DE19500638A1 - Elektrophoresegerät - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Trenn- und Analysegerät für DNA und andere biologische Substanzen, und insbesondere betrifft sie ein Elektrophoresegerät.

Im Stand der Technik wurde Gelelektrophorese zur DNA-Ana­ lyse, einschließlich einer DNA-Folgeermittlung, verwendet. In den letzten Jahren bestand zunehmende Nachfrage nach DNA- Folgeermittlung wie zur Genomanalyse. Auf dem Markt ist eine DNA-Folge-Ermittlungseinrichtung bekannt, die DNA-Fragmente auf Echtzeitbasis durch Markieren derselben durch Fluores­ zenzstoffe mißt, wobei zuvor eine Abtrennung durch Gelelek­ trophorese erfolgt. Eine solche DNA-Folge-Ermittlungsein­ richtung verwendet ein stabförmiges Gel (Polyacrylamid-Gel), das mit 30 bis 40 Wanderungsbahnen versehen ist. Die Gel­ platte wird mit vorgegebenen Intervallen ausgehend vom Elek­ trophorese-Ausgangspunkt mit einem Laserstrahl beleuchtet, und die Folge-Ermittlungseinrichtung erfaßt die Fluoreszenz der mit Fluoreszenzstoff markierten DNA-Fragmente, die durch den Bestrahlungsort laufen.

Jedoch beträgt der Durchsatz der am Markt erhältlichen DNA- Folge-Ermittlungseinrichtung nur 10 K bis 20 K Basen/Tag, was eine der Schwierigkeiten darstellt, die ein Hindernis für Genomanalyse sind. Um hohen Durchsatz zu gewährleisten, ist es wirksam, die Elektrophoresegeschwindigkeit zu erhö­ hen und soviel Wanderungsbahnen wie möglich zu schaffen, um dadurch die Anzahl von Proben zu erhöhen, die gleichzeitig gemessen werden können.

In den letzten Jahren wurde ein Kapillargel-Elektrophorese­ gerät entwickelt, das Trennung durch Elektrophorese inner­ halb kurzer Zeit ermöglicht. Ferner wurde ein Elektrophore­ segerät mit Kapillararray entwickelt, das gleichzeitige Mes­ sung durch eine Anordnung mit vielen Kapillaren erlaubt, um dadurch für hohen Durchsatz zu sorgen.

Ein Kapillararray-Elektrophoresegerät dieses Typs ist wie folgt bekannt. Ein Array von Kapillaren ist auf einer ebenen Platte gebündelt, die an einem X-Y-Tisch befestigt ist und einem Laserstrahl von oben ausgesetzt wird, um Fluoreszenz­ strahlung entsprechend der Richtung des Laserstrahls zu er­ mitteln (R. A. Mathies et al; Nature 359, 167 bis 169 (1992)). Bei diesem Gerät wird zu einem jeweiligen Zeitpunkt nur eine Kapillare einem Laserstrahl ausgesetzt, und das Kapillargel wird mechanisch mit vorgegebener Geschwindigkeit abgerastert, um Fluoreszenzsignale von allen Kapillaren zu messen.

Das ebengenannte Gerät erlaubt eine wesentliche Verbesserung des Durchsatzes, jedoch beträgt die Maximalanzahl von Wande­ rungsbahnen 20 bis 40. Dies, weil dann, wenn die Anzahl von Kapillaren anwächst, die Meßzeit pro Kapillare verringert ist, was zu unzureichender Empfindlichkeit führt. Es muß die Elektrophoresegeschwindigkeit verringert werden, da ein Er­ höhen der Abrastergeschwindigkeit der Lichteinstrahlung nicht möglich ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Elektrophore­ segerät zu schaffen, das sichere Erfassung einer Probe auch bei einem Erhöhen der Anzahl von Kapillaren ermöglicht, ohne daß dies zu Lasten der Empfindlichkeit und der Elektrophore­ segeschwindigkeit geht.

Um diese Aufgabe zu lösen, werden gemäß der Erfindung minde­ stens zwei Kapillaren in einer Lage angeordnet, und die En­ den der gelgefüllten Kapillaren werden rechtwinklig zur Wan­ derungsrichtung entlang einer geraden Linie in einer opti­ schen Zelle angeordnet; Pufferlösung wird dicht an den Enden der gelgefüllten Kapillaren vorbeigeführt, um eine Mantel­ strömung zu bilden. Ein Laserstrahl bestrahlt gleichzeitig die Orte, an denen mit Fluoreszenzfarbstoff markierte DNA- Fragmente aus den Enden der gelgefüllten Kapillaren in die Mantelströmung eluiert werden und nach unten strömen. Opti­ sche Fasern sind dicht an den Bestrahlungsorten angeordnet, um die von den genannten Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Fluoreszenzstrahlung zu sammeln und zu einem Zeilen- oder Flächensensor (zweidimensionaler Sensor) zu führen.

Allgemeiner ist die Erfindung durch die Lehre von Anspruch 1 gegeben.

Der Geltrennbereich gemäß Anspruch 1 wird durch die bereits genannten gelgefüllten Kapillaren oder durch gelgefüllte Bahnen in einer Platte gebildet. Der auf den Geltrennbereich folgende Wanderungsbereich wird vorzugsweise durch eine op­ tische Zelle gebildet, durch den Licht hindurchgeführt wird und an dem optische Fasern ansetzen.

