DE8805582U1 - Elektrophoresevorrichtung - Google Patents

Description

Elektrophoreseverrichtung

Die Erfindung betrifft ein Elektrophoresephoresevorrichtung auf der Basis einer Elektrophoresekassette mit einem Detektor zur Durchführung der automatischen Sequenzierung biologischer Makromoleküle, wie etwa DNA (DNS) und RNA (RNS),durch Gelelektrophorese.

Proteine und andere große biologische Moleküle einschließlich DNA können zur Analyse mit Elektrophoreseverfahren getrennt werden. Eine besonders wichtige Anwendung dieser Verfahren stellt die Sequenzierung von DNA- und RNA-MoIekülen dar. Zur elektropho.etischen Trennung derartiger Moleküle wird die sog. Gelelektrophorese herangezogen, bei der ein Gel zwischen zwei nichtleitenden Platten, beispielsweise Glasplatten, in Form einer dünnen Gelschicht zwischen den Glasflächen vorgesehen wird. Das Gel sollte dabei möglichst gleichmäßige Dicke und möglichst gleichmäßige andere Eigenschaften aufweisen. Die Oberflächen an beiden Enden der Gelschicht sind jeweils mit einem Pufferreservoir verbunden, das als Elektrode dier.t. Zur Durchführung der Gelelektrophcese wird durch Verbindung der beiden Reservoirs mit den beiden Polen einer Spannungsquelle ein Potential an das Gel angelegt.

0241-40.971G-SF/IS

Die zu separierenden Moleküle werden an dem Ende des Gels, an dem sich die negat ive Elektrode befindet, aufgegeben, was üblicherweise in vorgebildeten Vertiefungen erfolgt. Die Moleküle sind .negativ geladen; aufgrund ihrer Ladung bewegen sich die Moleküle im elektrischen Feld durch das Gel zur positiven Elektrode, da eine entsprechende Kraft im elektrischen Feld auf die Moleküle ausgeübt wird. Kleinere Moleküle wandern leichter durch das Gel als große Moleküle, was zu einer Trennung und Sortierung der Moleküle nach ihrer Größe bei ih·er Wanderung durch das Gel führt. Im einzelnen hängt die Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle von Form und Größe der Teilchen, ihrer Ladung dem pH-Wert, der Temperatur, der Viskosität und der Feldstärke ab.

Die Synthese von enzymatisch erhaltenen Bruchstücken von DNA- oder RNA-Molekülen erlaubt eine Analyse der Gesamtmoleküle aufgrund der Basensequenz, die dem Molekül zugrundeliegt. Die Techniken zur Durchführung solcher Analysen sind dem Fachmann geläufig (vgl. z. B. F. Sanger, S. Nicklen und A. R. Coulsen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463-5467; P.L. Deininger, Analytical Biochemistry 135 (1983) 247-263; H. Garoff und W. Ansorge, Anal. Biochem. 1 1 5 (1981) 450-457, sowie M.D. Biggin, T.J. Gibson und A.F. Hong, Proc. Natl. Acad. Sei. USA ^O (1983) 3963-3965).

Ein derzeit angewandtes Verfahren zur Sichtbarmachung der eiektrophoretischen Trennung von Makromolekülen in einem Gel besteht in der radioaktiven Markierung der Moleküle. Typischerweise wird hierbei das zur Elektrophorese herangezogene Gel aus der Kassette entnommen und längs einem
photographischem Medium angeordnet, das durch die emittierte radioaktive Strahlung der radioaktiv markierten

Moleküle exponiert wird. Nach dem Entwickeln der photographischen Emulsion liegt eine Reihe von Streifen vor, die für die Fcsition jeder Gruppe von Makromolekülen repräsentativ sind; bei der Sequenzierung können ihre relativen Positionen durch die auswertende Person dazu verwendet werden, um hieraus direkt die basenbezogene Lokalisierungssequenz abzuleiten. Diese Art von Analyse erfordert einen hohen Ausbildungsgrad, ist zeitaufwendig und mühsam und im übrigen sehr anfällig für Transkriptionsfehler.

Im Hinblick darauf wurden automatische Detektionsverfahren entwickelt, bei denen auf die radioaktive Strahlung ansprechende Detektoren zur automatischen Durchführung der DNA-Sequenzierung herangezogen werden. Aufgrund von Abweichungen der Elektrophoresegelkassette vom idealen Betriebsverhalten arbeiten jedoch bisherige automatische Systeme nicht zufriedenstellend.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Elektrophoresevorrichtung anzugeben, die sich insbesondere zur elektrophoretiscnen Trennung von biologischen Makromolekülen eignet und das eine relativ einfache Detektoreinrichtung aufweist, mit der die Positionsbestimmung in zuverlässiger und genauer Weise durchgeführt werden kann. Die Elektrophoresevorrichtung soll ferner eine Gelkassette aufweisen, die im Gegensatz zum Stand der Technik leicht zusammensetzbar ist und die Durchführung und Auswertung der Elektrophorese ohne besondere Erfahrung und ohne großen Zeitaufwand erlaubt; die Elektrophoresekassette
soll dabei auch von relativ unerfahrenen Bedienungspersonen zusammengebaut und befüllt werden können, ohne daß hierdurch die Zuverlässigkeit und Genauigkeit beeinträchtigt werden. Sie soll ferner ein gleichmäßigeres

e¹ektrisches Feld ergeben.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.

Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindungskonzeption.

Das erfindungsgemaße fciektrophoresevorrichtung umfaßt eine

j Elektrophoresezelle in Form einer völlig neuartig konzi-

pierten Elektrophoresekassette sowie eine Detektcreinrichtung, die eine automatische Durchführung der Analyse

■ radioaktiv markierter Moleküle erlaubt. Die erfindungsge-

mäße Elektrophoresesystem eignet sich besonders günstig

zur Analyse von DNA- und RNA-Molekülen, ist jedoch auch • günstig zur elektrophoretischen Trennung und Analyse

anderer Substanzen geeignet. Bei der erfindungsgemäßen f Elektrophoresekassette wird das elektrische Feld erheblich

gleichmäßiger gehalten, als dies bei herkömmlichen Elektrophoresezellen der Fall ist. Bei der erfindungsgemäßen

Elektrophoresekassette lassen sich die Platten, zwischen denen das Gel vorgesehen ist, auf eine völlig neuartige Weise trennen. Die Erfindungskonzeption umfaßt ferner eine neuartige Anordnung der Vertiefungen am oberen Ende des Gels sowie eine neuartige Plattenklammer. Die Erfindungskonzeption führt zu einer wesentlich höheren Genauigkeit der Elektrophoresekassette sowie einer Verringerung von Variationen im elektrischen Feld am unteren Ende und an den Seiten der Zelle auf ein Niveau, bei dem keine Feld
störung mehr vorliegt. Darüber hinaus umfaßt die Erfindung ein neuartiges Kassettenfüllsystem, das ein rascheres Füllen der Elektrophoresekassette mit Gelmaterial erlaubt, als dies beim Stand der Technik der Fall ist, wobei zugleich eine gleichmäßigere Gelschicht erzielbar ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen unter Bezug auf die Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 bis 3: Eine erfindungsgemäße Elektrophoresekassette;

Fig. 4A-4C Veränderungen des elektrischen Felds bei der erfindungsg?mäßen Elektrophoresekc^sette, die von einem Leck an der Grenzfläche zwischen Gel und Elektrophoresezelle herrühren;

Fig. 5 : eine schematische Darstellung zur Erläuterung der erfindungsgemäßen Herstellung von Vertiefungen und die daraus resultierenden Äquipotentiallinien;

Fig. 6 : eine schematische Darstellung zur Erläuterung des Verfahrens, mit o.em erfindungsgemäße Monofilament-Abstandshalter an einer Glasplatte angebracht werden können;

Fig. 7 : eine Detailansicht der erfindungsgemäßen Seitenklammer;

Fig. 8A-8C den Aufbau des oberen Reservoirs für den Puffer bei der erfindungsgemäßen Elektrophoresekassette und seine Anbringung an den Glasplatten der Kassette;

Fig. 9A, 9B eine erfindungsgemäß verwendete Kclj.^„-.atoranordnung;

Fig. 10: eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Erzeugung einer Vertiefung in einer Glasplatte zur Positionierung eines Kollimators;

Fig. 11: eine schematische Darstellung zur Erläuterung des Betriebs der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Füllen der Elektrophoresekassette gemäß der Erfindung;

Fig.12 und 13: Details des Klemmmechanismus;

Fig. 14: eine Detaildarstellung des Füllblocks
und

Fig. I5: einen Kamm zur· Erzeugung einer Zähnung irr Gelmaterial zur Separierung der zu analysierenden Proben.

Herkömmliche Gelelektrophoresezellen bzw. -kassetten, wie sie beispielsweise zur elektrophoretischen Trennung vor DNA- und RNA-Molekülfragmenten verwendet werden, weiser zwei flache Platten auf, die einander gegenüberliegen und durch seitliche Abstandshalter voneinander beabstandet
sind. Die vordere und die hintere Platte bestehen dabei aus einem flachen, nichtporösen und elektrisch isolierenden Material, das mit dem Gelmaterial und den zi analysierenden Molekülen nicht reagiert. Die Platter bestehen typischerweise aus Glas. Ihre Abmessunger betragen üblicherweise großenordnungsmäßig 30 &khgr; 30 cm.

Die seitlichen Abstandshalter werden beim Zusammenbau dei Zelle zwischen der vorderen Platte und der hinteren Platte angeordnf t., um so einen gleichmäßigen Zwischenraum zwi-

sehen den Platten vorzugeben, in dem das Gel vorgesehen wird. Die seitlichen Abstandshalter geben folglich die Dicke des Gels vor, die üblicherweise größenordnungsmäßig 0,25 bis 0,5 mm beträgt. Die Abstandshalter sind größenordnungsmäßig etwa 1 , 3 cm breit und bestehen typischerweise aus einem Flachmaterial aus Mylar oder einem anderen geeigneten Material.

Zur Ausbildung einer Gelschicht werden die Bestandteile der Elektrophoresegelkassette zusammengebaut. Die vordere und die hintere Glasplatte werden dabei durch die seitlichen Abstandshalter in entsprechendem Abstand gehalten. Die Seitenkanten der vorderen Platte und der hinteren Platte werden zusammengeklemmt, so daß das dazwischen ein- | gebrachte Gelmaterial seitlich nicht austreten kann. Übli- | cherweise wird ein Klebestreifen längs der Unterseite der | Gelelektrophoresekassette vorgesehen, mit dem sie abge- | dichtet wird. Das Gel wird anschließend in folgender Weise § zwischen die beiden Glasplatten eingebracht. |

Zum Füllen des Zwischenraumes zwischen den Platten wird ein geeignetes Material, wie etwa ein Polyacrylamid- oder Agarosegel, herangezogen. Diese Materialien sind flüssig,

P' wenn sie zwischen die Platten eingegossen oder eingspritzt J werden; danach verfestigen sich diese Materialien unter ^;1 Ausbildung eines Gels. Dabei ist es wesentlich iür die Erzielung einer ordnungsgemäßen elektrophoretischen Trennung, daß das Gel absolut gleichmäßig vorliegt. Jede Ungleichmäßigkeit im Gel beeinflußt die Geschwindigkeit und die Richtung der Moleküldiffusion unter dem Einfluß des an das Gel angelegten elektrischen Felds. Solche Ungleichmäßigkeiten können beispielsweise durch Luftblasen ,. oder Staub im Gel oder andere Faktoren hervorgerufen sein, \

wie im folgenden erläutert wird. >

Konstruktion und Zusammenbau von Elektrophoresegelkassctten zur Verwendung für Sequenzierungszwecke verlangen ein erhebliches Maß an Übung und praktischer Erfahrung. Dennoch treten auch dann, wenn erfahrene Personen den Zusammenbau vorgenommen haben, in zahlreichen Fällen bei herkömmlichen Kassetten Fehler und andere Unregelmäßigkeiten auf, die dazu führen, daß die elektrophoretische Trennung in einer nicht vorhersehbaren Weise erfolgt.

