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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf die Verwendung von mehrfachen Gradienten (von chemischen
Denaturanten, von thermische Denaturanten und von der Porosität der elektrophoretischen Matrix)
für die
Abtrennung von PCR verstärkten
DNA Fragmenten, die beide normal sind oder Punktmutuationen enthalten,
durch eine Gelslab-Zonenelektrophorese oder durch eine Kapillarelektrophorese
in Gegenwart von Viskosenpolymerlösungen (entweder linear oder
verzweigt). Des Verfahren ist auch anwendbar auf die Analyse von
Mutationen in Proteinen und auf die Optimierung bsp. von Chiralabtrennungen
in Kapillarien. In die vorliegende Erfindung eingeschlossen ist
die Verwendung von binären
Gradienten (bsp. chemischen und Porositätsgradienten) oder die gleichzeitige
Verwendung der drei Gradienten (chemisch, thermisch und von der
Porosität)
im Falle von Punktmutationen, die einen hohen Schmelzpunkt haben.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung
von gleichen Gruppen bzw. Batterien von Kapillarien im Falle der
Kapillarelektrophorese für
die gleichzeitige Analyse von mehrfache Proben. Sie schließt auch
ein die Erfassung von solchen DNA Fragmenten (oder von Proteinen und
anderen geeigneten Analyten) durch eine laserinduzierte Fluoreszenz.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung von gemischten
polymeren Lösungen
(bsp. Polyacrylamiden und Zellulosen von unterschiedlicher Kettenlänge) im
Falle der Kapillarelektrophorese und mit Polyacrylamiden, die aus
Monomeren bestehen, die gegenüber
der Hydrolyse widerstandsfähig
sind (typischerweise N-substituiert, wie bsp. N,N'-Dimethylacrylamid, N-Acryloylaminopropanol).
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Die Entdeckung von Unterschieden
mit einer einzigen Basis (Punktmutationen) in speziellen Bereichen
der menschlichen genomischen DNA ist von fundamentaler Wichtigkeit
bei der Analyse von Mutationen, die mit menschlichen Krankheiten
verbunden sind. Bei der Analyse von übernommenen genetischen Krankheiten
und für
eine Massenklassierung von Genen ist es erforderlich, in einer elektrophoretischen
Trennung einfache oder mehrfache Punktmutationen der DNA zu entdecken.
Das am meisten populäre
Verfahren ist bis heute dasjenige von Fischer und Lerman (Proc.
Natl. Acad. Sci USA 80, 1983, 1579–1583), das in einer elektrophoretischen
Trennung in einem Gelslap in Gegenwart eines Gradienten eines chemischen
Denaturanten besteht (gewöhnlich
Harnstoff und/oder Formamid) (denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese,
DGGE). Dieses Verfahren ist auf der Tatsache begründet, dass die
Mobilität
eines teilweise geschmolzenen DNA Moleküls merklich reduziert ist im
Vergleich zu derjenigen des gleichen DNA, welches als eine intakte Doppelhelix
existiert. Die Sequenzen, die abgetrennt werden können, bestehen
typisch aus zwei Domänen,
die einen niedrigen und einen hohen Schmelzpunkt haben. Dies macht
es innerhalb eines engen Intervalls der Konzentration des Denaturanten
möglich,
Verschmelzungs-Zwischenprodukte zu erhalten, die sowohl teilweise
lose bzw. abgewickelte wie auch intakte Doppelhelixe enthalten.
