DE69130930T2

DE69130930T2 - System für die Gel-Elektrophorese

Info

Publication number: DE69130930T2
Application number: DE69130930T
Authority: DE
Inventors: Robert A. Los Altos California 94022 Clappier; Erich A. Woodside California 94062 Gombocz; Wilhelm A-1232 Wien Kerth; David H. Woodside California 94062 Rammler; Alex Foster City California 94404 Roth
Original assignee: Labintelligence Inc
Current assignee: Labintelligence Inc
Priority date: 1990-05-14
Filing date: 1991-05-13
Publication date: 1999-08-05
Anticipated expiration: 2011-05-14
Also published as: EP0457526A2; EP0457526A3; US5410412A; US5104512A; EP0457526B1; DE69130930D1

Description

Das Gebiet der Erfindung ist Gelelektrophorese.
Im Zuge der gewaltigen Expansion auf dem Gebiet der Biotechnologie wurde die Gelelektrophorese zu einem unverzichtbaren Verfahren. Die Fähigkeit, Nukleinsäurefragmente und Proteine nach Größe, Form und Ladung zu trennen, bot zahlreiche Möglichkeiten, spezielle Verbindungen zu identifizieren, die Reinheit zu bestimmen und die Isolierung einer Verbindung in relativ reiner Form durchzuführen. Indem die Bedingungen, unter denen die Elektrophorese erfolgt, geändert werden können, können viele Eigenschaften der Verbindungen in der Probe bestimmt werden.
Eine Vielzahl neuer Verfahren hängen von der wirksamen und praktikablen Anwendung von Gelelektrophorese ab. Restriktionsfragment-Längenpolymorphien sind eine Anwendung, bei der genetische Diagnose mittels einer Genom-DNA-Probe durchgeführt werden kann. Dieses Verfahren eignet sich auch für das Gebiet der Gerichtsmedizin, um die Quelle von Nukleinsäure zu identifizieren. Gelelektrophorese kann auch zur Identifizierung einer Verbindung durch Auftrennung eines komplexen Gemisches und dann unter Verwendung von Markern, wie z. B. Antikörpern oder dergleichen, herangezogen werden. Elektrophorese wird in Verbindung mit einer Übertragung auf eine Membran, wie z. B. Southern-, Northern- und Western-Blotten, oder mit anderen Verfahren angewandt, welche die Übertragung der aufgetrennten Probe auf ein anderes Substrat vorsehen.
Obwohl die meisten Vorteile der Gelelektrophorese als Mittel zur Identifizierung und Trennung genützt werden, gibt es noch zahlreiche Nachteile. Die Vorrichtungen sind zumeist relativ groß und komplex. Vergleiche zwischen Proben, Läufen und insbesondere verschiedenen Laboratorien sind sehr problematisch, da die Bedingungen der Elektrophorese variieren und die Regelung und die Überwachung der Bedingungen entweder unmöglich oder unzuverlässig sind. Somit hat man es oft mit großen Schwankungen betreffend die Bestimmungen des Molekulargewichts und die Eigenschaften der Probenkomponenten zu tun. Aus diesem Grund war es bislang sehr schwierig, Vergleiche zwischen einzelnen Versuchen - geschweige denn zwischen einzelnen Laboratorien - anzustellen. Außerdem hindert die Gelelektrophorese-Vorrichtung die Probe üblicherweise nicht daran, aus dem Gel abzufließen, und sie bietet auch keine Sicherheit, daß die Probe ausreichend Zeit zur Trennung hatte. Somit sind deutliche Verbesserungen derzeit erhältlicher Geräte wünschenswert, da man auf diese Weise eine zufriedenstellende elektrophoretische Trennung durchführen könnte.
Es besteht ein großes Interesse an der Bereitstellung von Elektrophorese-Systemen, die im wesentlichen automatisiert sind, direkt vergleichbare Ergebnisse liefern und den Einsatz von Elektrophorese kostengünstiger machen.
US-A-4.909.920 offenbart eine computergesteuerte Vorrichtung, die flüssige Proben automatisch auf mikroporöse Trägerstreifen lädt, die flüssigen Proben durch die Streifen mittels Elektrophorese trennt, die Streifen entwickelt und die entwickelten Streifen elektronisch abtastet, um an verschiedenen Verlagerungen entlang der Länge die relativen Dichten der Probenkomponenten zu ermitteln. Obwohl die Vorrichtung ein Kühl/Heizmittel aufweist, kann sie die Betriebsparameter (z. B. die Temperatur des Elektrophoresemediums und das elektrische Feld über selbiges) nicht auf dem gewünschten Niveau halten und die Probe daran hindern, am Ende des elektrophoretischen Mediums abzufließen.
Andere relevante Veröffentlichungen sind Schafer-Nielsen, Electrophoresis 8, 20 (1987); Szewaczyk et al., ebd. 8, 25 (1987); Gill et al., ebd. 8, 38 (1987); Demeulemester et al., ebd. 8, 71 (1987); Blum et al., ebd. 8, 93 (1987); Albaugh et al., ebd. 8, 140 (1987); Serwer und Hayes, ebd. 8, 244 (1987); Zapolski et al., ebd. 8, 255 (1987); Tietz et al., ebd. 8, 271 (1987); Breborowicz et al., ebd. 8, 313 (1987); Pascali et al., ebd. 8, 371 (1987); Orban et al., ebd. 8, 465 (1987); Frey et al., ebd. 7, 28 (1986); Carpenter et al., ebd. 7, 221 (1986); ebd. 7, 241 (1986); Lamben et al., ebd. 7, 342 (1986); Foret et al., ebd. 7, 430 (1986); Prin et al., ebd. 6, 268 (1985); Lockshin, ebd. 6, 282 (1985); Mosher und Thormann, ebd. 6, b/77 (1985); Rhalem und Pery, ebd. 6, 564 (1985).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird ein Gelelektrophoresesystem bereitgestellt, umfassend eine Gelelektrophorese- Vorrichtung mit einer Gelscheiben-Trägerplattform, Puffernäpfen, Elektroden zur Aufrechterhaltung der Feldstärke über das Gel, einem Elektrodenpaar zur Überwachung der Spannung im Gel und einem Temperaturüberwachungs- und -regelmittel zum Steuern der Temperatur im Gel. Ergänzend zur Geltrennscheibe ist ein Spektralphotometermittel zur Überwachung der Bewegung von Fraktionen im Gel und ein elektrophoretischer Konzentrator oder ein Stapelgel vorhanden, um in der Probe vorhandene Fraktionen vor dem Aufbringen der Probe auf das Gel zu konzentrieren.
Außerdem besitzt das System eine Gelhalterung und Formen zur Herstellung von Gelen, insbesondere als Vielzahl einzelner Bahnen.
Das Fortschreiten der Elektrophorese wird hinsichtlich der Geltemperatur, des elektrischen Gradienten über das Gel, der Fortbewegung der einzelnen Banden und der Trennung zwischen den Banden überwacht, wobei je nach dem Zweck der Elektrophorese die Temperatur und das Feld konstant gehalten oder variiert werden können.
Das System ermöglicht die präzise und reproduzierbare Trennung von Nukleinsäuren, Proteinen, Sacchariden, Teilchen, wie z. B. Virusteilchen, sowie die Bestimmung der Größe und Eigenschaften einzelner Moleküle und Teilchen.

BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Elektrophoresesystems;
Fig. 2 ist eine schematische Schnittvorderansicht des Gelmoduls;
Fig. 3 ist eine schematische perspektivische Ansicht der Gelgießkomponenten;
Fig. 4 ist eine perspektivische Ansicht einer Gelplatte;
Fig. 5 ist eine Draufsicht der Gelplatte im Gelmodul;
Fig. 6 ist eine Querschnittsvorderansicht des elektrophoretischen Konzentrators;
Fig. 7 ist eine perspektivische Ansicht des auf einer Gelplatte befindlichen elektrophoretischen Konzentrators;
Fig. 8 ist eine perspektivische Ansicht von Komponenten zum Blotten des Gels; und
Fig. 9 ist eine perspektivische Ansicht eines Pufferverdünnerbehälters.
Es wird ein integriertes Gelelektrophoresesystem bereitgestellt, das die gesteuerte, reproduzierbare Trennung von Makromolekülen, z. B. Nukleinsäuren, Proteinen, Sacchariden, Teilchen wie etwa Virusteilen und Kombinationen davon, ermöglicht. Das System bietet die Möglichkeit des Überwachens und Regelns einer Anzahl von mit der Gelelektrophorese in Zusammenhang stehenden Variablen. Durch Überwachen des Status jeder der Vielzahl von mit der Gelelektrophorese assoziierten Variablen und Regulieren der Bedingungen der Gelelektrophorese können reproduzierbare Bandenmuster erzielt und Bedingungen je nach den Notwendigkeiten der jeweiligen Elektrophorese standardisiert oder variiert werden. Zu den überwachten Variablen zählen der Spannungsgradient im Gel, die Geltemperatur und die Bewegung einer oder mehrerer Banden im Gel während des Trennverfahrens. Durch Sicherstellen einer stabilen Temperatur und eines stabilen elektrischen Felds im Gel bewegen sich die Moleküle in der Probe in reproduzierbarer Weise durch das Gel. Durch Überwachen des Fortgangs der Bewegung der Banden kann man den Spannungsgradienten im Feld erhöhen oder senken, um die Bewegungsrate der Moleküle zu erhöhen oder zu senken oder die Elektrophorese zu beenden, wenn ein gewünschter Trennungsgrad erzielt oder eine gewünschte Entfernung zurückgelegt wurde.
Durch Vorsehen einer Temperaturregelplattform zum Tragen des Gels und Ermöglichen einer zufriedenstellenden Wärmeübertragung zwischen der Plattform und dem Gel kann die Temperatur im Gel innerhalb eines relativ engen Bereichs gehalten werden. Ein oder mehrere Temperatursensoren, z. B. Thermoelemente oder integrierte Schaltungstemperatursensoren, können verwendet werden, um die Temperatur an der Oberfläche der Plattform und/oder im Gel zu überwachen, sodaß Information kontinuierlich einem Monitor zugeführt und dadurch die Temperatur im Gel reguliert werden kann.
Der Spannungsgradient im Gel kann überwacht werden, indem zwei oder mehrere Elektroden vorgesehen werden, die von jenen getrennt sind, die den Spannungsgradienten über das Gel liefern. Diese zusätzlichen Elektroden sind über einen Großteil des Gels voneinander beabstandet, üblicherweise über mehr als etwa 60%, vorzugsweise 70%, der Länge des Gels. Die Elektroden stehen günstigerweise an einem Rand in Kontakt mit dem Gel, um den Spannungsabfall zwischen den zwei Elektroden im Gel in Feldrichtung zu bestimmen. Durch Überwachen der tatsächlichen Spannung im Gel können Schwankungen im Feld des Gels reguliert und dadurch ein konstantes Feld beibehalten werden. Durch Aufrechterhalten eines konstanten Felds und einer konstanten Temperatur können die wesentlichen Bedingungen zur Steuerung der Bewegung der Moleküle im Gel aufrechterhalten werden, sodaß sich die Moleküle in regulierter und reproduzierbarer Weise bewegen.
Die Migrationsstrecke beginnt an der Probenaufbringstelle. Die Migrationsstrecke beträgt zumindest etwa 5 cm, vorzugsweise zumindest etwa 10 cm, d. h. etwa 75% der gesamten Gellänge. Der verbleibende Abschnitt des Gels vom Katholyten bis zur Probenaufbringstelle dient zum Stapeln, sofern das Stapeln nicht durch ein anderes Verfahren erzielt wird.
Der Fortschreiten der Trennung der Banden wird in Echtzeit bestimmt und spektralphotometrisch überwacht, wobei die Absorption oder Fluoreszenz, die sich normalerweise aus der Einfärbung der im Gel vorhandenen Moleküle ergibt, bestimmt werden kann. Die Detektion der Banden kann das Ergebnis endogener spektralphotometrischer Eigenschaften der Moleküle oder das Ergebnis der Gegenwart von Farbstoffen im Gel oder der Bande sein, die mit den Molekülen in Wechselwirkung treten können, um für Variation spektralphotometrischer Eigenschaften zu sorgen, die mit der Gegenwart der Moleküle im Gel in Zusammenhang stehen. Durch Überwachen des Fortschreitens der Elektrophorese bestehen Möglichkeiten, die anderen Variablen wie z. B. die Temperatur und den Gradienten des elektrischen Felds zu variieren, um die Bewegungsrate der Moleküle im Gel zu senken oder zu erhöhen. Somit kann man die Rate, mit der die Elektrophorese durchgeführt wird, reduzieren oder steigern oder gegebenenfalls die Elektrophorese auch abbrechen. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Merkmals ist die Vermeidung von Zonenverzerrung. Man muß nicht warten, bis sich ein Marker zu einer vorbestimmten Position auf dem Gel bewegt oder sich von diesem entfernt hat, sondern man kann die Elektrophorese zu jedem geeigneten Zeitpunkt abbrechen.
Die wiederholte Überwachung von Temperatur und elektrischem Feld bei fortschreitender Elektrophorese sowie die gleichzeitige Regulierung der Temperatur und des elektrischen Felds bieten die Möglichkeit, die Bedingungen, unter denen die Elektrophorese durchgeführt wird, reproduzierbar und vergleichbar zu steuern. Durch Vorsehen vergleichbarer Bedingungen mit einer vergleichbaren Vorrichtung kann sicherstellt werden, daß vergleichbare Ergebnisse erzielt werden - ob im gleichen oder einem anderen Labor. Die Vergleichbarkeit von Ergebnissen bedeutet, daß man größere Gewißheit hat, ob die gleichen oder unterschiedliche Materialien verwendet werden; ein weiterer bedeutender Faktor sind die Eigenschaften der Probe, die durch die Elektrophorese bestimmt werden.
Durch Überwachen der mit der Elektrophorese assoziierten Variablen lassen sich zahlreiche weitere Vorteile erzielen. Beispielsweise kann man weiche Gele verwenden, die für eine relativ rasche Migration von Probenkomponenten sorgen, da die Bewegung der Komponenten überwacht werden kann. Auf diese Weise können sehr große Teilchen und Moleküle getrennt und charakterisiert werden. Man kann auch Ferguson-Kurven erstellen, indem eine Vielzahl von Bahnen mit unterschiedlichen Gelkonzentrationen vorhanden ist, die zu unterschiedlichen Größen der Gelmatrix führen. Die Reproduzierbarkeit der Kurve erlaubt den Vergleich zwischen Komponenten in unterschiedlichen Proben und bietet eine zusätzliche Eigenschaft zur Identifizierung einer bestimmten Zusammensetzung oder eines bestimmten Moleküls. Andere Vorteile ergeben sich aus der weiteren Beschreibung des Systems.