Ein eine Pufferlösung enthaltendes Reservoir ist am oberen Ende der Kassette vorgesehen, mit der die elektrische Verbindung zum oberen Ende der Gelschicht erfolgt. Das Reservoir ist typischerweise zwischen einer oberen Verlängerung der vorderen Glasplatte 10 und einem Rückteil ausgebildet, Jas Boden und Seitenwände der Rückseite des Reservoirs bildet. Zur Abdichtung ist eine schlauchförmige Dichtung zwischen dem Rückteil und der hinteren Platte 12 der Elektrophoresekassette vorgesehen, wobei die Abdichtung durch (nicht dargestellte) Klammern erfolgt.

Das untere Ende der Elektrophoresekassette taucht in ein unteres Reservoir ein, das eine zweite Pufferlösung enthält, die den elektrischen Kontakt mit dem unteren Ende der Gelschicht vermittelt. Die am Gel anliegende Spannung beträgt typischerweise größenordnungsmäßig 1000 V. Das elektrische Potential zwischen der oberen und der unteren Pufferlösung induziert ein elektrisches Feld innerhalb der Gelschicht. Dabei ist angestrebt, innerhalb der Gelschicht ein vollkommen gleichmäßiges elektrisches Feld aufzubauen, dessen Äquipotentiallinien bezogen auf die horizontale Ausdehnung der Gelschicht exakt parallel sind.

Normalerweise werden Elektrophoresen verschiedener Mole-

külkombinationen gleichzeitig im gleichen Gel vorgenommen. Hierzu sind am oberen Ende der Gelschicht mehrere Vertiefungen vorgesehen. Das Gemisch der zu trennenden Moleküle wird mit einer Injektionsnadel, die klein genug ist, um in die schmale Öffnung zwischen der vorderen Platte und der hinteren Platte der Elektrophoresekassette zu passen, in jede Vertiefung eingebracht. Die Vertiefungen können mit einem Stück des gleichen Materials, aus dem die seitlichen Abstandshalter bestehen, hergestellt werden; si- werden in geeigneter Weise _ugeschnitten. Dieses Bauteil wird als Kamm bezeichnet. Der Kamm wird nach dem Einfüllen des flüssigen Gels und vor dem Erh'-irten des Gels eingesetzt. Nach dem Erhärten des Gels wird der Kamm entfernt, wodurch entsprechende Vertiefungen zurückbleiben, in welche die zu analysierenden Moleküle aufgegeben werden.

Bei derartigen herkömmlichen Elektrophoresekassetten tritt entgegen der Erwartung in der Gelschicht kein gleichmäßiges Feld auf. Es wurde festgestellt, daß herkömmliche
Elektrophoresegelkassetten Fehlstellen aufweisen, die zur Ausbildung eines ungleichmäßigen elektrischen Felds innerhalb der Gelschicht führen.

Die beiden Hnuptursachen für die Unregelmäßigkeiten des elektrischen Felds sind darin zu sehen, daß die seitlichen Grenzflächen der Gelschicht nicht vollkommen geradlinig sind und die Dicke des Gels nicht gleichmäßig ist. Idealerweise sollte eine Gelschicht durch die seitlichen Abstandshalter so eingeschlossen werden, daß die tntsprechenden Grenzflächen geradlinig, parallel und vertikal sind. Die Flüssigkeit, aus der das Gel

gebildet wird, weist allerdings eine hohe Oberflächenspannung auf, weshalb sie in beliebig kleine Zwischenräume eindringt, mit denen sie in Kontakt kommt. Aufgrund kleiner Änderungen der Dicke der Abstandshalter und Abweichungen in der Planarität der vorderen und der hinterer Platte ist entsprechend der Kontakt zwischen den seitlichen Abstandshaltern und den Platten nicht gleichmäßig. Als Folge davon kann das UeI in die kleinen Zwischenräume zwischen den seitlichen Abstandshaltern und den Glasplatten eindringen, wodurch eine unregelmäßige Seitenkante der Geschieht hervorgerufen wird. Außerdem können Staubpartikel in diesen Bereich gelangen, wodurch zusätzliche Räume entstehen, in die das Gel 'infließen kann. Auf der anderen Seite führt der Versuch, eine derartige Leckbildung durch einen höheren Druck bei den entsprechender Klammern zurückzudrängen, zu einer Verwindung der Glasplatten, was wiederum zu einer ungleichmäßigen Geldicke und demzufolge zu einer Verzerrung des elektrischen Felds führt. Darüber hinaus ist die untere Fläche der Gelschicht nicht vollkommen flach, nachdem das zur Abdichtung dienende Band von der Unterseite der Gelkassette entfernt wurde. Diese Veränderungen tragen ebenfalls zur Ausbildung eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes bei.

Die Abdichtung zwischen dem Rückteil, welches das Reservoir bildet, und den Glasplatten kann ebenfalls zur Unregelmäßigkeit des elektrischen Feldes beitragen. Wenn die schlauchförmige Dichtung nicht vollständig abdichtet, tritt Pufferlösung in den Raum außerhalb der Dichtung aus. Auf der anderen Seite führt eine dichtere Verklammerung der Dichtung zwischen dem Rückteil und der entsprechenden Glasplatte zu einer Verbiegung oder Verwerfung der Glasplatte, was wiederum zur Ungleichmäßigkeit des elektrischen Feldes beiträgt.

In den Fig. 1, 2 und 3 ist die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung mit der neuartigen Elektrophoresekassette dargestellt, mit dem Unregelmäßigkeiten des elektrischen Feldes, wie sie für herkömmliche Elektrophoresekasseten typisch sind, verringert oder sogar vermieden werden können.

rig. &igr; ist, eine urdur sxcri l dur uj.e kit j.iiuuny syenidne Elektrophoresevorrichtung. Fig. 2 stellt eine entsprechende Seitenansicht gemäß der Linie 6-6 von Fig. 1 dar; Fig. 3 ist eine Darstellung der erfindungsgemäßen Elektrophoresekassette von oben entsprechend der Linie 7-7 von Fig. 1 ,

Bei der in Fig. 1 dargestellten Elektrophoresekassette befindet sich eine Gelschicht 18 zwischen der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12, die mit Abstandshaltern 40 voneinander beabstandet angeordnet sind, wobei zwischen den Abstandshaltern 40 und den Platten 10 bzw. 12 ein linienartiger Kontakt besteht. Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform bestehen die Abstandshalter 40 aus einem Polyamid-Monofilament. Aus den oben erläuterten Gründen sind dabei auf beiden Seiten der Gelschicht 18 jeweils zwei Abstandshalter 40 vorgesehen.

Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, daß die Verwendung von Abstandshaltern in Form von Monofilen (Monofilaments) gegenüber der Verwendung flacher Abstandshalter 14 bzw. 16, wie sie im Zusammenhang mit dem Stand der Technik erläutert wurden, zahlreiche Vorteile mit sich bringt. Zunächst sind Monofilaments leicht, billig und in unbegrenzter Menge in einer Vielzahl von Durchmessern erhältlich. Der Durchmesser solcher Monofilaments liegt typischerweise innerhalb einer Toleranz, die der von Mylar

oder anderen Kunststoff-Flachmaterialien entspricht, die üblicherweise fUr die seitlichen Abstandshalter herkömmlicher Elektrophoresekassetten verwendet werden. Rs Vurde festgestellt, daß die Gleichmäßigkeit eines Monofilaments von 0,25 mm Durchmesser typischerweise innerhalb von 2,5 · 10 mm liegt.

feinem sehr schmalen, linienförmigen Kontakt mit der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12, also im wesentlichen zu einer sehr scharfen Auflage. Dies führt zu einer Reihe von Vorteilen. Zunächst besteht keine Tendenz zum Einschluß von Staubpartikeln zwischen den Abstandshaltern Und den Glasplatten. Der sehr kleine Flächenbereich, über den die Abstandshalter mit der Glasoberfläche in Kontakt Stehen, verringert entsprechend die Fläche, auf der Staubpartikel entsprechende Lecks hervorrufen kennten. Darüber hinaus führt der kreisförmige Querschnitt von Monofilaments dazu, daß etwa eingedrungene Staubpartikel keine unerwünschten Hohlräume zwischen Monofilament und entsprechender Platte erzeugen, da Staubpartikel bei'i Zusammenbau der Elektrophoresekassette zur Seite geschoben werden.

Erfindungsgemäß können die Monofilaments der Abstandshalter auch aus anderen Materialien als Polyamid (Nylon) bestehen. Obgleich ihre Herstellung nicht ganz einfach ist, führen auch Abstandshalter mit elliptischem Querschnitt zu einer guten Abdichtung unter Punktkontakt bzw. linienförmigem Kontakt. Auch Abstandshalter mit polygonalem Querschnitt, beispielsweise achteckigem Querschnitt, führen zu einer Verteilung der Klemmkraft in einem sehr schmalen Flächenbereich und ergeben eine Abdichtung, die im wesentlichen der angestrebten Abdichtung mit Linien-

kontakt entspricht. Die Hauptanf orderungen j.n Abstandshalter für Elektrophoresekassetten sind eine leichte Elastizität, Flexibilität sowie sehr kleine Dimersionstoleranz des Abstandshalterquerschnitts.

Die Kraft, mit der die vordere Platte 10 und die hintere Matte 12 zusammengeklammert werden, wird im erfindungsge-Biäßen Fall durch di^p ans Mnnnf i 1 arnents au f gebauten Abstandshalter 40 auf eine erheblich kleinere Fläche verteilt, was zu °inem erheblich besseren Ausgleich von Oberflächenunregelmäßigkeiten der Glasplatten durch die Abstandshalter führt. Dementsprechend sind kleinere Kräfte trforder!ich, um eine mit dem Stand der Technik vergleichbare Abdichtung zwischen den Glasplatten und den Abstandshaltern 40 zu erzielen. Wie im folgenden im einzelnen näher erläutert ist, wird durch die Verwendung von zwei aus Monofilaments aufgebauten Abstandshaltern auf jeder Seite der Gelschicht 18 die Veränderung des elektrischen Felds durch Lecks nach diesen Abstandshaltern erheblich verringert oder sogar unterdrückt.

Die Gleichmäßigkeit der Abdichtung mit den Monofilament-Abstandshaltern 40 wird ferner durch neuartige Seitenklammern 48 (in den Fig. 1 und 2 nicht dargestellt) erhöht, mit denen die vordere Platte 10 und die hintere Platte 12 mit ^J°n Abstandshaltern 40 in Kontakt gehalten werden. Diese Seitenklammern erstrecken sich über die gesamte Länge der Gelschicht 18 vom unteren zum oberen Ende tier Platten 10 bzw. 12. Die Anbringung der Seitenklanunern 48 geht aus Fig. 3 hervor. Der Aufbau der Seitenklammerr ist in detaillierter Form in Fig. 7 dargestellt.