Wenn ein Gemisch von solchen Molekülen, welche die gleiche Länge bei der
Gesamtanzahl von Basen haben, welche sich aber durch eine einzige
Punktmutation voneinander unterscheiden, in einem Gel in der Gegenwart
eines Gradienten eines Denaturanten wandern, dann ergeben sich unterschiedliche
Gleichgewichte zwischen den natürlichen
und den teilweise geschmolzenen Molekülen, sodass solche Moleküle während des elektrophoretischen
Ablaufs abtrennbar sein werden. Generell wird das teilweise geschmolzene
Molekül
im Vergleich zu dem natürlichen
Molekül
langsamer wandern, da der Radius der Achsendrehung des ersteren
größer ist
als derjenige des letzteren, sodass der Reibungswi derstand gegenüber der
Wanderung bzw. Migration für
die teilweise geschmolzene Spezies größer sein wird. Bei einer typischen
Anwendung besteht das DGGE Verfahren in der Mischung von normalen
und mutierten DNA Ketten und in der Bildung einer gemischten Population
von „Homo" und „Hetero-" Doppelhelixen durch
eine Erwärmung
der Probe oberhalb des Schmelzpunktes (und von allen Ketten), gefolgt
von einem allmählichen
Abkühlen. Die
Hetero-Duplexe haben gewöhnlich
niedrigere Schmelzpunkte als die Homo-Duplexe, da bei den ersteren
falsche Anpassungen von einigen Grundlagen in dem Bereich der Mutation
auftreten. Wenn solche Gemische von Homo- und Hetero-Duplexen in einem
Gradienten eines Denaturanten zum Wandern gebracht werden, können sie
folglich zu unterschiedlichen Spitzen abgetrennt werden als Folge
ihrer unterschiedlichen Schmelzpunkte. Wenn die normalen (Wildtypen,
Wt) und die mutierten (M) Ketten geschmolzen und wiederholt abgekühlt werden,
dann sollte aus statistischen Gründen
die Bildung von vier Arten von Doppelhelixen erwartet werden: zwei
Homo-Duplexe (Wt/Wt und M/M) und zwei Hetero-Duplexe (Wt/M und M/Wt).
Es ist präzise
die Trennung und Erfassung dieses Spektrums von vier Bändern, die
entlang des Wander- bzw. Migrationsweges in einem denaturierenden
Gradienten die Diagnose auf die Anwesenheit einer Punktmutation
in einem Exon rückschließen lässt, das
von einem unter einer Analyse stehenden Patienten verstärkt wurde.
Eine fundamentale Variante des Verfahrens von Fischer und Lerman,
bei welchem nur chemische Denuranten benutzt werden (bsp. Harnstoff,
Formamid) ist das Verfahren der thermischen Denaturanten, welches
in dem Fall der Nukleinsäuren
aber ebenso wirksam ist. Bei diesem letzteren Verfahren (dem sogenannten TGGE,
thermische Gradienten-Gel-Elektrophorese, Riesner, Henco und Steger,
Advan. Electr. 4, 1991, 171–250)
wird ein Temperaturgradient (bsp. von 30 bis 90°C) an das Ende eines Gelslabs
angelegt, entweder senkrecht oder parallel zu der Richtung der Wanderung.
Bei einer Variante dieses Verfahrens wird ein solcher Temperaturgradient
innerhalb einer Kapillare geschaffen, nicht in dem Raum der Kapillare,
sondern in der Zeit (temperaturprogrammierte Kapillarelektrophorese,
Gelfi, Righetti, Cremonesi und Ferrari, Electrophoresis 15, 1994,
1506–1511).