Das System umfaßt das Gelmodul, das eine Temperaturregulierungsplattform besitzt, auf der die Gelplatte ruht, Puffernapfbehälter, die fixiert oder entfernbar sein können, und Elektroden, die fixiert oder entfernbar sein können, um in den Puffernäpfen positioniert zu werden, damit im Gel das elektrische Feld bereitgestellt wird. Das Gelmodul besitzt auch ein Elektrodenpaar zur Einpassung in die Gelhalterung und Bestimmung des elektrischen Feldgradienten im Gel. Außerdem besitzt das Gelmodul elektrische Anschlüsse zur Energieversorgung des Temperaturregulierungssystems und der Elektroden, um den elektrischen Feldgradienten im Gel zu erzeugen und das Temperaturregulierungssystem, die Feldgradientelektroden und die Gelüberwachungselektroden mit einem Überwachungs- und Regulierungsmittel zu verbinden, das die mit der Temperatur und dem elektrischen Feld im Gel assoziierten Variablen steuert. Eine entfernbare elektrolumineszierende Platte kann vorhanden sein, um auf der Temperaturregulierung montiert zu werden. Dies ermöglicht entweder Echtzeit-Extinktionsmessungen gefärbter Proben während des Trennverfahrens oder Extinktionsmessungen eingefärbter Gele aus Vorversuchen oder markierter Nukleinsäuren.
Entfernbar am Gelmodul montiert ist ein Photometermodul, das eine Anregungslichtquelle und ein Spektralphotometer umfaßt, das Zonenfluoreszenz oder Lichtabsorption im Gel detektiert. Es sind gesteuerte motorbetriebene mechanische Mittel vorhanden, um das Spektralphotometer und die Anregungslichtquelle über die Oberfläche des Gels zu bewegen und diese abzutasten. Das aus den Teilchenzonen im Gel ausgestrahlte Licht wird detektiert und das resultierende Signal an das Überwachungs- und Regelmit tel weitergeleitet, um das Fortschreiten der Elektrophorese zu steuern. Es sind Mittel zur Lokalisierung der Position des Photometermoduls im Verhältnis zum Gel vorhanden.
Außerdem kann ein Lichtkasten vorhanden sein, über den das Photometermodul paßt, worin die Gelhalterung spektralphotometrisch hinsichtlich Lichtabsorption oder -aussendung abgetastet werden kann. Der Lichtkasten kann zusätzlich zur oder anstelle der Elektrolumineszenzplatte vorhanden sein.
Das Überwachungs- und Regulierungsmittel ist günstigerweise ein Computer mit geeigneter Software zur Steuerung der Bedingungen und des Fortschreitens der Elektrophorese. Gegebenenfalls ist eine Eingabevorrichtung wie z. B. eine Tastatur zur Bedienung des Computers und ein Monitor zur visuellen Überwachung der Bedingungen und des Fortschreitens der Elektrophorese vorhanden.
Gelformen und Platten zum Halten des Gels sind vorhanden, wobei die Gelplatten ausgebildet sind, die Gelplattform, Puffernäpfe und Überwachungselektroden aufzunehmen.
Bezug nehmend auf die Abbildungen ist Fig. 1 eine schematische Darstellung der verschiedenen Komponenten des Systems, dessen zentrales Element die Elektrophoresevorrichtung 10 ist. Diese besitzt ein Gelmodul 24 mit einer Abdeckung 12, die ein Photometer 14 enthält, welches das abnehmbare Photometermodul 26 aufweist. In Verbindung mit dem Gelmodul 24 werden entfernbare Puffernäpfe 16 und 18 sowie entfernbare Elektrodenhalterungen 20 und 22 verwendet.
Die Gele für die Elektrophorese können in der Gelplatte 100 unter Verwendung der Gelform 102 mit einer oberen Platte 106 und einer unteren Platte 104 gebildet werden.
Ein Lichtkasten 200 ist gegebenenfalls vorhanden, um Gele in Zusammenhang mit dem Photometermodul 26 abzulesen, der über den Lichtkasten 200 gepaßt sein kann.
Signale aus dem Gelmodul 24 und dem Photometermodul 26 können einem Computer- und Datenspeichergerät 300 zugeführt werden, das mit einer Tastatur 302, CRT 304 und einem Drucker 306 ausgestattet ist. Mittels einer interaktiven Beziehung zwischen dem Computer- und Datenspeichergerät sowie dem Gelmodul 24 und dem Photometermodul 26 kann man den Verlauf der Elektrophorese überwachen und die Bedingungen wunschgemäß variieren oder beibehalten.
In Fig. 2 sind das Gel- und das Spektralphotometermodul dargestellt, worin das Gelmodul 24 die untere Komponente und das Photometer 26 die obere Komponente ist.
Das Gelmodul 24 besitzt einen ersten Pufferlösungsnapf 16, der Pufferlösung 28, die Elektrode 30 und den abnehmbaren Elektrodenträger 32 enthält. Der Puffernapf 18 enthält den Puffer 18a, die Elektrode 30a und den abnehmbaren Elektrodenträger 32a. Der Elektrodenträger kann ausgewählt sein, mit einem Detektor in Wechselwirkung zu treten, um die kontinuierliche Überwachung der Pufferzusammensetzung hinsichtlich Ionenstärke und/oder pH-Wert zu ermöglichen. Wenn die Pufferlösung 28/28a somit auf einen vorbestimmten Wert der Ionenstärke abfällt, kann eine (nicht dargestellte) Pumpe aktiviert werden, um den Puffer bis auf einen vorbestimmten Ionenstärkewert aufzufüllen, indem eine konzentrierte Lösung zugegeben wird. Verschiedene auf Ionen reagierende Elektroden können zur Überwachung der Pufferkonzentration verwendet werden. Auf diese Weise kann der Puffer aufrechterhalten werden, um jede Unterbrechung der Elektrophorese infolge des Leerens des Puffers unter einen vorbestimmten Wert zu verhindern.
Das Gelmodul 24 besitzt ein Temperaturregulierungssystem, umfassend die Temperaturregulierungsplatte 34, die auf einem Wärmeübertragungsblock 36 montiert ist, der seinerseits in Wärmeübertragungsbeziehung mit einer reversiblen Kühl/Heizvorrichtung, z. B. einem Peltier-Gerät, 38 steht. Die durch die Temperatursenkvorrichtung erzeugte Wärme wird mittels einer gerippten Wärmesenke 40 und eines Lüfters 42 in die Atmos phäre abgeleitet. Der Wärmeübertragungsblock 36 und das Kühlgerät 38 sind von Isolierung 44 umgeben, wobei die verschiedenen Komponenten des Temperaturregulierungssystems im Gehäuse 46 untergebracht sind. Die Puffernäpfe 16 und 18 sowie das Temperaturregulierungssystem 48 (siehe Fig. 1) werden von der Plattform 50 des elektrischen Schaltungsgehäuses 52 getragen.
Die Gelplatte 100 ruht auf einer Wärmeübertragungsplatte 34, die vorzugsweise aus Kupfer besteht und Beine 108 und 108a besitzt, die sich in die Pufferlösungen 28 bzw. 28a hinein erstrecken.
Das Photometermodul 26 umfaßt die Gelmodulabdeckung 12 und das Photometer 14, wie aus Fig. 1 ersichtlich. Das Photometermodul besitzt den vertieften Napf 54, um den Schlitten 56 zurückzuziehen, damit jede Wechselwirkung zwischen der Gelplatte 100 und dem Photometer 14 verhindert wird. Der Schlitten 56 ist an linearen Stangenlagern 58 montiert, die auf dem Führungsstab 60 laufen. Die Bewegung des Schlittens wird durch den Riemen 62 gesteuert, der vom Schrittmotor 64 angetrieben wird, wobei der Riemen über die Losrolle 66 geführt wird. Wenn man die Position kennt, von welcher der Schlitten ausgeht, kann man die Schritte des Schrittmotors zählen, um die Schlittenposition zu jedem Zeitpunkt zu bestimmen. Alternativ dazu kann der Schrittmotor 64 mit einer Überwachungsvorrichtung, z. B. einem Potentiometer, verbunden sein, sodaß die Position des Photometers 14 relativ zum Gel überwacht und die Postion der Banden im Gel bestimmt werden kann. Die Träger 68 tragen die Schaltplatte 70 und werden ihrerseits vom Boden 72 des Schlittens 56 getragen.
Eine Schwarzlichtbirne 74 dient als Lichtquelle zur Aktivierung fluoreszierender Komponenten im Gel. Eine zweite Schwarzlichtbirne 74a kann dazu verwendet werden, eine ausreichende Lichtintensität über den durch die Lichtsensoreinheit 76 absorbierten Bereich sicherzustellen.