Die in Fig. 1 dargestellte Seitenklammer 48 umfaßt ein Trägerteil 50 aus einem U-förmic profilierten Material,

typischerweise einem gefrästen Acrylprofil, das sich über die ganze Länge der Elektrophoresekassette erstreckt. Die Oberseite 58 des Profils liegt vermittels eines Haltestreifens 136 aus Kunststoff an der Vorderseite der Glasplatte 10 an. Ein Haltestück 52 aus Kautschuk liegt an der gegenüberliegenden Oberfläche der Elektrophoresekassette an der Glasplatte 12 an. Das Haltestück 52 aus Kautschuk besitzt etwa quadratischen Querschnitt und erstreckt sich ebenfalls über die gesamte Länge der Elektrophoresekassette. Das Haltestück 52 wird durch die zweite Seitenwand 60 des U-förmigen Trägerteils 50 an die Hinterfläche der Kassette angedrückt.

Eine ovale Öffnung 54 befindet sich in dem aus Kautschuk bestehenden Haltestück 52 und geht durch dessen gesamte Länge hindurch. Die Öffnung 54 verläuft in ihrer Längsrichtung parallel zur Rückseite des Trägerteils 50. Zum Zusammenklammern der Elektrophoresekassette wird ein fester Spannstab mit ovalem Querschnitt über die ganze Länge des Haltestücks 52 in das Loch 54 eingeschoben. Der Spannstab wird anschließend um 90⁰ gedreht, bis er die Stellung aufweist, die bei der Querschnittsdarstellung von Fig. 14 gestrichelt angedeutet ist. In dieser Weise kann rasch und leicht ein gleichmäßiger Druck auf die vordere Platte 10 und die hintere Platte 12 und die dazwischen liegenden Monofilament-Abstandshalter 40 ausgeübt werden.

Das in Fig. 7 dargestellte Klemmsystem ergibt eine gleichmäßige Kraft über die gesamte Länge der Abstandshalter 40, wobei zugleich durch ausreichenden Druck Abdichtung gewährleistet ist. Da die Verteilung der Kraft und ihr Gesamtbetrag allein von der Konstruktion der Klemmvorrichtung und nicht von einer Bedienungsperson abhängig sind, ist erfindungsgemäß eine Verwerfung der Glasplatten

durch zu starkes Anziehen der Klammern oder ungleichmäßige Klemmkraft ausgeschlossen. Das elastische Haltestück 52 kann dabei auch aus anderen Materialien als Kautschuk bestehen. Ferner können die Öffnung 54 und der Spannstab auch Querschnittsprofile aufweisen, die von der in Fig.7 dargestellten ovalen Form abweichen.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Merkmal, das zur Gleichmäßigkeit des elektrischen Feldes beiträgt, ist in Fig. 2 dargestellt; die Elektrophoresekassette von Fig. 2 weist am unteren Rand von einer oder beiden Glasplatten 10, 12 eine Abschrägung 42 bzw. 44 auf, so daß für das Gel zwischen den Platten 10, 12 ein sich zum Ende hin trichterförmig erweiternder Raum zur Verfügung steht, in dem die Gelschicht einen erheblich kleineren elektrischen Widerstand aufweist als in der übrigen Schicht zwischen den Platten 10, 12. Im Querschnitt liegt entsprechend eine trichterförmige Erweiterung 46 des Gels vor. Aufgrund des erheblich geringeren elektrischen Widerstands des Gels in der trichterförmigen Erweiterung 46 beeinflußt eine Ungleichmäßigkeit des Gels in der Bodenfläche das resultierende elektrische Feld in erheblich geringerem Maße.

Eine typische Gelschicht ist beispielsweise 0,25 mm dick, während die Glasplatten 10, 12 typischerweise giö'ßenordnungsmäßig 2,5 mm dick sind. Die Leitfähigkeit der Gelschicht ist direkt proportional zu ihrer Dicke, und die Verringerung des elektrischen Widerstands am unteren Ende der Gelschicht 18 in der trichterförmigen Erweiterung 46 ist proportional dem Verhältnis T/t, wobei T die Dicke des Gels am Boden der trichterförmigen Vertiefung 46 und t die Dicke der eigentlichen Gelschicht 18 zwischen den Platten 10, 12 bedeuten. Auf diese Weise ist der elektrische Wi-

derstand der Bodenschicht der trichterförmigen Erweiterung 46 größenordnungsmäßig etwa zwanzigmal kleiner als in 3er übrigen Gelschicht 18. Als Ergebnis davon ist entsprechend der Einfluß von Änderungen der Glattheit der Bodenfläche der Gelschicht auf das elektrische Feld ur.i etwa den Faktor 20 verringert.

Wie oben erläutert, besitzt die Anordnung der in Fig. 1 dargestellten Abstandshalter signifikant bessere Eigenschaften, als sie bei herkömmlichen Elektrophoresekassetten vorliegen, bei denen flache Abstandshalter verwendet werden. Der Grund hierfür ist aus den Fig. 4A-C ersichtlich. Bei herkömmlichen Gelelekrrophoresekassette, die einen Abstandshalter in Form eines Streifens aus einem Kunststoffmaterial aufweisen, treten Scörungungen bei der Abdichtung z"ischen dem Abstandshalter und den Glasplatten auf; als Ergebnis davon fließt Gelmaterial aus der Gelschicht in den Bereich, in dem die Abdichtung nicht vollständig ist.

Wenn ein solches Leck in der Abdichtung vorliegt, fließt Strom durch das zusätzliche Gelmaterial, das sich seitlich außerhalb der normalen Gelgrenzfläche befindet. Dieser Strom stört das elektrische Feld im Gel in dem an den Bereich mit der Abdichtungsstörung angrenzenden Gebiet, was wiederum die Wanderungsrichtung der Moleküle stört, die unter dem Einfluß des angelegten elektrischen Potentials durch das Gel hindurchdiffundieren.

Diese Situation ist in Fig. 4C dargestellt, in der Äquipotentiallinien 66 eingezeichnet sind, die durch eine leckartige Störung 62 im seitlichen Abstandshalter 16 hervorgerufen werden. Der genaue Verlauf der Äquipotentiallinien hängt von Größe und Form der Störung der Abdichtung

ab. Indessen führt jede leckartige Störung der Abdichtung zu einem signifikanten Einfluß auf das elektrische Feld in seiner Nachbarschaft.

Die in Fig. 1 dargestellte erfindungsgemäße Abdichtung mit jeweils zwei Monofilament-Abstandshaltern 40 führt zu einer signifikanten Verringerung der erläuterten Probleme aus folgenden zwei Gründen:

Zunächst ist, wi? oben erläutert, die durch Abstandshalter 40 aus Monofilaments erzielte Abdichtung erheblich besser als bei dem Stand der Technik entsprechenden Abstandshaltern 14, 16 aus flachen Kunststoffdichtungen. Zum anderen wird durch die Verwendung von zwei aus einem Monofilament bestehenden Abstandshaltern 40 auf jeder Seite der Elektrophoresekassette beiderseitig eine Pufferzone 68 erzeugt, durch die wiederum die Wirkungen etwaiger Spalte oder Störungen in der Abdichtung erheblich verringert werden. Dies ist aus Fig. 4 ersichtlich.

In Fig. 4A ist ein Ausschnitt der Seitenabdichtung einer erfindungsgemäßen Elektrophoresekassette dargestellt. Der äußere Abstandshalter 40a und der innere Abstandshalter 40b, die bride aus Monofilament bestehen, ergeben eine perfekte Abdichtung. Die im Gel resultierenden Äquipotentiallinien im Kassettenkörper in der Gelschicht 18 sowie in der Pufferzone 68 sind geradlinig und verlaufen senkrecht zur senkrechten Richtung der Elektrophoresekassette.

In Fig. 4B ist ein ähnlicher Schnitt durch eine erfindungsgemäße Elektrophoresekassette dargestellt, bei der zwei Störungen in der Abdichtung durch die Monofilament-Abstandshalter 40 vorliegen. Bei der Abdichtung des äußeren Abstandshalters 40a ist ein Spalt 7? dargestellt,

während sich ein zweiter Spalt 71 in der Abdichtung des inneren Abstandshaltern 40b befindet. Obgleich zuweilen durchaus derartige Unterbrechungen in der Abdichtung mit Monofilament-Abstaüdshaltern vorkommen, ist jedoch die Wahrscheinlichkeit außerordentlich gering, daß sich eine derartige Störung beim inneren Abstandshalter 40b in der Nähe einer entsprechenden Störung des äußeren Abstandshal-

Wenn sich ein Spalt oder eine Unterbrechung in der Abdichtung durch den äußeren Abstandshalter 40a befindet, baucht sich das Gelmaterial aus der Pufferzone 68 etwas nach außen aus, wie in Fig. 4B dargestellt ist. Hierdurch wird das elektrische Feld im Gel in der Pufferzone beeinflußt. Wenn jedoch die innere Abdichtung, die dem Spalt 72 gegenüberliegt, intakt ist, ist die Abweichung des elektrischen Felds im Hauptkörper der Gelschicht 18 vernachlässigbar gering, wie aus den in Fig. 9B dargestellten Äquipotentiallinien 78 ersichtlich ist.

In Fig. 4B ist ferner ein Spalt 74 eingezeichnet, der in der Abdichtung durch den inneren Abstandshalter 40b vorliegt. In diesem Fall tritt dann keine Beeinträchtigung des elektrischen Felds im Hauptkörper der Gelschicht 18 der Elektrophoresekassette auf, wenn die äußere Abdichtung mit dem äußeren Abstandshalter 40a in der Nähe des Spalts
74 intakt ist; diese Situation ist durch die entsprechenden Äquipotentiallinien 78 in Fig. 4B veranschaulicht.

Selbst in dem außerordentlich unwahrscheinlichen Fall, daß Unterbrechungen in der inneren und in der äußeren Abdichtung in unmittelbarer Nachbarschaft zueinander vorliegen,

schwächt die Pufferzone 68, die zwischen den beiden Abstandshaltern 40a und 40b vorliegt und aus einem Monofilament besteht, die Wirkung auf das elektrische Feld innerhalb der eigentlichen Gelschicht 18 der Elektrophoresekassette ab, die von derartigen Lecks hervorgerufen wird. Die effektive Beeinträchtigung des elektrischen Felds im Hauptkörper der Gelschicht 18 durch einander benachbarte

ist entsprechend signifikant geringer als die Beeinträchtigung des elektrischen Felds durch eine vergleichbare Unterbrechung bei einem herkömmlichen Abstandshalter aus einem streifenförmigen Material.

