DE4445551A1 - Elektrophorese-Fraktionssammler für mehrere Proben - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Elektrophorese-Fraktionssammler für mehrere Proben, insbesondere eine Ausrüstung, die sich dazu eignet, mehrere Proben zu fraktionieren, die DNA (De­ oxyribonucleinsäure), RNA (Ribonucleinsäure) oder Protein enthalten.

Die Fortschritte auf den Gebieten der Erforschung des Lebens und der Biotechnologie haben den Bedarf hinsichtlich einer Trennung und Fraktionierung von DNA-Bruchteilen verstärkt.

Wenn z. B. DNA-Bruchteile unter Verwendung eines Gels wie Agarose oder Polyacrylamid einer Elektrophorese unterzogen werden, werden sie abhängig von der Molekulargröße getrennt. Nach der Gelelektrophorese wird die Platte mit einem Pigment wie Ethidiumbromid versetzt, um die getrennten DNA-Bänder einzufärben, und das Gel mit dem eingefärbten Teil wird her­ ausgetrennt und in eine Pufferlösung (Lösungsmittel) ge­ taucht; so ist es möglich, ein abgetrenntes DNA-Fragment durch die Pufferlösung zu extrahieren und zu fraktionieren.

Ein anderes vorgeschlagenes Verfahren besteht darin, eine Pufferlösung rechtwinklig zum Endbereich einer zur Elektro­ phorese verwendeten Gelröhre zuzuführen, um dadurch die ab­ getrennten DNA-Bruchstücke in der Pufferlösung zu eluieren und sie zu fraktionieren (Offenlegung Nr. 3-115850 zu einer japanischen Patentanmeldung).

Das Verfahren des Heraustrennens von Gel zum Fraktionieren von DNA-Bruchstücken durch Eluieren derselben in einer Puf­ ferlösung hat den Nachteil, daß es arbeitsaufwendig ist. Beim herkömmlichen Verfahren des Einfärbens des Gels durch Ethidiumbromid besteht der Nachteil, daß die Erkennungsem­ pfindlichkeit für abgetrennte DNA gering ist; daher eignet sich dieses Verfahren nicht zur Fraktionierung kleiner Men­ gen von DNA-Bruchstücken.

Das herkömmliche Verfahren unter Verwendung einer rohrförmi­ gen Elektrophoresebahn zum Eluieren abgetrennter DNA-Frag­ mente in einer Pufferlösung und zum Fraktionieren derselben läßt nur die Handhabung einer Probe zu jeweils einem Zeit­ punkt zu; daher kann pro Zeiteinheit nur eine begrenzte Men­ ge verarbeitet werden. Auch verwendet dieses Verfahren opti­ sche Absorption zum Identifizieren von DNA-Bruchstücken, was zu geringer Erkennungsempfindlichkeit führt. Ferner erfor­ dert das herkömmliche Verfahren dann, wenn viele Proben zur Trennung und Fraktionierung gleichzeitig zu handhaben sind, die Verwendung vieler Elektrophoreseröhrchen. Dies wiederum erfordert dieselbe Anzahl an Ausrüstungsgegenständen, zu denen teure Detektoren gehören, wie Elektrophoreseröhrchen vorliegen, was zu einem sehr teuren Fraktionierungssystem führt. Zum Trennen von DNA-Bruchstücken wird ein langes Kunststoffröhrchen verwendet, und die DNA-Bruchstücke werden an der Innenwand des Röhrchens adsorbiert. Dies erschwert es, eine kleine Menge an Komponenten zu fraktionieren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein innovatives Instrument zu schaffen, das die bei den herkömmlichen Tech­ niken vorhandenen Schwierigkeiten dadurch überwindet, daß es Arbeit beim Heraustrennen von DNA-Bändern aus einer Gelelek­ trophoreseplatte einspart, die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben erlaubt und es ermöglicht, eine abgetrennte Komponente auf einfache und wirkungsvolle Weise zu fraktio­ nieren.

Der erfindungsgemäße Elektrophorese-Fraktionssammler ist durch die Lehre von Anspruch 1 gegeben.

Der Erfinder schlug bereits eine Elektrophoresevorrichtung vor, wie sie in der Offenlegung Nr. 6-138037 zu einer japa­ nischen Patentanmeldung beschrieben ist. Bei dieser Vorrich­ tung sind mehrere kapillarförmige Gelelektrophoreseröhrchen zwischen einem Puffergefäß mit einer Kathode für die Elek­ trophorese und ein Puffergefäß mit einer Anode für die Elek­ trophorese in der Mitte zweigeteilt und einander gegenüber­ stehend mit vorgegebenen Spaltweiten positioniert. Eine durch Elektrophorese abgetrennte Probe wird im Spalt eluiert und erfaßt. Die abgetrennte Komponente wird durch Einstrah­ len von Anregungslicht in den Spalt und durch Erfassen der Fluoreszenzstrahlung erkannt, wie sie von einer vom Anre­ gungslicht bestrahlten DNA, die mit einem Fluoreszenzstoff markiert ist, emittiert wird. Die abgetrennten Komponenten strömen nach dem Durchlaufen des beleuchteten Bereichs mit der Strömung der Pufferlösung in die unteren, gelfreien Röhrchen.

Der ebengenannten Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, für eine gleichzeitige Trennung mehrerer Proben zu sorgen und diese wirkungsvoll zu messen. Durch detaillierte Untersu­ chungen hat der Erfinder herausgefunden, daß wirkungsvolle Fraktionierung mehrerer Proben auf extrem einfache Weise möglich ist, wenn zur genannten Vorrichtung eine Fraktio­ nierfunktion in bestimmter Weise hinzugefügt wird. D. h., daß die Aufgabe der Erfindung mittels einer speziellen Frak­ tionssammeleinrichtung gelöst wird, die sich durch eine systematische Kombination einer Trenneinrichtung mit einer Elektrophoresebahn oder mehreren zum Auftrennen einer Probe durch Elektrophorese und einer Transporteinrichtung aus­ zeichnet, die ein kapillarförmiges Probentransportröhrchen oder mehrere aufweist, von denen jedes am Abschlußende einer Elektrophoresebahn angeordnet ist, wobei vorgegebene Spalt­ weiten zwischen einander zugewandten Enden eingehalten wer­ den.

