mit Hilfe einer Pumpe für Flüssigphasen­ chromatographie dafür gesorgt, daß ein TRIS-Borat-Puffer mit EDTA als Ummantelungslösung durchströmt, wobei die Pumpe den Zustand für eine Ummantelungslösung schafft. Dann wird auf einen Durchmesser von etwa 10 µm gebündeltes Laserlicht in die beinahe durch die Mitte der Strömungskammer fließende, abgetrennte Flüssigkeit eingestrahlt, wodurch die von den DNS-Fragmenten herrührende Fluoreszenzstrahlung mit Hilfe eines Spektralfilters gemessen wird.

Ein drittes Ausführungsbeispiel der Verwendung eines Wande­ rungspfades zur Bestimmung einer Basensequenz ist in Nature, Bd. 321, S. 674-679 (1986) und an anderen Stellen be­ schrieben. Wie angegeben, wird jede Art der endständigen Base von DNS-Fragmenten durch Fluoreszenzstoffe mit vier verschiedenen Arten für die Wellenlängen maximaler Fluores­ zenzemission markiert (Fluoreszin, 4-Chloro-7-Nitrobenzo- 2oxa-1-Diazol (NBD) und Tetramethylrhodamin, Texasrot (Han­ delsbezeichnung von Molecular Probes, Inc.)). Ein Laser wird dazu verwendet, die Fragmente anzuregen, die in der Rangord­ nung ihrer Molekulargewichte wandern, und jede Fluoreszenz­ strahlung wird durch vier Arten von Bandpaß-Interferenzfil­ tern abgetrennt, um Fluoreszenzstrahlungserfassung und Ba­ sensequenzbestimmung auszuführen.

Beim Kapillarelektrophoreseverfahren ist höhere Empfindlich­ keit gefordert, um die Größe der Proben verringern zu kön­ nen. Die Verarbeitungsmöglichkeiten sollen verbessert wer­ den, und es soll eine größere Anzahl von Proben gleichzeitig bearbeitet werden können. Bei der Fluoreszenzstrahlungsmes­ sung bei Elektrophorese wird Hintergrundlicht zusätzlich zur Fluoreszenzstrahlung eines jeweiligen Fluoreszenzstoffes selbst emittiert, mit Streulicht und Fluoreszenzstrahlung des Anregungslichts (Rayleigh-Streuung) durch das Gel, ge­ streutem Licht vom Gelträger, d. h. von der Innen- und der Außenwand der Kapillare, oder Fluoreszenzstrahlung von der Kapillare selbst, was zu einem erhöhten Wert des Hinter­ grundlichts und verringerter Meßempfindlichkeit führt. Eine der Hauptschwierigkeiten zum Erzielen hochempfindlicher Fluoreszenzstrahlungserfassung ist die Frage, wie solches Hintergrundlicht ausgeschaltet werden kann.

Eine Verbesserung der Verarbeitungsfähigkeit erfordert ein Erhöhen der Wanderungsgeschwindigkeit oder Erfassung durch gleichzeitiges Wandern zweier oder noch mehr Proben durch die Kapillare, die einen Wanderungspfad darstellt. Die Lö­ sung dieses Problems ist sehr wichtig.

Das erste Beispiel aus dem Stand der Technik gewährleistet eine höhere Empfindlichkeit der Fluoreszenzstrahlungserfas­ sung durch zwei Maßnahmen:

• 1) Das Anregungslicht (Streulicht) wird durch das Bandpaß- Interferenzfilter abgeschnitten, wodurch die Fluoreszenzkom­ ponente abgetrennt und erfaßt wird; und
• 2) die Kapillarachse wird um 25° gegenüber einer Position rechtwinklig zur Ebene mit der Laserstrahlachse und der Fluoreszenzstrahlungs-Bündelungsachse verdreht.

Jedoch kann die erste Maßnahme wegen der einem Interferenz­ filter eigenen Wirkung gestreutes Licht nicht auf einfache Weise ganz ausschließen. Ferner kann vom Gel und dem Glas­ rohr selbst eine schwache Fluoreszenzstrahlung ausgehen, welche Art der Hintergrundbeleuchtung durch das Bandpaß-In­ terferenzfilter nicht völlig beseitigt werden kann. Die letztere Maßnahme ist eine wirkungsvolle Vorgehensweise, die durch das Verdrehen der Kapillare den Anteil des gestreuten Lichts verringert, der in die Fluoreszenzstrahlungs-Konden­ sorlinse eintritt; jedoch weist die Kapillare kreisförmigen Querschnitt mit kleinem Durchmesser auf, was zu starker In­ tensität des Streulichts führt. Das Streulicht wird mehr oder weniger in allen Richtungen abgestrahlt, und eine Ver­ ringerung der Fluoreszenzstrahlung vom Gel und dem Glasrohr kann durch Verdrehen der Kapillare nicht erzielt werden. Diese Maßnahme ist ebenfalls nicht dazu in der Lage, Hinter­ grundsignale ausreichend zu beseitigen. Aus der vorstehenden Diskussion ist ersichtlich, daß der Stand der Technik Hin­ tergrundbeleuchtung nicht ausreichend beseitigen kann, wo­ durch hochempfindliche Fluoreszenzstrahlungsmessung nicht möglich ist.

Diese Beispiele aus dem Stand der Technik verwenden nur eine Kapillare, und gleichzeitige Verarbeitung für zwei oder mehr Proben wird nicht beschrieben oder auch nur vorgeschlagen. Es könnte daran gedacht werden, daß einfach zwei oder mehr Vorrichtungen verwendet werden, wie sie in Fig. 13 darge­ stellt sind. Dies erfordert jedoch zwei oder mehr Laserquel­ len, Detektoren und optische Teile, und die gesamte Vorrich­ tung wird sehr teuer; es handelt sich um keine realistische Lösung für das Problem.

Es wäre auch möglich, zwei oder mehr Kapillaren anzuordnen, die alle von einem einzigen Laserstrahl beleuchtet werden. Wenn jedoch das Laserlicht auf die Kapillaren strahlt, wird das Licht an der Grenze zum kreisförmigen Querschnitt der Kapillare gebeugt und gestreut, und Licht, das durch die Kapillaren läuft, wird über einen übermäßig großen Bereich gestreut; daher ist dieses Konzept nicht realistisch. Anders gesagt, bestehen keine Schwierigkeiten, wenn nur eine Kapil­ lare vorhanden ist. Wenn zwei oder mehr Kapillaren konti­ nuierlich beleuchtet werden, wird die Intensität des Lichts, das in die nächste Kapillare strahlt, bei jedem Durchtritt durch eine Kapillare extrem verringert, was zu einem Fehl­ schlag bei der Erfassung der Fluoreszenzstrahlung führt.

Die obige Diskussion zeigt, daß viele Probleme der Beispiele aus dem Stand der Technik auftreten, wenn zum Verbessern der Verarbeitungskapazität versucht wird, eine Bearbeitung von zwei oder mehr Proben gleichzeitig durchzuführen.

Das zweite Beispiel aus dem Stand der Technik ist ein Kapil­ lar-Gelelektrophoreseverfahren, das für wirkungsvolle Besei­ tigung des durch die Kapillare und das Gel gestreuten Lichts sorgt. Das Ende des Kapillargels wird als Probeneinlaß für die Ummantelungsströmungskammer verwendet, und die Proben­ flüssigkeit wird aus dem Kapillargel so herausgeführt, daß die Fluoreszenz im Zustand einer Ummantelungsströmung gemes­ sen wird. Dies beseitigt gestreutes Licht an der Grenze zur Kapillare sowie Streulicht und Fluoreszenzstrahlung vom Gel. Die Probenflüssigkeit strömt beinahe in der Mitte der Umman­ telungsströmungskammer mit laminarer Strömung, ohne daß sie die Innenseite der Ummantelungsströmungskammer berührt. Dies sorgt für eine räumliche Trennung zwischen dem Streulicht von der Ummantelungsströmungskammer und der Fluoreszenz­ strahlung von der Probe, was hochempfindliche Messung der Fluoreszenzstrahlungsintensität gewährleistet. Um die Umman­ telungsströmung zu schaffen, ist es jedoch erforderlich, eine TRIS-Borat-Pufferlösung als Ummantelungslösung dauernd durch eine Pumpe für Flüssigphasenchromatographie mit vorge­ gebener Strömungsgeschwindigkeit in die Ummantelungsströ­ mungskammer zu pumpen. Dieses Verfahren hat Schwierigkeiten wegen einer sehr teuren Ausrüstung und einer komplizierten Struktur. Ferner ist die Ummantelungsströmungskammer kompli­ ziert aufgebaut, mit einem großen Durchmesser des Einlasses für die Ummantelungslösung und kleiner Größe für den Fluo­ reszenzstrahlungsdetektor, bei dem es sich um einen Umman­ telungsströmungsbereich handelt. Dies macht die Herstellung der Ummantelungsströmungskammer schwierig und teuer. Beim vorliegenden Beispiel aus dem Stand der Technik wird, wie beim ersten Beispiel, nichts über gleichzeitige Verarbeitung von zwei oder mehr Proben beschrieben oder vorgeschlagen. Die Verwendung von zwei oder mehr Vorrichtungen, wie sie in Fig. 14 dargestellt sind, erfordern größere Abmessungen des Gerätes und höhere Kosten. Dies stellt keine realistische Lösung des Problems dar.

Es ist auch möglich, zwei oder mehr Ummantelungsströmungs­ kammern anzuordnen, wobei jede mit einer Kapillare versehen ist und mit einem gesonderten Laserstrahl zu beleuchten ist. Das Laserlicht strahlt nicht direkt auf die Kapillare, so daß das Licht in diesem Fall weder gebeugt noch gestreut wird. Da jedoch eine Ummantelungsströmungskammer für jede Kapillare vorhanden ist, ist es schwierig, den Raum zwischen den Kapillaren zu verringern, was zu erhöhter Größe der Um­ mantelungsströmungskammer führt. Die Verwendung von zwei oder mehr Ummantelungsströmungskammern erhöht die Kosten. Ferner führt ein Beleuchten aller Probenflüssigkeiten, die in zwei oder mehr Ummantelungsströmungskammern fließen, un­ ter gleichen Bedingungen zu einem Fehlschlag hinsichtlich eines Bündelns des Laserstrahls. Dies, weil die Trenntiefe des Laserlichts mit der Bestrahlungsfleckgröße verknüpft ist; verringerte Fleckgröße bedeutet kürzere Trenntiefe, je­ doch ist der Raum zwischen den Bündeln der in die Ummante­ lungsströmungskammer fließenden Probenflüssigkeiten größer.

Die obige Diskussion zeigt, daß viele Schwierigkeiten vor­ handen sind, wenn die Beispiele aus dem Stand der Technik auf die gleichzeitige Verarbeitung zweier oder mehrerer Pro­ ben angewendet werden, um die Verarbeitungskapazitäten zu erhöhen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Elektrophore­ segerät anzugeben, das hochempfindliche und einfache Fluo­ reszenzstrahlungsmessung oder Lichtabsorptionsmessung von durch Elektrophorese getrennten Proben gewährleistet und das gleichzeitige Verarbeitung von zwei oder mehr Proben er­ leichtert.

Zum Lösen dieser Aufgabe wird für ein Elektrophoresegerät, bei dem ein Probentrennbereich, der zwischen einem Gefäß für eine Kathodenelektrode und einem Gefäß für eine Anodenelek­ trode vorhanden ist, welchen Elektroden Spannung von einer Spannungsversorgung zugeführt wird, einen Wanderungspfad mit einem Paar Kapillaren bildet, der folgende Aufbau vorge­ schlagen:

• 1) Die Enden eines Paars Kapillaren oder von zwei oder mehr Paaren von Kapillaren werden mit dem Gefäß für die Kathoden­ elektrode bzw. dem Gefäß für die Anodenelektrode verbunden, und die anderen Enden werden unter Einhaltung eines vorgege­ benen Spaltes festgehalten, wobei ihre Achsen im wesentli­ chen aufeinander ausgerichtet sind, und sie sind einander gegenüberstehend in einer optischen Zelle angeordnet, um einen durch dieselbe gehenden Wanderungspfad zu bilden; dann wird Ummantelungslösung von außen in die optische Zelle ein­ gefüllt, und jede Probe, die vom Ende jeder stromaufwärtigen Kapillare eines Wanderungspfades ausgeht, d. h. vom Proben­ trennbereich, wird in den Zustand einer Ummantelungsströmung versetzt; dann wird sie in die gegenüberstehende Kapillare eingeleitet; während der Spalt als optischer Erfassungsab­ schnitt verwendet wird, wird in diesen Licht von einer Lichtquelle eingestrahlt, wodurch die Proben erfaßt werden.

Oder es wird wie folgt vorgegangen:

• 2) Die Enden von zwei oder mehr Kapillaren enden in einer optischen Zelle, während die anderen Enden in Elektrodenge­ fäße eingetaucht sind, und Ummantelungslösung wird von außen in die optische Zelle eingeleitet, um dafür zu sorgen, daß die in jede Kapillare wandernden Proben im Zustand einer Um­ mantelungsströmung in die optische Zelle strömen; während der Spalt als optischer Erfassungsabschnittsbereich verwen­ det wird, wird Licht von einer Lichtquelle in denselben ein­ gestrahlt, wodurch die Proben erfaßt werden.

Beim Aufbau (1) sind zwei oder mehr Erfassungsabschnitte, die durch zwei oder mehr Paare von Kapillaren gebildet wer­ den, in der optischen Zelle angeordnet. Ferner sind zwei oder mehr Paare von Kapillaren so in der optischen Zelle an­ geordnet, daß die zwei oder mehr durch diese zwei oder mehr Paare von Kapillaren ausgebildeten Erfassungsabschnitte in einer geraden Linie angeordnet sind; das Anregungslicht wird entlang dieser geraden Linie eingestrahlt, damit alle opti­ schen Erfassungsabschnitte gleichzeitig beleuchtet werden, wodurch gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenzstrahlung in den zwei oder mehr optischen Erfassungsabschnitten gewähr­ leistet wird.

Beim Aufbau (2) sind die zwei oder mehr Kapillaren so in der optischen Zelle angeordnet, daß zwei oder mehr durch die zwei oder mehr Paare von Kapillaren gebildete Erfassungsab­ schnitte in der optischen Zelle angeordnet sind, und das An­ regungslicht wird entlang einer geraden Linie eingestrahlt, so daß die optischen Erfassungsabschnitte gleichzeitig be­ leuchtet werden, was gleichzeitige Erfassung der von den Proben abgestrahlten Fluoreszenzstrahlung gewährleistet.

Bei den Anordnungen (1) und (2) ist auch die folgende Anord­ nung möglich. Der Probentrennbereich besteht aus einem Ka­ pillargel, und die Ummantelungslösung weist entsprechende Komponenten wie die Pufferlösung in den Kapillaren auf. Ein Denaturierungsmittel für die Probe kann, falls erforderlich, vorhanden sein. Das Niveau für die Ummantelungslösung ist höher eingestellt als das Flüssigkeitsniveau im unteren Elektrodengefäß, und es wird dafür gesorgt, daß die Ummante­ lungsflüssigkeit aufgrund dieses Überstands der zwei Flüs­ sigkeiten strömt. Im Erfassungsabschnitt wird die von den Proben emittierte Fluoreszenzstrahlung oder die Lichtabsorp­ tion durch die Proben gemessen.

Um die genannte Aufgabe zu lösen, wird auch der folgende Aufbau (3) angegeben, wenn bei einem Elektrophoresegerät Proben einer molekulargewichtsmäßigen Trennung durch Elek­ trophorese unterzogen werden, die z. B. mit einem Fluores­ zenzstoff markierte Nukleinsäurefragmente enthalten, wobei eine optische Erfassung und Analyse der der molekularge­ wichtsmäßigen Trennung unterzogenen Proben erfolgt: Der Wan­ derungspfad besteht aus dem mit Gel gefüllten Molekularge­ wicht-Trennbereich und dem mit dem Elektrolyten gefüllten optischen Erfassungsabschnitt.

Der Molekulargewicht-Trennbereich besteht vorzugsweise aus dem Kapillargel. Der mit dem Elektrolyten aufgefüllte opti­ sche Erfassungsabschnitt kann dadurch ausgebildet werden, daß zwei Kapillaren in einer geraden Linie angeordnet wer­ den, wobei ihre Achsen im wesentlichen miteinander überein­ stimmen und wobei die einander gegenüberstehenden Enden der Kapillaren in engen Kontakt miteinander gebracht werden, wo­ bei jedoch ein vorgegebener Spalt in axialer Richtung der Kapillaren eingehalten wird. In diesem Fall bildet minde­ stens eine der auf der stromaufwärtigen Seite des Wande­ rungspfades angeordnete Kapillare einen Molekulargewicht- Trennbereich, während der Spalt als optischer Erfassungsab­ schnitt dient, in dem die Fluoreszenzstrahlung oder die Lichtabsorption von Proben gemessen wird.

Ferner ist der Aufbau so beschaffen, daß ein Spalt von 1 mm Weite oder weniger eingehalten wird. Dieser Spalt ist vor­ zugsweise in einer optischen Zelle vorhanden, die eine grö­ ßere Innenabmessung aufweist, als es der Innenabmessung des Wanderungspfades entspricht. Es ist auch möglich, einen sol­ chen Aufbau zu entwerfen, bei dem die optischen Erfassungs­ abschnitte miteinander über den Elektrolyten verbunden sind.