Die Verringerung der Beeinflussung des elektrischen Felds durch leckartige Unterbrechungen in den Abstandshaltern durch das Vorsehen der Pufferzone 68 beruht auf dem im Querschnitt punktförmigen Kontakt der Monofilaments der Abstandshalter 40 und der dadurch hervorgerufenen guten Abdichtung. Eine funktionell vergleichbare Pufferzone könnte folglich bei herkömmlichen Elektrophoresekassetten mit flachen Abstandshaltern nicht realisiert werden. Eine Störung der Abdichtung führt bei Verwendung eines flachen Abstandshalters allgemein zu einem Bereich einer Störung, der Gelmaterial enthält. Aufgrund des elektrischen Feldes im Gel fließt ein Strom in diesem unregelmäßigen Bereich. Damit dieser Strom seitwärts in diesen Bereich hineinfließt, müssen die Feldlinien von der angestrebten senkrechter. Orientierung abweichen. Selbst wenn sich das Leck im streifenförmigen Abstandshalter ganz durch diesen hindurch erstreckt, müssen nichtvertikale Komponenten im elektrischen Feld existieren, damit der Strom in den gettörten Bereich hinein- und aus ihm herausfließen kann. Erfindungsgemäß besitzt die Abdichtung vernachlässigbare Breite; daher werden Abweichungen vom angestrebten

elektrischen Feld, die durch Stromfluß im Bereich um eine Abdir-htungsstörung herum hervorgerufen werden, in hohem Maße verringert oder sogar gänzlich unterdrückt.

Die aus Monofilaments bestehenden Abstandshalter 40 können in folgender Weise angebracht und in ihrer Lage gehalten Werden. In Fig. 6 ist ein Ausschnitt der vorderen Platte 10 dargestellt auf welche die Monof ilern^n^"-Abstre.ndsh?! tpr 40 aufgespannt sind. Ein steifer Haltestreifen 136 aus einem elastischen Material, dessen Länge der Höhe der Glasplatte 10 entspricht, ist längs der Vorderfläche der Platte 10 vorgesehen. Der Haltestreifen 136 endet am Oberen und unteren Ende jeweils in einer Abwinkelung 138, die unter einem Winkel aus der Vorderfläche der Glasplatte 10 heraussteht. Die Anordnung des Haltestreifens 136 ist in Fig. 8B detaillierter dargestellt. Der Haltestreifen 136 und die Abwinkelungen 138 bestehen nach einer bevorzugten Ausführungsform aus PVC. Erforderlichenfalls kann der Haltestreifen 136 mit einem Kleber an der Glasplatte 10 angeklebt werden. Dies erleichtert und beschleunigt den Ersatz der Monofilament-Abstandshalter beim Wieder^usamfnenbau und beim Füllen einer neuen Elektrophoresekassette fnit Gel. Die Breite des Haltestreifens 136 ist vorzugsweise groß genug, daß er den Druck vom Trägerteil 50, wie im folgenden noch erläutert wird, über den Bereich der vorderen Platte 10 verteilt, der den Raum zwischen den Monofilament-Abstandshaltern 40 überbrückt, wie Fig. 7 zeigt.

Eine geschlossene Schleife aus einem Monofilament wird durch Zusammencrimpen eines Stücks eines Monofilaments hergestellt. Diese Schleife wird dann über eine der Abwinkelungen 138 gelegt, um die Rückseite (Innenseite) der Platte 10 gezogen und schließlich über die Abwinkelung 138 am anderen Ende des Haltestreifens gelegt. Das Monofila-

mentmaterial ist. elastisch genug, so daß diese Montage sehr leicht durchführbar ist, wobei zugleich ausreichende Spannung erzielt wird, aufgrund deren die Monof ilament--Abstandshalter sicher auf Ihrem Platz gehalten werden.

Die Crimpstelle, an der durch Zusammencrimpen der Monofilamentenden die Schleife erzeugt wurde, wird an einer Stelle außerhalb der Innenfläche der Platte 10 vorgesehen, da durch das Crimpen eine Veränderung des Monofilamentdurchmessers erfolgt. Erforderlichenfalls können am oberen und am unteren Rand der Platte 10 Vertiefungen vorgesehen Bein, um die Abstandshalter noch besser zu positionieren und zu sichern. Darüber hinaus wird die Anbringung der Abstandshalter 40 durch Anbringen von Streifen aus Polyamid (Nylon) an der Schleife in den Punkten erleichtert, wo sie über die Abwinkelungen der Haltestreifen 136 gelegt wird. Auf diese Weise können die Monofilament-Abstandshalter beim Zusammenbau sicher positioniert werden. Diese Konzeption hat den zusätzlichen Vorteil, daß die Monofilamentschleife entfernt und durch eine neue Schleife ersetzt werden kann, wenn die Elektrophoresekassette wieder verwendet wird.

Ein weiteres Merkmal der Erfindungskonzeption, oas zur Aufrechterhaltung eines konstanten elektrischen Feldes innerhalb de-¹ Gelschicht der Elektrophoresekassette beiträgt, ist die Anordnung der ""ertief ungen 36 am oberen Rand des Gelmaterials. Herkömmliche Elektrophoresekassetten weisen am oberen Rand mehrere Vertiefungen auf, die in das Gelmaterial der Gelschicht hineinragen. Die Moleküle diffundieren von jeder Vertiefung unter dem Einfluß aes elektrischen Feldes nach unten. Die Wege, aui „--*■■■' sich die Moleküle bewegen, werden a: s Bahnen bezeichnet. Bei der herkömmlichen Anordnung folgen Stoffe, die längs den

einzelnen Spuren im Gel hinunterdiffundieren, bogenförmig nach außen gekrümmten Bahnen. Die äußeren Bahnen sind nach auswärts gebogen und weisen eine ausgeprägte Krümmung auf. Dieser Effekt ist zwar bei den weiter innen liegenden Bahnen in der Gelkassetre weniger ausgeprägt, tritt aber gleichwohl auf.

Diese Verzerrung der Bahnen wird im folgenden erläutert. Der elektrische Anschluß der Gelschicht erfolgt am oberen Ende der Elektrophoresekassette über die flüssige Pufferlösung im oberen Reservoir 20. Der Widerstand der Pufferlösung ist dabei erheblich kleiner als der Widerstand des Gels der Gelschicht. Dementsprechend kann das Reservoir näherungsweise als Aquipotentialbereich angesehen werden, der sich längs des oberen Randes des Geimaterials erstreckt. Die Ausbildung der Vertiefungen am oberen Rand des Gelmaterials erfolgt typischerweise so, daß die Höhe des Gels, das an die seitlichen Grenzflächen angrenzt, gleich dem oberen Rand der Vertiefungen ist.

Da das Reservoir im wesentlichen eine Elektrode konstanten Potentials darstellt, ist die Spannung an den Stellen am oberen Rand des Gels, die an die seitlichen Grenzflächen angrenzen, gleich groß wie die Spannung an den Unterkanten 94 der Vertiefungen. Im Ergebnis sind die Äquipotentiallinien unterhalb der Vertiefungen gekrümmt. Die Moleküle diffundieren längs der Feldlinien, die senkrecht zu den Äquipotentiallinien verlaufen. Auf diese Weise folgen Moleküle, die von den betreffenden Vertiefungen ausgehen, den erwähnten gekrümmten Bahnen, was zu der oben beschriebenen Bahnverzerrung führt.

In Fig. 5 ist ebenfalls eine alternierende Konfiguration am oberen Rand der Gelschicht 18 dargestellt, in der

t ·

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mehrere Vertiefungen ähnlich dem Stand der Technik vorgesehen sind. Im Gegensatz dazu sind jedoch im Bereich des Gels, das an die beiden seitlichen Grenzflächen 88 bzw. 90 angrenzt, zwei zusätzliche seitliche Vertiefungen 98 vorgesehen, die ähnlich wie die Vertiefungen 36 ausgebildet sind; in diese seitlichen Vertiefungen werden jedoch keine Moleküle zur Diffusion eingebracht. Der Boden dieser neitlichen Vertiefungen 98 befindet sich auf dem gleichen elektrischen Potential wie der Boden der Vertiefungen 36. Da die Böden der seitlichen Vertiefungen 98 und der Vertiefungen 36 sämtlich in der gleichen Ebene liegen, sind die resultierenden Aquipotentiallinien 100 erheblich gerader wie aus Fig. 5 unmittelbar ersichtlich ist.

Zu Fig. 5 ist zu bemerken, daß die darin dargestellten Aquipotentiallinien selbstverständlich nur grobe Näherungen für das tatsächlich bestehende elektrische Feld darstellen. Im einzelnen besitzen die Streufelder in den Bereichen zwischen den Vertiefungen 36 sehr komplizierte Konfiguration. Gleichwohl verringert sich der Einfluß dieser Streufelder rasch mit wachsendem Abstand von den Vertiefungen, Die genaue Tiefe der seitlichen Vertiefungen 98 zur Erzielung optimaler Eigenschaften hängt von der jeweiligen Konfiguration der Vertiefungen 36 ab, die am oberen Rand der Gelschicht 18 vorgesehen sind. Dabei wurde festgestellt, daß die zusätzliche Anordnung von seitlichen Vertiefungen 98 die besten Ergebnisse ergibt, wenn diese 50 bis 100 % der Tiefe der Vertiefungen 36 besitzen. Diese seitlichen Vertiefungen 98 können gleichzeitig mit der Ausbildung der für die Aufgabe der Moleküle vorgesehenen Vertiefungen 36 mit Hilfe eines Kamms mit ähnlicher Ausbildung wie gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden, der jedoch so modifiziert ist, daß damit auch die seitlichen Vertiefungen 98 entstehen.

Als Ergebnis der erfindungsgemäßen Verbesserung des elektrischen Feldes, wie oben erläutert, diffundieren die Moleküle in Bahnen, die sehr nahe am angestrebten geradlinig-senkrechten Verlauf liegen. Dementsprechend kann die erfindungsgemäße Elektrophoresevorrichtung auch zusammen mit Einrichtungen zur automatischen Erfassung von durch das Gel diffundierenden Molekülen verwendet werden. So können im einzelnen Detektoren, die auf die Strahlung von radioaktiv markierten Molekülsegmenten ansprechen, zur automatischen Erfassung des Durchtritts derartiger Molekülsegmente herangezogen werden.

Eine alternative Methode zur Isolierung der Proben wird wir folgt durchgeführt. Eine Gelelektrophoresekassette wird, wivi ob-_'n beschrieben, zusammengebaut und mit Gelmaterial befüMt mit dem Unterschied, daß das Gel mit einer flachen oberen Oberfläche vorgesehen wird, also ohne Ausbildung von Vertiefungen 36. Anschließend wird eine Reihe kleiner zahnförmiger Vertiefungen in der flachen oberen Oberfläche des Gels erzeugt. In Fig. 15 ist ein Kamm 240 dargestellt, mit dem sich diese Vertiefungen herstellen lassen. Eine Reihe von Zinken 246 ist bei diesem Kamm in regelmäßigen Abständen mit Zwischenräumen 244 zwischen jeder Gruppe von Zinken vorgesehen. Der Kamm 240 wird in das obere Ende der Gelkassette so eingesetzt, daß die Zinken 246 gerade mit der oberen Oberfläche des Gels in Kontakt kommen und zahnfö'rmige Vertiefungen einer Dicke von wenigen Hundertstel mm (wenigen Tausendstel inch) Dicke erzeugen. Proben des zu analysierenden Materials werden dann in die Bereiche eingetropft, die den Zwischenräumen 244 zwischen den jeweiligen Zinken 246 entsprechen. Die Anordnung von zwei Zinken 246 zwischen jedem Probenbereich erhöht die Isolation zwischen den

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Proben und erleichtert einer Bedienungsperson die Unterscheidung benachbarter Vertiefungen.