Die Lichtsensoreinheit 76 besitzt zumindest zwei Faseroptik-Röhren 78 und 78a pro Kanal, wobei in der Abbildung nur zwei dargestellt sind. Die Faseroptik-Röhren 78 und 78a leiten Licht vom Gel zu den Farbfilterscheiben 80 bzw. 80a. Einzelne Paare von Faseroptik-Röhren sind für jede zu beobachtende Bahn vorhanden, wobei die Röhren zu den gleichen oder unterschiedlichen Photodetektoren führen können. Es können Mittel zur individuellen Abfrage jedes Röhrenpaars vorhanden sein. Die Farbfilterscheiben 80 und 80a besitzen Wellenlängen-Absorptionsbereiche von etwa 400-500 nm und 500-800 nm, worin beim ersteren die Übertragung bei höheren Wellenlängen zunimmt und beim zweiteren abnimmt. Durch geeignete Fourieranalyse der Differenzen des von den Photodetektoren 82 bzw. 82a absorbierten und detektierten Lichts kann man das Licht bei verschiedenen Wellenlängen innerhalb eines relativ engen Bereichs von etwa 400 bis 800 nm messen. Die Fourieranalyse erfolgt durch Überlagern des transformierten Polynoms, das gemäß den Absorptionsprofilen der zwei in den getrennten Detektorkanälen verwendeten Filtern erhalten wird. Somit wird unter Verwendung von Scheiben der Farbfilter oder LEDs als Kalibratoren eine Farbunterscheidungsauflösung von etwa 50 nm erreicht.
Wie bereits beschrieben kann man durch Vorsehen von nur zwei Photodetektoren und zwei Filtern Fluoreszenz in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen über ein breites Spektrum an fluoreszierendem Licht detektieren. Eine Einfassung 84 mit konischem oder dreieckigem Querschnitt umfaßt die Faseroptik-Röhren 78, sodaß Licht durch die Öffnung 86 zu den Faseroptik-Röhren 78 geführt wird. Der Schlitten 56 kann die Einfassung 84 mit der Öffnung 86 über die Gelplatte 100 bewegen, wo die Schwarzlichtbirnen die im Gel vorhandenen fluoreszierenden Verbindungen photoaktivieren.
Durch Verwendung von Lichtquellen mit einem breiten Wellenlängenspektrum, welches das Absorptionsmaximum von im Gel vorhandenen Fluoreszenzmitteln umfaßt, worin Fluoreszenz im Verhältnis zur Bewegung der Probenkomponenten im Gel auftritt, fluoreszieren die Komponentenbanden, und Fluoreszenz wird von den Photodetektoren 82 und 82 detektiert. Wenn unterschiedliche Komponenten für unterschiedliche Fluo reszenzwellenlängen sorgen können, ermöglicht es die Fähigkeit, die Gegenwart der unterschiedlichen Wellenlängen zu detektieren, eine Bestimmung vorzunehmen, wie weit jede Komponente fortgeschritten ist. Das Photometer kann in einer einzigen Position beibehalten werden, um die Ankunft oder die Passage einer oder mehrerer Komponenten an der Position des Photometers vorbei zu detektieren, oder wiederholt über die Gelplatte geführt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese wiederholt zu überwachen.
Die Temperaturregelplatte 34 kann mit einem reflektierenden Material überzogen sein. Wenn dunkles Material erforderlich ist (hängt davon ab, ob gewünscht wird, Licht aus dem Gel zu reflektieren oder jedes Licht zu absorbieren, das auf die Temperaturregelplatte 34 gerichtet ist), kann eine schwarze Gelschale verwendet werden. Ein lichtreflektierender Hintergrund sorgt für höhere Anregungswerte. Die Wahl hängt von Überlegungen wie der Stokes-Verschiebung der im Gel vorhandenen fluoreszierenden Substanz, der Beschaffenheit der Fluoreszenzmittel, worin eine signifikante Zeitverzögerung zwischen Absorption und Elektronenanregung und Fluoreszenz zu beobachten ist, der jeweiligen Wellenlänge des Anregungslichts und des fluoreszierenden Lichts, dem Fluoreszenzwirkungsgrad und dergleichen ab. Somit sind die lichtdurchlässigen weißen oder schwarzen Gelschalen die geeignetsten Optionen.
Für das Gelelektrophoresesystem der Erfindung sind Platten zur Verwendung mit dem Gelmodul ausgebildet. Die Gelplatte 100 ist in den Fig. 3, 4 und 5 dargestellt, worin Fig. 3 die Gelform in ihrem geöffneten und geschlossenen Zustand zeigt. Die Gelform 102 besitzt eine Bodenplatte 104, die günstigerweise aus einem durchsichtigen Kunststoff besteht, sodaß man die Gelplatte 100 hinsichtlich Einschluß von Bläschen beobachten und Lichtübertragung ermöglichen kann. Die Gelplatte 100 besitzt eine Vielzahl an durch Trennwände 110 getrennte Bahnen 108. Proximal zu jedem Ende der Bahnen 108 befinden sich die Öffnungen 112 und 112a, die mit den Kanälen 114 bzw. 114a kommunizieren. Die Kanäle können günstigerweise aus Kunststoffblöcken 116 und 116a bestehen, die fluchtend mit den Bahnen fix an der oberen Platte 118, welche die Bahnen 108 umfaßt, befestigt sind. Die Kanäle 114 und 114a sind mit den Öffnungen 112 bzw. 112a ausgerichtet. Die Böden der Kunststoffblöcke 116 und 116a besitzen einen abgeschrägten Boden 120 und 120a in einem spitzen Winkel. Die abgeschrägten Böden schützen das Gel vor kontaminierenden Oberflächen, minimieren das Blockieren von Luftbläschen an der Grenzfläche mit dem Puffer und maximieren die Gel-Puffer- Grenzfläche.
Die obere Platte 118 ist normalerweise eine durchsichtige Kunststoffplatte. Alternativ dazu kann je nach den gewünschten Lichtabsorptions- oder Reflexionseigenschaften schwarzes oder weißes Material verwendet werden.
Die Elektrodenaufnahmekanäle 122 und 122a sind zur Einführung von Elektroden, die mit Gel 124 in der ersten Bahn in Kontakt stehen, versehen, um den elektrischen Feldgradienten zwischen 122 und 122a zu überwachen. Normalerweise werden die Gele alle aus dem gleichen Material gegossen, sodaß das Feld in der ersten Bahn im wesentlichen das gleiche wie in allen anderen Bahnen 108 sein sollte. Zumeist hängen die Felder von den vorhandenen ionischen Gruppen ab, die durch die Differenzen der Gelkonzentration in den unterschiedlichen Bahnen beeinflußt sein können oder nicht. Ein Probennapf 126 kann beim Gießen des Gels in der Form 102 ausgebildet werden.
Die Gelplatte kann jede geeignete Größe aufweisen, die in Migrationsrichung im allgemeinen im Bereich von 5 bis 40 cm liegt und bei etwa 1 bis 20 cm im rechten Winkel zur Migrationsrichtung, insbesondere 7,5-15 cm · 12-15 cm. Die Kanäle 114 und 114a, die mit dem Puffer und dem Gel kommunizieren, besitzen im allgemeinen eine Länge von etwa 0,5 bis 3 cm. Günstigerweise reicht der Winkel des abgeschrägten Bodens 120 und 120a im allgemeinen von etwa 20º bis 70º.
In den Fig. 3 und 4 ist die Gelplatte 100 auf die untere Gelformplatte 104 aufgesetzt, wobei Kunststoffblöcke 116 und 116a auf die Schlitze 128 und 128a gepaßt sind. Zumindest einer der Schlitze 128 und 128a erstreckt sich durch die gesamte Platte hin durch, um eine Öffnung zu hinterlassen, die den abgeschrägten Boden 120 oder 120a der Atmosphäre aussetzt. Üblicherweise werden beide Schlitze 128 und 128a vollständig geöffnet, bevor die Gelplatte 100 auf die untere Gelformplatte 104 gesetzt wird. Die untere Platte 104 besitzt vier Stifte 130, die mit der oberen Platte 106 in einer geeigneten Position relativ zur Gelplatte 100 ausgerichtet sind.
Die obere Platte 106 verfügt über eine Vielzahl an Ausstülpungen 132, die sich in die Bahnen 108 proximal zu einem Ende der Bahnen erstrecken, um die Probennäpfe 126 zu definieren. Die Ausstülpungen besitzen eine derartige Größe, daß sie sich über nicht mehr als etwa 80% der Dicke des Gels erstrecken und Räume hinterlassen (im allgemeinen etwa 1-2 mm zwischen den Trennwänden 110 und den Ausstülpungen 132). Wenn sich Gel am Boden der Näpfe befindet, tritt die Probe nicht aus den Näpfen aus. Der Abstand ermöglicht das Passieren von Luft bei der Herstellung des Gels, wodurch das Einschließen von Luftbläschen verhindert wird. Üblicherweise ist der Raum zwischen dem Boden des Napfes 126 und der Platte 118 etwa 0,5 mm groß.