Die Lichterfassungseinrichtung besteht, wie bereits genannt, aus einem ein- oder zweidimensionalen Sensorarray, zu dem die Enden der mit dem Wanderungsbereich verbundenen opti­ schen Fasern geführt sind.

Zwischen den Bestrahlungsorten und dem Eintrittsende der op­ tischen Fasern ist eine Lichtsammellinse angeordnet, und mindestens zwei Bandpaßfilter sind zwischen den Austritts­ enden der optischen Fasern und der Lichterfassungseinrich­ tung angeordnet. Dabei kann die Lichtsammellinse unmittelbar am Ende einer optischen Faser ausgebildet sein.

Ferner kann das Gerät eine Einrichtung zum Aufteilen des von der Lichtquelle herkommenden Lichts aufweisen, um mindestens zwei optische Fluoreszenzerfassungszellen zu beleuchten.

Bei der Erfindung kann ein Laserstrahl gleichzeitig alle Orte nahe den Enden der Trennwege beleuchten, wo mit Fluo­ reszenzfarbstoff markierte DNA eluiert wird, unabhängig von der Anzahl der Trennwege.

Abweichend vom Verfahren, bei dem ein Bild von zwei oder mehr Wanderungsorten durch eine Linse erzeugt wird, sind eine Lichtsammellinse und eine optische Faser in Kombination an jedem Wanderungsort im Lichtempfangsbereich ausgebildet, um die Fluoreszenzstrahlung von der markierten DNA zu em­ pfangen; daher ist eine effektive Erfassung der Fluoreszenz­ strahlung unabhängig von der Anzahl von Trennwegen gewähr­ leistet.

Die Erfinder haben bereits über ein Elektrophoresegerät mit Kapillararray mit den folgenden Eigenschaften berichtet: eine Pufferlösung strömt entlang Gelkapillaren, um an den Enden derselben, die in einer optischen Zelle entlang einer geraden Linie angeordnet sind, eine Mantelströmung zu erzeu­ gen, und ein Laserstrahl wird entlang dieser geraden Linie eingestrahlt, um gleichzeitig alle Wanderungsbahnen nahe den Enden im Mantelströmungsbereich zu beleuchten. Das so er­ zeugte Fluoreszenzstrahlungsbild wird durch eine CCD-Kamera oder dergleichen gemessen (H. Kambara et al; Nature 361, 565 bis 566 (1993)).

Dieses Gerät verwendet eine Linse zum Fokussieren des durch gleichzeitige Bestrahlung der Mantelströmungsbereiche nahe den Enden erhaltenen Fluoreszenzbilds auf den Detektor. Wenn die Länge des beleuchteten Bereichs groß ist, wird das Fluo­ reszenzbild zur Erfassung kleiner, da die Länge des verwen­ deten Sensorarrays nur 24 mm beträgt. Die Verkleinerung des Fluoreszenzbilds führt zu schlechter Erfassungswirkung für die Fluoreszenzstrahlung. Wenn versucht wird, die Anzahl von Kapillaren zu erhöhen, führt dies zu einer Verschlechterung der Sammelwirkung für die Fluoreszenzstrahlung und damit zu unzureichender Empfindlichkeit, was es erschwert, die Fluo­ reszenzstrahlungssignale von jeder Wanderungsbahn voneinan­ der zu trennen.

Gemäß der Erfindung wird die Erfassung der Fluoreszenzstrah­ lung jedoch dadurch ausgeführt, daß das Austrittsende jeder optischen Faser an einer Photozelle (Lichtempfangselement) eines Zeilen- oder Flächensensors angeordnet wird. Dies er­ möglicht es, Fluoreszenzstrahlung zu ermitteln, wie sie von so vielen Wanderungsbahnen emittiert wird, wie Lichtem­ pfangselemente vorhanden sind. Auf die vorstehend beschrie­ bene Weise ist es möglich, die Erfassungsempfindlichkeit bei einem Elektrophoresegerät mit Kapillararray, wie es von den Erfindern mitgeteilt wurde (Nature 361, 565 bis 566 (1993)), zu verbessern, um dadurch insgesamt verbesserte Funktion zu erzielen.

Es sind Zeilensensoren mit ungefähr 100 Photozellen (Licht­ empfangselementen) und Flächensensoren mit 100.000 und mehr Photozellen verfügbar. Die Erfindung schafft ein Elektropho­ resegerät, das eine sehr große Anzahl von Kapillaren, die in Arrays angeordnet sind, verwenden kann, was es ermöglicht, eine DNA-Folge-Ermittlungseinrichtung zu konstruieren, die besonders hohen Durchsatz zeigt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von durch Figuren veranschaulichten Ausführungsbeispielen näher beschrieben.

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau eines Elektrophoresegeräts gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung zeigt;

Fig. 2 veranschaulicht Anordnungen dafür, wie optische Fa­ sern dazu verwendet werden können, einen Fluoreszenzerfas­ sungsbereich und einen Detektor beim ersten Ausführungsbei­ spiel der Erfindung miteinander zu verbinden;

Fig. 3 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau eines Elektrophoresegeräts unter Verwendung von mindestens zwei Fluoreszenzerfassungszellen bei einem zweiten Ausführungs­ beispiel der Erfindung veranschaulicht; und

Fig. 4 ist ein schematisches Diagramm, das den Aufbau eines Elektrophoresegeräts gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel der Erfindung wiedergibt.