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Die beiden häufigsten analytischen Verfahren
für eine
Klassierung von Punktmutationen sind heute DGGE und TGGE. Die beiden
Verfahren weisen jedoch einige Nachteile auf, die oft eine präzise Diagnose
behindern. Da die verschiedenen DNA, die von verschiedenen Exons
verstärkt
werden, verschiedene Strukturen und weit unterschiedliche Schmelzpunkte
(Tm) haben, welche ein breites Intervall von Denaturant-Konzentrationen überdecken können, ist
es vor allem sehr schwierig, experimentelle Bedingungen zu finden
(Dauer der Elektrophorese und Neigung des Denaturant-Gradienten)
die auf jeden beliebigen Mutationstyp angepasst werden können. Für unterschiedliche
Mutationstypen müssen
daher die passenden Elektrophorese-Bedingungen aufgefunden werden,
was gegen Routineanwendungen des Verfahrens spricht. Da die für ein Trennen
der beiden Homo-Duplexe
benötigte
Elektrophoresezeit oft wesentlich länger ist als diejenige der
beiden Hetero-Duplexe, erzeugen die letzteren zusätzlich häufig derart
diffundierte Bänder
entlang der elektrophoretischen Spur, dass sie einer Erfassung durch
die gemeinsam, fluoreszierenden, eingefügten Farbstoffe (bsp. Ethidiumbromid)
entgehen. Wenn das charakteristische Spektrum der vier Bänder nicht erfasst
werden kann, dann verliert die Analyse ihren diagnostischen Wert.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung
besteht in der Verwendung eines DGGE (oder eines TGGE) Gradienten
in der Kombination mit einem kolinearen Porositätsgradienten in der Siebungsmatrix (generell,
jedoch nicht ausschließlich
Polyacrylamid) zum Abtrennen von DNA Fragmenten, normalen oder tragenden
Punktmutationen, bei elektrokinetischen Methodologien. Während der
erste Gradient für
ein Denaturieren in einer zeitlichen Sequenz der beiden Homo- und
Hetero-Duplexe benutzt
wird, um so das charakteristische Spektrum der vier Bänder zu erzeugen,
wird der zweite Gradient (der Porosität) für ein wiederholtes Verdichten
der diffundierten Bänder (der
beiden Homo- und Hetero-Duplexe) benötigt, um so die theoretische
Plattenhöhe
jeder Zone zu reduzieren und um so sehr enge Bänder zu erzeugen, die mit speziellen
Färbungsmitteln
und durch die Densitometrie gut sichtbar werden. Da der zweite Gradient
(der Porosität)
die Wanderung bzw. Migration der verschiedenen DNA's (die sich asymptotisch zu
der „Porengrenze" hin verlangsamen,
wo die Wanderung bzw. Migration allmählich aufhören wird) drastisch verringert,
erlaubt das bei der vorliegenden Erfindung angewandte Verfahren
zusätzlich
eine Übernahme
von Standard-Migrationszeiten für
jeden beliebigen Typ eines DNA Mutanten, wodurch eine Routineanwendung
der beiden DGGE und TGGE ermöglicht
wird. Die vorliegende Erfindung ermöglicht zusätzlich auch die Anwendung von
solchen binären Gradienten
der Porosität
und der chemischen (und/ oder thermischen) Denaturanten bei der
Kapillarelektrophorese. Die Verwendung von viskosen Polymerlösungen (entweder
linear oder verzweigt), die eine Siebung von solchen Nukleinsäuren auf
der Basis des Radius der Achsendrehung von natürlichen oder teilweise freien
Molekülen
ergeben, ist ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung, sowie
auch die Möglichkeit
der Verwendung von gleichen Gruppen bzw. Batterien von Kapillarien
für mehrfache
gleichzeitige Analysen und schließlich auch die Möglichkeit
des Auffindens von solchen Nukleinsäurebereichen durch eine laserinduzierte
Fluoreszenz. Auch die gleichzeitige Verwendung von mehr als einem
Gradienten von Denaturanten, bsp. eine Kombination von chemischen
(Harnstoff und/ oder Formamid) und thermischen Denaturanten, gekoppelt
mit der Verwendung von Porosität-Gradienten,
ist ebenfalls ein Teil der vorliegenden Erfindung. Eine solche kombinierte
Verwendung von Denaturanten erlaubt die Anwendung von Temperaturen
(entweder in einem Gelslabformat oder in einer Kapillare) weit unterhalb der
Siedetemperatur des Lösungsmittels
(typischerweise, jedoch nicht ausschließlich ein wässriges Lösungsmittel).