Bei der Herstellung der Gele wird die Gelplatte 100 auf die untere Gelformplatte 104 aufgesetzt, sodaß sich die Kanäle 114 und 114a hinunter in die Schlitze 128 und 128a erstrecken. Die obere Platte 106, die günstigerweise aus einem halbharten elastomeren Kunststoffmaterial besteht, besitzt vier Ausnehmungen 134 zur Aufnahme von Stiften oder Dübeln 130. Die obere Platte 106 ist über die untere Platte 104 gepaßt, wobei die Ausnehmungen 134 mit den Dübeln 130 ausgerichtet sind und sich die Ausstülpungen 132 in die Bahnen 108 erstrecken. Die Bodenplatte 104 und die obere Platte 106 werden dann miteinander verriegelt, sodaß die Vorderfläche 136 der oberen Platte mit den Trennwänden 110 in Kontakt steht, damit das Gel von einer Bahn nicht in eine zweite Bahn übertreten kann. Nach dem Verriegeln der unteren und der oberen Platte 104 und 106 mit Klemmen oder dergleichen werden die Platten in vertikale Position gesetzt, wie aus Fig. 3b ersichtlich. Die Bahnen können dann entweder von oben oder unten gefüllt werden.
Wenn das Füllen vom Boden aus erfolgt, wird eine Rohrverzweigung 138 mit Rohren 140 verwendet, die mit den Kanälen 1 14 ausgerichtet sind. An der Spitze des Rohrverzweigungsblocks befinden sich die Trichter 142, die mit den Rohren 140 verbunden sind, sodaß das Gel in die Trichter 142 eingebracht werden, nach unten durch die Rohre 140 hindurch in die Kanäle 114 fließen und dann nach oben fließen kann, um die Kanäle 114a bis zur oder bis unterhalb der Höhe der Rohrverzweigung 138 zu füllen, um den Kanal zu füllen und das Gel fertigzustellen. Die Polymerisation des Gels kann dann durch entsprechende Aktivierung erfolgen, z. B. Licht, Wärme, Inkubation unter Umgebungsbedingungen oder dergleichen, wobei der Verlauf der Polymerisation anhand des Temperaturprofils unter Verwendung eines (nicht dargestellten) Temperatursensors, anhand des veränderten Aussehens oder dergleichen überwacht werden kann.
Beim Füllen der Bahnen 108 von oben kann man eine Rohrverzweigung vorsehen, die in Ausrichtung mit den Kanälen 114a positioniert ist, und eine poröse Abdeckung über den Kanälen 114 anordnen, wodurch Luft, jedoch nicht das flüssige Gel passieren kann. Indem man zuerst eine Reihe der Kanäle 114 mit dem Gel füllt, kann das Gel dann ohne Abschluß von oben zugegeben werden. Andere Verfahren zur Herstellung von Gelen kommen auch in Frage. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, verschiedene Gradienten im Gel oder Bereiche mit unterschiedlichen Konzentrationen (%T) und Härten vorzusehen. Beispielsweise kann der Abschnitt des Gels, der sich unmittelbar stromab vom Probennapf befinden, ein Stapelgel umfassen, das einen geringeren Prozentsatz an Polymer aufweist, gefolgt vom Auflösungsgel. Durch aufeinanderfolgende Zugabe unterschiedlicher, im wesentlichen nicht-mischbarer Flüssigkeiten kann man ein abgestuftes Gel mit Bereichen unterschiedlicher Eigenschaften erhalten.
Wenn das Gel geformt ist, kann die Gelplatte 100 dann auf die Kühlplatte 34 aufgesetzt werden, wobei die Blöcke 116 und 116a in die Näpfe 16 bzw. 18 eintauchen. Die Elektroden 144 und 144a werden in die Elektrodenaufnahmekanäle 122 bzw. 122a eingesetzt, um das elektrische Feld des Gels in Bahn 1 zu überwachen. Die Elektrodenhalte rungen 20 und 22 werden in den Puffernäpfen 16 und 18 positioniert, um das elektrische Feld über das Gel zu erzeugen.
Anstelle der Verwendung eines Stapelgels in der Bahn kann das Stapeln oder Sammeln der Probenkomponenten in einer einzigen Bande durch Verwendung des elektrophoretischen Konzentrators 150 (siehe Fig. 6) erfolgen, der einen Block 152 mit einer Vielzahl an Aufnahmeöffnungen 154 besitzt. Der Kopf des Blocks 152 ist trichterförmig und verschmälert sich zum Boden hin in einen Bereich 156 mit immer schmälerem Querschnitt und in den Durchgang 158. Die Probe 162 wird auf die Spitze des Stapelgels 160 aufgesetzt. Ein Überzug eines leitenden Farbstoffs 164 bedeckt die Spitze des Stapelgels 160. Eine schwimmende Elektrode 166 ist vorgesehen, die ein elektrisches Feld zwischen der schwimmenden Elektrode 166 und der Analytenpuffernapf-Elektrode 30a bewirkt. Der elektrophoretische Konzentrator wird direkt oberhalb der Probennäpfe 126 im Gel 124 positioniert. Wenn der leitende Farbstoff die Elektrode 144 erreicht, wird das Feld zwischen die Puffernapfelektroden 30 und 30a gewechselt.
Zum Abschluß der Elektrophorese können die Bandenkomponenten vom Gel auf eine Membran oder ein anderes herkömmliches Substrat übertragen werden, wobei für die Übertragung die in Fig. 8 gezeigten Geräte zur Anwendung kommen. Ein Stapel von Schichten mit einer Graphitelektroden-Schichtanode 168 und einer Graphitelektroden- Schichtkathode 168a wird verwendet. Oberhalb der Graphitkathode 168a sind mit Pufferlösung getränkte Papierschichten 170 und 170a angeordnet. Das Gel 172 wird von NetfixTM-Substrat 174 getragen, um die Banden der permanenten Speicherung zuzuführen. Zur Aufnahme der Gelkomponenten wird die Membran 176 in Kontakt mit dem Gel 172 gebracht. Jede geeignete Membran kommt hierfür in Frage, z. B. ImmobilonTM, Nitrocellulose, DBMTM-Nitrocellulose usw. Über der Membran sind die Papierschichten 178 und 178a angeordnet, die auch mit Pufferlösung getränkt sind. Die Papierschichten 170, 170a, 178 und 178a ermöglichen die Leitung von Strom zwischen den Elektroden 168 und 168a.
Die Packung von Schichten 180 wird in einen unteren Elektroden rahmen 182 gesetzt und dann mit dem oberen Elektrodenrahmen 184 umschlossen. Die Elektrodenrahmen 182 und 184 werden an eine Stromversorgung 186 angeschlossen, die auch einen Zeitnehmer enthalten kann.
Der Strom wird über einen Zeitraum aufrechterhalten, der für die Übertragung der aufgetrennten Komponenten im Gel auf die Membran zur weiteren Verarbeitung und Analyse ausreicht.
Eine Verdünner-Abgabe-Vorrichtung für das Gelelektrophoresesystem der Erfindung kann als Behälter vorgesehen sein, um Pufferkonzentrat oder eine andere Lösung auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen.
Die Verdünner-Abgabe-Vorrichtung 310 ist günstigerweise als geformtes einstückiges Gerät mit einer getrennten Aufsetzkappe 312 ausgebildet. Die Vorrichtung besitzt eine kleine Kammer 314 zur Aufnahme des Pufferkonzentrats. Eine große Kammer 316 nimmt Wasser oder eine andere Flüssigkeit zur Verdünnung des Konzentrats auf. Der Verdünner wird bis zu einer vorbestimmten Höhe in die Kammer 316 gegossen, wobei sich die Höhe sich unterhalb der Spitze des Napfes 318 befindet. Der konzentrierte Puffer kann dann durch die Öffnung 320 gegossen werden, um die Kammer 314 bis zu einer angegebenen Höhe zu füllen. Die Aufsetzkappe 312 kann nun auf Gewindekanal 322 aufgeschraubt und die Vorrichtung 310 gekippt werden, um den konzentrierten Puffer aus der Kammer 314 in den Verdünner der Kammer 316 fließen zu lassen, wo er durch Schütteln vermischt werden kann. Sobald der Puffer entsprechend verdünnt ist, kann er von der Kammer 316 durch den Kanal 324 und aus dem Ausguß 326 gegossen werden.