Das Einleiten der aus den Elektrophoresebahnen eluierten ab­ getrennten Komponenten in die kapillarförmigen Probentrans­ portröhrchen wird dadurch ausgeführt, daß dem Spalt zwischen den Elektrophoresebahnen und den Probentransportröhrchen Pufferlösung zugeführt wird, ähnlich wie bei der Erfindung gemäß der Offenlegung Nr. 6-138037 zu einer japanischen Pa­ tentanmeldung. Die Erkennung der abgetrennten Komponenten erfolgt durch das Erfassen der Fluoreszenzstrahlung, wie sie von den abgetrennten Komponenten im Spalt emittiert wird, wozu ein geeignetes Verfahren verwendet wird, erneut ähnlich dem gemäß der ebengenannten offengelegten Erfindung. Es ist jedoch zu beachten, daß die Erfindung eine neue Einrichtung zum Fraktionieren der abgetrennten Komponenten, die in den kapillarförmigen Probentransportröhrchen nach unten strömen, schafft, und daß die Fraktioniereinrichtung abhängig von einem Ausgangssignal gesteuert wird, wie es durch Erfassen der von den abgetrennten Komponenten emittierten Fluores­ zenzstrahlung erhalten wird, um dadurch die abgetrennten Komponenten zu fraktionieren.

Die Elektrophoresebahn für die Probentrennung kann z. B. aus bekannten Elektrophorese-Stabgel- oder -Kapillargelröhrchen bestehen, erneut ähnlich wie bei der genannten offengelegten Erfindung. Die Anzahl von Elektrophoresebahnen muß nicht immer zwei oder mehr sein. Wie es später beschrieben wird, ist es möglich, wenn ein Detektor verwendet wird, der mehr als eine Wellenlänge von Licht erkennen kann, gleichzeitig mehrere Proben, die mit Fluoreszenzstoffen verschiedenen Fluoreszenzwellenlängen markiert sind, durch eine einzelne Elektrophoresebahn zu trennen. Jedoch ist die Trennung und Fraktionierung mehrerer Proben durch eine einzelne Elektro­ phoresebahn selbstverständlich beschränkt, so daß normaler­ weise die Verwendung mehrerer Elektrophoresebahnen bevorzugt ist. Mehrere Elektrophoresebahnen können leicht dadurch er­ halten werden, daß Elektrophoreseplatten unter Verwendung eines Stabgels in mehrere Teile unterteilt werden oder meh­ rere kapillarförmige Gelelektrophoreseröhrchen verwendet werden. Es ist jedoch zu beachten, daß es in diesem Fall er­ forderlich ist, mehrere kapillarförmige Probentransportröhr­ chen entsprechend der Anzahl von Elektrophoresebahnen zur Fraktionierung bereitzustellen.

Die Erkennung der abgetrennten, aus den Elektrophoresebahnen eluierten Komponenten wird durch Erfassen der von den abge­ trennten Komponenten emittierten Fluoreszenzstrahlung ausge­ führt. Im Prinzip ist es für die Erkennung einer abgetrenn­ ten Komponente möglich, Lichtstreuung oder Lichtabsorption zu verwenden, wie sie auftritt, wenn die abgetrennte Kompo­ nente Licht ausgesetzt wird. Um höhere Erkennungsempfind­ lichkeit zu gewährleisten, ist es bevorzugt, eine abzutren­ nende Probe vorab mit einem Fluoreszenzstoff zu markieren, ähnlich wie bei der genannten offengelegten Erfindung. In diesem Fall werden die abgetrennten Komponenten dadurch er­ kannt, daß Anregungslicht in den Spalt zwischen den einander gegenüberstehenden Enden einer Elektrophoresebahn und eines kapillarförmigen Probentransportröhrchens eingestrahlt wird, um dabei die von jeder abgetrennten Komponente emittierte Fluoreszenzstrahlung zu erfassen.

Die Einrichtung zum Fraktionieren abgetrennter, durch die kapillarförmigen Probentransportröhrchen transportierten Komponenten kann z. B. mittels Probenflaschenhaltern erfol­ gen, die mit speziellen Probenflaschen versehen sind, die so ausgelegt sind, daß die Komponenten in einzelne Probentrans­ portröhrchen übertragen werden können. Die Probenflaschen­ halter werden durch eine Probenflaschenhalter-Steuerung ab­ hängig vom Erkennungssignal der abgetrennten Komponenten, wie sie aus der Elektrophoresebahn eluiert werden, auf sol­ che Weise betrieben, daß die abgetrennten Komponenten frak­ tioniert werden und in die jeweils vorgegebene Probenflasche eingegeben werden.

Nachdem eine Trennung durch Elektrophorese erfolgte, errei­ chen Proben (z. B. DNA-Fragmente) mit kleinerer Molekular­ größe das Abschlußende einer Elektrophoresebahn in kürzerer Zeit als Proben mit großer Molekulargröße, und sie werden aus der Bahn in den genannten Spalt eluiert. Die eluierten, getrennten Komponenten können leicht durch das von einer je­ weiligen abgetrennten Komponente erzeugte Signallicht (z. B. Fluoreszenzstrahlung) erkannt werden. Die Pufferlösung füllt, wenn sie durch Schwerkraft in den Einlaß eines kapil­ larförmigen Probentransportröhrchens einströmt, die aus der Elektrophoresebahn eluierte abgetrennte Komponente ein, was zu einer sogenannten "Mantelströmung" führt. Im Ergebnis strömt jede von der Strömung der Pufferlösung begleitete ge­ trennte Komponente gleichmäßig in jedes Probentransportröhr­ chen hinein, ohne daß ein Vermischen mit einer abgetrennten Komponente erfolgt, die aus einer anderen Elektrophoresebahn eluiert wurde. Um eine stabile Mantelströmung zu errichten, ist es auch möglich, die Pufferlösung durch eine Pumpe oder eine andere geeignete Einrichtung unter zweckentsprechenden Druck zu setzen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von zwei durch Figu­ ren veranschaulichten Ausführungsbeispielen näher beschrie­ ben.

Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht, die das erste Aus­ führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Fraktionssammlers repräsentiert;

Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht, die das zweite Aus­ führungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Fraktionssammlers veranschaulicht;

Fig. 3 ist eine Zeichnung, die ein Beispiel einer Basenfolge eines Teils einer zu fraktionierenden DNA repräsentiert;

Fig. 4 ist eine Zeichnung, die ein Beispiele für eine Basen­ folge eines mit einem Fluoreszenzstoff markierten DNA-Bruch­ stücks zeigt;

Fig. 5A, 5B und 5C sind Zeichnungen, die ein Beispiel für eine Elektropherogramm repräsentieren, wie es von dem mit einem Fluoreszenzstoff markierten DNA-Bruchstück erhalten wird; und

Fig. 6 ist eine schematische Zeichnung, die den Transport einer Probe durch eine Mantelströmung veranschaulicht.

Fig. 1 veranschaulicht das erste Ausführungsbeispiel der Er­ findung. Diese Vorrichtung weist ein Trennmedium A, einen Erkennungsbereich B und einen Sammelbereich C auf. Das Trennmedium A besteht aus einer Elektrophoreseplatte 1 unter Verwendung eines Stabgels, in dem Elektrophoresebahnen aus­ gebildet sind. Mehrere Proben werden mit vorgegebenen Ab­ ständen an der (nicht dargestellten) Oberseite eingegeben, und diese Proben werden durch Elektrophorese dadurch ge­ trennt, daß ein Gleichstrom zwischen einer (nicht darge­ stellten) Kathode an der genannten Oberseite und einer an der Unterseite vorhandenen Anode 6 fließt. Die Komponenten der mehreren Proben werden in verschiedenen Elektrophorese­ bahnen, die sich in der Zeichnung nach unten erstrecken, durch Elektrophorese getrennt. Proben mit kleinerer Größe erreichen die Unterseite der Elektrophoreseplatte 1 in kür­ zerer Zeit als solche größerer Größe, und sie werden früher an der Unterseite der Elektrophoreseplatte 1 eluiert. Die mehreren Elektrophoresebahnen können jeweils dadurch voll­ ständig voneinander getrennt werden, daß die Gelelektropho­ reseplatte 1 unter Verwendung von Isolierwänden (dadurch werden mehrere Nuten als Wanderungspfade errichtet) in meh­ rere Wanderungspfade unterteilt wird. Polyacrylamid-Gel mit einer Konzentration von 5 bis 20% oder Agarose-Gel mit einer Konzentration von 0,5 bis 3% wird häufig als Trenngel verwendet.

Der Erkennungsbereich B besteht aus einem Puffergefäß 5, einer Anregungslichtquelle 4 und einem zweidimensionalen De­ tektor 9. Das Puffergefäß 5 weist eine schlanke Struktur auf, und es erstreckt sich entlang der gesamten Länge der Gelelektrophoreseplatte 1 in horizontaler Richtung, und es wird eine geeignete Menge an Pufferlösung zugeführt, um die gesamte Unterseite der Gelelektrophoreseplatte 1 einzutau­ chen. Der Bestrahlungswinkel des Anregungslichts 10 wird so eingestellt, daß ihm alle aus den mehreren Elektrophorese­ bahnen eluierten getrennten Komponenten ausgesetzt sind.

Die aus der Gelelektrophoreseplatte 1 eluierten getrennten Komponenten empfangen Anregungslicht 10 von der Lichtquelle 4, und sie senden Fluoreszenzstrahlung 50 aus, wenn mit Fluoreszenzstoff markierte Proben verwendet werden. Hochem­ pfindliche Erkennung getrennter Komponenten wird dadurch ausgeführt, daß die emittierte Fluoreszenzstrahlung unter Verwendung des zweidimensionalen Detektors 9 erfaßt wird.

Um den Einfluß eines Hintergrundsignals von anderen Substan­ zen (Gel usw.) als den getrennten Komponenten zu minimieren, wird die optische Achse des Anregungslichts 10 vorab für die getrennten Komponenten so positioniert, daß diese direkt nach dem Eluieren aus der Gelelektrophoreseplatte 1 dem An­ regungslicht 10 ausgesetzt werden.

Der Sammelbereich C weist mehrere kapillarförmige Proben­ transportröhrchen 8, eine entsprechende Anzahl von Proben­ flaschenhaltern 15, Verstelleinrichtungen 14 für Probenfla­ schenhalter und Steuerungen 13 für die Übertragungseinrich­ tung 14 auf. Ein Datenprozessor 11 verarbeitet das Ausgangs­ signal des zweidimensionalen Detektors 9 und überträgt es an eine Steuerung 13. Die Probentransportröhrchen 8 können die aus jeder Elektrophoresebahn eluierten Komponenten den Probenflaschenhaltern 15 zuführen. Sie sind entsprechend der Form der Unterseite der Elektrophoreseplatte 1 in einer Zei­ le ausgerichtet, und sie sind mit der Unterseite des Puffer­ gefäßes 5 verbunden, wobei die Oberseiten (Einlässe) zusam­ mengehalten werden.