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Die Vorteile von denaturierenden
Gradienten, kombiniert mit Porosität-Gradienten, gemäss der vorliegenden
Erfindung über
die bis jetzt benutzten Standardgradienten (also bei Abwesenheit
von Porosität-Gradienten)
sind nachfolgend angegeben.
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Abtrennung von DNA Punktmutanten
in Polyacrylamid-Gelslabs.
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1 zeigt
die Abtrennung von DNA Fragmenten (zystische Fibrosisgene, CFTR,
Exon 11), vermehrt von einer normalen Einzelperson (Wt) und einem
Patienten, der eine Punktmutation (R553X, 1789 C->T) in Anwesenheit entweder
eines einzigen (oberes Schaubild) oder eines doppelten (unteres Schaubild)
Gradienten trägt.
Bei dem oberen Schaubild wird die Abtrennung in einem Gel konstanter Konzentration
(6.5% T, wobei T = gesamte Monomer Konzentration) und in Anwesenheit
eines denaturierenden Gradienten von 10 bis 60% (Harnstoff oder Formamid)
durchgeführt
wird. Bei dem unteren Schaubild wird die Abtrennung fortgesetzt
mit dem gleichen denaturierenden Gradienten (10 bis 60%), der jedoch
gekoppelt ist mit einem zweiten Gradienten, kolinear mit dem ersten,
einer Matrix-Porosität. Dieser
Porosität-Gradient
wird durch eine Veränderung
des gesamten Monomergehalts in der Matrix (%T) in dem Intervall
6.5 bis 12% T erhalten. Die beiden Gradienten sind entlang der Migrationsachse ausgerichtet,
sodass der niedrige Anteil des Gradienten (der einen niedrigen Gehalt
an chemischem Denaturant und einen niedrigen prozentualen Anteil
an Monomeren aufweist) an dem Ablagerungsort der Probe (an der Kathodenseite)
angeordnet ist, während
der hohe Anteil des Gradienten an der anodischen Gelseite angeordnet
ist. In beiden Fällen
(einfache und doppelte Gradienten) sind die Gelslabs mit dem gleichen
Ablaufpuffer imprägniert
(40 mM Tris, 20 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 7.6; TEA Puffer). Die beiden
Gelslabs haben die folgenden Abmessungen: 0.75 mm Dicke, 15 cm Breite
und 15 cm Länge.
In dem Fall des einzigen Gradienten hatte der elektrophoretische
Ablauf eine Dauer von 5 Stunden bei 160 V; in dem Fall des doppelten
Gradienten wurde die Elektrophorese für 15 Stunden bei 75 V fortgesetzt. An
dem Ende des Ablaufs werden die beiden Gels mit Ethidiumbromid eingefärbt und
unter UV Licht fotografiert. Die beiden Schaubilder stellen densitometrische
Abtastungen der beiden Gels dar. Wie in dem oberen Schaubild gezeigt
ist, kann das densitometrische Profil nicht die beiden Hetero-Duplexe
offenbaren (die selbst durch eine visuelle Gelinspektion nach dem
Einfärben
nicht unterschieden werden können), und
es kann auch kaum eine Dublette erfassen, welche die zwei Homo-Duplexe
(Wt/Wt und MM) repräsentieren,
die an den Spitzen schwach aufgelöst sind. In diesem Fall konnte
eine präzise
Diagnose nicht gegeben werden. In dem Fall des einen Doppelgradienten
enthaltenden Gels (unteres Schaubild) ist dagegen das Spektrum vom
vier Spitzen, welche die Anwesenheit einer Punktmutation kennzeichnen,
klar sichtbar (Wt/M, M/Wt und M/M, Wt/Wt), sodass damit eine eindeutige
Diagnose möglich
ist. Es sollte zusätzlich
angemerkt werden, dass während
in dem zweiten Fall die Basislinie für die Aufzeichnung niedrig
und konstant ist, die Basislinie in dem Fall des einfachen Gradientengels
wellig und äußerst unregelmäßig ist,
wodurch die merkmalsmäßige Erfassung einer
Spitze behindert wird.