Nach der Beschreibung der verschiedenen Komponenten des vorliegenden Systems werden nun die Verwendung des Systems und seine diversen Anwendungen erläutert.
Verschiedene Gelzusammensetzungen können zur Herstellung der Gelmatrix verwendet werden. Polyacrylamid, Agarose, Gelatine oder dergleichen können als Verdicker für die Gelmatrix verwendet werden. Die Gelplatte 100 mit ihrer Vielzahl an Bahnen wird über der unteren Platte 104 der Gelform positioniert, und die Kanalblöcke 116 und 116a werden in die Schlitze 128 und 128a eingesetzt. Die Abdeckung 106 wird dann über der Gelplatte 100 angeordnet, wobei die Dübel 130 der unteren Platte in den Ausnehmungen 134 und die untere Platte 104 und die oberen Platte 106 der Form durch Klemmen zusammengehalten werden. Die Rohrverzweigung 138 wird dann gegen die untere Platte 104 angeordnet, wobei die Vielzahl an Rohren 140 mit den Kanälen 114 ausgerichtet ist. Saugwirkung kann dazu dienen, das Gel in die Bahnen zu ziehen. Die Komponenten werden zur Bildung der Gelmatrix vermischt: entweder bei erhöhter Temperatur, um die Viskosität zu senken, oder indem sie nicht-polymerisiertes Monomer enthalten. Diese Zusammensetzung wird dann in die Rohrverzweigung 138 gegossen, um durch die Bahnen 108 und hinauf aus den Kanälen 114a heraus zu wandern. Wenn die Lösung erhitzt wurde, um die gewünschte niedrige Viskosität zu erzielen, wird die Lösung gekühlt und gelieren gelassen.
Bei Polyacrylamid enthält die Lösung zumeist ein chemisches oder Photoinitiatorsystem. Verschiedene chemische Polymerisationssysteme können verwendet werden, die der Matrix vor der Herstellung der Platte zugegeben werden. Beispielsweise können TEMEDTM und Persulfat zugegeben werden, um für Polymerisationsinitiation zu sorgen. Beim Photoinitiatorsystem wird die Gelzusammensetzung mit Licht bestrahlt, um die notwendige Anregung für die Polymerinitiation zu bewirken, und der Verlauf der Polymerisation wird unter Verwendung eines Thermoelements verfolgt. Sobald die Temperatur stabil ist oder sich an Umgebungstemperatur annähert, kann man davon ausgehen, daß die Polymerisation beendet ist. Auf Wunsch kann ein Acrylamidgradient durch aufeinanderfolgende Zugabe von Lösungen mit immer größeren Mengen an Acrylamid und/oder Vernetzer entwickelt werden. Alternativ dazu kann Differentialinitiation angewandt werden, um für variierende Polymerisationsgrade zu sorgen. Auf diese Weise kann man einen Gelgradienten erzeugen.
In herkömmlicher PAGE-Technologie reichen Gele üblicherweise von 5 bis 22,5 0/0 T (T = Gesamtmenge an Acrylamid oder einem anderen Geliermittel), zumeist von 7,5 bis 15% T. Niedrigere Prozentsätze können bei linearem Polyacylamid verwendet werden. In der Agarosegelelektrophorese eignen sich Konzentrationen von etwa 0,2 bis 2% T.
Außerdem kann man einen Bereich, der als Stapelgel bezeichnet wird und eine relativ geringe Acrylamid-Konzentration aufweist, und ein Auflösungsgel vorsehen, das eine wesentlich höhrere Acrylamid-Konzentration aufweist. Beschreibungen zur Bildung von Gelen für die Gelelektrophorese finden sich in The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis, Chrambach, VCH Publishers. Aufgrund der Fähigkeit, den Verlauf der Elektrophorese zu regulieren und überwachen, können geringe Konzentrationen an Geliermittel verwendet werden.
Je nach Zweck der Elektrophorese können verschiedene Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten verwendet werden, wobei das Gel und die Puffer in den Puffernäpfen günstigerweise ein gemeinsames Ion besitzen können. Andere Komponenten im Gel sind Vernetzer wie z. B. BISTM, DATDTM, AcrylAideTM usw. Sobald das Gel gebildet wurde, die Bahnen ausfüllt und sich durch die Kanäle erstreckt, kann die Form geöffnet und die Gelplatte entnommen werden, da sie nun zur Verwendung bereitsteht.
Die Puffernäpfe 16 und 18 sind günstigerweise angrenzend an die Gelmodulplattform und die Gelplatte über dem Gelmodul positioniert, wobei sich Beine in die Pufferlösung in den Puffernäpfen hinein erstrecken. Die Elektrodenhalterungen, welche die Elektroden enthalten, werden dann in die Pufferlösungen gesetzt, um die Anode und Kathode für die Anolyten- und Katholytenlösungen zu bilden und den Fluß von Ionen und geladenen Probenkomponenten zu lenken. Die Sensorelektroden werden in die Halterungen eingesetzt und erstrecken sich in das Gel von Bahn 1, nachdem die Gelplatte auf die Gelmodulplattform aufgebracht wird. Die Sensorelektroden werden auch mit dem Computer verbunden.
Die Probe kann nun in den Probennapf eingebracht oder mit dem elektrophoretischen Konzentrator konzentriert werden.
Der elektrophoretische Konzentrator weist einen Kegel mit einem Stapelgel im unteren Abschnitt des Kegels und einem Durchgang auf, der in einer Öffnung endet, die im wesentlichen mit dem Probennapf zusammenfällt. Durch Vorsehen eines Blocks mit einer Vielzahl von Kegeln, die jeweils ein gemeinsames Stapelgel besitzen, kann jeder der Näpfe in den verschiedenen Bahnen gleichzeitig eine Probe aufnehmen.
Verschiedene Verfahren können zur Bestimmung herangezogen werden, wann die Probe den Napf erreicht hat oder sich über eine vorbestimmte Entfernung in das Auflösungsgel hinein erstreckt. Beispielsweise kann das Stapelgel im Kegel mit einem leitenden Farbstoff beschichtet sein.
Die Elektrode im elektrophoretischen Konzentrator und die Elektrode im stromab befindlichen Puffernapf bieten einen Spannungsgradienten über das Stapelgel. Die stromauf angeordnete Elektrode im Puffernapf ist ausgeschaltet, während die stromauf gelegene Sensorelektrode eingeschaltet ist. Während sich der leitende Farbstoff durch das Stapelgel und in das Auflösungsgel hinein bewegt, ändern sich die elektrischen Eigenschaften zwischen der Elektrode des elektrophoretischen Konzentrators und der stromauf gelegenen Sensorelektrode. Man kann eine zusätzliche Elektrode und Wechselstrom verwenden und die Impedanz über das Gel messen, um die Bande zu detektieren. Bei einem vorbestimmten Wert, der die Probe im Auflösungsgel anzeigt, wird die Elektrode im stromauf angeordneten Puffernapf eingeschaltet, wodurch ein Spannungsgradient über das Auflösungsgel erzeugt wird.
Die Elektrode in der Probe über dem Stapelgel kann so angeordnet sein, daß sie auf der Oberfläche schwimmt und sich ausschaltet, wenn die Elektrode mit dem Stapelgel in Kontakt kommt.
Ein leitender Farbstoff muß nicht verwendet werden, da jedes Material, das die gewünschte Mobilität besitzt, die Komponenten in der Probe zu stapeln oder zu vor diesen herzulaufen, in Frage kommt. So kann ein Fluoreszenzfarbstoff vom Photometer detektiert werden. Das Photometer kann eingangs angrenzend an den Probennapfpositioniert werden, sodaß ein fluoreszierender Farbstoff ein Signal aussendet, wenn er an eine geeignete Stelle gelangt. Sobald die Komponenten der Probe durch das Stapelgel und in den Napf gelangten und der Marker ein Signal lieferte, kann das Stapelgel entfernt und die Elektrophorese fortgesetzt werden.