Zur Herstellung des Kamins 240 werden die Zinken 246 durch Stanzer, oder anderweitiges Ausschneiden aus einer dünnen Platte 248 aus Kunststoff hergestellt, deren Dicke gleich dem Abstand zwischen der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12 ist und deren Länge dem Abstand zwischen den inneren Monofilament-Abstandshaltern 40 mitspricht. Ein zweites Kunststoffteil 250 ist auf einer Seite der Platte 248 befestigt. Die Dickenvergrößerung durch das Kunststoffteil 250 ermöglicht eine senkrechte Justierung des Kamms innerhalb der Elektrophoresekassette durch Anlegen der oberen oder unteren Kante des Kunststoffteils 250 an der Oberkante der hinteren Platte 12. Der Abstand a zwischen der Oberkante des Kunststoffteils 250 und der Oberkante der Platte 248 ist, wie aus Fig. 15 hervorgeht, geringfügig kleiner als der Abstand b zwischen der Unterkante des Kunststoffteils 250 und der Unterkante der Zinken 246. Dies ermöglicht eine Ausbildung der oberen Oberfläche des Gels durch Einsetzen des Kamms 240 in die Elektrophoresekassette in einer Orientierung, die umgekehrt ist wie bei der Darstellung von Fig. 15 (auf den Kopf gestellt). Der flache obere Rand des Kamms 240 bildet dann am oberen Ende des Gelmaterials eine flache Oberfläche aus. Nach der Verfestigung bzw. Polymerisation des Gels wird der Kamm 240 umgedreht und so wieder eingesetzt, daß die Zinken 246 zur Oberseite der Geloberfläche hin gerichtet sind. Der Kamm wird dabei eingeführt, bis er mi.t dem Kunststoffteil 250 zum Anschlag kommt; in dieser Stellung dringen die Zinken 246 gerade in die obere Oberfläche der Gelschicht ein. Auf diese Weise können mit großer Genauigkeit zahnförmige Vertiefungen in der oberen Oberfläche des Gelmaterials erzeugt werden.

Die Konfiguration einer erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung ist in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Sie weist mehrere Detektoren 110 auf, die hinter dem unteren Teil der Gelzelle angeordnet sind. Die Detektoren empfangen jeweils Strahlung, die durch einen zugeordneten Kollimator 112 austritt. Die Kollimatoren 112 sind vorzugsweise einstückig mit der hinteren Glasplatte 12 integriert, wie weiter unten im einzelnen erläutert wird. Wenn die radioaktiv markierten Molekülfragmente von den jeweiligen Vertiefungen 36 unter dem Einfluß des elektrischen Feldes nach unten waniern, passieren sie den entsprechenden Kollimator 112 und den zugehörigea Detektor 110 zu einem Zeitpunkt, der von der Molekülgröße und der resultierenden Diffusionsgeschwindigkeit abhängt. Durch elektronische Erfassung der Passage dieser Molekülfragmente kann eine automatische Analyse dieser Materialien durchgeführt werden. Obgleich schon früher automatische Detektionssysteme zur Analyse der elektrophoretischen Diffusion angegeben worden sind, war ihre Wirksamkeit aufgrund der Veränderungen der Diffusionsbahnen und Änderungen der Diffusionsgeschwindigkeit, die für herkömmliche Gelelektrophoresevorrichtungen typisch sind, in außerordentlichen Maße eingeschränkt. Die Genauigkeit der Diffusionswege bei der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung erlaubt andererseits die Konzeption wesentlich praktikablerer automatischer Detektionssysteme.

Darüber hinaus können erfindungsgemäß Kollimator- und Detektorsysteme vorgesehen werden, die gegenüber dem Stand der Technik sehr vorteilhaft sind und zu einer weiterer Erhöhung der Analysengenauigkeit führen.

Bei der elektrophoretischen Analyse von Nucleinsäurer

werden häufig radioaktiv markierte Molekülsegmente eingesetzt. P wird dabei für diese Zwecke am meisten herangezogen, jedoch können auch andere Isotope verwendet werden. Diese Isotope emittieren typischerweise eine

OO

Strahlung geringerer Energie als die von P, weshalb die nachstehenden Erörterungen im Rahmen der Erfindung von besonderer Bedeutung sind.

P ist ein ß-Strahler mit einer Energieverteilung, die um 600 keV zentriert ist. Die Energie der meisten dieser Quanten ist so niedrig, daß sie von den Materialien, aus denen die vordere Platte 10 und die hintere Platte 12 hergestellt sind, absorbiert werden. So absorbiert beispielsweise Glas einer Dicke von 1,25 mm die Hälfte der

OO

Emission P-markierter Moleküle. Demzufolge kann die emittierte Strahlung durch die Dicke der Platten der Elektrophoresezelle hindurch nicht in wirksamer Weise erfaßt werden.

Bei herkömmlichen Systemen, bei denen eine automatische Erfassung radioaktiv markierter Moleküle angestrebt war, wurde ein Einschnitt vorgesehen, der vollständig durch die Glasplatte hindurchgeht, um eine Erfassung von ß-Strahlung zu ermöglichen. Dabei wurde nach diesem Stand der Technik in der hinteren Platte oder der vorderen Platte eine Öffnung vorgesehen, die ganz durch die entsprechende Platte hindurchgeht. Diese Öffnung wurde dann mit einem Streifen aus einem Film aus PETP (Mylar) oder PET abgedichtet, der über die Öffnung der Glasplatte geklebt wurde. Obgleich diese Anordnung den Durchtritt der von radioaktiv markierten Molekülen stammenden emittierten Strahlung erlaubt, werden hierdurch unerwünschte Verzerrungen des elektrischen Feldes hervorgerufen. Die Dicke des Films beträgt ungefähr 0,05 mm oder mehr. Die

Dicke der Gelschicht beträgt größenordnungsmäßig 0,25 bis 0,5 mm. Das Hineinragen des nichtleitenden Films in die Gelschicht führt entsprechend zu einer außerordentlich Starken Verzerrung und Störung des elektrischen Feldes in der Nähe der schlitzartigen Öffnung.

1st für jeden KuIl inicator 112 in die

hintere Glasplatte 12 eine Vertiefung eingeschliffen, die Bich im Querschnitt über den größten Teil der Dicke der Glasplatte erstreckt. Die Vertiefung wird dabei im weeentlichen einem Kreissegment entsprechend oder mit einer ähnlichen Querschnittsform vorgesehen, um Punkte mit hoher mechanischer Spannung zu vermeiden. Die Vertiefung wird dabei so tief in das Glas eingeschliffen, daß die verbleibende Glasdicke 118 am Boden der Vertiefung etwa 0,13 mm beträgt; dieser Sachverhalt ist in Fig. 9A schematisch dargestellt.

Anschließend wird ein metallischer Kollimator in die Vertiefung eingeklebt. Der Kollimator 112 hat zwei funktionen. Zunächst dient er zur Kollimierung der Strahlung von den radioaktiv markierten Molekülen zur Erzielung einer besseren Auflösung des Detektors. Zum anderen verstärkt er das Glas durch Einbringen zusätzlicher Festigkeit in dem Bereich, in dem das Glas zur Strahlungserfassung sehr dünn geschliffen wurde. Wie aus Fig. 9A ersichtlich ist, weist der Kollimator 112 einen Querschnitt auf, der etwa einem Kreissegment entspricht. Fig.

9B ist eine Rückansicht des Kollimators 112 und zeigt, daß er länglich ausgebildet ist und halbkreisförmig gerundete Enden aufweist. Ein Schlitz 120 erstreckt sich durch den Kollimator 112, durch den die emittierte radioaktive Strahlung nach außen dringen kann. Die genaue Form des

Schlitzes 120 kann in Abhängigkeit von der Empfindlichkeit des Detektors, der angestrebten Auflösung und anderen Faktoren verändert werden. Im Stand der Technik sind zahlreiche verschiedene Kollimatorkonfigurationen bekannt, so daß die Konfiguration für den Schlitz 120 aus diesen vorbekannten Kollimatorkonfigurationen ausgewählt werden kann. Gemäß einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform besteht der Kollimator 1 ! 2 aus Kovär oder Wolfram, die beide einen thermischen Ausdehnungskoeffizienten aufweisen, der sehr nahe bei dem des Glasmaterials liegt, aus dem die Glasplatte 12 besteht. Blei, Messing oder Kupfer können ebenfalls verwfndet werden.

Die Vertiefung für den Kollimator kann in folgender Weise in der hinteren Glasplatte 12 vorgesehen werden. In Fig. 10 ist die Glasplatte 12 dargestellt, wobei die herzustellende Vertiefung 122 gestrichelt eingetragen ict. Ein Kugelschleifer 124, der an einer Welle 126 angebracht ist, wird um die Drehachse 130 rotieren gelassen. Der Kugelschleifer 124 ist typischerweise mit einer., harten Schleifmaterial, wie etwa Diamantstaub, bestückt. Dabei ist wesentlich, daß die Drehachse des Kugelschleifers 124 unter dem Winkel 128 zur Glasoberfläche gehalten wird.

Die Mittelzone 132 am Ende des Kugelschleifers 124, wo die Drehachse 1 30 -ic Kugeloberfläche des Kugelschleifers 124 schneidet, stellt gewissermaßen eine tote Zone dar, da Drehung und Schleifwirkung des Kugelschleifers 124 in fiiesem Bereich nur sehr klein sind. Es ist daher günstig, Eu vermeiden, daß diese Mittelzone 132 einen relevanter Druck auf die Glasplatte 12 ausübt, da in der Mittelzor^ 132 und in ihrer Nachbarschaft nur geringe Dr^;: , und minimale Schleifwirkung vorliegen. Es ist daher wesentlich, den Kugelschleifer 124 in einer solchen Orientierung

zu halten, daß die Mittelzone 132 nur geringe oder keine Schleifwirkung auf die Glasoberfläche bei der Herstellung der Vertiefung 122 ausübt, um ein Brechen des Glases zu vermeiden. Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform hat der Kugelschleifer 124 einen Durchmesser von 9,5 mm, wobei der Winkel 128 im Bereich von 45 bis 60° liegen sollte. Zur Ausbildung der Vertiefung 122 wird der Kugelschleifer 124 zunächst bis zur vollen Tiefe in das Glas eingeschliffen und dann in einem Zug horizontal bewegt. Zur Unterstützung der Kühlung und Abriebentfernung wird eine Befestigungsvorrichtung an der Glasoberfläche angebracht, um den Kugelschleifer und den bearbeiteten Bereich der Glasplatte in Öl eingetaucht zu halten. Bei dieser Bearbeitung entsteht eine ovale Vertiefung mit halbkreisförmigen Enden, in die der in Fig. 9B dargestellte Kollimator eingesetzt und eingeklebt werden kann.

Der in Fig. 2 dargestellte Detektor 110 sollte so nah wie möglich am Kollimator 112 vorgesehen sein. Hierdurch können in der Gelschicht 18 unerwünschte Temperaturgradienten hervorgerufen werden, wenn der Detektor 110 so montiert ist, daß er als Wärmeableiter wirkt. Solche Temperaturgradienten beeinträchtigen die Diffusion der radioaktiv markierten Moleküle.

Die Elektrophoresekassette wird typischerweise aufgrund der Erwärmung des Gels durch den hindurchfließenden Strom als Ergebnis des an das Gel angelegten elektrischen Potentials bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 60° C betrieben. Ein Detektor oder eine andere Vorrichtung, die mit der hinteren Glasplatte 12 oder dem Kollimator 112 in Kontakt steht, können Wärme zum Glas zuführen oder von ihm abführen und so zur Ausbildung unerwünschter TemperaturgradienN-n führen. So können beispielsweise Vorrichtungen

zur Montage und Positionierung der Elektrophoresekassette das thermische Gleichgewicht des Gels in erheblichem Maße stören. Bei herkömmlichen Kassettensystem werden daher Wassermäntel vorgesehen, um das ganze Gel auf einer gleichmäßigen Temperatur zu halten.