Erstes Ausführungsbeispiel

Im folgenden sind Fälle veranschaulicht, bei denen das er­ findungsgemäße Elektrophoresegerät auf die Feststellung einer DNA-Folge gerichtet ist.

Beim Feststellen einer DNA-Folge unter Verwendung einer Enzymreaktion werden vier DNA-Fragmentgruppen (Fragmentfami­ lien) durch komplementäre Kettensynthese unter Verwendung von DNA-Polymerase und Ziel-DNA als Matrize-DNA hergestellt.

D. h., daß komplementäre Ketten aus den Oligomeren mit einer speziellen Basenfolge, die an der Ziel-DNA ein Hybrid bilden kann, synthetisiert werden, um Fragmente mit verschiedenen Längen zu bilden, deren Endstellen Analoga zu Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) oder Guanin (G) aufweisen, was nicht mehr erweitert werden kann. Fragmente, deren Endstellen A-, T-, G- und C-Analoga sind, werden jeweils als A-Familie, T- Familie, G-Familie bzw. C-Familie bezeichnet.

Diese Familien werden mit verschiedenen Fluoreszenzstoffen markiert, um bei einem Spektroskopieverfahren unterschieden zu werden, und die DNA-Fragmentstücke werden durch Gelelek­ trophorese getrennt. Vier Familien werden vermischt und dann durch ein Kapillargel pro Probe getrennt. Ausgehend vom kür­ zesten DNA-Fragment durchlaufen die DNA-Fragmente den Be­ strahlungsort. Die Art der Basen der DNA-Fragementendstelle wird aus der Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung bekannt, wie sie von den mit dem Fluoreszenzstoff markierten DNA- Fragmenten emittiert wird. Die DNA-Folgeermittlung wird ab­ hängig von dieser Information ausgeführt.

Um in diesem Fall vier Typen von Endstellebasen zu identifi­ zieren, müssen mindestens zwei Fluoreszenzstoffe (vorzugs­ weise vier) durch Auswahl der Fluoreszenzwellenlängen erfaßt werden. Ferner kann Gelelektrophoreseanalyse eines DNA-Gels nicht nur zur DNA-Folgeermittlung, sondern auch zur Gendia­ gnose verwendet werden, wobei die Verwendung nur eines Typs von Fluoreszenzstoff ausreicht.

Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das ein Gerät mit Kapillararray veranschaulicht, das ein erfindungsgemäßes Elektrophoresegerät ist. Jedes der Reaktionsprodukte zur Folgeermittlung, wie aus verschiedenen DNA-Präparaten herge­ stellt, wird elektrophoretisch in die Oberseite einer Gel­ kapillare 1 injiziert. Das obere Ende der Gelkapillare 1 wird dazu in eine Probenflasche getaucht, die die vier Frag­ mentfamilien enthält, und zwischen eine in die Probenflasche getauchte Elektrode und das untere Ende der Kapillare wird eine Spannung von ungefähr 10 kV angelegt, um DNA-Fragmente in die Kapillare einzubringen.

Nachdem DNA-Fragmente in die Kapillare 1 eingebracht wurden, werden die oberen Enden dieser Gelkapillaren 1 gebündelt und in eine Pufferlösung in einem Puffergefäß 19 eingetaucht, das an einer oberen Position vorhanden ist. Zwischen eine Elektrophoreseelektrode 17, die in die obere Pufferlösung im Puffergefäß 19 eingetaucht ist und eine Elektrophoreseelek­ trode 17, die in die Pufferlösung in einem Puffergefäß 18 an einer unteren Position, an der die unteren Enden der offenen Kapillaren 6 liegen, wo die Pufferlösung herausfließt, wird eine Spannung von 10 bis 15 kV angelegt. Die Strömung der Pufferlösung erzeugt eine Mantelströmung um die Kapillaren herum, so daß die DNA-Fragmente mit der Mantelströmung wan­ dern.

Die Länge der gelgefüllten Kapillaren 1 beträgt normaler­ weise 20 bis 40 cm, jedoch kann sie 10 bis 15 cm sein, wenn kurze DNAs analysiert werden oder kein hohes Trennvermögen erforderlich ist. Wenn lange DNAs analysiert werden oder hohes Trennvermögen erforderlich ist, können gelgefüllte Kapillaren 1 mit einer Länge von 50 bis 100 cm verwendet werden.

Zur Fluoreszenzermittlung der Fragmente ist der untere Teil der Kapillaren 1 einem Laserstrahl 4 von einer Laserstrahl­ quelle 5 ausgesetzt. Wenn ein Kapillarröhrchen direkt dem Laserstrahl ausgesetzt wird, wird dieser an der Oberfläche des Kapillarröhrchens gestreut und abgelenkt, was dazu führt, daß nicht alle Kapillaren gleichzeitig beleuchtet werden können.