Ferner ist es möglich, einen Aufbau zu erstellen, bei dem zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitte mit zwei oder mehr Kapillaren in einer Reihe angeordnet sind und ein ein­ zelner Anregungslichtstrahl in Richtung der Reihe einge­ strahlt wird, um gleichzeitige Beleuchtung der zwei oder mehr optischen Erfassungsabschnitte zu ermöglichen, was für gleichzeitige Fluoreszenzstrahlungserfassung sorgt.

Da beim Aufbau (1) eines Elektrophoresegerätes die Enden eines Paars oder mehrerer Paare von Kapillaren mit den Gefä­ ßen für die Kathodenelektrode bzw. die Anodenelektrode ver­ bunden sind, während die anderen Enden einander mit einem vorgegebenen Spalt gegenüberstehen, wobei ihre Achsen im wesentlichen zusammenfallen und sie einander in der opti­ schen Zelle gegenüberstehen, ist die Ausbildung eines Wan­ derungspfades möglich, der durch die optische Zelle geht. Da der optischen Zelle Ummantelungslösung von außen zugeführt wird, kann die vom Kapillarende des stromaufwärtigen Wande­ rungspfades ausgehend wandernde Probe, d. h. die im Proben­ trennbereich wandernde Probe, in einen Zustand einer Umman­ telungsströmung versetzt werden und dann in die Kapillaren geleitet werden. So können die Proben sowohl in den strom­ aufwärtigen als auch in den stromabwärtigen Kapillaren dau­ ernd wandern, was eine Wanderung der Proben nur zum Spalt auf der Achse zwischen der stromaufwärtigen und der strom­ abwärtigen Kapillare sicherstellt. Dieser Spalt wird als Erfassungsabschnitt verwendet, und das Einstrahlen im opti­ schen Erfassungsabschnitt von der Lichtquelle kann in der Flüssigkeit ohne Kapillare vorgenommen werden, was optische Erfassung von Fluoreszenzstrahlung oder von Lichtabsorption ermöglicht. Dies gewährleistet eine hochempfindliche Erfas­ sung von Fluoreszenzstrahlung oder Lichtabsorption, während das Auftreten von Streulicht und von Fluoreszenzstrahlung durch Kapillaren oder durch Kapillargel verhindert wird.

So werden zwei oder mehr Kapillaren unter Einhaltung eines vorgegebenen Spaltes in einer optischen Zelle gehalten, wo­ bei ihre Achsen im wesentlichen miteinander übereinstimmen. Dadurch können stromaufwärtige Kapillaren, die Probentrenn­ bereiche darstellen, und Spalte, die optische Erfassungsab­ schnitte darstellen, leicht ausgebildet werden. Der Proben­ wanderungspfad kann dadurch genau festgelegt werden, daß ein Paar Kapillaren stromabwärts angeordnet wird, was sowohl die Beleuchtung durch eine Lichtquelle gewährleistet und er­ leichtert als auch den Empfang von Licht, wie von Fluores­ zenzstrahlung gewährleistet und vereinfacht. Darüber hinaus treten Ummantelungsflüssigkeit und die Proben nur durch das Innere der Kapillare aus der optischen Zelle aus. Da die Kapillare einen kleinen Durchmesser aufweist, ist es mög­ lich, die Strömungsgeschwindigkeit der in die optische Zelle eingeleiteten Ummantelungslösung zu erniedrigen, was einen bedeutenden Beitrag zum Einsparen von Ummantelungslösung darstellt. Die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungslö­ sung hängt vom Innendurchmesser der Kapillare, nicht von den Abmessungen der optischen Zelle, ab. Dieses Merkmal besei­ tigt das Erfordernis eines Erhöhens des Querschnitts des Einlasses für die Ummantelungslösung, um die optische Zelle so auszubilden, daß der Querschnitt des Strömungsbereichs für die Ummantelungslösung verringert wird, wie im Fall einer gewöhnlichen Ummantelungsströmungskammer. Es erlaubt die Verwendung einer quaderförmigen optischen Zelle und da­ mit eine einfache und wirtschaftliche Herstellung derselben. So können zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitte, die durch zwei oder mehr Paare von Kapillaren gebildet werden, in der optischen Zelle dicht beieinander angeordnet werden, das die Größe des Systems wesentlich verringert.

Die optische Zelle und eine Leitung, die die Ummantelungs­ strömung erzeugt, sind ausreichend; dies gewährleistet einen einfachen und wirtschaftlichen Aufbau des Systems. Darüber hinaus werden von den Kapillaren ausgehend wandernde Proben für jede Kapillare in den Zustand der Ummantelungsströmung versetzt, wenn sie durch den optischen Erfassungsabschnitt laufen, und die Ummantelungsströmungen unterliegen alle den­ selben Bedingungen. Ummantelungsströmungsbedingungen, wie die Strömungsgeschwindigkeit, werden für jede Kapillare gleich eingestellt, was die optische Erfassungsgenauigkeit verbessert. Das Innere der optischen Zelle weist einen gro­ ßen Querschnitt auf, da sie zwei oder mehr Paare von Kapil­ laren enthält. Jedoch strömt die Ummantelungslösung aus den Kapillaren an der stromabwärtigen Seite aus. Demgemäß ent­ spricht der effektive Querschnitt für die Strömung der Um­ mantelungslösung der Summe der Innendurchmesser der Kapilla­ ren; er ist gegenüber dem Querschnitt der optischen Zelle selbst sehr klein. Daher kann die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungslösung verringert werden, was einen Beitrag zur Verringerung des Volumens derselben und zur Größe des Systems leistet.

Zwei oder mehr Kapillaren sind so angeordnet, daß zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitte in einer geraden Linie in einer optischen Zelle angeordnet sind, und Anregungslicht wird entlang dieser geraden Linie eingestrahlt, so daß alle optischen Erfassungsabschnitte gleichzeitig beleuchtet wer­ den, was gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenz durch die zwei oder mehr optischen Erfassungsabschnitte gewährleistet. Ferner sind zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitte mit­ einander über Flüssigkeit verbunden, so daß jeder Erfas­ sungsabschnitt beleuchtet werden kann, ohne daß das Anre­ gungslicht durch Streulicht von den Kapillaren beeinflußt wird. Dieses Merkmal sorgt für wirkungsvolles Einleiten des Streulichts in die Erfassungsabschnitte, was eine hochgenaue Messung der Fluoreszenzstrahlung ermöglicht. Wenn eine zwei­ dimensionale TV-Kamera als Lichterfassungsabschnitt verwen­ det wird, können die Fluoreszenzbilder von zwei oder mehr Erfassungsabschnitten gleichzeitig gemessen werden. Zwei oder mehr Paare von Kapillaren sind in einer optischen Zelle so angeordnet, daß zwei oder mehr optische Erfassungsab­ schnitte in einer geraden Linie liegen, und die zwei oder mehr Paare von Kapillaren können in dichten Kontakt zueinan­ der gebracht werden. Diese Anordnung verringert nicht nur die Größe und den Preis des Systems, sondern verkürzt auch den Abstand zwischen den optischen Erfassungsabschnitten, die an den Enden entlang der geraden Linie liegen. Ein ver­ ringerter Abstand zwischen den optischen Erfassungsabschnit­ ten an den Enden führt dazu, daß alle optischen Erfassungs­ abschnitte im wesentlichen mit demselben Lichtstrahl be­ leuchtet werden, selbst wenn das Anregungslicht durch eine Linse oder dergleichen gebündelt wird. Wenn z. B. das Laser­ licht brennweitenmäßig auf 100 µm gebündelt wird, beträgt der Durchmesser des Laserlichts ungefähr 100 µm im Bereich von 10 mm an der Vorderseite und der Hinterseite des Brenn­ bereichs. Wenn Kapillaren mit einem Außendurchmesser von 200 µm und einem Innendurchmesser von 10 µm mit Abständen von 400 µm angeordnet werden, können etwa 50 Kapillaren im Bereich von etwa 10 mm zwischen der Vorder- und der Hinter­ seite des Brennbereichs angeordnet werden, und sie können mit einem Lichtstrahl mit im wesentlichen konstantem Durch­ messer und konstanter Intensität beleuchtet werden. Dies er­ laubt es, daß die optischen Erfassungsabschnitte mit gebün­ deltem Anregungslicht beleuchtet werden können, was die Fluoreszenzintensität erhöht, wodurch hochempfindliche Mes­ sung der Probe gewährleistet wird.

Darüber hinaus wird einfache molekulargewichtsmäßige Tren­ nung durch den aus dem Kapillargel bestehenden Probentren­ nungsbereich gewährleistet. Es ist auch möglich, die strom­ abwärtigen Kapillaren hohl auszubilden, was wirkungsvolles Durchströmen der Ummantelungslösung erlaubt. Statt der Ka­ pillaren kann strömabwärtig auch eine Einrichtung verwendet werden, die auf entsprechende Weise arbeitet, z. B. eine Platte mit Löchern oder Nuten mit einer Anzahl, die derjeni­ gen der stromaufwärtigen Kapillaren entspricht. Die Elektri­ zitätsflußrichtung im Spalt, d. h. im optischen Erfassungs­ abschnitt kann dadurch festgelegt werden, daß die Ummante­ lungslösung entsprechende Komponenten, wie die Pufferlösung, in einer Kapillare aufweist, wodurch für Elektrophorese von Proben gesorgt wird. Da die Pufferlösung entsprechende Zu­ sammensetzung sowohl innerhalb als auch außerhalb der Kapil­ laren aufweist, besteht ferner keine Möglichkeit, daß die Pufferlösung innerhalb einer Kapillare in die optische Zelle ausströmt, was zu einer Änderung der Zusammensetzung führen würde. Daher geht die Probentrennfunktion während der Elek­ trophorese nicht verloren. Wenn die Proben einsträngige DNS- Proben sind, kann in der Ummantelungslösung ein Denaturie­ rungsmittel vorhanden sein. In diesem Fall ist es möglich, ein Rückbinden zu verhindern, wenn DNS-Proben im Spalt, d. h. im optischen Erfassungsabschnitt, wandern; dies bedeu­ tet erhöhte Meßgenauigkeit. Dieses Merkmal erniedrigt die Möglichkeit, daß in der Kapillare vorhandenes Denaturie­ rungsmittel in die optische Zelle ausleckt, und es verhin­ dert, daß die Probentrennfunktion verlorengeht.

Zum Zuführen der Ummantelungslösung in die optische Zelle wird das Ummantelungslösungsniveau im Ummantelungslösungs­ behälter höher eingestellt als das Flüssigkeitsniveau im stromabwärtigen Elektrodengefäß, und es wird dafür gesorgt, daß die Ummantelungsflüssigkeit durch den Niveauunterschied zwischen den zwei Flüssigkeiten gleichmäßig strömt. Dies be­ seitigt das Erfordernis des Herstellens einer Strömung durch eine mechanische Einrichtung, und es sorgt für einen einfa­ chen und wirtschaftlichen Aufbau des Gerätes. Ferner besei­ tigt dieses Merkmal pulsierende Strömung, wie sie auftreten kann, wenn eine Pumpe verwendet wird, wodurch eine stabile Ummantelungsströmung und höhere Meßgenauigkeit gewährleistet werden. Die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungslösung kann leicht dadurch eingestellt werden, daß der Niveauunter­ schied zwischen dem Niveau der Ummantelungsflüssigkeit in der Ummantelungslösungsflasche und dem Flüssigkeitsniveau im stromabwärtigen Elektrodengefäß verändert wird.

Darüber hinaus wird im optischen Erfassungsabschnitt entwe­ der die Fluoreszenzstrahlung oder die Lichtabsorption der Proben gemessen. Die Spaltweite liegt nicht fest, jedoch be­ trägt sie vorzugsweise 0,1 mm bis 3,0 mm. Im allgemeinen er­ möglicht eine kleinere Spaltweite einfachere Elektrophorese der Proben im Spaltraum, so daß die Spaltweite grundsätzlich klein sein sollte. Jedoch ist das Zusammenbauen des Gerätes schwieriger, wenn die Spaltweite sehr klein ist; daher ist sie in der Praxis vorzugsweise 0,1 mm oder mehr. Jedoch kann sie auch auf weniger eingestellt werden. Die Grenze wird durch die Breite des Anregungsstrahls, wie eines Laser­ strahls, im Spalt bestimmt. Umgekehrt bewirkt eine größere Spaltweite eine leichtere Aufweitung der Proben. Der Erfin­ der hat herausgefunden, daß eine Spaltweite von 3 mm für ru­ hige Elektrophorese der Proben sorgt. D. h., eine Spaltweite von 0,1 mm bis 3,0 mm erlaubt ruhige und wirkungsvolle Elek­ trophorese der Proben.

Elektrophorese mit einem in einer optischen Zelle gehaltenen Paar von Kapillaren sorgt dafür, daß Proben entlang einer Linie wandern, die die zwei Kapillaren miteinander verbin­ det, ohne daß sie in Berührung mit der Innenfläche der opti­ schen Zelle kommen. Dies beseitigt die Möglichkeit, daß die Proben an der Innenfläche der Zelle adsorbiert werden oder durch Streulicht von der Innenseite der Zelle beeinflußt werden, wodurch die Meßempfindlichkeit verbessert wird.

Beim Aufbau (2) eines Elektrophoresegerätes enden die zwei oder mehr Kapillaren, deren andere Enden in die Elektroden­ gefäße eingetaucht sind, in der optischen Zelle, und Umman­ telungslösung wird in dieselbe von außen her eingeleitet. Dies sorgt dafür, daß in den Kapillaren wandernde Proben in der optischen Zelle im Zustand einer Ummantelungsströmung fließen. Unter Verwendung des Ummantelungsströmungsbereichs als optischer Erfassungsabschnitt und bei Ausbildung des Elektrophoresegerätes mit demselben Aufbau, wie unter (1) angegeben, ist es auch möglich, getrennt Proben zu erfassen, die in den Kapillaren wandern, wodurch dieselben Ergebnisse wie beim Aufbau (1) eines Elektrophoresegeräts erhalten wer­ den.

Andere Funktionen, wie sie in Verbindung mit dem Aufbau (1) eines Elektrophoresegerätes diskutiert werden, sind beim Aufbau (2) dieselben.

Beim Aufbau (3) eines Elektrophoresegerätes, bei dem Proben von mit Fluoreszenzstoffen markierten Nukleinsäurefragmenten einer molekulargewichtsmäßigen Trennung durch Elektrophorese unterzogen werden und die getrennten Proben optisch erfaßt und analysiert werden, besteht der Wanderungspfad aus einem mit Gel gefülltem Molekulargewicht-Trennbereich und einem mit einem Elektrolyten gefüllten optischen Erfassungsab­ schnitt. Die Fluoreszenzstrahlung oder die Lichtabsorption von Proben wird im Elektrolyten ohne Gel gemessen. Dies ver­ hindert es, daß Streulicht und Fluoreszenzstrahlung vom Gel und vom Gelhalter, wie den Kapillaren, auftreten, und es ge­ währleistet eine hochempfindliche Messung von Fluoreszenz­ strahlung oder Lichtabsorption. Darüber hinaus wird das Er­ fordernis der mechanischen Erzeugung einer Strömung besei­ tigt, und es wird ein einfacher Aufbau des Gerätes erhalten. Das Vorsehen eines Molekulartrennbereichs mit Gel ermög­ licht, wie beim herkömmlichen Verfahren, molekulargewichts­ mäßige Trennung durch Elektrophorese.

Hochgeschwindigkeitstrennung wird durch einen Molekular­ trennbereich mit Kapillargel erzielt.

Der Molekulartrennbereich und der optische Detektor können leicht dadurch ausgebildet werden, daß zwei Kapillaren ent­ lang einer geraden Linie angeordnet werden, wobei ihre Ach­ sen im wesentlichen zusammenfallen, wobei die einander ge­ genüberstehenden Enden der Kapillaren dicht beieinander an­ geordnet werden, wobei ein vorgegebener Spalt in axialer Richtung der Kapillaren aufrechterhalten wird. In diesem Fall dient der Spalt als optischer Detektor, der die Fluo­ reszenzstrahlung oder Lichtabsorption der Proben erfaßt. Elektrophorese wird dadurch ermöglicht, daß der Spalt mit Elektrolyt aufgefüllt wird, was Hintergrundlicht, ein­ schließlich Streulicht vom Gel und den Kapillaren, verhin­ dert. Der Molekulargewicht-Trennbereich wird einfach dadurch gebildet, daß Gel in mindestens einer der Kapillaren erzeugt wird.

Vorzugsweise ist die Spaltlänge 0,1 mm bis 1,0 mm. Im allge­ meinen sorgt eine kleinere Spaltlänge für einfachere Elek­ trophorese der Proben im Spaltraum, so daß grundsätzlich die Spaltlänge klein sein sollte. Jedoch ist der Zusammenbau des Gerätes schwieriger, wenn die Spaltlänge sehr klein ist; daher beträgt sie in der Praxis vorzugsweise 0,1 mm oder mehr. Jedoch kann sie auch weniger als 0,1 mm sein. Die Grenze wird durch die Breite des anregenden Strahls, wie eines Laserstrahls, im Spalt bestimmt. Umgekehrt bewirkt eine größere Spaltweite, daß die Proben nicht mehr in gera­ der Linie im Spaltraum wandern, was zu einfacherer Aufwei­ tung der Proben führt; die Proben wandern dabei aber nicht in andere Kapillaren. Der Erfinder hat herausgefunden, daß eine Spaltweite von etwa 3 mm für ruhige Elektrophorese der Proben sorgt. Ruhige Elektrophorese kann, abhängig von ver­ schiedenen Bedingungen, wie der Elektrophoresespannung, nicht ausgeführt werden. D. h., daß eine Spaltweite von 0,1 mm bis 1,0 mm ruhige und wirkungsvolle Elektrophorese der Proben erlaubt.