Mit Fortdauer der Elektrophorese werden die Temperatur und Spannung im Gel kontinuierlich überwacht. Wenn die Elektrophorese zu langsam abläuft, kann das Feld, z. B. der Spannungsgradient, im Gel verstärkt werden. Somit wird das Fortschreiten der Elektrophorese überwacht und jener der Banden verlangsamt oder beschleunigt, was vom zufriedenstellenden Ergebnis der Trennung abhängt.
Interne Marker können in der Probe oder in Vergleichsbahnen enthalten sein. Derivate von Verbindungen können verwendet werden, die fluoreszierend sind und Proteine, Nukleinsäure, Saccharid oder Teilchen enthalten können. Wenn eine bekannte Verbindung gesucht ist, kann die markergebundene Verbindung in einer Vergleichsbahn verwendet werden.
Das Photometer kann kontinuierlich über das Gel bewegt werden und bewegt sich mit einer bestimmten Frequenz vor und zurück; es kann sich gelegentlich über das Gel bewegen oder so gesteuert werden, daß es sich in bestimmten Zeitintervallen bewegt. Fluoreszenz kann unter Verwendung fluoreszierender Standards in einer Vergleichsbahn bewirkt werden, indem fluoreszierende Verbindungen bereitgestellt werden, die sich an die Probenkomponenten binden, indem Verbindungen im Gel bereitgestellt werden, die mit den Probenkomponenten in Wechselwirkung treten, um Fluoreszenz zu bewirken, oder dergleichen. Auf diese Weise können die verschiedenen, sich im Gel bildenden Banden überwacht werden, sodaß die Fortbewegung der vordersten Bande und die Trennung zwischen den Banden detektiert werden kann. Bedingungen können geändert werden, um die Trennung zu verstärken oder die Elektrophorese abzubrechen, wenn ein gewünschter Trennungsgrad erreicht ist.
Eine Verdünner-Abgabe-Vorrichtung kann als Teil des Systems der Erfindung verwendet werden, um Konzentrat oder ein anderes Reagens zu verdünnen, das als Teil des Systems bereitgestellt werden kann. Eine kleine Schale ist vorhanden, die bis zu einer vorbestimmten Höhe gefüllt wird, während ein mit der Schale verbundener Mischbehälter bis zu einer vorbestimmten Höhe mit Wasser oder einer anderen Lösung gefüllt wird. Durch Kippen der Verdünner-Abgabe-Vorrichtung wird das Konzentrat in der Schale in den Mischbehälter übertragen, wo es verdünnt und dann durch den Verbindungskanal in einem Ausguß in die Puffernäpfe abgegeben werden kann.
Sobald die Elektrophorese beendet ist, können die Gele auf unterschiedliche Weise verwendet werden. Für Nukleinsäuren können verschiedene Farbstoffe wie z. B. Ethidiumbromid, das sich in Nukleinsäuren einlagert und fluoreszierend ist, verwendet werden. Nach dem Abwaschen von nicht eingelagertem Ethidiumbromid kann das Photometer zum Detektieren der fluoreszierenden Banden herangezogen werden. Alternativ dazu kann ein Farbstoff im sichtbaren Bereich verwendet werden, z. B. Coomassieblau, und die Gelplatte zum Lichtkasten bewegt werden, um die sichtbaren Banden zu betrachten. Wenn der Farbstoff fluoreszierend ist, kann das Photometermodul aus dem Gelmodul entfernt und über dem Lichtkasten positioniert werden. Das Photometermodul leitet die beobachteten Fluoreszenzsignale an den Computer weiter. Die Elektrolumineszenzplatte kann dazu dienen, einen im sichtbaren Bereich absorbierenden Farbstoff zu detektieren.
Die verschiedenen aus dem Gelmodul und Photometermodul erhaltenen Signale werden einem Computer zugeführt, der mit der Temperatursteuerung und Elektroden interagiert, die den Spannungsgradienten bereitstellen und ihn im Gel messen. Die bereit gestellte Tastatur interagiert mit dem Computer, sodaß die Variablen gemäß der Leistung der Elektrophorese und den Wünschen der Bedienperson geändert werden können. Die Bedingungen der Elektrophorese können mit CRT überwacht und Hardcopys der Bedingungen und Bandentrennungen mit einem an den Computer angeschlossenen Drucker angefertigt werden. Durch Verwendung von Bahnen mit unterschiedlichen Mengen an Verdicker oder Polymer können Ferguson-Kurven erstellt werden, die für eine bestimmte Verbindung, z. B. Protein, charakteristisch sind (Charakterisierung in bezug auf Größe und Ladung).
Ein bereitgestelltes Programm setzt die verschiedenen aus dem Gelmodul und Photometermodul erhaltenen Signale mit dem Verlauf der Elektrophorese in Beziehung und hält im Gel konstante Bedingungen betreffend Temperatur und elektrischen Gradienten aufrecht, indem die Spannung an den Elektroden in den Puffernäpfen und die durch das Kühlsystem erzielte Kühlrate modifiziert werden.
Obwohl die Gele direkt analysiert werden können, mag es in zahlreichen Situationen wünschenswert erscheinen, die getrennten Moleküle vom Gel auf eine Membran zu übertragen. Zu diesem Zweck entfernt man die Gele von den Bahnen auf ein poröses Substrat wie z. B. Netfix oder dergleichen. Ein Stapel von Schichten wird bereitgestellt, wo die Gele sandwichartig zwischen mit Puffer benetzten Papieren angeordnet werden, die ihrerseits zwischen Schichtelektroden eingeschoben sind. Durch Einsetzen eines an eine Stromversorgung angeschlossenen Elektrodenrahmens können die Komponenten im Gel auf die Membran übertragen und kovalent oder nichtkovalent an diese gebunden werden. Die Probenkomponenten können dann mit Antikörpern, Nukleinsäuresonden oder dergleichen sondiert werden.
Das System der Erfindung eignet sich nicht nur zur Elektrophorese, sondern auch für isoelektrische Fokussierung im Trägerampholyten oder in immobilisierten pH-Gradientgelen. Stabile Bedingungen können unter Verwendung fluoreszierender Propidiumiodidmarker direkt überwacht werden.
Das System erfordert nur eine kleine Stromversorgung, die z. B. 0-500 V ± 10% bei Strömen von 0-25 mA üblicherweise unter unabhängiger Regulierung von Spannung und Strom liefert. Das Kühlsystem kann Wärme mit einer Rate von etwa 0-59 W (0-200 britischen Wärmeeinheiten/h) und einer Präzision von etwa ± 0,1ºC ableiten.
Das System kann zum Detektieren und Charakterisieren einer Vielzahl an Probenkomponenten dienen. Das System kann Nahrungsmittel überwachen, Viren nachweisen, Krankheiten diagnostizieren, z. B. die Produktion von Isozymen beim Myokardinfarkt, typisieren (betreffend Haupt-Histokompatibilitätskomplex-Antigene, Bluttyp oder dergleichen) und Zucker, Lipidkomplexe usw. nachweisen. Bei Zuckern kann es günstig sein, Boronate zu bilden, worin das Bor an ein geladenes Molekül wie z. B. Polyphosphat, Polyacrylat usw. gebunden sein kann. Aufgrund der Reproduzierbarkeit des Systems und der Fähigkeit, eine Vielzahl von Bahnen unter den gleichen Bedingungen laufen zu lassen, sodaß Bahnen mit bekannten Substanzen verwendet werden, können präzise Bestimmungen von Probenkomponenten vorgenommen werden.
Es ist aus obiger Beschreibung ersichtlich, daß ein geeignetes elektrophoretisches Gesamtsystem bereitgestellt wird, das dem Benutzer die Möglichkeit gibt, seine eigenen Gele herzustellen oder sie fertig zu kaufen, Elektrophorese in wirkungsvoller und reproduzierbarer Weise unter kontrollierten Bedingungen durchzuführen und dann die Gele in Einklang mit bekannten Verfahren zu verwenden, um die jeweiligen Komponenten der Probe spezifisch zu bestimmen. Außerdem wird ein Stapelgel getrennt von der Gelplatte bereitgestellt, was eine hohe Konzentration der Probenkomponenten ermöglicht, wodurch der Wirkungsgrad der Trennung weiter gesteigert wird.