Um diese Schwierigkeit zu überwinden, sind die unteren Enden der Kapillaren 1 in einer geraden Linie angeordnet, und in eine Pufferlösung in einer optischen Zelle 2 eingetaucht, um im wesentlichen gleichzeitige Einstrahlung des Laserstrahls 4 an einer Position sicherzustellen, die nahe bei den unte­ ren Enden aller Kapillaren 1 liegt; damit ist praktisch gleichzeitige Erkennung der aus den unteren Enden der Kapil­ laren 1 eluierten DNA-Fragmente möglich. Um eine Diffusion eines DNA-Bands 3 nach dem Eluieren desselben zu vermeiden, sind offene Kapillaren 6 in der Nähe des unteren Endes jeder gelgefüllten Kapillare 1 so angeordnet, daß sie diesem unte­ ren Ende zugewandt sind, so daß Pufferlösung von einem Gefäß 7 in die optische Zelle fließt und von dort durch die offe­ nen Kapillaren so ausströmt, daß eine Mantelströmung um die gelgefüllten Kapillaren 1 herum gebildet wird.

Wie im Kreis links unten in Fig. 1 vergrößert dargestellt, strömt die Pufferlösung am Außenumfang jeder gelgefüllten Kapillare 1 in der Nähe des unteren Endes derselben entlang, um eine Mantelströmung 40 (Strömung der Pufferlösung) zu er­ zeugen, die in die offene Kapillare 6 hineinführt, die der gelgefüllten Kapillare 1 zugewandt ist. Die aus dem unteren Teil der gelgefüllten Kapillare 1 eluierten DNA-Fragmente wandern in der Mantelströmung 40. Es ist zu beachten, daß beim praktischen Gebrauch keine Schwierigkeiten entstehen, wenn keine offenen Kapillaren 6 den gelgefüllten Kapillaren 1 jeweils gegenüberstehen, solange nur gewährleistet ist, daß eine Strömung am Einstrahlungsort besteht.

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wurde ein Quarzröhr­ chen mit einem Innendurchmesser von 0,1 mm für die gelge­ füllten Kapillaren 1 verwendet. Abhängig von den speziellen Erfordernissen können Röhrchen mit Innendurchmessern im Be­ reich von 0,05 bis 0,3 mm verwendet werden. Als Gel wurde Polyacrylamid (Gesamtkonzentration 5%, mit einer Vernet­ zungsrate von 3%) verwendet, das in die Kapillarröhrchen gefüllt wurde; das Herstellverfahren ist z. B. im Artikel von Y. Baba et al. in Analytic Chem. 64, 1221-1225 (1992) beschrieben.

Es entstanden keine Schwierigkeiten, wenn die Strömungsrate der Pufferlösung für die Mantelströmung 50 ml/Sek. oder mehr pro Gefäß betrug. Die Form des DNA-Bands und die Abhängig­ keit der Fluoreszenzintensität von der Strömungsrate werden vorzugsweise abhängig von der Fluoreszenzerfassungszelle op­ timiert. Die Fluoreszenzerfassungszelle 2 ist mit dem mit Pufferlösung für die Mantelströmung gefüllten Außengefäß 7 verbunden, wobei die Höhe dieses Gefäßes eingestellt wird, um die Strömungsrate dieser Pufferlösung einzustellen. Ein Laserstrahl 4 dringt von der Seite her durch die optische Zelle 2. Die Unterseite der Fluoreszenzerfassungszelle ist mit der offenen Kapillare 6 verbunden, wo die Pufferlösung für die Mantelströmung ausströmt.

Die gelgefüllten Kapillaren 1 sind, zusammen mit einem Hal­ ter 9 für ein optisches Faserarray an der Oberseite der Fluoreszenzerfassungszelle angesetzt, und die unteren Enden der gelgefüllten Kapillaren 1 sind so positioniert, daß sie ungefähr 0,5 mm vom Lasereinstrahlungsbereich entfernt sind. Der Lichtpfad des Laserstrahls 4 sollte vorzugsweise 2 mm oder weniger vom unteren Ende der gelgefüllten Kapillaren entfernt sein, d. h., daß es sich hier um den Abstand zum Einstrahlungsort handelt. Wenn dieser Abstand übermäßig groß ist, können DNA-Fragmente sich mit solchen vermischen, die in benachbarten Bahnen wandern, oder es können ähnliche Schwierigkeiten auftreten.

Lichtsammellinsen oder optische Fasern 11 mit Lichtsammel­ linsen sind durch einen Halter 10 für ein optisches Faser­ array in einer Ebene rechtwinklig zu derjenigen Ebene ange­ ordnet, die durch die gelgefüllten Kapillaren 1 und die of­ fenen Kapillaren 6 gebildet wird. Der Abstand zwischen einer Wanderungsbahn und dem Lichteintrittsende einer optischen Faser 11 beträgt 2 bis 3 mm und der Zwischenraum zwischen benachbarten gelgefüllten Kapillaren 1 beträgt 0,35 bis 2 mm, so daß keine optische Faser 11 mit einer benachbarten Wanderungsbahn in Verbindung steht.

Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel sind vier Fasern als Satz für jede Wanderungsbahn vorhanden. Die vier Fasern sind optisch mit jeweils einem Lichtempfangselement eines opti­ schen Zeilensensors 13 oder eines Flächensensors über opti­ sche Filter 12 verbunden, die jeweils verschiedene Transmis­ sionswellenlängenbänder aufweisen. Der Einfachheit halber zeigt Fig. 1 die Verbindung zwischen einem Lichtempfangsele­ ment und einer optischen Faser 11 nur für die beiden Enden in der Einstrahlungsrichtung des Laserstrahls dem Array der gelgefüllten Kapillaren 1 entlang.