Wenn die den Spalt bildenden Kapillarenden in einer opti­ schen Zelle gehalten werden, deren Innendurchmesser größer ist als der Durchmesser eines Wanderungspfades, z. B. mit einem Lichtpfad, dessen Länge und Breite größer ist als der Außendurchmesser einer Kapillare, und in einen Elektrolyten gefüllte Proben einer Elektrophorese unterzogen werden, ist es den Proben ferner erlaubt, entlang der den Kapillaren verbindenden Linie zu wandern, ohne daß sie die Innenfläche der optischen Zelle berühren. Dies beseitigt die Möglich­ keit, daß sie an der Innenfläche der Zelle adsorbiert werden oder durch Streulicht von der Innenseite der Zelle beein­ flußt werden, wodurch die Meßempfindlichkeit verbessert wird.

Wenn zwei oder mehr durch die Spalte zwischen zwei oder mehr Paaren von Kapillaren gebildete optische Detektoren in der optischen Zelle vorhanden sind und sie miteinander über einen Elektrolyten verbunden sind, ist es auch möglich, gleichzeitige Messung von zwei oder mehr Proben mit im we­ sentlichen denselben Bedingungen auszuführen.

Optische Detektoren, die von Proben emittierte Fluoreszenz­ strahlung erfassen, können dadurch ausgebildet werden, daß zwei oder mehr Kapillaren entlang einer Reihe angeordnet werden, was es erlaubt, daß die zwei oder mehr optischen De­ tektoren gleichzeitig mit einem einzelnen Anregungslicht­ strahl beleuchtet werden, was gleichzeitige Fluoreszenz­ strahlungsmessung gewährleistet.

Wenn die zwei oder mehr optischen Detektoren über einen Elektrolyten miteinander verbunden werden, erlaubt dies eine wirkungsvolle Übertragung des Anregungslichts in die opti­ schen Detektoren durch den Elektrolyten hindurch mit mini­ maler Lichtstreuung, was zu hochgenauer Fluoreszenzstrah­ lungsmessung führt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von durch Figuren veranschaulichten Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das einen Elektrophoresebe­ reich und ein Laserbeleuchtungssystem bei einem Elektropho­ resegerät gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfin­ dung zeigt;

Fig. 2 ist ein Blockdiagramm, das das Fluoreszenzstrahlungs- Meßsystem beim Elektrophoresegerät gemäß einem zweiten Aus­ führungsbeispiel der Erfindung zeigt;

Fig. 3 ist ein Blockdiagramm, das das Beleuchtungssystem und das Meßsystem eines Elektrophoresegerätes gemäß einem drit­ ten Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt;

Fig. 4 ist ein Blockdiagramm, das den Bereich um Spalte in einem Elektrophoresegerät gemäß einem vierten Ausführungs­ beispiel der Erfindung zeigt;

Fig. 5 ist ein Blockdiagramm, das den Elektrophoresebereich eines Elektrophoresegerätes gemäß einem fünften Ausführungs­ beispiel der Erfindung zeigt;

Fig. 6 ist eine perspektivische Ansicht einer mit zwei oder mehr Nuten versehenen Platten gemäß einem sechsten Ausfüh­ rungsbeispiel der Erfindung;

Fig. 7 zeigt eine Fluoreszenzzelle des Elektrophoresebe­ reichs des Elektrophoresegeräts gemäß dem sechsten Ausfüh­ rungsbeispiel der Erfindung;

Fig. 8 ist ein Blockdiagramm, das ein Elektrophoresegerät gemäß einem siebten Ausführungsbeispiel der Erfindung veran­ schaulicht;

Fig. 9 ist eine vergrößerte Schnittdarstellung einer Fluo­ reszenzzelle gemäß dem siebten Ausführungsbeispiel der Er­ findung;

Fig. 10 ist ein Blockdiagramm, das ein Elektrophoresegerät gemäß einem achten Ausführungsbeispiel der Erfindung veran­ schaulicht;

Fig. 11 ist ein Blockdiagramm, das ein Elektrophoresegerät gemäß einem neunten Ausführungsbeispiel der Erfindung veran­ schaulicht;

Fig. 12 ist eine vergrößerte Schnittdarstellung einer Fluo­ reszenzzelle gemäß einem zehnten Ausführungsbeispiel der Er­ findung;

Fig. 13 ist ein Blockdiagramm, das einen Fluoreszenzstrah­ lungsdetektor eines bekannten Elektrophoresegeräts mit Ka­ pillaren veranschaulicht; und

Fig. 14 ist ein Blockdiagramm, das einen Fluoreszenzstrah­ lungsdetektor mit einer Ummantelungsströmungskuvette bei einem bekannten Elektrophoresegerät mit Kapillaren veran­ schaulicht.

Ausführungsbeispiel 1

Beim Ausführungsbeispiel werden mit Fluoreszenzstoffen mar­ kierte DNS-Fragmente nach ihrem Molekulargewicht durch die Elektrophorese getrennt und fluoreszenzmäßig erfaßt. Das Folgende beschreibt den Fall der Verwendung von Fluoreszin- Isothizyanat (FITC) zu Fluoreszenzmarkierung. Anstatt mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente zu verwenden, ist es auch möglich, nur teilweise in solcher Weise markierte derartige Fragmente zu verwenden.

Zum Beispiel werden Proben durch eine DNS-Polymerasereaktion unter Verwendung eines mit einem Fluoreszenzstoff markierten Startermoleküls nach dem wohlbekannten, von Sanger und Kol­ legen erfundenen Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren herge­ stellt. D. h., daß ein mit FITC verbundenes Startermolekül (markiertes Startermolekül) als Startermolekül verwendet wird, und dieses einer einsträngigen Matrizen-DNS zugesetzt und mit dieser erhitzt wird, wodurch das markierte Starter­ molekül mit der einsträngigen DNS verbunden wird. Danach werden dATP, dTTP, dCTP, dGTP und ddATP zugesetzt, um die DNS-Polymerasereaktion zu bewirken. Der obige Ablauf sorgt für DNS-Fragmente, die mit Fluoreszenzstoffen markiert sind und verschiedene Längen mit der Endgruppe A aufweisen. Sol­ che Fragmente werden als Proben verwendet.

Zunächst wird der Aufbau des Geräts beschrieben. Fig. 1 zeigt den Aufbau des Elektrophoresebereichs und des Laser­ einstrahlungsbereichs des Elektrophoresegeräts des Ausfüh­ rungsbeispiels. Fig. 2 zeigt den Aufbau des Fluoreszenzer­ fassungssystems des Elektrophoresegeräts. Das Elektrophore­ segerät ist für gleichzeitige Erfassung mindestens zweier Proben dadurch ausgebildet, daß 20 Kapillaren vorhanden sind, die als Probentrennbereich dienen. Der Probentrennbe­ reich verwendet 20 Kapillaren 1a, 1b, 1c, 1d . . . 1t, die aus Silicatglas hergestellt sind. Es wird davon ausgegangen, daß es sich um ideale Silicatglaskapillaren mit einem Innen­ durchmesser von 100 µm einem Außendurchmesser von 375 µ und einer Länge von 40 cm handelt. Es werden auch 20 Sili­ catglaskapillaren mit 2a, 2b, 2c, 2d . . . 2t mit demselben Außen-und Innendurchmesser mit einer Länge von 10 cm verwen­ det. Für die Kapillaren 1a bis 1t wird ein Kapillargel mit Polyacrylamidgel zubereitet, das Harnstoff als Denaturie­ rungsmittel enthält. Zunächst wird das Innere der Kapillaren ausgewaschen und einer Haftvermittlungsbearbeitung mit Silan unterzogen. Dann wird eine Lösung aus N,N,N′,N′-Tetramethyl­ ethylendiamin und Ammoniumpersulfat einem TRIS-Borat-Puffer mit 3,84 Prozent entgastem Acrylamid, 0,16 Prozent N,N′- Methylen-Bis-Acralamid, 7 M Harnstoff und 2 mM EDTA zuge­ setzt und in die Kapillaren eingefüllt; dann wird das Acryl­ amidgel durch Polymerisierung erhalten. Da die Kapillaren mit dem Silan-Haftvermittler bearbeitet wurden, binden das Acrylamidgel und die Kapillaren chemisch aneinander, was die Möglichkeit ausschließt, daß das Gel während der Elektropho­ rese aus den Kapillaren austritt.

Die Kapillaren 2a bis 2t werden so behandelt, daß ihre In­ nenflächen positiv geladen sind. Zunächst wird eine 3-(2- Aminoethylaminopropyl) -Trimethoxysilan-Lösung in die Kapil­ laren gefüllt, um eine Reaktion hervorzurufen. Dann folgt eine Wärmebehandlung bei 110°C, und unter anderem wird ein Säurerest auf die Innenwände der Kapillaren übertragen, um diese positiv zu laden. Dies ändert die Richtung des elek­ troosmotischen Flusses vom negativen zum positiven Pol in­ nerhalb jeder der Kapillaren 2a bis 2t. Die Wanderungsrich­ tung (vom negativen zum positiven Pol) der Proben in den mit dem Polyacrylamidgel aufgefüllten Kapillaren 1a bis 1t wird an die Wanderungsrichtung (vom negativen zum positiven Pol) von Proben in den Kapillaren 2 angepaßt, was Probenwanderung sicherstellt. Die Enden der Kapillaren 1a bis 1t und der Ka­ pillaren 2a bis 2t werden Kopf an Kopf in die optische Zelle eingesetzt und mit einem vorgegebenen Spalt voneinander be­ abstandet gehalten; dann werden die Proben optisch erfaßt.

In diesem Fall wird eine Fluoreszenzzelle zum Erfassen der Proben durch Fluoreszenz verwendet. D. h., daß die Enden der Kapillaren 1a bis 1t und der Kapillaren 2a bis 2t innerhalb einer rechteckigen Fluoreszenzzelle 4 aus Silicat angeordnet werden (Außenabmessungen: 36 mm breit, 4,5 mm tief und 3 mm lang; Innenabmessungen: 30 mm breit, 2 mm tief und 3 mm lang; wobei die Breite die Horizontalrichtung in der Zeich­ nung (Richtung der Kapillaren 1a bis 1t), die Tiefe die Richtung rechtwinklig zur Zeichenebene und die Länge die Längsrichtung (Richtung der Probenwanderung von den Kapilla­ ren 1 nach 2) in der Zeichnung bezeichnen). Sie sind so an­ geordnet, daß die Kapillare 1a koaxial zur Kapillare 2a an­ geordnet ist und diese einander mit einem Spalt 3a einer Länge von 1 mm gegenüberstehen. Entsprechend sind die Kapil­ laren 1b und 2b, 1c und 2c, 1d und 2d, . . ., 1t und 2t so an­ geordnet, daß sie Spalte 3b, 3c, 3d . . . 3t bilden. Um die Kapillaren in der optischen Zelle festzuhalten, wird in der Regel ein Mehrkapillarhalter mit 20 vertikalen Löchern mit Abständen von 0,6 mm verwendet, die in einem plattenförmigen Block aus einem fluorhaltigen Polymer, z. B. Tetrafluor­ ethylen-Polymer angebracht sind. Genauer gesagt, wird jede der Kapillaren 1a bis 1t in jeweils eines der 20 Vertikal­ löcher des Mehrkapillarhalters 5a eingesetzt. Dann wird jede der Kapillaren 2a bis 2t in jeweils eines der 20 Vertikal­ löcher des Mehrkapillarhalters 5b eingesetzt. Der Mehrkapil­ larhalter 5a und der Mehrkapillarhalter 5b werden in dichter Berührung mit der Oberseite und dem Boden der Fluoreszenz­ zelle 4 befestigt, um sicherzustellen, daß die Kapillaren 1a und 2a, 1b und 2b, 1c und 2c, 1d und 2d, . . ., 1t und 2t je­ weils koaxial sind. Da die Spalte 3a bis 3t im vorliegenden Fall als optischer Erfassungsabschnitt oder als Fluoreszenz­ erfassungsabschnitt verwendet werden, erfolgt ferner eine Einstellung der Länge der Kapillaren 1a bis 1t und 2a bis 2t innerhalb der Quarzfluoreszenzzelle (optische Zelle zum Er­ fassen von Fluoreszenz) 4 in solcher Weise, daß die Spalte 3a bis 36 entlang einer geraden Linie liegen. Die anderen Enden der Kapillaren 1a bis 1t und 2a bis 2t werden in ein Gefäß für eine Kathodenelektrode 6 und ein Gefäß für eine Anodenelektrode 7 eingetaucht, die mit einer Pufferlösung versorgt werden (TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung mit Harn­ stoff). Das Innere der Fluoreszenzzelle 4 ist zum Füllen mit einer Ummantelungslösung mit einem Ummantelungslösungseinlaß 8 versehen, damit Ummantelungslösung 11 aus einer Ummante­ lungslösungsflasche 10 über ein Rohr 9 aus einem Tetrafluor­ ethylen-Polymeren eingeleitet werden kann. Die Ummantelungs­ lösung 11 verwendet eine TRIS-Borat-EDTA-Pufferlösung mit Harnstoff mit derselben Zusammensetzung wie derjenigen der Pufferlösung im Kapillargel der Kapillaren 1a bis 1t, wo­ durch verhindert wird, daß die Komponenten des Kapillargels in die Fluoreszenzzelle 4 auslecken.

Ferner fließt Ummantelungslösung durch die Kapillaren 2a bis 2t in das Gefäß für die Anodenelektrode 7, wenn die Fluores­ zenzzelle 4 mit den Kapillaren 1a bis 1t und den Kapillaren 2a bis 2t mit Ummantelungslösung gefüllt wird und das Niveau der Ummantelungslösung 11 in der Ummantelungslösungsflasche höher eingestellt wird als dasjenige der Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode 7. Unter dieser Bedingung wer­ den die Fluoreszenzzelle 4 und die Kapillaren 2a und 2t mit Ummantelungslösung, d. h. der Pufferlösung, gefüllt, und auch die Kapillaren 1a bis 1t werden mit Kapillargel ge­ füllt. Wenn eine Gleichspannung zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode 6 und das Gefäß für die Anodenelektrode 7 mit Hilfe einer Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 12 gelegt wird, fließt ein Strom durch die Kapillare 1a, den Spalt 3a und die Kapillare 2a, wodurch die Proben wandern können. Wenn das Niveau der Ummantelungslösung 11 in der Um­ mantelungslösungsflasche 10 höher eingestellt wird als das­ jenige der Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode 7, erzeugt die Strömung der Ummantelungslösung innerhalb der Kapillaren 2a bis 2t eine Strömung über die oberen Enden dieser Kapillaren hinaus, d. h. um die Spalte 3a bis 3t herum. Proben, die von den Kapillaren 1a bis 1t ausgehend wandern, laufen durch die Spalte 3a bis 3t entlang der Strö­ mung über die Kapillaren 2a bis 2t unter Ummantelungsströ­ mungsbedingungen und werden dann in jede Kapillare geleitet, und es wird dafür gesorgt, daß sie zum Gefäß für die Anoden­ elektrode 7 wandern.

Die Kapillaren 2a bis 2t werden so behandelt, daß ihre In­ nenseiten positiv geladen sind, und die elektroosmotische Strömung innerhalb der Kapillaren 2a bis 2t wird von den Ka­ pillaren 1a bis 1t zum Gefäß für die Anodenelektrode 7 ge­ leitet, was die Möglichkeit einer Rückwärtsströmung der Lö­ sung in die Spalte ausschließt, und eine stabile Strömung der Ummantelungslösung zum Gefäß für die Anodenelektrode 7 gewährleistet. Selbst wenn die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungslösung besonders niedrig ist, ist eine stabile Strömung der Ummantelungslösung zum Gefäß für die Anoden­ elektrode 7 gewährleistet.

Elektrophorese wird durch Anlegen von Gleichspannung zwi­ schen das Gefäß für die Kathodenelektrode 6 und das Gefäß für die Anodenelektrode 7 durch die Hochspannungs-Gleich­ spannungsversorgung 12 bewirkt. Der durch die Kapillare 1a und die Kapillare 2a fließende Strom läuft hauptsächlich durch den Spalt 3a; ähnlich laufen die Ströme durch die Ka­ pillaren 1b und 2b, 1c und 2c, 1d und 2d, . . . 1t und 2t hauptsächlich durch die Spalte 3b, 3c, 3d, . . . 3t. Ferner strömen, wie oben ausgeführt, die von den Kapillaren 1a bis 1t ausgehend wandernden Proben entlang der Strömung über die Kapillaren 2a bis 2t und durchlaufen beim Zustand der Strö­ mung der Ummantelungslösung die Spalte 3a bis 3t; dann wer­ den sie in die jeweiligen Kapillaren eingeleitet. Genauer gesagt, wird dafür gesorgt, daß die durch die Kapillaren und Spalte wandernden Proben so wandern, daß sie nicht mit den Proben in Berührung kommen, die in den benachbarten Spalten wandern. Dies erlaubt getrennte Fluoreszenzerfassung der in jedem Spalt wandernden Probe. Darüber hinaus berühren die Proben die Innenfläche der Fluoreszenzzelle 4 nicht, was die Möglichkeit beseitigt, daß Proben an der Fluoreszenzzelle 4 absorbiert werden und was räumliche Entfernung durch Schlit­ ze oder eine ähnliche Vorrichtung von Licht bewirkt, das an der Fläche der Fluoreszenzzelle 4 streut. Dadurch ist hoch­ empfindliche Fluoreszenzerfassung möglich.