Die Pufferlösung im Puffergefäß 5 strömt sofort zum Einlaß eines Probentransportröhrchens 8 nach unten und nimmt die aus der Elektrophoresebahn der Gelelektrophoreseplatte 1 ge­ trennten Komponenten in das Probentransportröhrchen 8 mit. Um für eine gleichmäßige Übertragung der getrennten Kompo­ nenten durch die Pufferlösung in die Probentransportröhrchen zu sorgen und um zu gewährleisten, daß die getrennten Kompo­ nenten dem Anregungslicht ausgesetzt werden, ist zwischen der Unterseite (Abschluß der Elektrophoresebahn) der Gel­ elektrophoreseplatte 1 und der Oberseite (Einlaß) des Pro­ bentransportröhrchens 8 ein Spalt von ungefähr 1 mm vorhan­ den.

Die mehreren Probenflaschenhalter 15 sind geordnet den Un­ terseiten der Probentransportröhrchen 8 (Auslässe) gegen­ überstehend angeordnet, so daß die in den Probentransport­ röhrchen 8 herunterströmenden getrennten Komponenten zusam­ men mit der Pufferlösung für jede Elektrophoresebahn frak­ tioniert werden können. Das vorliegende Ausführungsbeispiel verwendet Probenflaschenhalter 15, die entlang geraden Li­ nien dadurch ausgebildet sind, daß mit Abständen von 5 mm in rechtwinkligen Blöcken als Probenflaschen 16 wirkende Ver­ tiefungen mit einem Durchmesser von 4 mm angebracht sind. Anstelle der Ausbildung von Vertiefungen ist es möglich, eine vorgegebene Anzahl von Kunststoffflaschen anzuordnen, wie sie am Markt erhältlich sind.

Die Verstelleinrichtung 14 für die Probenflaschenhalter 15 wird durch die Probenflaschenhalter-Steuerung 13 gesteuert, die abhängig von im Datenprozessor 11 vorgegebenen Steue­ rungsdaten betrieben wird. Die mittlere Wanderungszeit, wie sie eine getrennte, aus der Elektrophoresebahn der Gelelek­ trophoreseplatte 1 eluierte Komponente erfordert, um am Ab­ schluß eines Probentransportröhrchens 8 anzukommen, ist als Steuerdatenwert festgelegt. Diese mittlere Wanderungszeit kann aus derjenigen Zeit berechnet werden, wie sie durch die Strömungsrate der durch ein Probentransportröhrchen 8 flie­ ßenden Pufferlösung und der Länge dieses Röhrchens bestimmt wird. Normalerweise wird diese mittlere Wanderungszeit da­ durch berechnet, daß vor der Fraktionierung ein Markierstoff hindurchgeleitet wird, um die Zeit zu messen, die der Mar­ kierstoff benötigt, um durch das Probentransportröhrchen 8 zu laufen. Das vorliegende Ausführungsbeispiel verwendet auch ein Verfahren, bei dem die mittlere Wanderungszeit da­ durch erhalten wird, daß ein Markierstoff hindurchgeleitet wird, wobei das Ergebnis als Steuerungsdatenwert einge­ schrieben wird. Die Probenflaschenhalter-Steuerung 13 steu­ ert die Verstelleinrichtung 14 auf Grundlage dieses Steue­ rungsdatenwerts. Die Verstelleinrichtung 14 verstellt, ge­ steuert durch die Probenflaschenhalter-Steuerung 13, den Probenflaschenhalter 15 in Übereinstimmung mit dem Eluier­ zeitpunkt einer getrennten Komponente. D. h., daß die Pro­ benflaschenhalterung 15 nach der Ausgabe eines Erkennungs­ signals für eine getrennte, aus der Elektrophoresebahn eluierte Komponente durch den zweidimensionalen Detektor 9 durch die von der Probenflaschenhalter-Steuerung 13 gesteu­ erte Verstelleinrichtung 14 auf Grundlage des Steuerungs­ datenwerts (mittlere Wanderungszeit) verstellt wird. Dann wird eine spezifizierte Probenflasche 16 in Übereinstimmung mit dem Zeitpunkt, zu dem die getrennte Komponente aus der Elektrophoresebahn eluiert wurde, verstellt, und die ge­ trennte Komponente wird fraktioniert und in der spezifizier­ ten Probenflasche 16 gesammelt. Dies gewährleistet eine Fraktionierung einer großen Anzahl von DNA-Bruchstücken mit extrem gutem Wirkungsgrad. Es ist zu beachten, daß der Pro­ benflaschenhalter 15 mit vorgegebenen Zeitintervallen inter­ mittierend verstellt werden kann.

Eine fraktionierte Probe wurde dadurch hergestellt, daß eine Pufferlösung mit einem DNA-Bruchstück versetzt wurde, das durch das 6-Basen-Erkennungsenzym ECoRI abgetrennt wurde, ein Restriktionsenzym, das 6 Basen erkennt und sie abtrennt. Um das DNA-Bruchstück zu markieren, wurde ein mit Sulfo­ rhodamin 101 (mit einer Fluoreszenzwellenlänge von 620 nm) markiertes Oligomer durch eine Legationsreaktion mit der Schnittstelle des DNA-Bruchstücks verbunden. Es ist auch möglich, ein DNA-Bruchstück dadurch mit einem Fluoreszenz­ stoff zu markieren, daß eine mit einem Fluoreszenzstoff mar­ kierte Nukleinsäure mit der Schnittstelle der DNA verbunden wird, wozu die Polymerasereaktion durch DNA-Polymerase ver­ wendet wird. Anregungslicht von der Lichtquelle in Form eines He-Ne-Lasers (Fluoreszenzwellenlänge von 594 nm) wurde zum Erkennen der aus der Gelelektrophoreseplatte eluierten DNA-Bruchstücke verwendet. Es ist auch möglich, verschiedene Größen einsträngiger DNAs zu trennen und zu fraktionieren, wie sie durch eine Ausdehnungsreaktion komplementärer Stränge unter Verwendung einer mit einem Fluoreszenzstoff markierten Deoxynucleinsäure erhalten werden, wobei eine einsträngige Matrizen-DNA dadurch erhalten wird, daß die doppelsträngige Proben-DNA zerlegt wird.