Um die Lichtempfangselemente und die optischen Fasern mit­ einander zu verbinden, wird ein CCD mit optischem Faserfen­ ster verwendet, oder die Lichtempfangselemente und die opti­ schen Fasern werden im Verhältnis 1 : 1 mit Klebstoff mitein­ ander verbunden, während die Position unter einem Mikroskop eingestellt wird. Es ist auch möglich, das obere Ende des optischen Faserarrays zunächst mittels einer Spanneinrich­ tung auszurichten, um dann mittels Kleber eine Verbindung des oberen Endes zum Zeilensensor oder Flächensensor herzu­ stellen.

Z. B. werden als Fluoreszenzstoffe zum Markieren einer je­ weiligen Familie FAM (mit einer Emissionswellenlänge von 519 nm, vertrieben von ABI (Applied Biosystem Inc.)), JEO (mit einer Emissionwellenlänge von 548 nm), TAMRA (mit einer Emissionswellenlänge von 578 nm) und ROX (mit einer Emis­ sionswellenlänge von 605 nm) verwendet, und ein Ar⁺-Laser (mit einer Wellenlänge von 488 nm) und ein YAG-Laser (mit einer Wellenlänge von 532 nm) werden als anregende Laser­ quelle 5 verwendet. Vier Bandpaßfilter mit einer Transmis­ sions-Wellenlängenbandbreite von ungefähr 20 nm und einer Mittenwellenlänge bei der Emissionswellenlänge jedes Fluo­ reszenzstoffs werden als optisches Filter 12 verwendet.

Wenn die Anzahl der Kapillaren ungefähr 100 beträgt, ist es möglich, die Fluoreszenzintensität dadurch zu messen, daß ein Zeilensensor in vier Teile unterteilt wird und jede Fluoreszenzstoffwellenlänge abgetrennt wird. Wenn viele Ka­ pillaren vorhanden sind oder das Licht von einer optischen Faser durch mehrere Lichtempfangselemente unter Verwendung großer Fasern zu erfassen ist, ist es wirkungsvoll, einen Flächensensor oder mehrere Zeilensensoren zu verwenden, die getrennt für eine optische Erfassung jedes Fluoreszenzstoffs sorgen (hierzu werden insgesamt vier Zeilensensoren verwen­ det).

Ein optischer Detektor wie ein solcher Zeilen- oder Flächen­ sensor wird von einem Treiber 14 angesteuert. Das Erfas­ sungssignal des optischen Sensors wird einer Analyse durch einen Datenprozessor 15 unterzogen, um die Art der Endstel­ lenbase zu identifizieren. Ferner werden zeitliche Änderun­ gen der Fluoreszenzintensität zur DNA-Folgeermittlung er­ faßt. Das Ausgangssignal des Datenprozessors 15 wird einer Ausgabevorrichtung 16 wie einer Kathodenstrahlröhre, einem Recorder oder einem Plotter zugeführt.

Fig. 2 zeigt ein Beispiel für ein Verfahren unter Verwendung optischer Fasern zum Verbinden des Lichtdetektors und des Lichtempfangsbereichs zum Erfassen von Fluoreszenzstrahlung von mit Fluoreszenzstoff markierten DNA-Fragmenten.

Fig. 2(a) zeigt ein Beispiel für den Fall, daß die Fluores­ zenzstrahlung von einem Emissionspunkt 31 (Überkreuzungs­ punkt zwischen einer Wanderungsbahn und der Linie des einge­ strahlten Laserlichts, wo Fluoreszenzstrahlung emittiert wird) nach der Umsetzung in paralleles Licht durch eine Lin­ se 8 in vier optischen Fasern 11 gesammelt wird, die an ih­ ren Endseiten mit optischen Filtern 32 mit verschiedenen Transmissionswellenlängenbändern versehen sind. Jedes opti­ sche Filter 32 wird dadurch hergestellt, daß ein Film durch eine dielektrische Substanz ausgebildet wird, die am Licht­ eintrittsende einer optischen Faser 11 abgeschieden wird. Um eine optische Faser wirkungsvoll mit der Photozelle eines Zeilensensors zu verbinden, wird das Austrittsende der opti­ schen Faser 11 verschmälert, um zur Photozelle zu passen, oder als Verbindungsfaser wird eine sich verjüngende Faser mit verschiedenen Querschnittsflächen an ihren beiden Enden verwendet.

Die vier miteinander verbundenen optischen Fasern 11, wie sie in Fig. 2(a) dargestellt sind, und die Lichtsammellinse 8 können als integrales Teil ausgebildet sein. Es ist auch möglich, ein Linsenarray zu verwenden, bei dem Mikrolinsen entlang einer geraden Linie mit Intervallen ausgebildet sind, die denjenigen entsprechen, mit denen die vier mitein­ ander verbundenen optischen Fasern angeordnet sind.

Fig. 2(b) veranschaulicht den Fall, daß Fluoreszenz von einem Emissionspunkt 31 durch eine Linse 8 gesammelt und durch eine einzige optische Faser 11 geleitet wird. In Fig. 2(b) ist nur ein Emissionspunkt 31 dargestellt, jedoch exi­ stieren in tatsächlichen Fällen viele Emissionspunkte, und entsprechend viele optische Fasern sind mit einer Linse 8 gekoppelt.