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Die 2 zeigt
die Analyse eines anderen Punktmutanten in dem CFTR Gen (Exon 20,
bekannt als S125N, 3384 G->A)
gemäss
einer Analyse genau wie bei dem vorhergehenden Beispiel in der Anwesenheit
eines einfachen (oberes Schaubild) oder eine doppelten (unteres
Schaubild) Gradienten mit dem Unterschied, dass die Gels wegen eines
höheren
Tm der Mutation einen steileren Denaturierungsgradienten von 20
bis 70% enthalten. In diesem Fall löst das einfache Gradientengel
die beiden Homo-Duplexe (M/M und Wt/Wt) gut, es ergibt jedoch keinen
klaren Rückschluss
auf die Anwesenheit der beiden Hetero-Duplexe, die versuchsweise
den beiden mit Wt/M und M/Wt markierten „Klecksen" zugeordnet werden. Die markierte Wellenlinie
der Basislinie erlaubt auch hier keine klare Iden tifizierung von
kleineren Spitzen. Im Gegensatz dazu löst das den doppelten Gradienten
enthaltende Gel als Folge seiner inhärenten Fähigkeit zu einer wiederholten
Verdichtung von diffundierten Bändern
das gesamte Spektrum der vier Bänder
(unteres Schaubild) für
eine klare Identifikation, um eine präzise Diagnose zu ermöglichen.
Auch in diesem Fall ist die Basislinie flach und konstant.
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3 zeigt
die Analyse von einem weiteren Punktmutanten in dem CFTR Gen (Exon
1, bekannt als 125G/C), analysiert genau wie in dem Beispiel der 1 in Anwesenheit eines einfachen
(oberes Schaubild) oder eines doppelten (unteres Schaubild) Gradienten
mit dem Unterschied, dass in beiden Fällen der verwendete denaturierende
Gradient einen Konzentrationsbereich von 40 bis 90% übergreift,
da die Mutation einen noch höheren
Tm aufweist. In diesem Fall zeigt die Kontrolle (oberes Schaubild)
eine gute Lösung
der beiden Hetero-Duplexe (Wt/T und M/ Wt) mit einer einzigen Spitze
in der Zone der beiden Homo-Duplexe, die wahrscheinlich eher ähnliche
Tm's haben. Im Gegensatz
dazu zeigt das einen Doppelgradienten enthaltende Gel eine ausgezeichnete
Abtrennung der beiden Hetero-Duplexe
und auch eine gute Abtrennung der beiden Homo-Duplexe, jedoch nicht
an der Basislinie.
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Abtrennung von DNA Punktmutanten
bei der Kapillarelektrophorese.
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Das vorstehende Verfahren wurde auch
auf die Kapillarelektrophorese (CZE) mit merklich verbesserten Ergebnissen
im Vergleich zu der Annäherung
mit einem einzigen Gradienten angepasst. Bis jetzt war es nicht
möglich,
Gradienten von Chemikalien als Folge des sehr kleinen Volumens der
zu mischenden Flüssigkeiten
(in der Größenordnung
von wenigen Mikrolitern) zu schaffen. Mit den Techniken der Mikromanipulation
wurde es möglich,
solche Kapillarien mit Gradienten der chemischen Denaturanten und
der Porosität
zu füllen. 4 zeigt die Ergeb nisse einer
solchen Analyse. Die geschmolzene Silica-Kapillare wurde zuerst
chemisch behandelt, um so den elektroendoosmotischen Fluss aufzuheben durch
eine Verankerung eines Polymeren von Poly(N-acryloylaminoethoxyethanol),
an der Innenwand, welches eine hohe Hydrophillie und einen hohen
Widerstand gegenüber
einer alkalischen Hydrolyse besitzt. Zur Kontrolle wird die Kapillare
mit einer Pufferlösung
(TBE: 8.9 mM Tris, 8.9 mM Borat, 1 mM EDTA, 6 M Harnstoff, 10 mM
NaCl, ph 8.3) in Anwesenheit einer konstanten Konzentration von
Acrylamidmonomeren (bsp. 6% T) gefüllt, die dann in situ polymerisiert
werden. Acrylamid kann auch in Abwesenheit eines Vernetzungsmittels
polymerisiert werden, sodass so eine viskose Polymerlösung gebildet wird,
die auch eine gute Siebung an den DNA Analyten ausübt. In dem
Fall des Doppelgradienten wird die Kapillare (durch eine wiederholte,
aufeinanderfolgende Einspritzung einer Reihe von Lösungen mit abgestuften
Konzentrationsplateaus, wie nachfolgend angegeben) mit der gleichen
Pufferlösung
gefüllt,
die jedoch einen Gradienten der Konzentration des Monomeren enthält (bsp.