Bei der Erfindung wird freier Fall dazu verwendet, die ge­ trennten Komponenten in die Probenflaschen 16 zu leiten. Um die Abtrennung von Komponenten aus einem kapillarförmigen Probentransportröhrchen 8 zu erleichtern, wird mit Ultra­ schall auf das Ende des Röhrchens eingewirkt, oder es wird mit Tintenstrahlfunktion versehen. Dies erlaubt es, daß eine kleine Menge abgetrennter Komponenten mit höherem Wirkungs­ grad gesammelt werden kann. Die Verwendung von Probentrans­ portröhrchen 8, die so klein wie möglich sind, ist bevor­ zugt, um zu verhindern, daß eine abgetrennte Komponente an der Innenwand einer Flasche adsorbiert wird. Gemäß dem vor­ liegenden Ausführungsbeispiel ist die Ausrüstungskonfigura­ tion so konzipiert, daß die Gelelektrophoreseplatte 1 und das kapillarförmige Probentransportröhrchen 8 vertikal aus­ gerichtet sind. Es ist auch möglich, die Gelelektrophorese­ platte 1 horizontal und das Probentransportröhrchen 8 verti­ kal auszurichten.

Ausführungsbeispiel 2

Fig. 2 zeigt das zweite Ausführungsbeispiel der Erfindung. Dieselben Symbole wie in Fig. 1 bezeichnen dieselben Teile oder Orte mit denselben Funktionen. Diese Vorrichtung ist eine Anwendung der Erfindung auf die Elektrophoresevorrich­ tung, wie sie in der Offenlegung Nr. 6-138037 zu einer japa­ nischen Patentanmeldung beschrieben ist. Das Trennmedium A besteht aus mehreren kapillarförmigen Gelelektrophoreseröhr­ chen 18, ähnlich wie im Fall der ebengenannten Erfindung, und der Sammelbereich C ist praktisch derselbe wie beim er­ sten Ausführungsbeispiel. Als Gelelektrophoreseröhrchen 18 und als Probentransportröhrchen 8 wird z. B. jeweils ein Ka­ pillarröhrchen mit einem Außendurchmesser von 200 µm und einem Innendurchmesser von 100 µm verwendet. Selbstverständ­ lich kann für beide Kapillarröhrchen ein größerer Durchmes­ ser verwendet werden. Als in das Gelelektrophoreseröhrchen 18 einzufüllendes Gel wird Polyacrylamid mit einer Konzen­ tration von 5 bis 20% oder Agarose mit einer Konzentration von 0,5 bis 3% verwendet. Der Erfassungsbereich B verwendet Anregungslicht von einem He-Ne-Laser (mit einer Fluoreszenz­ wellenlänge von 594 nm) als Lichtquelle. Z. B. wird das La­ serlicht im Brennpunkt auf einen Durchmesser von ungefähr 100 µm so fokussiert, daß er im Bereich von ungefähr 10 mm vor und hinter dem Brennpunkt eine Strahltaille von ungefähr 100 µm aufweist. Demgemäß können, wenn Gelelektrophorese­ röhrchen 18 mit einem Außendurchmesser von 200 µm und einem Innendurchmesser von 100 µm mit Abständen von 400 µm ange­ ordnet werden, ungefähr 50 Röhrchen im Bereich von 10 mm vor und hinter dem Brennpunkt verlegt werden. Dies ermöglicht es, eine Einstrahlung nahe den Enden der Gelelektrophorese­ röhrchen 18 mit gleichmäßigem Durchmesser und gleichmäßiger Intensität des Lichtstrahls vorzunehmen. Die oberen Enden der weiten Transportröhrchen 8 sind den Gelelektrophorese­ röhrchen 18 gegenüberstehend angeordnet. Fig. 2 ist eine lineare Wiedergabe der Probentransportröhrchen 8, um die Vorrichtung schematisch zu veranschaulichen. Tatsächlich sind die Probentransportröhrchen 8 in der Mitte gebogen, um zu gewährleisten, daß jede Unterseite eines Probentransport­ röhrchens 8 über einer spezifizierten Probenflasche 16 jeder Probenflaschenhalterung 15 liegt. Der zweidimensionale De­ tektor 9 ist ein solcher, wie er in der Offenlegung Nr. 2-269936 zu einer japanischen Patentanmeldung offenbart ist. Dieser Detektor ist mit einem Bildteilerprisma 21 mit mehre­ ren optischen Ebenen versehen, um das durch die Einstrahlung von Anregungslicht erhaltene lineare Fluoreszenzbild aufzu­ teilen, und auf der Meßoberfläche werden mehrere durch die mehreren Ebenen des Prismas 21 aufgeteilte Bilder einzeln ausgebildet. Nachdem das Signallicht unter Verwendung des Bildteilerprismas 21 in zwei verschiedene Lichtpfade aufge­ teilt wurde, werden zwei verschiedene Farbfilter 22 dazu verwendet, um eine Auswahl und Erkennung aufgrund der Wel­ lenlänge vorzunehmen.

Die Kombination aus einem Bildteilerprisma, das ein Auftei­ len des Lichts in drei oder mehr Lichtpfade ermöglicht, und entsprechenden Farbfiltern ermöglicht eine Auswahl und Er­ kennung von Licht mit mehreren Wellenlängen.

Dem Probengefäß 5 wird von einem Behälter 20 für Mantelströ­ mungslösung, der über dem Puffergefäß 5 angeordnet ist, das auch als Fluoreszenzzelle 19 dient, durch die Schwerkraft Pufferlösung zugeführt. Die Zufuhr kann auch dadurch erfol­ gen, daß durch eine Druckausübungseinrichtung wie eine Pumpe Druck auf die Pufferlösung ausgeübt wird.