Bei diesem Beispiel wird dafür gesorgt, daß die von den op­ tischen Fasern übertragene Fluoreszenzstrahlung mittels einer Linse 20′ Bilder auf einem Flächensensor (zweidimen­ sionalen Sensor) 13 erzeugt. Dabei sorgt die Linse 20 dafür, daß das vom Ende der optischen Faser herkommende Licht als paralleles Licht zu einem Strahlteilerprisma 21 mit einem Filter zur Auswahl von vier Wellenlängen läuft, und eine Ab­ bildungslinse 20′ wird dazu verwendet, das Fluoreszenzbild auf den Detektor zu fokussieren.

Es wird darauf hingewiesen, daß die eine optische Faser 11 und die Lichtsammellinse 8 in Fig. 2(b) als integrales Teil ausgebildet sein können. Es ist auch möglich, ein Linsen­ array zu verwenden, bei dem Mikrolinsen entlang einer gera­ den Linie mit Intervallen angeordnet sind, die denen ent­ sprechen, mit denen die optischen Fasern angeordnet sind.

Fig. 2(c) zeigt ein System, bei dem vier optische Fasern 11, die dem Emissionspunkt 31 gegenüberstehen, direkt zu den Lichtempfangselementen des Zeilensensors geführt sind. Lin­ sen 20 und 20′ sowie Filter 22 sind in der Mitte jeder opti­ schen Faser 11 angeordnet und über eine optische Faser 23 jeweils mit einer Photozelle (Lichtempfangselement) im opti­ schen Zeilensensor verbunden.

Es wird darauf hingewiesen, daß die vorstehende Beschreibung ein Beispiel unter Verwendung von vier optischen Fasern be­ trifft, daß die Anzahl der optischen Fasern jedoch nicht hierauf beschränkt ist: sechs, acht oder Fasern mit jeder anderen Anzahl können verwendet werden, abhängig von den speziellen Erfordernissen.

Zweites Ausführungsbeispiel

Beim ersten Ausführungsbeispiel ist eine Fluoreszenzerfas­ sungszelle verwendet; jedoch besteht keine Beschränkung auf die Verwendung nur einer einzigen solchen Zelle. D. h., daß ein erfindungsgemäßes Gerät mehrere Laserquellen, mehrere optische Fasern, einen einzelnen oder mehrere optische De­ tektoren und zwei oder mehr Fluoreszenzerfassungszellen 2 aufweisen kann, wobei zwei oder mehr Arrays 1 von gelgefüll­ ten Kapillaren 1 angeschlossen sind und mehrere Mantelströ­ mungen innerhalb ausgebildet sind, in denen Probenfragmente wandern, wie in Fig. 1 dargestellt.

Fig. 3 zeigt ein Beispiel für praktisch gleichzeitige Erfas­ sung des Lichts (des Lichtsignals) von den von vielen gelge­ füllten Kapillaren eluierten Fragmenten durch Aufteilen eines Laserstrahls und/oder durch Anordnen von zwei oder mehr optischen Zellen hintereinander. Wie im Fall von Fig. 1 (in Fig. 3 nicht dargestellt) sind die oberen Enden der gel­ gefüllten Kapillaren 1 in ein oben liegendes Puffergefäß eingetaucht, und die Unterseite jeder offenen Kapillare 6, wie sie jeweils einer gelgefüllten Kapillare 1 entspricht, ist in ein unten angeordnetes Puffergefäß eingetaucht, wobei eine Elektrophoresespannung an die beiden Enden einer gelge­ füllten Kapillare angelegt ist. Ferner ist die Fluoreszenz­ erfassungszelle 2 mit dem mit Pufferlösung für die Mantel­ strömung gefüllten Gefäß 7 verbunden.

Die Anzahl der in einer Batterie gehandhabten Kapillaren 1 beträgt 96 (12 × 8 beim Beispiel), was der Anzahl von Lö­ chern in Titrierplatten entspricht, wie sie zur Einstellung von DNA-Proben verwendet werden. Jedoch ist es wirkungsvol­ ler, um die Anpassung an einen Probeneinstellroboter zu er­ zielen und um zu geschickter Funktion zu gelangen, wenn ein Mehrfaches von 24 verwendet wird, was dem Doppelten der An­ zahl von Löchern in einer Linie auf einer Titrierplatte ent­ spricht. So wurde ein Array von 96 Kapillaren verwendet, die als eine Einheit in ebener Form gebündelt wurden, und es wurde eine Fluoreszenzerfassungszelle ausgebildet, mit der ein solches Kapillararray verbunden wurde; dann wurde die Anzahl der Fluoreszenzerfassungszellen 2 nach Bedarf erhöht.

Es ist möglich, zwei oder mehr Fluoreszenzerfassungszellen 2 hintereinander anzuordnen, so daß ein Laserstrahl, der durch ein Fenster 24 einer ersten Fluoreszenzerfassungszelle aus­ getreten ist, die folgende Fluoreszenzerfassungszelle be­ leuchtet, und/oder den Laserstrahl so aufzuspalten, daß meh­ rere parallele Strahlen zwei oder mehr Fluoreszenzerfas­ sungszellen beleuchten.