Im Rahmen der Erfindung wurde diesbezüglich festgestellt, daß das thermische Gleichgewicht der Elektrophoresekassette mit dem Gel dadurch am besten aufrechterhalten werden kann, daß der Detektor 110 in einer thermisch leitenden Platta eingebettet wird, die sich im wesentlichen über die gesamte Fläche der hinteren Platte 12 der Elektrophoresekassette erstreckt. In Fig. 2 ist eine derartige Platte 134 dargestellt, die sich vom oberen Rand der Elektrophoresekassette bis zu einer Höhe gut unterhalb des Punktes erstreckt, an dem der Kollimator 112 in die hintere Platte 12 eingesetzt ist. Die Platte 134 erstreckt sich seitwärts über die gesamte Breite der Elektrophoresekassette. Die Hauptforderung besteht bei der Platte 134 darin, daß sie eine hohe thermische Leitfähigkeit besitzt; sie ist dementsprechend bevorzugt aus Aluminium hergestellt. Die erfindungsgemäße Elektrophoresekassette ist bei dieser Ausführungsform entsprechend so aufgebaut, daß die Platte 134 über einen möglichst großen Bereich mit der Rückseite der hinteren Glasplatte 12 in Kontakt steht. Hierdurch wird die Aufrechterhaltung eines thermischen Gleichgewichts im Gel gewährleistet. Die Platte 134 ist größenordnungsmäßig etwa 2,5 cm dick und sollte von sämtlichen Teilen des Elektrophoresesystems mit Ausnahme der Gelkassette thermisch isoliert sein. Der Boden des Reservoirs 140 wird vom oberen Rand der Platte 134 abgestützt, wobei ein StütZceil 135 am unteren Ende der hinteren Platte 12 vorgesehen sein kann, um die Positionierung der Gelkassette zu erleichtern.

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Die Art und Weise der Anbringung des oberen Reservoirs 20 an die Gelkassette kann ihre Eigenschaften beeinflussen. Bei herkömmlichen Elektrophoresekassetten, wird das Rückteil, das Rückwand und Seitenwände des oberen Reservoirs bildet, typischerweise an die Rückseite der Gelkassette angeklemmt. Die Abdichtung zwischen dem Rückteil und den Platten der Gelkassette geschieht dabei mittels einer schlauchförmigen Dichtung. Zur Erzielung einer ausreichenden Abdichtung ist es erforderlich, senkrecht zu den Oberflächen der Glasplatten nicht nur längs ihrer Seiten, sondern auch in der Mitte ihres oberen Randes Druck auszuüben. In zahlreichen Fällen wird durch diesen Druck eine Verbiegung oder Verwerfung der Glasplatte hervorgerufen, was wiederum zu einer Verzerrung des elektrischen Feldes innerhalb der Gelschicht führt.

Im Rahmen der Erfindung ist eine neuartige Anbringung des oberen Reservoirs an der Gelkassette vorgesehen. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, weist die dort dargestellte Elektrophoresekassette ein Rückteil 140 auf, das Rückwand und Seitenwände des oberen Reservoirs bildet. Seine Anbringung an der Gelkassette und das Material, aus dem das Rückteil hergestellt ist, sind allerdings erheblich von entsprechenden Rückteilen gemäß dem Stand der Technik verschieden. In Fig. 8A ist das Rückteil 140 und seine Anbringung gemäß der Erfindung detaillierter dargestellt. Die Ansicht von Fig. 8 entspricht daher der gleichen Schnittlinie in Fig. 1 wie bei Fig. 2. Das in Fig. 8A dargestellte Rückteil 140, welches das obere Reservoir bildet, besteht aus einem elastischen Material, wie etwa aus Kautschuk, und ist als entsprechendes Formteil hergestellt. An der Außenfläche der hinteren Glasplatte 12 ist längs des oberen Randes ein Stab 142 angebracht, wie Fig. 8A zeigt. Gemäß einer bevorzugten AusfUhrungsform besteht

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der Stab 142 aus Glas und weist auf einer Seite eine Abflachung auf, mit der er mit der Glasplatte 12 verklebt ist. Das Rückteil I40 besitzt andererseits eine eingeformts Öffnung, in die der Stab 142 hineinpaßt. Das Rückteil 140 wird über diesen Stab 142 gepreßt, um so eine entsprechende Positionierung zu erzielen. Längs des oberen Endes des Rückteils, das dem Reservoirboden entspricht, kann ferner eine Dichtlippe 143 vorgesehen sein, um eine elektrolytdichte Abdichtung zu gewährleistr-.. Darüber hinaus kann an d_r Überseite des Stabs 142 eine kleine rechtwinklige Kerbe 145 vorgesehen sein, um so eine weitere Abdichtung und Flüssigkeitssperre zu erzielen. Da das Rückteil 140 aus einem elastischen Material besteht, dichtet es selbst über die gesamte hintere Oberfläche der hinteren Platte 12 ab, ohne daß hierfür Dichtungen und Klemmen erforderlich wären. Der Stab 142 wird ferner zusätzlich zu einer Versteifung der Gelkassette in horizontaler Richtung, die zur Verwerfungsfestigkeit beiträgt.

Die seitliche Abdichtung der durch das Rückteil 140 gebildeten Reservoirstruktur ist in Fig. 8B dargestellt, die einem Querschnitt längs der Linie 15B-I5B von Fig. 1 entspricht. Fig. 8C ist eine Ansicht des Reservoirs von oben, die len in Fig. 8B gezeigten Querschnitt einschließt. Eine Seitenv/and 148 des Reservoirs erstreckt sich über die Seitenfläche der hinteren Platte 12 und steht mit der vorderen Platte 10 beiderseits des äußeren Abstandshalters 40a in Kontakt.

Die erfindungsgemäße Elektrophoresekassette laß sich besonders vorteilhaft verwenden, wenn die Füllung mit dem Gelmaterial in der nachstehend beschriebenen Weise erfolgt. Wie oben erläutert, erfordern die bisher üblichen Verfahren zur Füllung von Elektrophoresekassetten mit Gel

beträchtliche Erfahrung und Sorgfalt zur Erzielung einer brauchbaren Gelschichi. mit gleichmäßiger Dicke und ohne Diskontinuitäten, wie sie etwa von Blasen oder Staubpartikeln in der Gelschicht herrühren. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, daß die Einspritzung des Gels in die Elektrophoresekassette im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren zu einer gleichmäßigeren Gel schichtdicke führt, was wiederum Funktion und Genauigkeit verbessert.

In Fig. 11 ist eine Vorrichtung perspektivisch dargestellt, die zur Einspritzung von Gel in die erfindungsgemäße Elektrophoresekassette vorgesehen ist. In diesem Zusammenhang ist festzuhalten, iaß das nachstehend beschriebene Verfahren und die im folgenden erläuterte Vorrichtung zum Füllen von Elektrophores^kassetten mit Gel auch für herkömmliche Elektrophoresekassetten anwendbar sind. Fig. 12 stellt eine Seitenansicht der Vorrichtung von Fig. 11 dar, wobei bestimmte Bereiche herausgeschnitten dargestellt sind.

Die Füllvorrichtung der Fig. 11 und 12 umfaßt eine Grundplatte 200, welche als Träger für die waagrecht aufzusetzende Kassette dient, wie im folgenden näher erläutert wird. Ein Klemmechanismus 202 dient zur Positionierung und zum Anklemmen eines Füllverteilers 204 an den Boden der Gelkassette, in die ein elastischer Abdichtstreifen 205 aus Kautschuk eingesetzt ist. Der Füllverteiler 204 dient zur Abdichtung des Bodens der Kassette während der Füllung mit dem Gel und stellt ein Zwischenstück dar, durch welches das Gel zwischen die vordere und die hintere Glasplatte der Kassette eingespritzt wird.

Die Grundplatte 200 kann ein Formteil, beispielsweise ein Spritzgußteil, aus Kunststoff oder einem anderen geeigne-

ten Material sein. Der Klemmechanismus 202 ist an der Grundplatte 200 mit Schraubbolzen 208 befestigt, die durch entsprechende lecher in den Grundplatten 206 des Klemmmechanismus hindurchgehen und in entsprechende Gewindelöcher in der Grundplatte 200 eingeschraubt sind. Umgekehrt können die Schraubbolzen auch in der Grundplatte 200 vorgesehen sein. Die Löcher in den Grundplatten 206 be- % sitzen leichtes Übermaß, so daß der Klemrnecuäniäfnüs etwas | justiert werden kann. |

Eine flache Platte 210 ist auf der Oberseite der Grundplatte 200 befestigt. Bei der beschriebenen Ausführungsform besteht diese Platte 210 aus Aluminium. Sie besitzt vorzugsweise die gleiche Größe wie die Platte 134 von Fig. 2. Das seitliche Stutzteil 135 kann am unteren Ende der hinteren Platte 12 angebracht werden, um so einen Anschlag zu erzielen, der an der Vorderkante der Platte 210 anliegt. In der in den Fig. 11 und 12 dargestellten Füllposition liegt die hintere Platte 12 auf der Platte 210 auf. Dabei ist wichtig, daß die obere Fläche der Platte 210, wie im folgenden begründet wird, flach und waagrecht ist.

Der Klemmechanismus 202 umfaßt ein linkes und ein rechtes Tragteil 214, die am Füllverteiler 204 mit Schrauben 216 oder anderen geeigneten Befestigungsmitteln befestigt sind. Die Tragteile 214 un<i der Füllverteiler 204 können, wie aus Fig. 13 ersichtlich ist, weggeklappt werden, urn das Einsetzen der Gelkassette und ihre Positionierung '-gemäß Fig. 12 zu ermöglichen. Im Anschluß daran wird der \ Füllverteiler 204 zurückgeklappt und gegen das Ende der \ Gelkassette bewegt und daran angedrückt; die Fixierung und | Verriegelung erfolgt mit den Sperrhebeln 217. Die Dirnen- \ sionierung des Klemmechanismus 202, der den Füllverteiler \

204 trägt, ist so ausgelegt, daß eine ausreichende Kraft über den Klemmechanismus 202 und den Füllverteiler 204 auf die Elektrophoresekassette ausgeübt werden kann, um eine geldichte Abdichtung zwischen dem Abdichtstreifen 205 imüllverteiler 204 und dem unteren Ende der vorderen und 4er hinteren Platte der Elektrophoresekassette sicherzustellen. Dabei sollte zur Vermeidung einer Deformation der lassette und insbesondere der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12 nur die notwendige Kraft ausgeübt

|)er Füllverteiler 204 weist eine weite Öffnung 218 an der Von der Elektrophoresekassette abliegenden Seite auf. tiese Öffnung 218 ist so ausgebildet, daß eine Einspritzvorrichtung zum Einspritzen von Gel zwischen die beiden flatten der Elektrophoresekassette dicht eingesetzt werden kann. Bei der vorliegenden bevorzugten Ausführungsform fctellt die Einspritzvorrichtung eine Injektionsspritze iar, die in die Öffnung 218 eingesetzt und darin befestigt Verden kann. Durch den eingesetzten Abdichtstreifen 205 (vgl. Fig. 14) geht ein kleines Loch 220 hindurch, das mit feinem entsprechenden Loch im Füllverteiler 204 fluchtet. t>as mit der Spritze oder einer anderen Einspritzvorrichtung eingespritze Gelmedium fließt durch das Loch 220 und in die Öffnung 19 zwischen der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12. Die Oberfläche des Abdichtstreifens £05 im Füllverteiler 204, die zur Elektrophoresekassette hin liegt, sollte mit Ausnahme einer Vertiefung 222 flach fcein, die sich über die Breite der Elektrophoresekassette erstrecken kann, um das Füllen der Pufferzonen 68 der Kassette zu erleichtern.