Claims

1. Gelelektrophoresesystem zum Trennen von Komponenten eines Gemisches aufgrund ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften durch Hindurchschicken durch ein Gel unter einem Spannungsgradienten, wobei das System umfaßt:

a. eine Gelplatte (100), die umfaßt:

eine Oberfläche (118) zum Halten eines Gels (124);

Öffnungen (112, 112a) in der Nähe eines jeden der Enden der Oberfläche; und

Kanäle (114, 114a), die mit den Öffnungen kommunizieren und sich zum Einbringen in Pufferlösung von der Oberfläche nach unten erstrecken;

b. ein Gehäuse (10), das ein Gelelektrophoresemodul (24), ein Photometermodul (26) und elektrische Schaltung zum äußeren Anschluß umfaßt;

c. wobei das Gelelektrophoresemodul (24) umfaßt:

eine Temperaturregelplattform (34) zum Halten der Gelplatte (100);

Mittel (38) zum Abkühlen der Plattform;

Puffernäpfe (16, 18) zur Aufnahme von Pufferlösung (28, 28a) auf gegenüberliegenden Seiten der Temperaturregulierungsplattform;

Elektroden (30, 30a) zum Erzeugen eines Spannungsgradienten über die Gelplatte, wenn sie in den Puffernäpfen angeordnet ist; und

ein Paar Abfühlelektroden (144, 144a) zum Überwachen des Spannungsgradienten über ein Gel auf der Geloberfläche;

d. wobei das Photometermodul (26) umfaßt:

ein Abdeckgehäuse (12) zum Anbringen über dem Gelmodul;

einen Schlitten (56), der auf dem Gehäuse montiert ist;

Mittel (62, 64, 66), um den Schlitten über das Gehäuse zu bewegen;

ein Photometer (14), das auf dem Schlitten montiert ist und umfaßt:

zumindest zwei Photodetektoren (82, 82a);

ein Paar Filter (80, 80a) mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen, wobei jeder Photodetektor einen der Filter im Lichtweg zum Photodetektor aufweist; und

ein Paar optischer Fasern (78, 78a) zum Empfangen von Licht und Übertragen von Licht zu jedem der Photodetektoren durch die Filter;

eine Anregungslichtquelle (74, 74a);

e. elektrophoretische Konzentrationsmittel (150), umfassend:

einen Verteiler (152), der eine Vielzahl von Gefäßen (154) zur Aufnahme eines Stapelgels (160) umfaßt und der in einem engen Durchgang (158) endet; und

zumindest eine schwimmende Elektrode (166) zum Detektieren der Höhe einer Lösung (162) über dem Stapelgel;

f. Überwachungs- und Regelmittel (300), die operativ mit der elektrischen Schaltung verbunden sind, wobei das Überwachungs- und Regelmittel umfaßt:

Mittel zum Aufnehmen und Analysieren von Signalen von den Photodetektoren (82, 82a) und Bestimmen des Wellenlängenbereichs von Licht und der Intensität von Licht, das von den optischen Fasern (78, 78a) aufgenommen wird;

Mittel zum Detektieren eines Probenkomponentenbandes im Gel (124) durch die Wellenlängen- und Intensitätsbestimmung;

Mittel zum Bestimmen der Position des Bandes durch das Probenkomponentenband- Detektionsmittel und die Position des Schlittens (156);

Mittel zum Bestimmen der Temperatur der Plattform (34) und/oder des Gels;

Mittel zum Bestimmen des Spannungsgradienten im Gel; und

Mittel zum Regeln der Temperatur und des Spannungsgradienten im Gel als Antwort auf ein definiertes Programm.

2. System nach Anspruch 1, worin die Gelplatte (100) eine Vielzahl von Bahnen (108) und eine Vielzahl von Kanälen (114, 114a) an jedem Ende umfaßt, wobei das System weiters umfaßt:

eine Gelform (102) zur Erzeugen von Gels mit der Gelplatte, wobei die Gelform umfaßt:

eine Unterform (104) mit offenen Schlitzen (128, 128a) zum Aufnehmen der Kanäle;

eine Oberform (106), die eine ebene Fläche (136) mit ausgerichteten beabstandeten Ausstülpungen (132) umfaßt, um Probennäpfe (126) im Gel zu bilden;

Mittel (130,134), um die Ober- und die Unterform auszurichten und sie miteinander ausgerichtet zu halten; und

einen Gelfüll-Verteiler (138), der einen Block mit einer Vielzahl von Gelaufnahmeöffnungen (142) an einer oberen Kante aufweist; und

eine Vielzahl von Durchgängen (140), die sich von den Gelaufnahmeöffnungen durch den Block und aus einer Wand des Blocks heraus in solcher Ausrichtung erstrecken, daß sie mit den Kanälen (114) ausgerichtet sind, worin die Höhe der Durchgänge zumindest gleich groß wie die Länge der Bahnen (108) ist.

3. System nach Anspruch 1, worin die Gelplatte (100) eine Vielzahl von Bahnen (108) und eine Vielzahl von Öffnungen (112, 112a) in der Nähe eines jeden Endes umfaßt und das Photometermodul (26) zwei Photodetektoren (82, 82a) pro Bahn umfaßt.

4. System nach Anspruch 3, worin die Kanäle (114, 114a) in einer abgeschrägten Kante (120, 120a) enden.