Gemäß dem in Fig. 3 veranschaulichten Beispiel wird ein La­ serstrahl 4 von einer Laserstrahlquelle 27 durch Halbspiegel 25 in Laserstrahlen 4-1 und 4-2 aufgeteilt, und die Richtung des Laserstrahls 4-1, der durch den Halbspiegel gelaufen ist, wird durch einen Spiegel 26 geändert. Zwei oder mehr Fluoreszenzerfassungszellen 2 sind in den optischen Pfaden der Laserstrahlen 4-1 und 4-2 hintereinander angeordnet, um dadurch eine wesentliche Verbesserung des Durchsatzes zu er­ zielen. Die an der Fluoreszenzerfassungszelle 2 befestigten optischen Fasern 11 sind mit einem Lichtdetektor 13 wie einem Zeilen- oder Flächensensor verbunden.

Es wird darauf hingewiesen, daß der Lichtdetektor und die Lichtsammelelemente zum Erfassen der Fluoreszenzstrahlung der im Mantelströmungsbereich wandernden DNA-Fragmente mit­ einander gemäß einer der verschiedenen beim Ausführungsbei­ spiel 1 beschriebenen Möglichkeiten verbunden sind. Ferner können zwei oder mehr optische Sensoren 13 oder Laser ver­ wendet werden.

Drittes Ausführungsbeispiel

Das erste und das zweite Ausführungsbeispiel verwenden Ka­ pillaren. Es ist auch möglich, anstelle von Kapillaren Nuten zu verwenden, die in einer ebenen Tafel ausgebildet sind, um zum Herstellen von Wanderungsbahnen mit Gel gefüllt zu wer­ den.

Fig. 4 zeigt ein Beispiel zum Ausbilden von Elektrophorese­ gel zwischen zwei Glasplatten 28 unter Verwendung von Ab­ standhaltern oder in der Platte ausgebildeten Nuten, zur Verwendung derselben als Wanderungsbahnen. Die Wanderungs­ bahnen sind durch einen Abstandhalter voneinander getrennt, der aus einer Kunststoffolie (Fluorkohlenstoff-Polymer, wie Polytetrafluorethylen, und andere polymere) oder aus Glas besteht (wenn Nuten in der einen Seite der Glasplatte ausge­ bildet werden und die Glasplatte mit einer anderen Glasplat­ te kombiniert wird). Gleichzeitige Bestrahlung aller Wande­ rungsbahnen wird dadurch ausgeführt, daß DNA-Fragmente am Ende der zwischen den zwei Glasplatten eingebetteten Wande­ rungsbahnen in eine Mantelströmung eluiert werden und die strömende DNA an einer Position beleuchtet wird, die um einen vorgegebenen Abstand vom Ende der Glasplatten beab­ standet ist.

D. h., daß mit Fluoreszenzstoff markierte DNA-Fragmente in die Pufferlösungsströmung (Mantelströmung) in der Fluores­ zenzerfassungszelle 30 eluiert werden und mit einer Puffer­ lösung strömen. Der Laserstrahl 4 beleuchtet die wandernden DNA-Fragmente gleichzeitig. Ähnlich wie im Fall des Kapil­ lararrays der Ausführungsbeispiele 1 und 2 wird die Puffer­ lösungsströmung (Mantelströmung) nahe dem Ende der Gelkapil­ laren ausgebildet, um eine Dispersion der von einer Wande­ rungsbahn eluierten DNA-Fragmente zu verhindern. Die Platten 28 zum Aufnehmen des Elektrophoresegels sind vertikal ausge­ richtet, jedoch können sie auch horizontal angeordnet sein. In Fig. 4 wandern die aus dem Gel austretenden DNA-Fragmente in der Mantelströmung nach unten. Die Pufferlösung strömt aus dem Spalt zwischen den Platten 28 zum Aufnehmen des Elektrophoresegels (Glasplatten) an der Innenwand der Fluo­ reszenzerfassungszelle 30 nach unten. Es wird darauf hinge­ wiesen, daß das mit Pufferlösung für die Mantelströmung ge­ füllte Gefäß 7 nicht dargestellt ist.

In der Fluoreszenzerfassungszelle 30, die die die Mantel­ strömung erzeugende Pufferlösung enthält, ist die Unterseite mit den offenen Kapillaren 6 verbunden, durch die die Puf­ ferlösung ausströmt, wobei die Platten 28 zum Aufnehmen des Elektrophoresegels an einer festgelegten Position an der Fluoreszenzerfassungszelle 30 so befestigt sind, daß sie mit einem bestimmten Abstand den offenen Kapillaren 6 gegenüber­ stehen. Der Laserstrahl 4 beleuchtet den Spalt zwischen den Enden der Wanderungsbahnen in den Platten und den Enden der offenen Kapillaren 6. Es wird darauf hingewiesen, daß kein praktisches Problem entsteht, wenn die offenen Kapillaren 6 nicht so ausgerichtet sind, daß sie jeweils dem Ende einer Wanderungsbahn entsprechen, solange nur eine Strömung am Einstrahlungsort besteht.

Die optischen Fasern 11 sind entlang dem Einstrahlungsbe­ reich verlegt, und die aus diesem Bereich emittierte Fluo­ reszenzstrahlung wird durch eine Linse 8 gesammelt. Dann läuft die Strahlung in optische Fasern, die jeweils einer Wanderungsbahn entsprechen. Die anschließenden Abläufe sind dieselben wie bei den Ausführungsbeispielen 1 und 2.