Mehrere Gelelektrophoreseröhrchen 18 sind in einer Linie zwischen einem (nicht dargestellten) oberen Elektrodengefäß und dem Puffergefäß 5 angeordnet. In zahlreiche Löcher in einer Probenaufnahme Platte 17 ist eine große Anzahl zu mes­ sender Proben eingegeben, und das obere Ende jedes Gelelek­ trophoreseröhrchen 18 wird in jeweils ein Loch eingetaucht, um eine Probe aufzunehmen. Dann wird das jeweilige obere Ende zum (nicht dargestellten) oberen Elektrodengefäß ver­ stellt. Die Trennung der zu messenden Proben erfolgt durch Anwenden von Gleichstrom zwischen dem oberen Elektrodengefäß und dem Puffergefäß 5.

Mehrere Probentransportröhrchen 8 im Sammelbereich C sind in einer Linie in Übereinstimmung mit der Anordnung der Gel­ elektrophoreseröhrchen 18 angeordnet, und ihr oberes Ende (Einlaß) ist mit der Unterseite des Gefäßes so verbunden, daß gewährleistet ist, daß spezielle Spalte innerhalb des Puffergefäßes 5 zu den jeweiligen Gelelektrophoreseröhrchen 18 eingehalten werden können. Dies führt zu einer Pufferlö­ sung innerhalb des Puffergefäßes 5, die eine Übertragung in die Probentransportröhrchen 8 vornimmt. In diesem Fall wer­ den aus einem Gelelektrophoreseröhrchen 18 eluierte getrenn­ te Komponenten in ein gewünschtes Fraktionsröhrchen 8 einge­ leitet.

Es wird darauf hingewiesen, daß die Spaltweite vorzugsweise ungefähr 0,5 bis 10 mm beträgt. Speziell ist es bevorzugt, daß die Spaltweite relativ kurz ist, da Fraktionierung der durch Elektrophorese getrennten Proben erleichtert ist, wenn die Spaltweite klein ist. Vom Gesichtspunkt des Vorrich­ tungszusammenbaus her ist jedoch die Einstellung schwieri­ ger, wenn die Spaltweite kleiner ist. Normalerweise kann sie in der Praxis auf 10 mm oder weniger eingestellt werden, wobei die Grenze durch die Streuung des Laserlichts an den Kapillargrenzen gegeben ist, da für eine Erfassung mit hoher Empfindlichkeit Streuung vermieden werden sollte. Es besteht also Abhängigkeit vom Durchmesser des Anregungslichts, wie Laserlicht in den Spalten. Umgekehrt führt eine größere Spaltweite zu leichterer Probendiffusion. Es hat sich her­ ausgestellt, daß eine Spaltweite von ungefähr 10 mm eine gleichmäßige Strömung der Probe gewährleistet. D. h., daß eine Spaltweite von 0,5 mm bis 10 mm eine einfache und wir­ kungsvolle Zuführung getrennter Komponenten von einem Gel­ elektrophoreseröhrchen 18 auf selektive Weise in ein ge­ wünschtes Fraktionierröhrchen 8 erlaubt.

Die Erfindung schafft eine Vorrichtung, die zum Fraktionie­ ren mehrerer DNAs unter Verwendung ein und desselben Gel­ elektrophoreseröhrchens 18 geeignet ist, um mehrere Proben zu trennen, die mit einem Fluoreszenzstoff mit verschiedenen Fluoreszenzwellenlängen markiert sind. Im folgenden wird ein Ablauf zur DNA-Messung beschrieben.

Fig. 3 ist Teil eines schematischen Diagramms doppelsträngi­ ger DNA-Strukturen mit teilweise verschiedenen DNA-Basenfol­ gen. In dieser Figur bezeichnen 70 (70a bis 70d, 70x) und 71 einzelne Basenfolgeeinheiten. Die Basenfolgeeinheit 71 kann durch das spezielle 6-Basen-Erkennungsenzym ECoRI herausge­ trennt werden. Die DNA 60 oben in der Zeichnung verfügt nicht über die Basenfolgeeinheit 70x, die Teil der DNA 61 unten in der Zeichnung ist. Andere Teile stimmen für beide überein. Hinsichtlich der DNA 60 und 61 werden mit Fluores­ zenzstoff markierte DNA-Bruchstücke dadurch erhalten, daß ein vorab mit Fluoreszenzstoff markiertes DNA-Oligomer durch eine Legationsreaktion mit der Schnittstelle verbunden wird, nachdem ein Abbau durch das spezielle 6-Basen-Erkennungs­ enzym ECoR erfolgte.

In Fig. 4 bezeichnen die Bezugszahlen 80 und 81 mit Fluores­ zenzstoff markierte DNA-Bruchstücke, die durch Abbauen der DNAs 60 und 61 erhalten wurden und die verschiedene Basen­ folgen aufweisen. Das DNA-Bruchstück 80 ist mit einem Fluo­ reszenzstoff markiert, wozu z. B. ein DNA-Oligomer 73a ver­ wendet wird, das mit Sulforhodamin 101 (mit einer Fluores­ zenzwellenlänge von 620 nm) markiert ist. Andererseits ist das DNA-Bruchstück 81 mit einem Fluoreszenzstoff markiert, wozu z. B. ein DNA-Oligomer 73b verwendet wird, das mit Cy-5 (mit einer Fluoreszenzwellenlänge von 650 nm) markiert ist. Die zwei DNAs 60 und 61 werden durch das 6-Basen-Erkennungs­ enzym ECoR mit einer Basenfolgeeinheit 71 abgebaut, und die Schnittstelle 72 wird mit dem DNA-Oligomer 73a und dem DNA- Oligomer 73b verbunden. Nach einem Vermischen der zwei in Fig. 4 dargestellten DNA-Bruchstücke 80 und 81, wobei die Konzentration so eingestellt wird, daß die Fluoreszenzinten­ sitäten einander gleich sind, erfolgt ein Vermischen mit der Pufferlösung, um die zu messende Probe herzustellen.