6 bis 8% oder 6 bis 10%). Bezüglich
der 4 ist der zweite
Gradient (des Denaturanten) in beiden Fällen ein thermischer Gradient,
der das Temperaturintervall von 56 bis 58°C überdeckt werden, mit welchem
die Tm Werte der verschiedenen Homo- und Hetero-Duplexe (Exon 11
des CFTR Gens, Mutation bekannt als 17171G->A) überdeckt.
Wenn ein thermischer Gradient als Denaturant bei der CZE verwendet
wird, dann ist dem Puffer auch 10 mM NaCl hinzugefügt, wodurch
die Denaturierung von DNA begünstigt
und die Schaffung eines thermischen Gradienten durch einen Joule-Effekt
unterstützt
wird (der temporale thermische Gradient wird während des Ablaufs durch Spannungsrampen
aktiviert, wie beschrieben von Gelfi et al., Electrophoresis 15,
1994, 1506-1511). Eine
DNA Banderfassung wird in situ ausgeführt, entlang des Kapillarweges, über eine
inhärente
UV Absorption von DNA bei 260 nm. In 4 zeigt
das Schaubild D einen Kontrollablauf in Abwesenheit der thermischen
und Porosität-Gradienten. Bei Abwesenheit
eines denaturierenden Gradienten ist keine teilweise Freilegung
der Doppelhelixe vorhanden, und die einzige herausgelöste Spitze
(bei 80 min) stellt eine Umhüllung
der vier Bänder
der Homo- und Hetero-Duplexe dar. Das Schaubild A zeigt eine Analyse
in Gegenwart eines einzigen Gradienten (thermischer Denaturant,
von 56 bis 58°C).
Die beiden Homo-Duplexe sind gut abgetrennt, jedoch ergeben auch
hier die beiden Hetero-Duplexe sehr diffundierte Bereiche, die versuchsweise
als Wt/M und M/Wt ausgezeichnet wurden. Bei dem Schaubild B war
die gleiche Analyse wiederholt worden, jedoch in Gegenwart auch
eines Porosität-Gradienten
von 6 bis 8% T. Die beiden Hetero-Duplexe sind jetzt gut sichtbar
und können
leicht identifiziert werden. In dem Schaubild C ist schließlich die
gleiche Analyse wiederholt worden in Anwesenheit eines steileren
Porosität-Gradienten
(von 6 bis 10% T). Es ist anzuerkennen, dass jetzt auch die beiden
Homo-Duplexe von der Basislinie gelöst sind.
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Schaffung von chemischen
und/oder Porosität-Gradienten
in einer Kapillare.