Einleiten der mit Fluoreszenzstoffen markierten DNS-Fragmen­ te ist dadurch möglich, daß ein Ende der Kapillare 1a auf der Kathodenseite in die Probenlösung eingetaucht wird und eine Spannung von 6 kV für etwa 20 Sekunden zwischen die Probenlösung und das Gefäß für die Anodenelektrode 7 gelegt wird. Danach wird das Ende der Kapillare in die Ursprungs­ stellung im Gefäß für die Kathodenelektrode 6 zurückgeführt. Dieser Ablauf wird für jede der Kapillaren 1a bis 1t wieder­ holt, um Proben in die Kapillargele der Kapillaren 1a bis 1t einzuleiten. Es ist zu beachten, daß die Proben aufeinander­ folgend, wie vorstehend beschrieben, in jede Kapillare ein­ geleitet werden können, oder daß sie dadurch eingeleitet werden können, daß jede der Kapillaren 1a bis 1t in die Pro­ benlösung eingetaucht wird und gleichzeitig Spannung ange­ legt wird. Molekulargewichtsmäßige Trennung durch Proben­ elektrophorese erfolgt durch Anlegen der Spannung von 6 kV zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode 6 und das Gefäß für die Anodenelektrode 7. Die in jede der Kapillaren 1a bis 1t eingeleitete Probe wandert innerhalb der Kapillargele der Kapillaren 1a bis 1t von der Kathode zur Anode, wobei mole­ kulargewichtsmäßige Trennung erfolgt, und sie laufen dann durch die Spalte 3a bis 3t. Proben, die durch die Spalte 3a bis 3t laufen, werden durch einen Argonlaser mit einer Wel­ lenlänge von 488 nm erfaßt, der den Fluoreszenzstoff FITC anregt.

Die Achse des Laserlichts ist so eingestellt, daß das Laser­ licht die entlang einer Linie ausgerichteten Spalte gleich­ zeitig beleuchtet oder dies mit im wesentlichen denselben Bedingungen vornimmt. Wenn das Laserlicht eingestrahlt wird, kann Fluoreszenz erfaßt werden. Genauer gesagt, wird Laser­ licht 21 mit einer Wellenlänge von 488 nm von einer Argon­ laserquelle 20 durch eine Linse 22 gebündelt und so einge­ strahlt, daß es die durch die Spalte 3a bis 3t mit Fluores­ zenzstoff markierten DNS-Fragmente anregt. Es werden ein Laser mit einem Strahldurchmesser von etwa 0,7 mm und eine Linse 22 mit einer Brennweite von 100 mm verwendet, und der Brennpunkt wird in die Mittelposition zwischen den Spalten 3a und 3t eingestellt. In diesem Fall beträgt die Fleckgröße des Laserlichts im Brennpunkt etwa 150 µm, und die Fokal­ distanz beträgt etwa 20 mm. Der Abstand zwischen den Spalten 3a und 3t entspricht dem Abstand von der Kapillare 1a zur Kapillare 1t. Im Fall des vorliegenden Ausführungsbeispiels ist dies 0,6 mm×19, d. h. etwa 12 mm. D. h., daß das La­ serlicht die 20 Positionen der Spalte 3a bis 3t im wesentli­ chen mit derselben Fleckgröße beleuchtet, die im wesentli­ chen mit der Größe des Kapillargels (100 µm) übereinstimmt. Wie oben ausgeführt, kann die Fleckgröße des Laserlichts im wesentlichen mit derjenigen des Kapillargels übereinstimmen. Gleichförmige und wirkungsvolle Anregung der mit Fluores­ zenzstoff markierten DNS-Fragmente, die durch die Spalte 3a bis 3t wandern, ist dadurch möglich, daß die Lichtquelle und das Linsensystem so ausgewählt werden, daß alle Spalte im wesentlichen mit derselben Größe beleuchtet werden.

Die von den mit den Fluoreszenzstoffen markierten DNS-Frag­ menten, die durch die Spalte 3a bis 3t wandern, abgestrahlte Fluoreszenz wird aus einer Position rechtwinklig zur Rich­ tung der Laserstrahlung erfaßt. Dieser Aufbau wird durch Fig. 2 veranschaulicht. Von Fluoreszenzstrahlung 30, wie sie von den DNS-Fragmenten emittiert wird, wird die Hintergrund­ strahlung, wie sie durch Streulicht entsteht, durch ein In­ terferenzfilter 32 beseitigt, und durch eine Linse 33 wird ein Bild auf einem zweidimensionalen Detektor 34, wie einer CCD-Kamera, abgebildet. Gesteuert durch eine Steuerung 35, erfaßt der zweidimensionale Detektor 34 das Fluoreszenzbild der Spalte 3a bis 3t, und er erzeugt eine kontinuierliche und gleichzeitige Erfassung der zeitlichen Änderung der Fluoreszenzintensität für alle Spalte 3a bis 3t unter Ver­ wendung eines Datenprozessors 36, eines Computers oder der­ gleichen. Die Ergebnisse werden auf einem Monitor 37 darge­ stellt und auf einem Drucker 38 ausgegeben oder durch einen Speicher 39 gespeichert. Dieses Merkmal erlaubt gleichzeiti­ ge und kontinuierliche Erfassung der Wanderungsmuster für jede der Kapillaren 1a bis 1t, wie sie durch die molekular­ gewichtsmäßige Trennung hervorgerufen werden. Es ist zu be­ achten, daß beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ein ein­ dimensionaler Detektor, wie ein Photodiodenarray statt eines zweidimensionalen Detektors, wie eine CCD-Kamera, verwendet werden kann, da die Fluoreszenzbilder der Spalte eindimen­ sional angeordnet sind. Für wirkungsvolle Erfassung der vom FITC emittierten Fluoreszenzstrahlung verwendet das Inter­ ferenzfilter 32 ein Bandpaß-Interferenzfilter, das Trans­ mission im Wellenlängenband von 500 bis 540 nm zuläßt. Die Vergrößerung der Linse 33 wird so gewählt, daß das Bild der Spalte 3a bis 3t auf eine Photodetektorfläche des zweidimen­ sionalen Detektors gebündelt wird. Da die Spalte beim Aus­ führungsbeispiel im wesentlichen aus Pufferlösung bestehen, wird das Laserlicht zwischen den Spalten übertragen, ohne daß es von Streulicht durch die Kapillaren beeinflußt wird. Dies erlaubt gleichzeitige, homogene und wirkungsvolle Be­ leuchtung der durch die mindestens zwei Kapillaren wandern­ den Proben. Dies erlaubt eine wesentliche Verringerung von Hintergrundstrahlung, wie von Streulicht und von Fluoreszenz von Kapillaren und Kapillargelen, was hochempfindliche Fluo­ reszenzerfassung gewährleistet.

Die Wirkung des verringerten Hintergrundlichts ist die fol­ gende: Im Vergleich zum Fall, bei dem die Fluoreszenzerfas­ sung dadurch erfolgt, daß das Laserlicht durch die Kapillare selbst erfolgt, deren Ummantelung beseitigt ist, ohne daß ein Spalt gebildet wird, verringert Fluoreszenzerfassung im Spalt, wie beim Ausführungsbeispiel, die erfaßte Intensität der Hintergrundstrahlung auf etwa ein Zehntel oder weniger, was es erlaubt, Proben mit niedriger Konzentration zu erfas­ sen. Die Anordnung mit mindestens zwei Spalten in gerader Linie ermöglicht gleichzeitige und einfache Beleuchtung al­ ler Spalte durch das Laserlicht, was eine einfache Gerätean­ ordnung erlaubt. Da mindestens zwei Paare von Kapillaren in einer optischen Zelle festgehalten werden können, ist die Verwendung einer einzigen optischen Zelle ausreichend, und eine Leitung ist zum Zuführen der Ummantelungslösung ausrei­ chend. Darüber hinaus findet Strömung der Ummantelungslösung nur dicht bei den Spalten statt, und die Strömungsgeschwin­ digkeiten sind für alle Spalte gleich, was zu größerer Re­ produzierbarkeit unter den Spalten führt. Dieses Merkmal er­ niedrigt Schwankungen zwischen Wanderungspfaden, und für diesen Zweck reicht eine optische Zelle mit einfachem Aufbau aus, wie beim Ausführungsbeispiel. Es ist nicht erforder­ lich, eine optische Zelle mit kompliziertem Aufbau zu ver­ wenden, wie bei einer herkömmlichen Kammer für Ummantelungs­ flüssigkeit. Dieses Merkmal gewährleistet einen insgesamt einfachen Geräteaufbau. Beim Ausführungsbeispiel ist der Ab­ stand zwischen benachbarten Kapillaren auf 0,6 mm einge­ stellt. Die Position der Probenwanderung kann dadurch fest­ gelegt werden, daß ein Paar Kapillaren Kopf an Kopf mit einem vorgegebenen Spalt gehalten werden, und mindestens zwei Kapillaren (und Spalte) können an dicht beieinanderlie­ genden Positionen angeordnet werden. Dies erlaubt eine Ver­ ringerung der Größe der optischen Zelle. Außerdem ermöglicht es dies, das Laserlicht zum Beleuchten des Spalts weiter ab­ zusenken. Umgekehrt ermöglicht es dies, daß mehr Paare von Kapillaren in derselben optischen Zelle gehalten werden kön­ nen. Der Molekulargewicht-Trennbereich ist beim Ausführungs­ beispiel derselbe Kapillargel-Trennbereich wie der herkömm­ liche, wodurch hochempfindliche Erfassung gewährleistet ist, ohne daß die Molekulargewicht-Trenneigenschaften leiden.

Beim Ausführungsbeispiel wird dafür gesorgt, daß Pufferlö­ sung strömt, ohne daß eine mechanische Einrichtung, wie eine Pumpe für Flüssigphasenchromatographie, verwendet wird. Dies vereinfacht den Geräteaufbau und erniedrigt die Herstellko­ sten. Es liegt keine pulsierende Strömung vor, wie sie beim Verwenden einer Pumpe auftreten kann, was eine stabile Strö­ mung der Ummantelungslösung und erniedrigte Schwankung der Speisegeschwindigkeit sowie erniedrigte Schwankung der Fluo­ reszenzintensität der in den Spalten strömenden Proben ge­ währleistet, was zu genauer Erfassung führt. Die Strömungs­ geschwindigkeit der Ummantelungslösung kann einfach dadurch eingestellt werden, daß der Überstand zwischen dem Niveau der Ummantelungslösung in der Ummantelungslösungsflasche und dem Pufferlösungsniveau im Gefäß für die Anodenelektrode auf der stromabwärtigen Seite für die Wanderung verstellt wird. Diese Einstellung ist auch dadurch möglich, daß der Innen­ durchmesser der Kapillare auf der stromabwärtigen Seite für die Wanderung verändert wird. Es ist grundsätzlich möglich, dafür zu sorgen, daß die Ummantelungslösung durch Verwenden einer mechanischen Einrichtung, wie einer Pumpe für Flüssig­ phasenchromatographie, strömt. In diesem Fall besteht der Vorteil, daß die Strömungsgeschwindigkeit unmittelbar einge­ stellt werden kann. Jedoch besteht eine Neigung dazu, daß die Fluoreszenzintensität sich aufgrund der pulsierenden Strömung durch die Pumpe ändert, so daß eine glättende Bear­ beitung bei der Datenverarbeitung wesentlich wird.

Beim Ausführungsbeispiel durchläuft die Ummantelungslösung in der optischen Zelle auf der stromabwärtigen Seite die Ka­ pillaren 2a bis 2t und fließt aus der Zelle. Da die Kapilla­ ren im allgemeinen einen kleinen Innendurchmesser aufweisen, ist die Strömungsgeschwindigkeit in den Kapillaren im allge­ meinen klein. Daher kann das Volumen der Ummantelungslösung verringert werden, was zu verbesserter Handhabbarkeit führt. Beim Ausführungsbeispiel erfolgt eine Bearbeitung, die ge­ währleistet, daß das Innere der Kapillaren 2a bis 2t positiv geladen ist, damit die Richtung der elektroosmotischen Strö­ mung innerhalb der Kapillaren 2a bis 2t von den Kapillaren 1a bis 1t zum Gefäß für die Anodenelektrode 7 geht, und daß keine Rückwärtsströmung von den Kapillaren 2a bis 2t in die 1 Spalte vorhanden ist. Dies gewährleistet eine stabile Strö­ mung der Ummantelungslösung zum Gefäß für die Anodenelektro­ de 7 selbst dann, wenn die Strömungsgeschwindigkeit der Um­ mantelungslösung klein ist. Wenn die Strömungsgeschwindig­ keit der Ummantelungslösung im Spalt erhöht ist, z. B. dann, wenn der Innendurchmesser der Kapillaren 2a bis 2t groß ist, verringert sich die Wirkung der elektroosmotischen Strömung; infolgedessen ist eine Behandlung der Innenseite der Kapil­ laren 2a bis 2t nicht immer erforderlich.

Beim Ausführungsbeispiel verwenden die Ummantelungslösung und die Pufferlösung im Gefäß für die Kathodenelektrode und im Gefäß für die Anodenelektrode die TRIS-Borat-EDTA-Puffer­ lösung mit Harzstoff, um zu gewährleisten, daß dieselbe Zu­ sammensetzung wie bei der Pufferlösung des Kapillargels vor­ liegt. Dies verhindert es, daß die Komponenten des Kapillar­ gels in die Fluoreszenzzelle 4 oder das Elektrodengefäß aus­ lecken, und es führt zu fortgesetzter, stabiler Elektropho­ rese mit hoher Trennkraft und Wiederverwendbarkeit des Ka­ pillargels. Es ist auch möglich, eine Pufferlösung ohne Harnstoff, d. h. ohne DNS-Denaturierungsmittel zu verwenden.

In diesem Fall kann Harnstoff innerhalb des Kapillargels im Lauf der Zeit aus demselben in das Elektrodengefäß und die Fluoreszenzzelle strömen. Dadurch verringert sich die Häu­ figkeit der Wiederverwendung, jedoch ist Wanderung, wie im Fall einer Pufferlösung mit Harnstoff, möglich.

Die verwendete Laserausrüstung und der verwendete Fluores­ zenzstoff sind nicht auf einen Argonlaser und FITC be­ schränkt; jeder Fluoreszenzstoff und jede geeignete Laser­ ausrüstung können verwendet werden. Das Ausführungsbeispiel wurde für die Erfassung von DNS-Fragmenten beschrieben, je­ doch gilt das Prinzip auch für die Analyse von Proteinen, Zucker und ähnlichen Substanzen. Beim Ausführungsbeispiel wurden zwei Kapillaren mit demselben Innendurchmesser ver­ wendet; eine Kombination verschiedener Innendurchmesser ist ebenfalls möglich. Wenn z. B. der Innendurchmesser der Ka­ pillare auf der stromabwärtigen Seite kleiner ist als derje­ nige der Kapillare auf der stromaufwärtigen Seite, erhöht sich die Konzentration der Probenlösung, wenn Proben, die ausgehend vom Ende der stromaufwärtigen Kapillare wandern, in die stromabwärtige Kapillare eingeleitet werden, was zu hochempfindlicher Erfassung führt. Wenn der Innendurchmesser der Kapillare auf der stromabwärtigen Seite größer als der­ jenige auf der stromaufwärtigen Seite ist, können Proben, die ausgehend von der stromaufwärtigen Kapillare wandern, leichter und zuverlässiger in die stromabwärtige Kapillare eingeleitet werden.

Da beim Ausführungsbeispiel Fluoreszenz von der Probe erfaßt werden kann, ohne daß das Anregungslicht durch den Kapillar­ bereich läuft, muß darüber hinaus die Kapillare nicht durch­ sichtig sein. Genauer gesagt, muß die Kapillarummantelung nicht beseitigt werden, was einfache Handhabbarkeit gewähr­ leistet. Darüber hinaus erlaubt dies auch die Verwendung einer Kapillare aus einem lichtundurchlässigen fluorhaltigen Polymer, wie aus Tetrafluorethylen oder aus chloriertem Tri­ fluorethylen. Eine Kapillare aus einem fluorhaltigen Polymer zeigt geringes Anhaften von Proben, was das Erfordernis für eine Behandlung, wie eine Oberflächenbehandlung, beseitigt.

Darüber hinaus wird sie nicht beschädigt, was zu ausgezeich­ neter Handhabbarkeit führt. Ferner erlaubt die überragende Beständigkeit gegen Chemikalien die Verwendung von Lösungs­ mitteln in einem sehr großen Bereich von pH-Werten.

Beim Ausführungsbeispiel wurde der Fall von mindestens zwei Paaren von Kapillaren erläutert. Wenn nur ein Paar von Ka­ pillaren verwendet wird, sind Wanderung, Erfassung der Fluo­ reszenz und Erfassung des Probentrennmusters auf dieselbe Weise möglich. Es kann dann ein Photovervielfacher als opti­ scher Detektor verwendet werden.

Ausführungsbeispiel 2

Im folgenden wird ein Verfahren zum Erfassen einer DNS-Se­ quenz beschrieben, das das beim Ausführungsbeispiel 1 vorge­ stellte Gerät verwendet.

Mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente werden durch eine DNS-Polymerasereaktion unter Verwendung eines mit einem Fluoreszenzstoff markierten Fördermoleküls gemäß dem wohlbe­ kannten Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren, wie es von Sanger und seinem Kollegen erfunden wurde, hergestellt. Es wird ein mit FITC verbundenes Startermolekül (markiertes Startermolekül) als Startermolekül verwendet. Zunächst wird das markierte Startermolekül einer einsträngigen Matrizen- DNS hinzugefügt, und es erfolgt Erwärmung (doppelsträngige DNS), wodurch das markierte Startermolekül mit der einsträn­ gigen DNS verbunden wird. Diese Reaktionslösung wird in vier Teile aufgeteilt, die DNS-Polymerasereaktionen für A, C, G bzw. T unterworfen werden. D. h., daß vier Arten von Desoxy­ nukleotid-Triphosphaten (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) und von ddATP, die Endgruppen sind, der mit dem markierten Starter­ molekül verbundenen einsträngigen DNS versetzt werden, um eine DNS-Polymerasereaktion zu bewirken. Die obige Vorge­ hensweise ergibt mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Frag­ mente mit verschiedenen Längen mit der Endgruppe A. Ähnliche Reaktionen werden für C, G und T ausgeführt. Die vier Arten von Reaktionslösungen, die durch die obige Vorgehensweise erhalten werden, werden in vier der Kapillaren 1a bis 1t eingefüllt, z. B. die Kapillaren 1a, 1b, 1c bzw. 1d. Der Einfüllablauf ist derselbe wie beim Ausführungsbeispiel 1. Die Reaktionslösung A wird in die Kapillare 1a eingefüllt, die Reaktionslösung C in 1b, die Reaktionslösung G in 1c und die Reaktionslösung T in 1d. Danach wird eine Spannung von etwa 6 kV angelegt, um Elektrophorese hervorzurufen. Unter Verwendung von Argonlaserlicht als Anregungslicht wird die zeitabhängige Fluoreszenzintensität in den Spalten 3a bis 3d gemessen. Da DNS-Fragmente mit kleinerem Molekulargewicht früher wandern, wird die Basissequenz dadurch bestimmt, daß die Spaltstelle ermittelt wird, an der die Fluoreszenzsi­ gnalspitze zeitabhängig auftrat.

Das beim Ausführungsbeispiel 1 veranschaulichte Gerät weist 20 Kapillaren auf, in die Proben eingefüllt werden können. Das genannte Verfahren zum Bestimmen der DNS-Basissequenz erlaubt gleichzeitige Erfassung der Basissequenz von fünf Arten von DNS-Proben. Dies erlaubt die Erfassung der Basis­ sequenz von mehr DNS-Proben durch Erhöhen der Anzahl von Proben, die in der optischen Zelle gehalten werden. Beim Ausführungsbeispiel wird eine Art von FITC als Fluoreszenz­ stoff verwendet. Jedoch ist es möglich, die Fluoreszenz zu erfassen, die von zwei oder mehr Fluoreszenzstoffen emit­ tiert wird. In diesem Fall ist es z. B. möglich, den folgen­ den Schritt einzusetzen, der weit bekannt ist:

• 1) Sätze einer optischen Detektoranordnung mit einem Inter­ ferenzfilter 32, einer Linse 33 und einem Detektor 34 werden mit einer der Anzahl der Fluoreszenzstoffe entsprechenden Anzahl bereitgestellt, und es wird dafür gesorgt, daß jeder Detektor Fluoreszenz in getrennten Wellenlängenbändern in Fig. 2 erfaßt; oder
• 2) ein Strahlteilerprisma wird nach der Linse 33 angeord­ net, um Licht in spektrale Komponenten aufzuteilen, und das Bild jeder Komponente wird auf einem zweidimensionalen De­ tektor, wie einer Kamera, abgebildet. Dann wird die Fluores­ zenzintensität für jeden Wanderungspfad und jede Wellenlänge gemessen, und die Fluoreszenzintensität für jeden Wande­ rungspfad und jeden Fluoreszenzstoff wird berechnet.

Wie vorstehend erörtert, kann die DNS-Basissequenz selbst dann bestimmt werden, wenn das Gerät so aufgebaut ist, daß es gleichzeitige Erfassung von zwei oder noch mehr Fluores­ zenzstoffen ermöglicht. D. h., daß jede DNS einer Polymera­ sereaktion unterzogen wird, wobei Startermoleküle verwendet werden, die für jeden Typ der Endgruppenbase mit einem ande­ ren Fluoreszenzstoff markiert sind. Dann werden die Reak­ tionslösungen vermischt, und die Elektrophorese wird ausge­ führt; dann wird die von den durch die Spalträume laufenden DNS-Fragmenten emittierte Fluoreszenz erfaßt. Die Art der Base kann dadurch festgestellt werden, daß der Fluoreszenz­ stoff identifiziert wird, wodurch die Basissequenz bestimmt wird.

Der Fluoreszenzstoff kann dadurch identifiziert werden, daß die Fluoreszenz bei der Maximalemissionswellenlänge für vier Fluoreszenzstoffe verglichen wird. In diesem Fall kann die Basissequenz der DNS-Proben im Wanderungspfad mit einem Paar Kapillaren bestimmt werden. Wenn zwei oder mehr Wanderungs­ pfade vorhanden sind, wie in Fig. 1 dargestellt, kann die Basissequenz von zwei oder mehr DNS-Proben gleichzeitig be­ stimmt werden.

Ausführungsbeispiel 3

Die Ausführungsbeispiele 1 und 2 veranschaulichten ein Ge­ rät, das Proben durch Fluoreszenzerfassung bestimmt. Dersel­ be Geräteaufbau ist zur Bestimmung mit Hilfe der Intensität von absorbiertem oder transmittiertem Licht möglich. Fig. 3 zeigt einen Aufbau für ein Beleuchtungssystem und ein Erfas­ sungssystem für ein Elektrophoresegerät zur Bestimmung durch Lichtabsorption. Der Elektrophoresebereich weist dieselbe Konstruktion wie in Fig. 1 beim Ausführungsbeispiel 1 auf. Das Einleiten von Proben, z. B. von DNS-Fragmenten, die durch ein Restriktionsenzym aufgeschlossen wurden, erfolgt mit demselben Ablauf, wie er beim Ausführungsbeispiel 1 be­ schrieben wurde. Elektrophorese mit molekulargewichtsmäßiger Trennung erfolgt ebenfalls mit dem Ablauf gemäß dem Ausfüh­ rungsbeispiel 1. Für DNS-Fragmente, die durch die Spalte 3a bis 3t laufen, wird Licht von einer Lichtquelle 5, wie einer Xenonlampe und einer D2-Lampe, durch einen Monochromator 51 geleitet und dann durch eine Linse 52 so gesammelt, daß die Spalte 3a bis 3t beleuchtet werden. Die Wellenlänge des Be­ leuchtungslichts wird normalerweise so eingestellt, daß es eine Wellenlänge ist, die von der Probe absorbiert wird. Z. B. sind 260 nm für den Fall von DNS-Fragmenten geeignet. Licht, das von den DNS-Fragmenten absorbiert wird, wird wie­ der durch eine Linse 53 gesammelt und durch einen eindimen­ sionalen Sensor 54, wie ein Photodiodenarray, erfaßt. Der Betrieb des eindimensionalen Sensors 54 wird durch eine Steuerung 55 für denselben gesteuert, und das Elektrophore­ semuster wird durch einen Datenprozessor 56 eines Computers oder dergleichen für jeden Spalt gemessen.

Die Ergebnisse werden auf einem Monitor 57 dargestellt und auf einem Drucker 58 ausgegeben oder in einem Speicher 59 abgespeichert. Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist der Spalt zwischen den Kapillaren vorhanden. Jede Kapillare ist als Molekulargewicht-Trennbereich vom Spalt als optischem Detektor zum Messen der Lichtabsorption abgetrennt. Dieser Aufbau erlaubt es, daß das Beleuchtungslicht durch die Um­ mantelungslösung läuft, was zu minimalem Streulicht führt, und er gewährleistet wirkungsvolle Bestrahlung der Proben, ohne daß das Licht durch die Kapillaren oder durch Gel ge­ streut werden, wodurch es zu hochempfindlicher Erfassung durch Lichtabsorption kommt.

Es sei angenommen, daß "1" die Transmissionslichtintensität ist (die numerische Apertur der Photodetektorlinse ist "0,19", wenn die Probe nicht durchlaufen wird), wenn das Licht in den Spalt eintritt wie beim vorliegenden Ausfüh­ rungsbeispiel. Wenn das Licht wie beim Stand der Technik die Kapillare durchstrahlt, wird die Transmissionslichtintensi­ tät auf etwa 0,6 verringert. Da die Kapillare selbst und das Gel, wie das Polyacrylamidgel, das als Medium für die mole­ kulargewichtsmäßige Trennung durch Elektrophorese dient, als Lichtstreuquellen wirken, wird das einfallende Licht durch diese Körper gestreut, was zu verringerter Intensität durch Strahlungslicht führt. Eine verringerte Intensität des Durchstrahlungslichts hat ein um denselben Betrag verringer­ tes S/R-Verhältnis zur Folge, was die Meßgenauigkeit beein­ flußt. Beim Stand der Technik wird auch ein Teil des von der Oberfläche der Kapillare gestreuten oder reflektierten Lichts erfaßt. Solches Licht tritt direkt in den Detektor ein, ohne daß es die Probe bestrahlt (ohne daß es von der Probe absorbiert wird). Trotz des Vorhandenseins einer Probe kommt es zu einer sehr kleinen Änderung der Lichtintensität, wenn irgendwelche Lichtkomponenten absorbiert werden, was die Messung erschwert; insbesondere ist hochgenaue Lichtab­ sorptionsmessung schwierig. Beim vorliegenden Ausführungs­ beispiel wird das durch den Monochromator 51 laufende Licht durch die Linse auf den Spalt kollimiert und in diesen ein­ gestrahlt. Dieselbe Messung ist auch möglich, wenn Licht mit parallelen Lichtstrahlen ohne Lichtsammlung eingestrahlt wird und nur die Intensität desjenigen Lichts gemessen wird, das durch den Spalt lief.

Ausführungsbeispiel 4

Bei den Ausführungsbeispielen 1, 2 und 3 wird der Spalt durch ein Paar Kapillaren gebildet, jedoch muß dies nicht unbedingt der Fall sein. Z. B. kann der Molekulargewicht- Trennbereich aus Kapillaren bestehen, wie bei den Ausfüh­ rungsbeispielen. Es kann aber auch ein Spalt zwischen den Enden dieser Kapillaren und einer mit feinen Löchern verse­ henen Platte gebildet sein. Fig. 4 zeigt die Konfiguration für einen solchen Spalt. Wie im Fall des Ausführungsbei­ spiels 1 werden 20 Kapillaren 1a bis 1t als Molekularge­ wicht-Trennbereich vom Mehrkapillarhalter 5a gehalten, und sie sind in der optischen Zelle 60 fixiert. Eine mit feinen Löchern mit einem Innendurchmesser von 200 µm versehene Platte 62 ist an der der optischen Zelle 60 gegenüberliegen­ den Seite befestigt. Feine Löcher 61a bis 61t sind an Posi­ tionen vorhanden, die jeweils den Kapillaren 1a bis 1t ent­ sprechen, was zur Ausbildung der Spalte führt. Wenn die Um­ mantelungslösung strömt, wird die von jeder Kapillare aus­ gehend wandernde Probe jeweils in das entsprechende feine Loch eingeleitet. Das Gefäß für die gesammelte Lösung 63 liegt unterhalb der Platte 62, um die durch die feinen Lö­ cher tretende Lösung aufzufangen, und die Lösung wird dann durch eine Leitung 64 zu einem Gefäß für eine Elektrode 65 geführt.

Elektrophorese wird auf dieselbe Weise wie beim Ausführungs­ beispiel 1 dadurch ausgeführt, daß Spannung an das Gefäß für die Elektrode 65 und ein anderes (nichtdargestelltes) Gefäß für eine Elektrode gelegt wird.

Ausführungsbeispiel 5

Im Gegensatz zum Fall beim Ausführungsbeispiel 1 ist es mög­ lich, eine Anordnung für Elektrophorese durch die Strömung einer Ummantelungslösung nur unter Verwendung der stromauf­ wärtigen Kapillaren, ohne Verwendung der stromabwärtigen, zu entwerfen. Fig. 5 zeigt den Aufbau eines solchen Elektro­ phoresegeräts. Wie im Fall des Ausführungsbeispiels 1 sind die Enden von Kapillaren 1a bis 1t in einer optischen Zelle 4 angeordnet, und sie werden in dieser festgehalten. Die Ka­ pillaren sind durch einen Mehrkapillarhalter 5a aus einem plattenförmigen Block aus einem fluorhaltigen Polymer, wie Tetrafluorethylen, der mit zwanzig Vertikallöchern mit Ab­ ständen von 0,6 mm versehen ist, in der optischen Zelle be­ festigt. Die Kapillaren 1a bis 1t sind jeweils in die zwan­ zig Vertikallöcher des Mehrkapillarhalters 5a eingesetzt, und derselbe ist in dichter Berührung mit der Oberseite der Fluoreszenzzelle 4 befestigt. Der Boden der Fluoreszenzzelle 4 ist mit einer Abdichtungsplatte 70 und einer Leitung 71 aus einem Tetrafluorethylen-Polymer verbunden, das in das Gefäß für die Anodenelektrode 7 eingetaucht ist, um die Strömung der Ummantelungslösung und Elektrophorese zu erlau­ ben. Die Fluoreszenzzelle 4 ist mit dem Einlaß 8 für die Um­ mantelungslösung versehen, damit sie mit derselben gefüllt werden kann, wozu diese Ummantelungslösung 11 aus der Umman­ telungslösungflasche 10 durch die Leitung 9 aus dem Tetra­ fluorethylen-Polymer eingefüllt wird. Wenn das Niveau der Ummantelungsflüssigkeitslösung in der Ummantelungslösungs­ flasche 10 höher als das Niveau der Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode 7 ist, kann eine Probenwanderung von den Kapillaren 1a bis 1t, ausgehend durch diesen Überstand, in der Ummantelungslösung aufrechterhalten werden, wobei die Strömung zur Fluoreszenzzelle 4 erfolgt. Diese Lösung wird schließlich in das Gefäß für die Anodenelektrode 7 geleitet.

Elektrophorese wird durch eine Gleichspannung ausgeführt, die von einer Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 12 ge­ liefert wird und zwischen das Gefäß für die Kathodenelektro­ de 6 und das Gefäß für die Anodenelektrode 7 gelegt wird. Direkt unterhalb der Kapillaren kommt eine Probe, die durch eine der Kapillaren wandert, nicht in Berührung mit Proben, die durch andere Kapillaren wandern, sondern sie wandern durch die optische Zelle und erreichen schließlich das Gefäß für die Anodenelektrode 7. Die Proben werden dadurch erfaßt, daß Laserlicht 500 µm unter den Enden der Kapillaren in die Fluoreszenzzelle 4 eingestrahlt wird und die Fluoreszenz­ strahlung empfangen wird.

Das Photodetektorsystem ist auf dieselbe Weise aufgebaut wie beim Ausführungsbeispiel 1. Die Vorgehensweise zum Ausbilden der Ummantelungsströmung unterscheidet sich beim vorliegen­ den Ausführungsbeispiel jedoch grundsätzlich von derjenigen beim Ausführungsbeispiel 1. Beim vorliegenden Ausführungs­ beispiel strömt die Ummantelungslösung mit laminarer Strö­ mung durch die gesamte optische Zelle. Infolgedessen unter­ scheidet sich die Strömungsgeschwindigkeit der Ummantelungs­ lösung abhängig vom Ort innerhalb der optischen Zelle leicht von Ort zu Ort, und auch die Probenwanderungspfade neigen zu Schwankungen; derartige instabile Zustände treten auf. Hin­ sichtlich der Empfindlichkeit und des Aufbaus des Gerätes können jedoch beinahe dieselben Ergebnisse erhalten werden wie beim Ausführungsbeispiel 1.

Ausführungsbeispiel 6

Das Ausführungsbeispiel 1 kann so abgewandelt werden, daß der Spalt dadurch gebildet wird, daß eine Platte mit zwei oder mehr Nuten statt der stromabwärtigen Kapillaren verwen­ det wird. Fig. 6 ist eine Schrägansicht einer mit mehreren Nuten versehenen Platte. Die Figur zeigt einen Fall, gemäß dem vier Nuten vorhanden sind, die vier Kapillaren entspre­ chen. Nuten 61a, 61b, 61c und 61d sind in einer Seite einer Platte 80 ausgebildet, die an die Form des Inneren der Fluo­ reszenzzelle 4 angepaßt ist. Die Form der Nuten entspricht der Größe der Kapillaren für die molekulargewichtsmäßige Trennung. Z. B. ist eine Nut so ausgebildet, daß sie eine Breite von 300 µm und eine Tiefe von 600 µm aufweist. Der Abstand zwischen den Nuten ist 1 mm. Es ist zu beachten, daß der Abstand und die Nut je nach Erfordernis verändert werden können. Fig. 7 ist eine perspektivische Schnittdarstellung der Fluoreszenzzelle 4 des Elektrophoresebereichs eines Elektrophoresegeräts, das die oben genannte Platte verwen­ det. Die Fluoreszenzzelle 84 weist Innenabmessungen mit 20 mm Breite, 3 mm Tiefe und 40 mm Länge auf. Es wird eine Strömungszelle mit einer (Quarz-)Glasplatte mit einer Dicke von 2 mm verwendet, wobei die Ober- und die Unterseite ge­ öffnet sind. Die Figur zeigt auch, daß bei der Fluoreszenz­ zelle der Glasbereich an der Vorderseite angeordnet ist. Die Platte 80 ist in engem Kontakt in die Fluoreszenzzelle 84 eingesetzt, so daß vier Pfade mit den Nuten 81a, 81b, 81c und 81d sowie dem Fluoreszenzzellenglas gebildet sind. Ka­ pillaren 82a, 82b, 82c und 82d mit einem Innendurchmesser von 100 µm und einem Außendurchmesser von 200 µm (Gel ist mit derselben Vorgehensweise wie beim Ausführungsbeispiel 1 eingebracht) sind durch einen Mehrkapillarhalter 83 inner­ halb der Fluoreszenzzelle 84 befestigt. Der Abstand zwischen den Kapillaren ist 1 mm, in Übereinstimmung mit dem Abstand zwischen den Nuten, und es erfolgt eine Ausrichtung, die gewährleistet, daß die Kapillarachsen mit der Mittelachse jeder Nut übereinstimmen. Diese Einstellung wird dadurch vorgenommen, daß die Positionen der Löcher im Mehrkapillar­ halter 83 eingestellt werden. Die Enden der Kapillaren 82a, 82b, 82c und 82d sind im Mehrkapillarhalter 83 angeordnet, und die Einstellung erfolgt so, daß jedes Kapillarende etwa 1 mm vor der Platte 80 steht. Elektrophorese wird dadurch ermöglicht, daß der Boden der Fluoreszenzzelle in Berührung mit einer Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode 7 gebracht wird. Wie im Fall der Ausführungsbeispiele 4 oder S, ist es auch möglich, eine Verbindung mit dem Gefäß für die Elektrode über eine Leitung herzustellen. Die Fluores­ zenzzelle 84 ist mit einem Einlaß 85 für Ummantelungslösung versehen, um sie mit Ummantelungslösung 88 aus einer Umman­ telungslösungflasche 87 über eine Leitung 86 aus einem Tetrafluorethylen-Polymer aufzufüllen.