Auf diese Weise hergestellte Proben werden zur Analyse in eines der Gelelektrophoreseröhrchen 18 gegeben, und sie wer­ den einer Elektrophorese unterzogen, um dann in das Puffer­ gefäß 5 eluiert zu werden. Der zweidimensionale Detektor 9 wird dazu verwendet, die von den DNA-Bruchstücken 80 und 81 emittierte Fluoreszenz zu erfassen. Die Fig. 5A und 5B zei­ gen einen Teil von Elektropherogrammen, wie sie dadurch er­ halten werden, daß die Fluoreszenzstrahlung bei Wellenlängen von 620 mm und 650 mm erfaßt wird, wie sie nach dem Start der Elektrophorese zu erkennen ist. Die Bezugszahl 82 in Fig. 5 kennzeichnet das Fluoreszenzsignal vom DNA-Bruchstück 80, wie es zum Wanderungszeitpunkt t₃ beobachtet wird, wäh­ rend 83 in Fig. 5B das Fluoreszenzsignal vom DNA-Bruchstück 81 bezeichnet, wie es zum Wanderungszeitpunkt t₄ beobachtet wird. Zu Wanderungszeitpunkten t₁, t₂, und t₅ in den Fig. 5A und 5B werden Fluoreszenzsignale von DNA-Fragmenten beob­ achtet, die durch die zerschnittenen DNAs 60 und 61 erhalten werden, die gemeinsame Basenfolgen aufweisen.

Fig. 5C zeigt das Differenzspektrum, wie es aus den zwei in den Fig. 5A und 5B dargestellten Elektropherogrammen erhal­ ten wird. Das Fluoreszenzsignal zu den Wanderungszeitpunkten t₁, t₂ und t₅ ist im Differenzspektrum als Spur erkennbar, während das Fluoreszenzsignal zu den Wanderungszeitpunkten t₃ und t₄ im Differenzspektrum deutlich erkennbar ist. Dem­ gemäß ist aus dem Differenzspektrum von Fig. 5C erkennbar, daß die zwei DNA-Bruchstücke 80 und 81 voneinander getrennt und erfaßt werden können. Der Datenprozessor 11 wird dazu verwendet, die Betriebsverarbeitung zum Erhalten des Diffe­ renzspektrums auszuführen. Auf Grundlage des durch die Be­ triebsverarbeitung erhaltenen Ergebnisses für das Differenz­ spektrum steuert die Probenflaschenhalter-Steuerung 13 die Verstelleinrichtung 14 und diese verstellt die Probenfla­ schenhalterung 15. Eine Probenflasche 16 wird zum Sammeln durch eine spezifizierte Probenflasche 16 ersetzt, und die zwei DNA-Bruchstücke 80 und 81 werden voneinander getrennt und in verschiedenen Probenflaschen 16 gesammelt.

Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Fraktionssammlers er­ laubt das Einsparen von Zeit, wie sie zum Erhalten eines Gels erforderlich ist, und daß Fraktionieren getrennter Kom­ ponenten durch Erfassen des Lichtsignals, wie es durch die durch Elektrophorese getrennten Proben emittiert wird, und durch Steuern der Probenflaschenhalterung. Wenn Fluoreszenz­ strahlung als Erkennungssignal verwendet wird, erzielt die erfindungsgemäße Sammeleinrichtung eine hochempfindliche Fraktionierung mit sehr kleinen Probenmengen. Ferner ist es unter Verwendung eines Detektors, der Licht mit mehreren Wellenlängen erkennen kann, möglich, mehrere Proben mittels ein und derselben Elektrophoresebahn zu fraktionieren. Die Erfindung beschreibt den Fall einer Fraktionierung von DNA-Bruchstücken. Jedoch kann die Erfindung auch auf die Frak­ tionierung von z. B. Proteinen, RNA-Bruchstücken und Amino­ säuren angewandt werden.

Im folgenden wird der Probentransport durch Mantelströmung näherungsweise beschrieben, was unter Verwendung von Fig. 4 und eines Beispiels für ein kapillarförmiges Gelelektropho­ reseröhrchen erfolgt. Unter Einfüllung eines kapillarförmi­ gen Gelelektrophoreseröhrchens 18 strömt die Pufferlösung spontan zum Einlaß 101 eines kapillarförmigen Probentrans­ portröhrchens und tritt in dieses (unter Erzeugung einer Mantelströmung) ein. In Fig. 6 ist die Strömung der Puffer­ lösung durch obere und untere Pfeile gekennzeichnet. Das Bezugssymbol 102a bezeichnet die im kapillarförmigen Gel­ elektrophoreseröhrchen 18 durch Elektrophorese getrennte Komponenten. Das Bezugssymbol 102b bezeichnet eine getrennte Komponente, die aus dem kapillarförmigen Gelelektrophorese­ röhrchen 18 eluiert ist und in den Spalt zwischen diesem und dem kapillarförmigen Probentransportröhrchen 8 strömt, wobei sie von der Strömung der Pufferlösung eingehüllt wird. Das Bezugssymbol 102c bezeichnet die getrennte Komponente, die durch das kapillarförmige Probentransportröhrchen 8 strömt. Da die von der Pufferlösung eingehüllte getrennte Komponente 102b in das kapillarförmige Probentransportröhrchen 8 strömt, das dem kapillarförmigen Gelelektrophoreseröhrchen 18 gegenübersteht, werden die aus den mehreren Elektropho­ resebahnen eluierten abgetrennten Komponenten ohne gegensei­ tige Vermischung den den Elektrophoresebahnen zugewandten Probentransportröhrchen zugeführt. Während die getrennten Komponenten 102b durch den Spalt strömen, sind sie dem Anre­ gungslicht 10 ausgesetzt, und vom Fluoreszenzstoff als Mar­ kierung der getrennten Komponenten 102b wird Fluoreszenz­ strahlung emittiert. Diese Fluoreszenzstrahlung wird durch den zweidimensionalen Detektor erfaßt, und dann wird die Probenflaschenhalterung 15 verstellt, und die getrennten Komponenten, die durch das kapillarförmige Probentransport­ röhrchen 8 strömen, werden in die Probenflaschen 16 auf dem Probenflaschenhalter 15 fraktioniert. Das Bezugssymbol 102e bezeichnet eine getrennte, fraktionierte Komponente, und 102d bezeichnet diejenige getrennte Komponente, die vor der getrennten Komponente 102e fraktioniert wurde.