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Solche Gradienten könnten mit
der Unterstützung
von mikromanipulierenden Vorrichtungen geschaffen werden, die computerbetriebene
Mikrospritzen und eine Mikro-Mischkammer umfassen. Eine noch einfachere
Annäherung
wird hier beschrieben. Eine Reihe von Lösungen, die abgestufte Konzentrationen
des gewünschten
Porosität-Gradienten (oder
eines chemischen Denaturant-Gradienten oder beide) enthält, werden
vorbereitet. Diese Lösungen werden
aufeinanderfolgend in dem Probenkarussel einer Kapillarelektrophoreseeinheit
angeordnet (bsp. Beckmann P/ACE 5100, Bio Rad Bio Focus 2000 usw.)
und werden aufeinanderfolgend in die Kapillare eingespritzt (ein
typischer Einspritzdruck beträgt
0.5 psi, d.h. 3448.4 Pa). Wenn die Lösungen, die wechselnde Konzentrationen
an Chemikalien enthalten, in einem stufenweisen Ablauf eingespritzt
werden, dann wird zu erwarten sein, dass das Konzentrationsprofil
in der Kapillare ebenfalls stufenweise ausfällt. Parabolische Fließprofile,
die sich während
der Einspritzung unter Druck in der Kapillare ergeben, wirken jedoch
als zusätzliche
Dispersionsfaktoren, welche Unregelmäßigkeiten der Konzentration
reduzieren, insbesondere in den Bereichen der großen Gradienten.
Diese Bereiche sind diejenigen zwischen benachbarten Stufen, in
welchen ein Konzentrationsplateau eine Nachfolge von dem anderen
erfährt.
Dieses Verfahren ist sehr bekannt und basiert auf der Theorie der
Dispersion in Kapillarien, wie entwickelt von Taylor (Proc. R. Soc.
London, Ser. A, 219, 1953, 186–200).
Die Frage verbleibt, wie viele Stufenkonzentrationen eingespritzt
werden sollten, um einen vernünftig
glatten Gradienten zu erhalten. Dies wurde bei Kapillarien untersucht,
die eine Gesamtlänge
von 37 cm (30 cm zu dem Detektor) haben und einen Innendurchmesser
von 100 aem. Die Endergebnisse sind in 5 gezeigt, welche das Konzentrationsprofil
darstellt, das durch ein aufeinanderfolgendes Einspritzen von 11
Lösungen
erhalten wurde, die ein Acrylamid-Konzentrationsintervall von 3
bis 8% (bei Zunahmen von 0.5%) überdecken
und über 33
cm der Kapillarlänge
verlaufen (sodass so die nützliche
Abtrennungsachse gerade vorbei an dem Detektorfenster überdeckt
wird). Es ist ersichtlich, dass mit Ausnahme eines etwas welligen
Musters nahe an dem Einspritzpunkt der Konzentrationsgradient bemerkenswert
glatt ist, insbesondere in dem Bereich hin zu dem Erfassungspunkt,
also dem wichtigsten Teil der Abtrennungskapillare. Es hat so den Anschein,
dass nach einer goldenen Regel jedes Konzentrationsplateau beim
Einspritzen eine gesamte Kapillarlänge von etwa 3 cm einnehmen
sollte, um einen vernünftig
glatten Gradienten zu erhalten.
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Unter einigen unterschiedlichen Aspekten bezieht
sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von gekoppelten
(oder mehrfachen) Gradienten in Gelslabs oder Kapillarien für alle elektrokinetischen
Abtrennungen, welche nicht-isokratische
Bedingungen erfordern.
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Die Lehre der vorliegenden Erfindung
ist auch auf die Verwendung von Porosität-Gradienten anwendbar, die mit einem
Gradienten eines Denaturanten (entweder chemisch oder thermisch)
gekoppelt sind oder die mit dreifachen Gradienten kombiniert sind
für eine
Analyse von Mutationen in Proteinen, von einer Dissoziation in Untereinheiten,
von angleichenden bzw. anpassungsfähigen Umwandlungen oder Übergängen, sowohl
in dem Gel-Slabformat wie auch bei den Kapillarien, und auf die
Verwendung jedes beliebigen vorstehenden Gradienten (thermisch,
chemisch oder Porosität,
entweder allein oder kombiniert) für eine Optimierung von chiralen Abtrennungen
in der Kapillarelektrophorese.