Wenn das Niveau der Ummantelungslösung 88 in der Ummante­ lungslösungsflasche 87 höher eingestellt wird als das Niveau der Pufferlösung im Gefäß für die Anodenelektrode, kann eine Probenwanderung aus den Kapillaren 81a bis 81t in der Umman­ telungslösung durch den Überstand aufrechterhalten werden, um eine Strömung zum Gefäß für die Anodenelektrode durch die Nuten 81a, 81b, 81c und 81d zu erzielen. Zur Elektrophorese, für die Lasereinstrahlung und die Fluoreszenzstrahlungser­ fassung wird dieselbe Vorgehensweise verwendet, wie sie für das Ausführungsbeispiel 1 beschrieben wurde, was zu wir­ kungsvoller und gleichzeitiger Erfassung von Proben führt, die jeweils durch zwei oder mehr Kapillaren getrennt werden.

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die stromabwärti­ ge Seite durch die Platte mit den Nuten, nicht durch Kapil­ laren gebildet. Dies erlaubt eine einfache Einstellung der Enden der Nuten. Wenn die Platte aus Quarzglas besteht, tritt keine Fluoreszenzstrahlung auf, selbst wenn Laserlicht gegen die Platte hin streut, was einfachere Fluoreszenzer­ fassung gewährleistet.

Ausführungsbeispiel 7

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel werden mit Fluores­ zenzstoffen markierte DNS-Fragmente molekulargewichtsmäßiger Trennung durch Elektrophorese unterzogen, und sie werden durch Fluoreszenzstrahlung erfaßt. Im folgenden wird der Fall beschrieben, daß Fluoreszin und Fluoreszin-Isothio­ zyanat (FITC) als markierende Fluoreszenzstoffe verwendet werden.

Fig. 8 veranschaulicht den Aufbau eines Elektrophoresegerä­ tes gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel. Dieses ver­ wendet zwei Kapillaren, nämlich eine Silicatkapillare 101 mit einem Innendurchmesser von 100 µm, einem Außendurchmes­ ser von 375 µm und einer Länge von 30 cm sowie eine Silicat­ kapillare 102 mit demselben Innen- und Außendurchmesser und einer Länge von 5 cm. Fünf Prozent Polyacrylamidgel mit Harnstoff als Denaturierungsmittel ist in der Kapillare 101 vorhanden. Zunächst wird das Innere der Kapillare gereinigt, und es wird ein Silan-Haftvermittler eingebracht. Dann wird eine Lösung aus aus N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin und Ammoniumpersulfat mit 4,75 Prozent entgastem Acrylamid, 0,25 Prozent N,N′-Methylen-Bis-Acrylamid, 7 M Harnstoff, 2 mM EDTA und TRIS-Borat-Pufferlösung versetzt und in die Kapil­ lare eingefüllt, um Polymerisierung zu bewirken, und es wird ein Polyacrylamidgel hergestellt. Die Kapillare wird einer Silan-Haftvermittlung unterzogen, so daß das Acrylamid und die Kapillare chemisch aneinander haften und das Acrylamid während der Elektrophorese nicht aus der Kapillare herausge­ drückt wird. Die Kapillare 102 wird so bearbeitet, daß ihre Innenwand positiv geladen ist. Zunächst wird eine Lösung von 3-(2-Aminoethylaminopropyl)-Trimethoxysilan in die Kapillare eingefüllt, um eine Reaktion hervorzurufen, und es erfolgt eine Wärmebehandlung bei 110°C. Ein Aminosäurerest wird in die Innenwand der Kapillare eingeführt, wodurch die Innen­ wand positiv geladen wird. Dies bewirkt, daß sich die Rich­ tung des elektroosmotischen Flusses innerhalb der Kapillare 102 so ändert, daß sie von negativ nach positiv erfolgt. Die Wanderungsrichtung einer Probe in der mit dem Polyacrylamid­ gel aufgefüllten Kapillare 101 (von negativ nach positiv) stimmt mit derjenigen für die Probe in der Kapillare 102 überein (von negativ nach positiv), was zu leichter Proben­ wanderung führt.

Die Enden der Kapillaren 101 und 102 werden einander gegen­ überstehend in der optischen Zelle gehalten, und die Proben werden chemisch erfaßt. Um eine Probe durch Fluoreszenz­ strahlung zu erfassen, wird eine Fluoreszenzzelle als opti­ sche Zelle verwendet. Die Enden der Kapillaren 101 und 102 werden koaxial einander gegenüberstehend so gehalten, daß ein Spalt 103 von 0,1 mm Weite innerhalb der quaderförmigen Quarz-Fluoreszenzzelle 101 (Außenweite 3 mm im Quadrat, In­ nenweite 1 mm im Quadrat) gebildet ist, und der Raum im Spalt wird als optischer Detektor verwendet. Die anderen Enden der Kapillaren 101 und 102 sind jeweils in ein Gefäß für eine Kathodenelektrode 195 bzw. ein Gefäß für eine Ano­ denelektrode 106 eingetaucht, die mit Pufferlösung (TRIS- Borat-EDTA-Pufferlösung) gefüllt sind. Glyzerol enthaltende Pufferlösung wird in die Quarzfluoreszenzzelle 104 einge­ füllt, und der Spalt 103 wird mit Pufferlösung aufgefüllt. Durch eine Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 107 wird eine hohe Gleichspannung zwischen das Gefäß für die Katho­ denelektrode 105 und das Gefäß für die Anodenelektrode 106 gelegt. Wenn die Spannung angelegt wird, läuft ein Strom durch die Kapillare 102, den Spalt 103 und die Kapillare 101. Da der Spalt 103 kurz ist, fließt in ihm ein Strom ent­ lang der Linie, die die Achsen der Kapillaren 102 und 103 verbindet. Daher läuft die wandernde Probe aus der Kapillare 101 heraus und durchläuft den Spalt 103 ohne starke Aufwei­ tung, und dann fließt sie in die Kapillare 102. D. h., daß die Probe wandert, ohne daß sie die Fluoreszenzzelle 104 be­ rührt. Pufferlösung mit Glyzerol wurde in die Fluoreszenz­ zelle 104 und damit den Spalt 103 gefüllt; das Zusetzen von Glyzerol soll dazu dienen, den Einfluß von Konvektion auf­ grund erhöhter Viskosität der Pufferlösung zu verringern, und um die elektromagnetische Stärke zu erhöhen. Eine ge­ steuerte Konvektion der Pufferlösung und erhöhte elektroma­ gnetische Intensität verringert ein Aufweiten der Probe im Spalt 103, was leichte Wanderung d 34003 00070 552 001000280000000200012000285913389200040 0002004313367 00004 33884er Probe von der Kapillare 101 zur Kapillare 102 zuläßt.

Um diese Aufgabe zu lösen, wird beim Ausführungsbeispiel Glyzerol verwendet. Andere Substanzen können verwendet wer­ den, wenn sie hohe Viskosität aufweisen und für Elektropho­ rese geeignet sind. Z. B. können Polyethylenglykol, Saccha­ rose usw. verwendet werden. Wenn der Spalt 103 eng ist, kann normale Pufferlösung ohne Glyzerol verwendet werden. Um mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente als Proben einzu­ leiten, wird ein Ende der Kapillare 101 auf der Kathodensei­ te zeitweilig in die Probenlösung eingetaucht, und eine Spannung von 5 kV wird für etwa 20 Sekunden zwischen die Probenlösung und das Gefäß für die Anodenelektrode 106 ge­ legt. Das Ende der Kapillare 101 wird dann in das Gefäß für die Kathodenelektrode 105 rückgeführt, und eine Gleichspan­ nung von 10 kV wird zwischen das Gefäß für die Kathodenelek­ trode 105 und das Gefäß für die Anodenelektrode 106 gelegt. Dann wandert die Probe in der Kapillare 101 von der Kathode zur Anode, während sie einer molekulargewichtsmäßigen Tren­ nung unterliegt, und sie läuft durch den Spalte 103.

Laserlicht 109 mit einer Wellenlänge von 488 nm von einer Argonlaserquelle 108 wird durch eine Linse 110 auf etwa 20 µm gebündelt und auf die DNS-Fragmente gestrahlt, die durch den Spalt 103 laufen. Von den DNS-Fragmenten abgegebe­ ne Fluoreszenzstrahlung 111 wird von einer Linse 112 recht­ winklig zur Richtung gesammelt, in der das Laserlicht einge­ strahlt wird. Hintergrundsignale, wie solche von gestreutem Licht, werden durch ein Interferenzfilter 113 beseitigt, und das Bild wird durch einen Schlitz 115 über eine Linse 114 abgebildet. Das durch den Schlitz 115 tretende Licht wird durch einen Photovervielfacher 116 erfaßt und von einem Ver­ stärker 117 verstärkt. Dann wird das Elektrophoresemuster durch einen Datenprozessor 118 eines Computers oder derglei­ chen verarbeitet, und die Ergebnisse werden auf einem Moni­ tor 119 dargestellt und auf einem Drucker 120 ausgegeben oder in einem Speicher 121 gespeichert.

Um wirkungsvolle Erfassung der vom FITC emittierten Fluores­ zenzstrahlung zu gewährleisten, verwendet das Interferenz­ filter 113 ein Bandpaß-Interferenzfilter, das Transmission im Wellenlängenband von 500 bis 540 nm zuläßt. Die Linsen­ systeme 112 und 114 sind so ausgebildet, daß sie zwei Bild­ vergrößerungen erlauben. Die Öffnung des Schlitzes 115 ist in Elektrophoreserichtung auf 50 µm und in Laserlichtrich­ tung auf 100 µm eingestellt, und es erfolgt eine Einstel­ lung, die gewährleistet, daß das Fluoreszenzstrahlungsbild im Spalt 103 in der Mitte der Öffnung angeordnet ist. Da Proben nur dicht beim Spalt 103 wandern, wird das Bild des gestreuten Laserlichts an der Quarzfluoreszenzzelle 104 nicht in der Öffnung des Schlitzes 115 abgebildet und vom Photovervielfacher 116 wegen des Aufbaus des optischen Sy­ stems nicht erfaßt. Durch die Kapillare und das Gel werden kein Streulicht und keine Fluoreszenzstrahlung erzeugt, was zu wesentlich verringerter Hintergrundstrahlungsintensität führt.

Fig. 9 ist eine vergrößerte Schnittdarstellung der Fluores­ zenzzelle. Die Quarzfluoreszenzzelle 104 wird durch Mehr­ kapillarhalter 123a und 123b festgehalten. Ein Auslecken von Flüssigkeit wird durch Dichtungen 122a und 122b aus Silicon­ gummi zwischen der Fluoreszenzzelle 104 und den Haltern 123a und 123b verhindert. Die Kapillare 101 ist mit dem Mehrka­ pillarhalter 123a über eine Muffe aus Tetrafluorethylen- Polymer und eine Schraube 125a verbunden. Entsprechend ist die Kapillare 102 durch eine Muffe 124a und eine Schraube 125a befestigt. Der Spalt zwischen der Kapillare 101 und der Kapillare 102 kann dadurch frei eingestellt werden, daß die Länge der Kapillare, ausgehend von der Muffe, festgelegt wird. Beim Ausführungsbeispiel ist er 0,1 mm breit, wie oben angegeben. Die Fluoreszenzzelle ist mit einem Lösungseinlaß versehen, um Pufferlösung einzufüllen. Sie ist auch mit Ven­ tilen 126a und 126b verbunden, die dazu verwendet werden, die Fluoreszenzzelle 104 mit Pufferlösung zu füllen, nachdem die Kapillaren angebracht sind. Die Lösungseinlässe, wie derjenige für den Puffer, sind am Halter der Fluoreszenz­ zelle angebracht.

Um mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente unter Ver­ wendung des Gerätes des vorliegenden Ausführungsbeispiels zu erfassen, wurde ein Versuch ausgeführt. Mit Fluoreszenzstof­ fen markierte DNS-Fragmente wurden durch eine DBA-Polymera­ sereaktion ausgeführt, und zwar mit dem von Sanger und sei­ nem Kollegen erfundenen Didesoxy-Sequenzerstellungsverfahren unter Verwendung eines mit einem Fluoreszenzstoff markierten Startermoleküls. Das Startermolekül wird mit Fluoresziniso­ thiozyanat (FITC) verbunden (markiertes Startermolekül). Zu­ nächst wird das markierte Startermolekül einer einsträngigen DNS zugesetzt und erwärmt, wodurch das markierte Startermo­ lekül mit der einsträngigen DNS verbunden wird. Dann werden dATP, dTTP, dCTP, dGTP und ddATP hinzugefügt, um für eine DNS-Polymerasereaktion zu sorgen. Der obige Ablauf ergibt mit den Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente mit ver­ schiedenen Längen, mit der Endgruppe A.

Wie oben ausgeführt, kann das Molekulargewicht-Trennmuster der DNS-Fragmente dadurch gemessen werden, daß die Proben in die Kapillare eingeleitet werden und die Fluoreszenzstrah­ lungsintensität im Spalt gemessen wird. Darüber hinaus wird beim vorliegenden Ausführungsbeispiel die Hintergrundstrah­ lungsintensität auf etwa ein Zehntel oder weniger im Ver­ gleich zur Verwendung des herkömmlichen Verfahrens verrin­ gert, bei dem Fluoreszenzerfassung ohne Ausbildung des Spalts erfolgt, z. B. unter Verwendung von Kapillaren der­ selben Form mit einer Länge von 35 cm mit einem Elektropho­ reseweg von 30 cm, wobei die Schutzfilme der Kapillaren für die Fluoreszenzerfassung abgeschält werden; durch die gerin­ gere Hintergrundstrahlung können Proben mit geringerer Kon­ zentration erfaßt werden.

Das Verfahren beim vorliegenden Ausführungsbeispiel erlaubt hochempfindliche Erfassung von Proben unter Verwendung des genannten Gels, ohne Verlust der Eigenschaften molekularge­ wichtsbezogener Trennung. Darüber hinaus können die Proben nur in einem vorgegebenen Bereich innerhalb der Fluoreszenz­ zelle für Fluoreszenzerfassung wandern, ohne daß eine Pumpe zum Hervorrufen der Strömung der Pufferlösung verwendet wird; dadurch ist ein einfacher Geräteaufbau möglich.

Die verwendete Laserausrüstung und die verwendeten Fluores­ zenzstoffe sind nicht auf einen Argonlaser bzw. FITC be­ schränkt; jeder Fluoreszenzstoff und jede geeignete Laser­ ausrüstung kann verwendet werden. Ferner erlaubt es das ak­ tuelle Verfahren, zwei oder mehr Fluoreszenzstoffe gleich­ zeitig zu erfassen. In diesem Fall werden Sätze optischer Detektoranordnungen mit einer Linse 112, einem Interferenz­ filter 113, einer Linse 114, einem Schlitz 115 und einem Photovervielfacher 116 mit der Anzahl der Fluoreszenzstoffe entsprechender Zahl angeordnet, und jede Detektoranordnung wird so ausgebildet, daß sie die Fluoreszenzstrahlung in einem besonderen Wellenlängenband erfaßt. Es ist auch mög­ lich, die Fluoreszenzstrahlung in einen Spektrographen zu leiten und einen Zeilensensor für Photoerfassung zu verwen­ den.

Auch dieses Gerät kann dazu verwendet werden, die DNS-Basen­ sequenz zu bestimmen. D. h., daß mit verschiedenen Fluores­ zenzstoffen markierte Startermoleküle für jeweils einen Typ der endständigen Base verwendet werden und Reaktionslösungen vermischt werden, um Elektrophorese nach jeder DNS-Polymera­ sereaktion auszuführen. Der Typ der Base kann dadurch fest­ gestellt werden, daß die Fluoreszenzstrahlung der durch den Spalt laufenden DNS-Fragmente erfaßt wird und dabei die Art der Fluoreszenzstrahlung identifiziert wird, wodurch die Basensequenz festgestellt werden kann. Um die Art des Fluo­ reszenzstoffs zu identifizieren, ist es erforderlich, vier Sätze von Detektoren bereitzustellen, um die Fluoreszenz­ strahlung in vier Wellenlängenbändern zu messen, wie dies zuvor unter Bezugnahme auf Fig. 8 beschrieben wurde.