Claims (15)

1. Fraktionssammler mit:

• - einer Elektrophoreseeinrichtung (A) zum Trennen von Proben durch Elektrophorese in Komponenten und
• - einer Erfassungseinrichtung (B) zum optischen Erfassen der Komponenten;

gekennzeichnet durch

• - eine Fraktioniereinrichtung (C) zum Fraktionieren der Kom­ ponenten und
• - eine Steuerungseinrichtung (13, 14) zum Steuern der Frak­ tioniereinrichtung auf Grundlage des von der Erfassungsein­ richtung ausgegebenen Signals.

2. Sammler nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Lichtquelle (4) zum Emittieren von Licht, um Fluoreszenz von mit Fluoreszenzstoff markierten Proben hervorzurufen.

3. Sammler nach einem der Ansprüche 1 oder 2, gekennzeich­ net durch

• - eine Trenneinrichtung (1, 18) mit mindestens einer Elek­ trophoresebahn zum Trennen von Proben durch Elektrophorese in Komponenten;
• - eine Transporteinrichtung zum Transportieren der aus der mindestens einen Elektrophoresebahn eluierten getrennten Komponente, mit mindestens einem kapillarförmigen Proben­ transportröhrchen (8), wobei das jeweilige Einlaßende eines Probentransportröhrchens dem Ende der zugehörigen Elektro­ phoresebahn getrennt durch einen Spalt gegenübersteht;
• - eine Mitnahmeeinrichtung (5) zum Zuführen von Pufferlösung zum Spalt und zum Mitnehmen der mindestens einen getrennten Komponente in das Probentransportröhrchen mittels Mantel­ strömung der Pufferlösung;
• - eine Fraktioniereinrichtung (15, 16) zum Fraktionieren mittels einer getrennten Komponente, die in einem Proben­ transportröhrchen gelaufen ist;
• - eine Erfassungseinrichtung zum Erfassen der mindestens einen getrennten, eluierten Komponente durch Erfassen des von dieser im Spalt emittierten Lichts und
• - eine Steuereinrichtung (13, 14) zum Steuern der Fraktio­ niereinrichtung auf Grundlage des von der Erkennungseinrich­ tung erhaltenen Signals.

4. Sammler nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trenneinrichtung Elektrophoresebah­ nen aufweist, die in einer Elektrophoreseplatte (2) unter Verwendung eines Stabgels ausgebildet sind.

5. Sammler nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Trenneinrichtung kapillarförmige Gel­ elektrophoreseröhrchen (18) aufweist.

6. Sammler nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß für mit Fluoreszenzstoff markierte Pro­ ben die Spalte mit einer Lichtquelle (4) zum Einstrahlen von Anregungslicht versehen sind und die Erfassungseinrichtung ein optischer Detektor (9) zum Erfassen der von den genann­ ten Komponenten auf das Anregungslicht hin emittierten Fluo­ reszenzstrahlung ist.

7. Sammler nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktioniereinrichtung Probenfla­ schenhalter (15) aufweist, die Probenflaschen (16) tragen, deren Öffnungen unter die Enden der Probentransportbahnen verschiebbar sind, daß die Steuerungseinrichtung eine Pro­ benflaschenhalter-Steuereinrichtung (13) aufweist, um eine Verstelleinrichtung (14) zum Verstellen der Probenflaschen­ halter anzusteuern, und daß die Probenflaschenhalter-Steuer­ einrichtung die Verstelleinrichtung auf Grundlage des von der optischen Erfassungseinrichtung ausgegebenen Signals so steuert, daß die getrennten Komponenten in spezifizierte Probenflaschen fraktioniert werden.

8. Sammler nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenflaschenhalter-Steuereinrichtung (13) die Ver­ stelleinrichtung (14) zu einem vorgegeben Zeitpunkt ver­ stellt, nachdem von der optischen Erfassungseinrichtung (9) ein optisches Signal erfaßt wurde.

9. Sammler nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine vorgegebene Zeitspanne verwendet wird, die kürzer ist als diejenige, die eine getrennte Komponente benötigt, um vom Ort der Bestrahlung mit Anregungslicht durch ein Proben­ transportröhrchen (8) hindurch zu einer Probenflasche (16) zu laufen.

10. Sammler nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß eine vorgegebene Zeitspanne verwendet wird, die kürzer ist als diejenige, die eine spezifizierte Substanz ab der Elektrophorese in einer Elektrophoresebahn vor der Trennung und Fraktionierung der Probe bis in eine Probenflasche (16) benötigt, ausgehend vom Ort, an dem An­ regungslicht in die Spalte eingestrahlt wird.

11. Sammler nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Spalte linear angeordnet sind.

12. Sammler nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß für mit einem Fluoreszenzstoff markierte Proben eine Licht­ quelle (4) zum Beleuchten der Spalte vorhanden ist.

13. Sammler nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben in mehrere Gruppen klassifiziert sind, wobei jede Gruppe mit einem anderen Fluoreszenzstoff markiert ist, und daß die Probenflaschenhalter-Steuereinrichtung (13) die Ver­ stelleinrichtung (14) auf Grundlage der Differenz von Fluo­ reszenzintensitäten steuert, wie sie von den von der opti­ schen Erfassungseinrichtung erfaßten verschiedenen Fluores­ zenzstoffen emittiert werden.

14. Sammler nach einem der Ansprüche 3 bis 13, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Enden der Elektrophoresebahnen (1, 18) und diejenigen der Probentransportröhrchen (8) mit einem Lösungsgefäß (5) verbunden sind, in das die Pufferlösung eintritt.