Der Abdichtstreifen 205 des Füllverteilers 204 sollte genügend Steifheit besitzen, um zu gewährleisten, daß ein sicherer Kontakt zwischen dem Abdichtstreifen und dem unteren Rand der Elektrophoresekassette über ihre ganze Länge gewährleistet ist, jedoch gleichzeitig elastisch

genug sein, um eine Abdichtung zu erzielen, aufgrund deren kein &Pgr;'-&idiagr; rr^^ial ^d>r Luft hindurchdringen kann. Tn der vorliegenden Ausführungsform besteht der Abdichtstreifen 205 aus Silikonkautschuk. Ein positiver Befestigungsmecha-· nismus zwischen der Einspritzvorrichtung und dem Füllverteiler 204 ist dabei besonders günstig. Gemäß der bevortugten Ausführungsform, bei der eine herkömmliche Injektionsspritze zum Einspritzen des Gelmediums dient, ist am tnde der Öffnung 218 ein Luer-Anschluß vorgesehen, in den der entsprechende Anschluß der Spritze hineinpaßt.

Die Verwendung r'ieser Vorrichtung zum Füllen von Elektrophoresekassetten mit Gel bringt gegenüber dem Stand der Technil' zahlreiche Vorteile mit sich. Zunächst ist es damit leichter, eine glattere Unterseite des Gels zu erzielen und aufrechtzuerhalten als beim Füllen einer Kassette von oben unter Verschließen des Kassettenbodens mit einem Verschlußband, wie dies herkömmlicherweise durchgeführt wird. Ferner kann die Bedienungsperson das Füllen der Kassette mit Gelmaterial beim Einspritzen sorgfältig überwachen. Luftblasen, Staubpartikel und andere Ursachen für Störungen im Gel können dabei beobachtet werden. Wenn solche Störungen eintreten, kann das GeI-fnaterial durch Zurückziehen des Kolbens in die Spritze Zurückgezogen werden, worauf der gestörte Bereich neu gefüllt werden kann. Dies ist besonders günstig bei der Bildung von Luftblasen, da diese sehr leicht entfernt werden könne' venn der entsprechende Bereich nochmals gefüllt wird.

darüber hinaus liefert das oben erläuterte Verfahren, das fcich insbesondere mit der beschriebenen Vorrichtung durchführen läßt, eine Gelschicht 18 zwischen der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12, deren DicK- --■■■■ eblich gleichmäßiger ist, als dies bei den meisten herkömmlichen Methoden der Fall ist. Typischerweise werden herkömmliche Gelelektrophoresekassetten des oben erläuter-

ten Typs nach Abdichten des Bodens der zusammengebauten Elektrophoresekassette durch Eingießen des Gelmaterials von oben befüllt, wobei sich die Kassette in einer senkrechten oder nahezu senkrechten Position befindet. Bei dieser Verfahrensweise besteht ein erheblich größeres Risiko des Einbringens von Luftblasen und Staubpartikeln in die Gelschicht. Wenn derartige Störungen beim Eingießen des Gels festgestellt werden, muß das Gelmaterial durch Umkippen der gesamten Elektrophoresekassette bewegt
werden, bis die Störung entfernt ist. Im Gegensatz dazu können erfindungsgemäß derartige Störungen der Gelschicht 18 in den meisten Fällen durch teilweises oder vollständiges Zurücksaugen der Gelflüssigkeit in die Füllspritze und Wiedereinspritzen des Gels eliminiert werden.

Das herkömmliche Verfahren zum Füllen senkrechter Elektrophoresekassetten führt ferner zu einer leichten Ausbeulung der vorderen Platte 10 und der hinteren Platte 12 nach außen aufgrund des von der Masse des Gelmaterials herrührenden hydrostatischen Drucks. Dieser Effekt ist am Boden der Gelkassette stärker, wo der hydrostatische Druck am größten ist. Bei Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens gemäß der Erfindung wirkt kein derartiger hydrostatischer Druck auf die Platten ein, da die Kassette in waagrechter Stellung gefüllt wird, wobei im wesentlichen die gesamte RUckflache der hinteren Platte 12 von der aus Aluminium bestehenden Platte 210 abgestützt wird.

Aus der obigen Erläuterung folgt, daß im wesentlichen keine Biegekräfte auf die hintere Platte 12 einwirken. Die einzigen auf die hintere Platte 12 während des Befüllens der Elektrophoresekassette wirkenden Kräfte sind Druckkräfte aufgrund der Gewichtskraft des Gels der Gelschicht 18, welche die hintere Glasplatte 12 zwischen· der Gelschicht 18 und der Platte 210 gewissermaßen unter Druck :;etzen. Piese Kräfte führen zu keiner merklichen Deformation der hinferen Platte 12.

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Da die Gelschicht 18 nach dem Befüllen der Elektrophoresekassette vom flüssigen in einen festen Zustand übergeht, wirkt nur ein geringer oder kein hydrostatischer Druck auf die vordere Platte 10 und die hintere Platte 12 durch das verfestigte Gelmaterial ein, wenn die Elektrophoresekassette dann in vertikale Position gebracht wird. Deshalb kann die hintere Platte 12 extrem dünn gemacht werden, sogar dünner als die vordere Platte 10, die dick ge-nug sein muß, um ihre eigene Masse zu tragen, ohne sich während der Fülloperation zu verbiegen. Eine dünnere hintere Platte 12 führt zu einer entsprechend kleineren Trennschicht zwischen den radioaktiv markierten Molekülen und den Detektoren 110. Dies führt zu einem größeren Erfassungswinkel der von den radioaktiv markierten Molekülen emittierten Strahlung und damit zu einer deutlichen Erhöhung der Empfindlichkeit der Detektoren 110. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist bei einer Kassette mit den Abmessungen von größenordnungsmäßig etwa 200 &khgr; 300 mm die vordere Platte 4,5 mm dick, während die Dicke der hinteren Platte 12 1,6 mm beträgt; dabei verbiegt sich die 4,8 mm dicke vordere Platte 10 unter der Einwirkung der Schwerkraft nur in einem völlig vernachlässigbaren Maße. Die 1,6 mm dicke hintere Platte 12 würde sich unter dem hydrostatischen Druck, wie er beim herkömmlichen Füllverfahren beim Befüllen der Kassette in senkrechter Stellung auftritt, um etwa 0,025 mm nach außen biegen.

In Fig. 14 ist die Stirnfläche des Füllverteilers 204 mit dem Abdichtstreifen 205 dargestellt, die zur Elektrophoresekassette hin liegen. Die große öffnung 218, in die
eine Füllvorrichtung eingesetzt werden kann, befindet sich am Boden des FUllverteilers 204 und ist entsprechend in j Fig. 14nicht dargestellt. Die Spritze dichtet gegen die Rückseite des aus Kautschuk bestehenden Abdichtstreifens, so daß ihre Mündung direkt mit der kleinen Öffnung 220 im Abdichtstreifen 205 verbunden ist, die sich in die läng-

liehe Vertiefung 222 öffnet. Die Enden der Vertiefung 222 sind mit entsprechenden Seitenwänden verschlossen, die einstückig zusammen mit dem Abdichtstreifen 205 ausgeformt sind. Die Vertiefung 222 sollte sich über etwa den hai Jen Abstand zwischen den doppelten Monofilament-Abstandshaltern auf jeder Seite der Kassette erstrecken. Es erwies sich, daß die Vertiefung 222 ein besseres Einströmen des Gelmaterials erlaubt, was zu einer gleichmäßigeren Bodenfläche der Gelschicht führt, wobei hinzukommt, daß das Füllen der Pufferzonon 68 zwischen den Monofilament-Abstandshaltern erleichtert wird. Bei der vorliegenden bevorzugten Ausführungsform beträgt die Breite der Vertiefung 222 etwa 1,56 mm, also etwa das Sechsfache des Plattenabstands.

Beim Zusammenbau und Befüllen einer Elektrophoresekassette gemäß der Erfindung sollten folgende Scnritte durchgeführt werden. Zunrchst sollten die vordere und die hintere Platte gereinigt und gründlich silanisiert werden. Das Monofilamentmaterial für die Abstandshalter wird anschließend gereinigt und in der beschriebenen Weise an der vorderen Platte 10 angebracht und befestigt. Danach wird die Bodenplattenanordnung mit dem daran befestigten. Reservoir auf der Füllvorrichtung positioniert, wobei sie auf der aus Aluminium bestehenden Platte 210 aufliegt und entsprechend ausgerichtet wird. Im Anschluß daran sollte Staub von der oberen Platte und der Bodenplatte entfernt werden, worauf die obere Platte unmittelbar mit der Bodenplatte zusammengebaut werden sollte, wobei sich der untere Rand
der oberen Platte etwas über den unteren Rand der unteren (hinteren) Platte erstreckt. Die Seitenklammern 48 werden dann eingesetzt, ohne die zur Verriegelung dienenden Stäbe anzuziehen bzw. zu verdrehen.

Anschließend wird der am Boden der Elektrophoresekassette liegende Füllverteiler 204 gegen die hintere Platte 12 bewegt und mit dem Sperrhebel 217 in dieser Position ver-

riegelt. Erforderlichenfalls kann eine kleine Menge Fett auf die Vorderfläche des Füllverteilers 204 aufgebracht werden, um eine noch sicherere Abdichtung zu erzielen. Diese Maßnahme ist typischerweise nur längs der Außenkanten der Abdichtung erforderlich. Die vordere Platte 10 wird dann langsam nach unten bewegt, bis sie den Abdichtstreifen 205 des Füllverteilers 204, der zur entsprechenden Abdichtung vorgesehen ist, gerade berührt; danach werden die Verriegelungsstäbe der Seitenklammer.&igr; 48 in die Verriegelungsstellung gedreht.

Danach wird eine Spritze mit dem flüssigen Gel gefüllt, wobei sorgfältig sämtliche Luftblasen aus der Spritze entfernt werden. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird eine 30-ml-Spritze verwendet. Die Spritze wird dann in die entsprechend ausgebildete Öffnung 218 im Füllverfeiler 204 eingesetzt. Anschließend wird der Kolben der Spritze zum Befüllen der Elektrophoresekassette langsam vorgeschoben, bis das flüssige Gel am oberen Ende der Kassette überfließt. Das Gelmaterial besitzt, obgleich es flüssig ist, ausreichende Grenzflächenspannung, um den gesamten Raum zwischen der vorderen und der hinteren Platte ohne Hohlräume zu füllen, wenn der Soritzenkolben vorwärts geschoben wird. Nach vollständiger Füllung der Elektrophoresekassette wird ein Kamm mit der erwünschten Anordnung der Vertiefungen in das obere Ende des Gels eingesetzt. Erforderlichenfalls wird der Kolben der Spritze weiter vorgeschoben, bis die Kanäle an beiden Seiten der Elektrophoresekassette zwischen den Monofilament-Abstandshaltern vollständig gefüllt sind. Nach vollständiger Füllung der Elektrophoresekassette wird der Füllverteiler 204 wegpeklappt, so daß kein Druck mehr auf die Platten ausgeübt wird. Das Gel wird dann verfestigen gelassen, bevor die Elektrophoresekassette aus der Füllvorrichtung entnommen wird, und insbesondere, bevor die Kassette aus :hrer horizontalen Position bewegt wird.