Das vorliegende Ausführungsbeispiel wurde für die Erfassung von DNS-Fragmenten beschrieben. Das Verfahren ist aber auch auf die Analyse von z. B. Proteinen, Zucker und ähnlichen Substanzen anwendbar. Ferner wurden beim Ausführungsbeispiel zwei Kapillaren mit demselben Innendurchmesser verwendet. Es ist jedoch auch möglich, eine Kombination von Kapillaren mit verschiedenen Innendurchmessern zu verwenden. Wenn z. B. der Innendurchmesser der Kapillare 102 kleiner ausgebildet wird als derjenige der Kapillare 101, wird das Volumen verrin­ gert, wenn Proben, die ausgehend von der Kapillare 101 wan­ dern, in die Kapillare 102 eintreten. Dies führt zu höherer Konzentration der Probenlösung, was hochempfindliche Erfas­ sung gewährleistet. Wenn umgekehrt der Durchmesser der Ka­ pillare 102 größer ausgebildet wird als derjenige der Kapil­ lare 101 können die von der Kapillare 101 ausgehend wandern­ den Proben einfacher und zuverlässiger in die Kapillare 102 eingeleitet werden.

Ferner erlaubt es das Verfahren beim vorliegenden Ausfüh­ rungsbeispiel, Fluoreszenzstrahlung zu erfassen, ohne daß Anregungslicht durch den Kapillarbereich läuft, so daß die Kapillaren nicht durchsichtig sein müssen; es muß keine Ka­ pillarummantelung entfernt werden, was zu einfacher Handha­ bung führt. Dies erlaubt auch die Verwendung von Kapillaren aus lichtundurchlässigen fluorhaltigen Polymeren, wie einem Tetrafluorethylen-Polymer oder einem chlorhaltigen Trifluor­ ethylen-Polymer. Kapillaren aus einem fluorhaltigen Polymer zeigen geringe Anhaftung für Proben, was das Erfordernis einer Behandlung, wie einer Oberflächenbehandlung, besei­ tigt. Darüber hinaus besteht keine Beschädigungsgefahr, was ausgezeichnete Handhabbarkeit ergibt. Ferner erlaubt die überragende Beständigkeit gegen Chemikalien die Verwendung von Lösungsmittel über einen sehr großen Bereich von pH-Wer­ ten.

Ausführungsbeispiel 8

Im folgenden wird ein Gerät mit vier parallel angeordneten Kapillaren für gleichzeitige Fluoreszenzstrahlungserfassung beschrieben. Fig. 10 zeigt den Aufbau des Fluoreszenzdetek­ tors des Elektrophoresegeräts des aktuellen Ausführungsbei­ spiels. Mit 127a, 127b, 127c und 127d sind in der Figur Si­ licatglaskapillaren mit einem Innendurchmesser von 100 µm, einem Außendurchmesser von 375 µm und einer Länge von 30 cm bezeichnet. Ein (nichtdargestelltes) Ende der Kapillaren ist wie bei dem in Fig. 8 dargestellten Fall in das Gefäß für die Kathodenelektrode eingetaucht. Entsprechend weisen Sili­ catglaskapillaren 128a, 128b, 128c und 128d entsprechenden Innen- und Außendurchmesser auf, mit einer Länge von 5 cm, von denen jeweils ein Ende in das Gefäß für die Anodenelek­ trode eingetaucht ist.

Mit demselben Verfahren, wie es für das Ausführungsbeispiel 7 beschrieben wurde, werden 5 Prozent Polyacrylamidgel mit Harnstoff als Denaturierungsmittel in den Kapillaren herge­ stellt. Jede Kapillare wird einer Behandlung mit einem Si­ lan-Haftvermittler unterzogen, damit das Acrylamid und die Kapillare chemisch aneinander haften, wobei auch berücksich­ tigt ist, daß das Acrylamid während der Elektrophorese nicht aus der Kapillare auslaufen soll. Die Kapillaren 127a bis 127d und die Kapillaren 128a bis 128d werden von quaderför­ migen Fluoreszenzzellen 129a bis 129d gehalten und sind so angebracht, daß zwei oder mehr optische Detektoren gebildet werden. Die Kapillaren werden durch Kapillarhalter 142 und 143 eines plattenförmigen Blocks aus einem fluorhaltigen Polymer, wie Tetrafluorethylen, gehalten, der mit vier Ver­ tikallöchern im Abstand von 1 mm versehen ist. Jede Kapilla­ re ist in jeweils eines der vier Vertikallöcher eingesetzt, so daß jeweils Kapillaren 127a und 128a, 127b und 128b, 127c und 128c sowie 127d und 128d jeweils koaxial sind.

Zur Fluoreszenzstrahlungserfassung wird eine Pufferlösung mit Glyzerol in die Quarzfluoreszenzzelle 30 eingefüllt, wo­ durch die Spalte 129a bis 129d mit Pufferlösung ausgefüllt werden. Wenn in diesem Zustand Spannung angelegt wird, wan­ dert die in die Kapillare 127a eingeleitete Probe in den Spalt 129a und dann zur Kapillare 128a. Proben, die in ande­ re Kapillaren eingeleitet werden, wandern auf dieselbe Wei­ se. Das Glyzerol in der Pufferlösung beschränkt die Konvek­ tion derselben in den Spalten, wie beim Fall des Ausfüh­ rungsbeispiels 7, und es gewährleistet zuverlässige und gleichmäßige Wanderung der Proben von den Kapillaren 127a bis 127d zu den Kapillaren 128a bis 128d.

Die Fluoreszenzstrahlungserfassung der durch die Spalte 129a bis 129d laufenden DNS-Fragmente wird wie folgt ausgeführt. Zunächst wird Laserlicht 132 von einer Laserquelle 131 durch eine Linse 133 so kollimiert, daß gleichzeitige Bestrahlung zweier oder mehrerer optischer Detektoren, d. h. der Spalte 120a bis 129d möglich ist. Der Brennpunkt wird in die Posi­ tion in der Mitte zwischen den Spalten 129b und 129c einge­ stellt, und es erfolgt eine solche Justierung, daß der Maxi­ maldurchmesser des Bestrahlungsflecks zwischen den Spalten 129a und 129d 100 µm ist. Wenn eine Linse 33 mit einer Brennweite von z. B. 150 mm verwendet wird, ist es möglich, die Spalte 129a bis 129d mit im wesentlichen derselben Fleckgröße zu beleuchten.

Fluoreszenzstrahlung, die von den durch jeden Spalt laufen­ den DNS-Fragmenten emittiert wird, wird durch eine Linse 134 rechtwinklig zur Einstrahlungsrichtung des Laserlichts ge­ sammelt, und Hintergrundstrahlung, wie solche von Streu­ licht, wird durch ein Abblockfilter 135 entfernt. Dann er­ folgt Sammlung durch eine Linse 136, und ein Bild wird auf einen Zeilensensor 137, wie einer CCD-Kamera oder einem Pho­ todiodenarray, ausgebildet.

Nachdem Daten vom Ausgang des Zeilensensors 137 ausgegeben worden sind, wird das Elektrophoresemuster und dergleichen einer Datenverarbeitung durch einen Datenprozessor 138 eines Computers oder einer ähnlichen Vorrichtung unterzogen, und die Ergebnisse werden auf einem Monitor 139 dargestellt und auf einem Drucker 140 ausgegeben oder in einem Speicher 141 abgespeichert.

Unter Verwendung eines Argonlasers als Lichtquelle und einer FITC-Lösung als Probe wird kontinuierliche Elektrophorese im Innern der Kapillaren 127a bis 127d ausgeführt. Wenn Fluo­ reszenzbilder der in den Räumen zwischen den Spalten, die optische Detektoren darstellen, wandernden Proben durch den Zeilensensor 137 erfaßt werden, wird intensive Fluoreszenz­ strahlung an den vier Positionen der Spalte 129a bis 129d erfaßt, d. h. von optischen Detektoren, die den Wanderungs­ pfaden entsprechen, wobei jeder von den anderen optischen Detektoren unabhängig ist. Dauernde und gleichzeitige Erfas­ sung der in den Kapillaren wandernden Proben ist dadurch möglich, daß die Intensität der Signale auf dem Zeilensensor an den den Wanderungspfaden entsprechenden Positionen gemes­ sen werden.

Das Verfahren beim vorliegenden Ausführungsbeispiel erlaubt Fluoreszenzstrahlungserfassung von gleichzeitig wandernden Proben durch zwei oder mehr optische Detektoren unter den­ selben Bedingungen. Es erlaubt auch eine Analyse über einen weiten Bereich, z. B. zur DNS-Basensequenzbestimmung oder zur gleichzeitigen Bestimmung einer Mehrproben-DNS-Basense­ quenz, eine Analyse des Seitenstrangs oder einer funktionel­ len Gruppe unter Verwendung eines Fluoreszenzstoffs und eine detaillierte Analyse von Proben, die durch Flüssigchromato­ graphie getrennt wurden. Ein einziger Fluoreszenzstrahlungs- Sammelbereich mit einer Linse ist ausreichend; dieses Merk­ mal gewährleistet verringerte Kosten und einfache Struktur.

Ferner sind beim Ausführungsbeispiel Paare von Kapillaren entlang einer Reihe angeordnet, und Spalträume sind entlang einer geraden Linie ausgerichtet, wobei Laserlicht entlang den Spalten eingestrahlt wird, in denen keine Kapillare vor­ handen ist. Daher wird das Laserlicht nicht durch Kapillaren gestreut oder gebrochen, wodurch jeder Spalt mit im wesent­ lichen derselben Strahlgröße beleuchtet werden kann. Dies erlaubt einen einfachen Aufbau des Geräts mit wirkungsvoller Anregung der zwei oder mehr Proben und demgemäß empfindliche Erfassung. Wenn eine ähnliche Fluoreszenzstrahlungserfassung dadurch ausgeführt wird, daß zwei oder mehr Kapillaren ohne Vorsehen eines Spalts angeordnet werden, wenn z. B. zwei oder mehr Kapillaren ohne Ummantelung, ähnlich wie im her­ kömmlichen Fall, angeordnet werden, wie in Fig. 13 darge­ stellt, wird das Laserlicht entlang der Einstrahlungsachse desselben jedesmal dann gestreut oder gebrochen, wenn es durch eine Kapillare läuft, und der Laserlichtdurchgang wird gebogen oder der Laserstrahl spreizt auf, wodurch es nicht möglich ist, Kapillaren mit denselben Bedingungen zu be­ leuchten; daher erhalten in der Reihe weiter hinten angeord­ nete Kapillaren nicht ausreichend Anregungslaserlicht. In diesem Fall ist es schwierig, zwei oder mehr Kapillaren an­ zuordnen. Beim Verfahren des vorliegenden Ausführungsbei­ spiels können dagegen auch dann, wenn zwei oder mehr Kapil­ laren vorhanden sind, alle darin wandernden Proben mit hoher Empfindlichkeit unter denselben Bedingungen erfaßt werden. Dieses Merkmal erleichtert gleichzeitige Erfassung vieler Proben.

Im folgenden wird ein Verfahren zur DNS-Basensequenzbestim­ mung unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Gerätes be­ schrieben.

Mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente werden durch eine DBA-Polymerasereaktion unter Verwendung eines mit Fluo­ reszenzstoffen markierten Startermoleküls gemäß dem wohlbe­ kannten Diseoxy-Sequenzerstellungsverfahren hergestellt, wie es von Sanger und seinem Kollegen erfunden wurde. Das Star­ termolekül ist ein mit FITC verbundenes Startermolekül (mar­ kiertes Startermolekül). Zunächst wird das markierte Star­ termolekül einer einsträngigen DNS zugesetzt, woraufhin er­ wärmt wird, wodurch sich das markierte Startermolekül mit der einsträngigen DNS verbindet. Diese Reaktionslösung wird in vier Teile unterteilt, die jeweils einer DNS-Polymerase­ reaktion für A, C, G bzw. T unterzogen werden. D. h., daß vier Arten von Desoxynukleotid-Triphosphat (dATP, dTTP, dCTP und dGTP) und ddATP als Endgruppe der einsträngigen DNS zu­ gesetzt werden, um die DNS-Polymerasereaktion zu bewirken. Diese Reaktion sorgt für mit Fluoreszenzstoffen markierte DNS-Fragmente mit verschiedenen Längen mit der Endgruppe A. Dieselbe Reaktion wird für C, G und T wiederholt.

Vier Reaktionslösungen A, C, G und T, wie sie mit dem obigen Ablauf erhalten wurden, werden jeweils in die Kapillaren 127a bis 127d eingeleitet. Dieses Verfahren ist dasselbe, wie es für das Ausführungsbeispiel 1 beschrieben wurde; die Reaktionslösung A wird in die Kapillare 127a eingeleitet, C in 127b, G in 127c und T in 127d. Dann wird eine Spannung von etwa 10 kV angelegt, um Elektrophorese hervorzurufen. Die zeitliche Änderung der Fluoreszenzstrahlung in den Spal­ ten 129a bis 129d wird gemessen, wobei als Anregungslicht­ quelle ein Argonlaser mit einer Wellenlänge von 488 nm ver­ wendet wird. Da die DNS-Fragmente in einer Reihenfolge wan­ dern, die mit demjenigen mit dem kleinsten Molekulargewicht beginnt, kann die Basensequenz dadurch analysiert werden, daß die zeitliche Folge im Spalt analysiert wird, mit der Spitzensignale in der Fluoreszenzstrahlung auftreten.

Auch beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist wie beim Aus­ führungsbeispiel 7 die Intensität der erfaßten Hintergrund­ strahlung verringert, und hochempfindliche Fluoreszenzstrah­ lungserfassung ist gewährleistet. Darüber hinaus erlaubt ein einfacher Geräteaufbau gleichzeitige Erfassung von zwei oder noch mehr Proben.

Gleichzeitge Erfassung von DNS-Basensequenzen für viele Pro­ ben ist möglich, wenn ein Gerät so aufgebaut wird, daß der Fluoreszenzstoff für jede Base geändert wird, Lösungen A, C, G und T gemischt werden und in eine vorgegebene Kapillare eingefüllt werden und die Änderung der Fluoreszenzstrah­ lungsintensität für jede Emissionswellenlänge der Fluores­ zenzstrahlung von jedem Fluoreszenzstoff zeitabhängig für jede der zwei oder mehr Kapillaren gemessen wird.

Ausführungsbeispiel 9

Die Ausführungsbeispiele 7 und 8 veranschaulichten ein Ge­ rät, das Proben durch Messen der Fluoreszenzstrahlung er­ faßt. Derselbe Geräteaufbau ist für eine Erfassung absor­ bierten oder transmittierten Lichts möglich. Fig. 11 zeigt einen Aufbau eines Elektrophoresegeräts für Messung durch Lichtabsorption. Wanderungspfade verwenden zwei Silicanglas­ kapillaren, nämlich eine Kapillare 151 mit einem Innendurchmesser von 100 µm, einem Außendurchmesser von 200 µm und einer Län­ ge von 30 cm sowie eine Kapillare 152 mit entsprechenden In­ nen- und Außendurchmessern und einer Länge von 20 cm. Fünf Prozent Polyacrylamidgel mit Harnstoff als Denaturierungs­ mittel werden in den Kapillaren 151 und 152 hergestellt. Das Verfahren zum Herstellen des Gels ist dasselbe wie beim Aus­ führungsbeispiel 7; Acrylamidgel wird chemisch mit der Ka­ pillare verbunden, die mit einem Silan-Haftvermittler verse­ hen ist.

Die Enden der Kapillaren 151 und 152 werden in einer opti­ schen Zelle 154 gehalten, und die Intensität von Transmis­ sionslicht, die von der Probenabsorption abhängt, wird wie im Fall des Ausführungsbeispiels 7 erfaßt. Die optische Zel­ le 154 ist eine quaderförmige optische Zelle (außen 3 mm im Quadrat, innen 1 mm im Quadrat) mit vier lichtdurchlässigen Seiten. Wie beim Aufbau der Fig. 7 und 8 wird jeweils ein Ende der Kapillaren 151 und 152 innerhalb der optischen Zel­ le 154 in solcher Weise gehalten, daß die zwei Kapillaren koaxial zueinander sind und ein Spalt 153 von 0,2 mm Weite ausgebildet wird.

Der Spalt 153 wird als optischer Detektor verwendet. Die an­ deren Enden der Kapillaren 151 und 152 sind in ein Gefäß für eine Kathodenelektrode 105 bzw. ein Gefäß für eine Anoden­ elektrode 106 eingetaucht, die mit Pufferlösung (TRIS-Borat- EDTA-Pufferlösung) gefüllt sind. Eine hohe Gleichspannung wird durch eine Hochspannungs-Gleichspannungsversorgung 107 zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode 105 und das Ge­ fäß für die Anodenelektrode 106 gelegt. Das Anlegen der Spannung ruft einen Strom durch die Kapillare 152, den Spalt 153 und die Kapillare 151 hervor, und die Proben wandern durch die Kapillare 151, den Spalt 153 und die Kapillare 152.

Um z. B. DNS-Fragmente einzufüllen, die durch ein Restrik­ tionsenzym aufgeschlossen wurden, wird das Ende der Kapilla­ re 151 zeitweilig an der Kathodenseite in eine Probenlösung eingetaucht, und eine Spannung von 5 kV wird für 10 Sekunden zwischen die Probenlösung und das Gefäß für die Anodenelek­ trode gelegt. Dann wird das Ende der Kapillare in das ur­ sprüngliche Gefäß für die Kathodenelektrode zurückgeführt, und eine Spannung von 10 kV wird zwischen das Gefäß für die Kathodenelektrode und das Gefäß für die Anodenelektrode ge­ legt. Es wird dafür gesorgt, daß die Probe in der Kapillare 11 von der Kathodenseite zur Anodenseite wandert, wobei sie eine molekulargewichtsmäßige Trennung erfährt. Sie läuft dann durch den Spalt 153 und wird in die Kapillare 152 ein­ geleitet.