Es wird darauf hingewiesen, daß auch beim zweiten Ausfüh­ rungsbeispiel mit den mehreren Fluoreszenzerfassungszellen Wanderungsbahnen verwendet werden können, die in Platten ausgebildet sind.

Bei den Ausführungsbeispielen 1, 2, und 3 wird Fluoreszenz­ strahlung nur von einer Seite einer Fluoreszenzerfassungs­ zelle erfaßt. Dabei kann der Lichtsammelwirkungsgrad dadurch verbessert werden, daß an der Gegenseite eine reflektierende Einrichtung wie ein Spiegel angeordnet wird.

Die Erläuterung für die Ausführungsbeispiele 1, 2 und 3 er­ folgte unter Verwendung von Beispielen, gemäß denen die Fluoreszenz von mit Fluoreszenzstoff markierter DNA erfaßt wird. Es ist aber auch möglich, ein DNA-Band unter Verwen­ dung von Chemolumineszenzstrahlung zu erkennen. In diesem Fall wird der Reaktionspartner in der Mantelströmung der Lö­ sung angeordnet, um die Chemolumineszenz zu erfassen, wie sie bei der Reaktion zwischen dem Reaktionspartner in der Mantelströmung und der speziellen Verbindung des aus dem Gel eluierten DNA-Fragments emittiert wird.

Die Erfindung ermöglicht optische Erfassung unter Verwendung nur eines oder mehrerer Zeilen- oder Flächensensoren selbst bei einem Elektrophoresesystem mit einem langen Einstrah­ lungsbereich; sie sorgt für ein optisches Meßsystem, das optimal ist, wenn viele Wanderungsbahnen vorhanden sind, um einen besonders hohen Durchsatz zu erzielen.

Ein Zeilensensor und ein Flächensensor sind kompakter und billiger als eine Anordnung vieler Photovervielfacherröhren; dieses Merkmal gewährleistet einen effektiven Weg zum Auf­ bauen eines billigeren Systems.

Ferner ist es ermöglicht, daß Kapillararrays nach Wunsch hinzugefügt werden, wodurch ein einfach verwendbares System geschaffen ist.

Claims (12)

1. Elektrophoresegerät zum Messen von Proben, mit:

• - mindestens zwei Geltrennbereichen (1; 39), deren Enden entlang einer geraden Linie angeordnet sind und die vonein­ ander getrennt sind;
• - einem Wanderungsbereich (2; 30) folgend auf jeden Gel­ trennbereich;
• - einer Lichtquelle (5; 27);
• - einer Einrichtung (2; 30), die dafür sorgt, daß das Licht von der Lichtquelle entlang der geraden Linie durchlaufen kann, die alle Wanderungsbereiche durchquert; und
• - einer optischen Detektoreinrichtung (13); gekennzeichnet durch:
• - Lichtempfangsfasern (11), deren Lichteintrittsenden so an­ geordnet sind, daß ihre optischen Achsen auf den Überkreu­ zungspunkt zwischen dem Licht von der Lichtquelle und einem jeweiligen Wanderungsbereich gerichtet sind, und deren An­ zahl mindestens der Anzahl der Wanderungsbereiche ent­ spricht;
• - wobei die optische Detektoreinrichtung mit den Lichtaus­ trittsenden der optischen Fasern verbunden ist.

2. Elektrophoresegerät nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß jeder Geltrennbereich aus einer gelgefüllten Kapillare (1) besteht.

3. Elektrophoresegerät nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß jeder Geltrennbereich aus einer Geltrennbahn besteht, die zwischen zwei benachbarten Substraten (28) aus­ gebildet ist.

4. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Fasern (11) so ausgebildet sind, daß sie von den Proben emittierte Fluoreszenzstrahlung leiten können.

5. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Detektor­ einrichtung (13) ein eindimensionaler oder zweidimensionaler optischer Sensor ist.

6. Elektrophoresegerät nach Anspruch 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Lichtaustrittsende jeder optischen Faser (11) mit mindestens einer Photozelle des ein- oder zwei­ dimensionalen optischen Sensors (13) verbunden ist.

7. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Fluores­ zenzemissionspunkt und dem Lichteintrittsende der optischen Faser (11) eine Lichtsammellinse (8) ausgebildet ist.

8. Elektrophoresegerät nach Anspruch 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Lichtsammellinse (8) unmittelbar am Licht­ eintrittsende der optischen Faser (11) ausgebildet ist.

9. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Band­ paßfilter (22) zwischen dem Lichtaustrittsende der optischen Faser (11) und der optischen Detektoreinrichtung (13) ange­ ordnet sind.

10. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die in einer geraden Linie angeordneten Wanderungsbereiche in einer optischen Zelle (2; 30) angeordnet sind.

11. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß am Lichteintrittsende der optischen Faser (11) ein Lichtsammelfilter ausgebildet ist.

12. Elektrophoresegerät nach einem der vorstehenden An­ sprüche, gekennzeichnet durch eine Einrichtung (25, 26) zum Aufteilen des von der Lichtquelle (27) herkommenden Lichts (4), um mindestens zwei optische Zellen (2; 30) zu beleuch­ ten.