Für die durch den Spalt 153 laufenden DNS-Fragmente wird das Licht von einer Lichtquelle 155, wie einer Xenonlampe oder einer D₂-Lampe, mittels einer Linse 157 kollimiert und durch einen Monochromator 156 geleitet und in den Spalt 153 einge­ strahlt. Die Wellenlänge des einzustrahlenden Lichts wird auf die Absorptionswellenlänge der Probe eingestellt. Z. B. wird sie im Fall von DNS-Fragmenten auf 260 nm eingestellt. Das nach Absorption durch die DNS-Fragmente vorhandene Transmissionslicht wird wieder durch eine Linse 158 gesam­ melt und durch einen Photovervielfacher 159 erfaßt. Das Aus­ gangssignal des Photovervielfachers 159 wird durch einen Verstärker 160 verstärkt, und das Elektrophoresemuster und dergleichen wird einer Datenverarbeitung durch einen Daten­ prozessor 138 eines Computers oder einer ähnlichen Vorrich­ tung unterzogen. Die Ergebnisse werden auf einem Monitor 162 und einem Drucker 163 ausgegeben oder in einem Speicher 164 abgelegt.

Der mit Pufferlösung ausgefüllte Spalt ist beim vorliegenden Ausführungsbeispiel zwischen den Kapillaren vorhanden, um eine Trennung zwischen dem Kapillarbereich als Molekularge­ wicht-Trennbereich und dem Spaltraum als optischem Detektor zum Messen der Lichtabsorption vorzunehmen. Diese Anordnung ermöglicht wirkungsvolle Bestrahlung der Probe, ohne daß das Licht durch die Kapillaren gestreut wird, was hochgenaue Er­ fassung durch Lichtabsorption gewährleistet.

Es sei angenommen, daß "1" die Transmissionslichtintensität ist (die numerische Apertur der Photodetektorlinse ist "0,19" bei fehlendem Durchlauf der Probe), wenn das Licht in den Spalt, wie beim vorliegenden Ausführungsbeispiel, ein­ tritt. Wenn das Licht, wie beim Stand der Technik, durch die Kapillare tritt, wird die Transmissionslichtintensität auf etwa 0,6 erniedrigt. Da die Kapillare selbst und das Gel, wie das Polyacrylamidgel, das das Medium für molekularge­ wichtsmäßige Trennung durch Elektrophorese ist, als Licht­ streukörper wirken, wird das eintretende Licht durch diese Körper gestreut, was zu verringerter Intensität des Trans­ missionslichts führt. Eine verringerte Intensität des Trans­ missionslichts bedeutet ein entsprechend verringertes S/R- Verhältnis des optischen Detektors, was zu verringerter Meß­ genauigkeit führt. Beim Stand der Technik wird auch ein Teil des von der Oberfläche einer Kapillare gestreuten oder re­ flektierten Lichts gemessen. Derartiges Licht tritt direkt in den Detektor ein, ohne daß es die Probe beleuchtet (ohne von der Probe absorbiert zu werden). Trotz des Vorhanden­ seins einer solchen Probe ist es schwierig, eine kleine Än­ derung der Lichtintensität zu erfassen, wenn eine zu erfas­ sende Lichtkomponente vorliegt; d. h., daß eine hochgenaue Messung der Lichtabsorption schwierig ist.

Da beim vorliegenden Ausführungsbeispiel das Licht durch den Spaltraum, d. h. die Pufferlösung mit minimaler Lichtstreu­ ung, tritt, wird das Licht nicht durch Streuung durch die Kapillare selbst und das Gel beeinflußt, wie beim obigen Fall. Dies gewährleistet wirkungsvolle Beleuchtung der Pro­ ben und hochgenaue Messung durch Lichtabsorption.

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird das durch den Mo­ nochromator 156 laufende Licht durch eine Linse gesammelt und in den Spalt eingestrahlt. Dieselbe Messung ist auch möglich, wenn das Licht in Form paralleler Strahlen ohne Lichtsammlung eingestrahlt wird und durch räumliche Trennung nur die Intensität desjenigen Lichts gemessen wird, das durch den Spalt lief.

Wie im Fall des Ausführungsbeispiels 8 ist auch gleichzeiti­ ge Erfassung der Absorption von Proben mit zwei oder mehr Paaren von Kapillaren möglich. In diesem Fall ist das Gerät wie folgt aufgebaut: zwei oder mehr Paare von Kapillaren sind innerhalb einer Fläche rechtwinklig zur Lichteinstrahl­ achse angeordnet, und die Intensität des Lichts durch jeden der zwei oder mehr Spalte wird durch einen zweidimensionalen Sensor oder eine ähnliche Vorrichtung erfaßt.

Ausführungsbeispiel 10

Bei den Ausführungsbeispielen 7 bis 9 wird der Spalt aus­ schließlich durch ein Paar Kapillaren gebildet. Der Moleku­ largewicht-Trennbereich besteht bei diesen Ausführungsbei­ spielen aus Kapillaren. Ein Spalt kann jedoch auch durch die Enden von Kapillaren und durch eine mit feinen Löchern ver­ sehene Platte gebildet werden.

Fig. 12 ist eine vergrößerte Darstellung des Querschnitts einer Fluoreszenzzelle, bei der ein Spalt durch eine Kapil­ lare und durch eine mit feinen Löchern versehene Platte ge­ bildet wird.

Wie im Fall des Ausführungsbeispiels 1 sind eine mit Poly­ acrylamidgel gefüllte Kapillare 171 und eine mit feinen Lö­ chern 172 versehene Platte 173 (z. B. eine Platte aus Tetra­ fluorethylen-Polymer) einander gegenüberstehend so angeord­ net, daß die Achse der Kapillare 171 mit dem feinen Loch 172 fluchtet und ein Spalt 174 ausgebildet wird. Sie werden in­ nerhalb einer Fluoreszenzzelle 175 gehalten. Es ist eine quaderförmige Fluoreszenzzelle mit Außenabmessungen von 3 mm im Quadrat und Innenabmessungen von 1 mm im Quadrat, wobei die Ober- und die Unterseite geöffnet sind. Sie wird z. B. durch einen oben liegenden Block 176 aus einem Tetrafluor­ ethylen-Polymer und durch eine unten liegende Platte 173 ge­ halten, wodurch Pufferlösung in ihr enthalten sein kann. Der Block 176 aus dem Tetrafluorethylen-Polymer ist mit einem Loch versehen, das an die Außenabmessung der Kapillare 171 angepaßt ist. Die Kapillare 171 ist durch dieses Loch so ge­ steckt, daß sie in ihm festgehalten wird, und die Länge 174 kann von 0,1 mm bis 1,0 mm eingestellt werden. Das andere Ende der Kapillare 171 ist, wie im Fall des Ausführungsbei­ spiels 1, in das Gefäß für die Kathodenelektrode einge­ taucht. Eine Leitung 177 aus Tetrafluorethylen-Polymer ist über einen Leitungshalter 178 mit dem Boden der Platte 173 verbunden, und sie führt zum Gefäß für die Anodenelektrode. Auch die Platte 173 kann in Kontakt mit dem Gefäß für die Anodenelektrode stehen.

Obwohl dies in Fig. 12 nicht dargestellt ist, ist innerhalb der Fluoreszenzzelle 175 ein Einlaß für Pufferlösung vorhan­ den wie im Fall von Fig. 9. Die Pufferlösung wird während der Elektrophorese über ein Ventil zugeführt, um die Fluo­ reszenzzelle 174, den Spalt 175 und die Leitung 177 aus dem Tetrafluorethylen-Polymer aufzufüllen. Nachdem die Zufuhr der Pufferlösung beendet wurde, wird dafür gesorgt, daß die Probe wandert. Das Verfahren bei diesem Ausführungsbeispiel sorgt, wie im Fall des Ausführungsbeispiels 7, für Fluores­ zenzstrahlungserfassung mit minimaler Intensität der Hinter­ grundbeleuchtung, was hochempfindliche Fluoreszenzstrah­ lungserfassung ermöglicht.

Die Anordnung feiner Löcher in der Platte 173 in einer gera­ den Linie erlaubt einen Aufbau einer Fluoreszenzzelle, die dieselben Wirkungen zeigt wie diejenige des Ausführungsbei­ spiels 8.

Das Verfahren bei diesem Ausführungsbeispiel gewährleistet einfache Installation des Gerätes, da die Platte 173 auf einer Seite verwendet wird.

Die Erfindung erlaubt den Aufbau eines Elektrophoresegerä­ tes, das hochempfindliche Messung durch Fluoreszenzstrahlung oder Lichtabsorption bei minimaler Beeinflussung durch Hin­ tergrundlicht erlaubt, wenn optische Erfassung in einem Mo­ lekulargewicht-Trennbereich, wie einem Kapillargel, ausge­ führt wird. Sie erlaubt auch einen einfachen Aufbau eines Fluoreszenzstrahlungs- oder Lichtabsorptionsdetektors, der aus einem Elektrolyten besteht, ohne daß das Molekularge­ wicht-Trennvermögen bei Gelelektrophorese verlorengeht, was zu einem vereinfachten Geräteaufbau führt. Sie realisiert auch ein Elektrophoresegerät für gleichzeitige Elektrophore­ se von zwei oder noch mehr Proben und für deren gleichzeiti­ ge Messung.

Claims (19)

1. Elektrophoresegerät, bei dem ein Probentrennbereich, der zwischen einem Gefäß für eine Kathodenelektrode (6) und einem Gefäß für eine Anodenelektrode (7) vorhanden ist, zwi­ schen welche Elektroden eine von einer Spannungsquelle her­ rührende Spannung gelegt wird, einen Wanderungspfad mit einem Paar Kapillaren (1a . . . 1t; 2a . . . 2t) bildet; wobei die Enden der Kapillaren mit dem Gefäß für die Kathoden­ bzw. Anodenelektrode verbunden sind und die anderen Enden mit einem vorgegebenen Spalt (3a . . . 3t) voneinander beab­ standet gehalten werden, wobei ihre Achsen im wesentlichen zusammenfallen und sie in einer optischen Zelle (4) einan­ der gegenüberstehen, um einen durch diese gehenden Wande­ rungspfad zu bilden; in welche optische Zelle eine Ummante­ lungslösung von außen eingeleitet wird, wobei die vom Kapil­ larende des stromaufwärtigen Wanderungspfades, d. h. dem Pro­ bentrennbereich, ausgehend wandernde Probe in den Zustand einer von einer Ummantelungsströmung umgebenen Strömung ver­ setzt wird und dann in die gegenüberstehende Kapillare ein­ geleitet wird; wobei der Spalt als optischer Erfassungsab­ schnitt verwendet wird und Licht von einer Lichtquelle (20) in diesen optischen Erfassungsabschnitt eingestrahlt wird, um die Proben zu messen.

2. Elektrophoresegerät nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch zwei oder noch mehr optische Erfassungsabschnitte mit zwei oder noch mehr Paaren von Kapillaren (1a . . . 1t, 2a . . . 2t), die in der optischen Zelle (4) angeordnet sind, wobei die zwei oder mehr optischen Erfassungsabschnitte miteinan­ der über den Elektrolyten verbunden sind.

3. Elektrophoresegerät nach Anspruch 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zwei oder mehr Paare von Kapillaren so an­ geordnet sind, daß die zwei oder mehr optischen Erfassungs­ abschnitte in einer geraden Linie angeordnet sind und das Anregungslicht entlang dieser geraden Linie eingestrahlt wird, so daß alle optischen Erfassungsabschnitte gleichzei­ tig beleuchtet werden, wodurch gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenz von den durch die Kapillaren wandernden Proben gewährleistet wird.

4. Elektrophoresegerät, bei dem ein Probentrennbereich, der zwischen einem Gefäß für eine Kathodenelektrode (6) und einem Gefäß für eine Anodenelektrode (7) angeordnet ist, an welche Elektroden eine Spannung von einer Spannungsquelle angelegt wird, Wanderungspfade mit zwei oder mehr Kapillaren (1a . . . 1t; 2a . . . 2t) bildet, und die zwei oder mehr Kapil­ laren, deren Enden in die Gefäße für die Elektroden einge­ taucht sind, in einer optischen Zelle (4) enden, wobei dafür gesorgt wird, daß die aus den Kapillaren ausströmenden Pro­ ben in einem Ummantelungsströmungszustand in die opti­ sche Zelle fließen, wobei die Ummantelungslösung von außen zugeführt wird; und bei dem Licht von einer Lichtquelle (20) in den als Erfassungsabschnitt dienenden Ummantelungsströ­ mungsbereich einstrahlt, wodurch die Proben erfaßt werden.

5. Elektrophoresegerät nach Anspruch 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die zwei oder mehr Paare von Kapillaren so an­ geordnet sind, daß die zwei oder mehr optischen Erfassungs­ abschnitte in einer geraden Linie angeordnet sind und das Anregungslicht entlang dieser geraden Linie eingestrahlt wird, so daß alle optischen Erfassungsabschnitte gleichzei­ tig beleuchtet werden, wodurch gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenz von den durch die Kapillaren wandernden Proben gewährleistet wird.

6. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß der Probentrennbereich des Wanderungspfades aus einem Kapillargel besteht.

7. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Ummantelungslösung ent­ sprechende Komponenten wie die in den Kapillaren (1a . . . 1t; 2a . . . 2t) vorhandene Pufferlösung aufweist.

8. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Ummantelungslösung ein Denaturierungsmittel für die Probe enthält.

9. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Zufuhr der Ummante­ lungslösung in die optische Zelle (4) so erfolgt, daß das obere Niveau der Ummantelungslösung höher als das Flüssig­ keitsniveau im stromabwärtigen Elektrodengefäß (7) steht, und die Ummantelungsflüssigkeit wegen des Niveauunterschieds der zwei Flüssigkeiten strömt.

10. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, gekennzeichnet durch einen optischen Erfassungsab­ schnitt (3a . . . 3t), in dem die von den Proben emittierte Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.

11. Elektrophoresegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch einen optischen Erfassungsabschnitt (3a . . . 3t), in dem die Lichtabsorption der Proben gemessen wird.

12. Elektrophoresegerät, bei dem ein durch eine optische Zelle (4) gehender Wanderungspfad zwischen einem Gefäß für eine Kathodenelektrode (6) und einem Gefäß für eine Anoden­ elektrode (7) ausgebildet ist, an welche Elektroden eine Spannung von einer Spannungsquelle angelegt wird, wobei min­ destens der stromaufwärtige Wanderungspfad der optischen Zelle durch Kapillaren (1a . . . 1t) festgelegt wird, wobei die Enden der Kapillaren in der optischen Zelle enden und wobei die Innenabmessung derselben rechtwinklig zum Wande­ rungspfad größer ist als der Durchmesser des Wanderungspfa­ des, der mit einem Elektrolyten aufgefüllt ist; und bei dem, während der Wanderungspfad außerhalb der Kapillaren in der optischen Zelle als optischer Erfassungsabschnitt verwendet wird, Licht in die optischen Erfassungsabschnitte (3a . . . 3t) von der Lichtquelle (20) her eintritt, wodurch eine Er­ fassung der Proben gewährleistet wird.

13. Elektrophoresegerät nach Anspruch 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Probentrennbereich des Wanderungspfades aus einem Kapillargel besteht.

14. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die Enden eines Paars von Kapillaren (1a, 2a) mit dem Gefäß für die Kathodenelektrode (6) bzw. dem Gefäß für die Anodenelektrode (7) verbunden sind, während die anderen Enden mit einem vorgegebenen Spalt (3a) voneinander beabstandet gehalten werden, wobei ihre Achsen im wesentlichen miteinander übereinstimmen und sie in der optischen Zelle (4) einander gegenüberstehend zum Aus­ bilden des Spalts angeordnet sind, welcher Spalt als opti­ scher Erfassungsabschnitt verwendet wird.

15. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß der Spalt eine Länge von 1 mm oder weniger aufweist.

16. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei oder mehr opti­ schen Erfassungsabschnitte (3a . . . 3t) zwei oder mehr Paare von Kapillaren (1a . . . 1t; 2a . . . 2t) aufweisen, die in einer einzelnen optischen Zelle (4) angeordnet sind, wobei die zwei oder mehr optischen Erfassungsabschnitte (3a . . . 3t) miteinander über den Elektrolyten verbunden sind.

17. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, gekennzeichnet durch einen optischen Erfassungsab­ schnitt (3a . . . 3t), in dem die von den Proben emittierte Fluoreszenzstrahlung erfaßt wird.

18. Elektrophoresegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 16, gekennzeichnet durch einen optischen Erfassungsabschnitt (3a . . . 3t), in dem die Lichtabsorption der Proben gemessen wird.

19. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden Ansprü­ che, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei oder mehr Paare von Kapillaren (1a . . . 1t) so herausgeführt sind, daß zwei oder mehr optische Erfassungsabschnitte (3a . . . 3t) für die zwei oder mehr Paare von Kapillaren entlang einer geraden Linie angeordnet sind, und das Anregungslicht entlang der geraden Linie einstrahlt, so daß die optischen Erfassungs­ abschnitte gleichzeitig beleuchtet werden, was gleichzeitige Erfassung der Fluoreszenzstrahlung von den in die Kapillaren gefüllten Proben gewährleistet.