D" ⁿ Konzeption der erf: ndungsgemäßeri Elektrophoresevorrichtung einschließlich der Zusatzeinrichtungen erlaubt die Erzielung von Gelschichten, mit denen eine automatische Gelelektrophor"se unter optimalen Betriebsbedingungen möglich ist, wie sie im Stand der Technik bisher nicht erreicht werden konnten. Die damit verbundenen zahlreichen Vorteile sind oben erläutert.

Claims (23)

Ansprüche

1. Elektrophcvesevorrichtung mit
- einer Elektrophoresekassette mit

- einer flachen vorderen Platte (10) und einer flachen hinteren Platte (12), die jeweils im wesentlichen zueinander parallele Seiten aufweisen und au_^: einem elektrisch isolierenden Material bestehen,

- zwei seitlichen Abstandshaltern, die längs der beiden Seitenkanten der Platten (10, 12) zwischen ihnen vorgesehen sind und die Platten (10, 12) unter Druck durch eine Klemmvorrichtung seitlich gegeneinander abdichten und in einem vorgegebenen Abstand voneinander halten, wobei die Seiten, unteren Enden und oberen Enden der Platten (10, 12) den Seiten, dem unteren Ende bzw. dem oberen Ende der Elektrophoresekassette entsprechen und der zwischen den Platten (10, 12) vorliegende Raum zur Füllung mit einem Gel unter Ausbildung einer Gelschicht (18) vorgesehen ist,

- einem am oberen Ende der im Betrieb senkrecht stehenden Elektrophoresekassette vorgesehenen oberen Reservoir (20) für eine Elektrolytlösung, die mit dem oberen Ende der Gelschicht (18) in elektrischem Kontakt steht, und

- einem am unteren Ende der Elektrophoresekassette vorgesehenen unteren Reservoir (30) für eine zweite Elektrolytlösung, die mit dem unteren Ende der Gelschicht (18) in elektrischem Kontakt steht,

- einer Einrichtung (34) zum Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen dem Elektrolyten im oberen Reservoir (210) und dem zweiten Elektrolyten im unteren Reservoir (30)

sowie

- einer Detektoreinrichtung (110),
dadurch gekennzeichnet, daß

- die seitlichen Abstandshalter (40) so ausgebildet sind, daß sie einen Linienkontakt mit den daran anliegenden Platten (10, 12) längs deren Seiten ergeben,
und

- die Klemmvorrichtung (48) sich längs der Seiten der Platten (10, 12) erstreckt (Fig. 1, 3, 4A, 6, 7).

2. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die seitlichen Abstandshalter (40) aus Monofilen mit dem angestrebten Plattenabstand etwa entsprechendem Durchmesser und mit im wesentlichen über ihre Länge konstantem Querschnitt bestehen und im wesentlichen parallel zu den Seitenkanten der Platten (10, 12) angeordnet sind.

3. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß auf jeder Seite der Platten (10, 12) zwei voneinander beanstandete Abstandshalter (40a, 40b) aus Monofilen mit im wesentlichen rundem

Querschnitt vorgesehen sind, die im wesentlichen parallel zueinander und zu den Seitenkanten der Platten (10, 12) angeordnet sind, wobei auF jeder der beiden Seiten zwischen dem äußeren Abstandshalter (40a) und dem inneren Abstandshalter (40b) eine Pufferzone (68) vorliegt, die mit dem Gel der Gelschicht (18) gefüllt ist (Fig. 1 , 3, 4A, 6 , 7) .

4. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Morofile (40; 40a, 40b) aus Polyamid.

5. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch Platten (10, 12) aus Glas.

6. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die innenliegende Unterkante mindestens einer der Platten (10, 12) eine Abschrägung (42, 44) aufweist, die im Querschnitt eine sich nach außen bzw. unten erweiternde, trichterförmige Erweiterung (46) bildet und ebenfalls mit dem Gel der Gelschicht (18) füllbar ist (Fig. 2).

7. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine Elektrophoresekassette mit einer Klemmvorrichtung mit einer auf jeder Seite der Platten (10, 12) vorgesehenen Seitenklammer (48), die so ausgebildet ist, daß sie einen im wesentlichen kontinuierlichen und konstanten Druck längs der Länge des Linienkontakts der Abstandshalter (40; 40a, 40b) auszuüben erlaubt (Fig. 7).

8. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Klemmvorrichtung aus jeweils einer auf jeder Seite der Elektrophoresekassette

vorgesehenen und sich über deren ganze Länge | erstreckenden Seitenklammer (48) besteht, die aufweist:

- Ein Tragteil (50) mit U-förmigem Querschnittsprofil, das die Platten (10, 12) mit den dazwischen verlaufenden Abstandshaltern (40; 40a, 40b) von außen umgreift und sich über die gesamte Länge der Seitenklammern (48) erstreckt,

- ein Halles Luck (52) aus einem elastischen Material, das zwischen der hinten liegenden Seitenwand (60) des Tragteils (50) und einer der Platten (10, 12) angeordnet ist, auf der Seite, mit der es an der Platte (10, 12) anliegt, eine flache Oberfläche besitzt, sich über die ganze Länge der Seitenklammer (48) erstreckt und eine durch seine ganze Länge durchgehende Öffnung (54) mit einem im Querschnitt ovalartigen Profil mit einer längeren und einer kürzeren Achse aufweist, wobei die längere Achse etwa parallel zur Oberfläche der Platte (10, 12) liegt,

sowie

- einen sich über die ganze Länge der Seitenklammer (48) erstreckenden Spannstab mit dem Querschnittsprofil der Öffnung (54) entsprechendem Querschnittsprofil mit einer längeren und einer kürzeren Achse, der in die durchgehende Öffnung (54) einsteckbar ist, wenn seine längere Achse im Querschnitt etwa parallel zur längeren Achse der Öffnung (54) liegt,

wobei das Tragteil (50) und das Haltestück (52) im Querschnitt so dimensioniert sind, daß die Einheit aus den beiden Platten (10, 12) mit den dazwischen angeordneten Abstandshaltern (40; 40a, 40b) in die Seitenklammer (48) feingeschoben werden kann und bei in die Öffnung (54) feingestecktem und so gedrehtem Spannstab, daß dessen längere Achse im Querschnitt etwa senkrecht auf der länfjeren Achse der Öffnung (54) steht, auf die Seitenbereiche der Platten (10, 12) ein zur Abdichtung
Ausreichender Preßdruck ausübbar ist (Fig. 6, 7).

9. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch ein oberes Reservoir (20) für Elektrolytlösung, das aus einem Rückteil (140) fcesteht, das Rückwand, Boden und Seitenwände (148) des tberen Reservoirs (20) bildet und auf einem auf der Rückseite einer der Platten (10, 12) vorgesehenen und parallel zu ihrer Oberkante verlaufenden erhabenen

pi'öfll UUt^-T tfli'it· IiTi RUcktSil (140) VOTyeSehene

tntsprechende Quernut, die sich in einem elastischen iereich des Rückteils (140) befindet, dichtend so Äufklemmbar ist, daß keine Deformation der Platten (10, 12) eintritt (Fig. 2, .8A).

10. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß

- an der Außenfläche der hinteren Platte (12) längs des oberen Randes und parallel dazu ein Stab (142) angebracht ist, der eine sich über seine Länge erstrekkende Abflachung aufweist, über die er an der Platte (12) befestigt ist,

- das RUckteil (140) an der an der hinteren Platte (12) anliegenden Seite eine eingeformte, dem Profil des Stabes (142) formangepaßte Quernut aufweist, in die der Stab (142) hineinpaßt, auf den das Rückteil (140) dichtend und ohne Deformation der Platten (10, 12) aufklemmbar ist (Fig. 8A).

11. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß oberhalb der Quernut eine etwa parallel dazu verlaufende Dichtlippe (143) vorgesehen ist, die an der Außenseite der entsprechenden Platte (10, 12) dichtend anliegt (Fig. 8a).

12. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Rückteil (14) &bull;us einem elastischen Kautschuk besteht.

13. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß

- auf der Außenseite einer der Platter. (10, 12) mehrere Vertiefungen (122) vorgesehen sind, die sich in die betreffende Platte (10, 12) hinein erstrecken, jedoch nicht durch diese hindurchgehen,

- in den Vertiefungen (122) jeweils ein Kollimator (112) vorgeser.rn ist (Fig. 9A)₁

14. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kollimatoren (112) aus Kovar, Wolfram, Blei, Messing oder Kupfer bestehen.

15. Elektrophoresevorrichtung nach einem Cer Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandshalter (40; 40a, 40b) einen im wesentlichen über ihre Länge konstanten, kreisförmigen oder elliptischet. Querschnitt besitzen.

16. Elektroph^^cesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet durch

- eine im Raum zwischen den Platten (10, 12) angeordnete Gelschicht (18),

- mehrere am oberen Rand der Gelschicht (18) vorgesehene Vertiefungen (36) zur Aufnahme der elektrophoretisch zu trennenden Proben, die zwischen den innerste- etlichen Abstandshaltern (40: 40b) angeordnet sind und sich jeweils bis zu gleicher Tiefe von der Oberfläche der Gelschicht (18) erstrecken,

- jeweils eine zusätzliche seitliche zahnförmigt Vertiefung (98) auf jeder Seite der Gruppe der Vertiefungen (36) zwischen der jeweils seitlich äußersten Vertiefung (36) und dem benachbarten innenliegenden Abstandshalter (40; 40b), wobei sich der Boden der zusätzlichen Vertiefungen (98) bis zum angrenzenden Abstandshalter (40; 40b) erstreckt und die Tiefe der Vertiefungen (98) 50 bis 100 % der Tiefe der Vertiefungen (36) beträgt (Fig. 1, 5).

17. Elektrophoresevorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, gekennzeichnet durch

- eine Platte (134) mit hoher thermischer Leitfähigkeit und mindestens einer flachen Oberfläche

sowie

- eine Vorrichtung zur Anbringung der zusammengefügten Elektrophoresekassette an der Platte (134) in der Weise, daß im wesentlichen die gesamte Außenfläche einer der Platten (10, 12) der Elektrophoresekassette im Kontakt mit der flachen Oberfläche der Platte (134) steht und der untere Rand der Elektrophoresekassette sich in das untere Reservoir (30) erstreckt (Fig. 2).

18. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch mehrere Detektoren (110) zur Erfassung radioaktiver Strahlung, die in der Platte (134) so angeordnet sind, daß sie mit deren flachen Oberfläche fluchten und den Kollimatoren (112) gegenüberliegen.

19. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Platte (134) aus Aluminium besteht.

20. Elektrophoresevorrichtung, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 19, gekennzeichnet durch eine Vorrichtung zum Einbringen von Gel in die am oberen und am unteren Rand offene Elektrophoresekassette, die aufweist:

- eine Grundplatte (200) mit flacher, im wesentlichen waagrechter Oberfläche,

- eine Befestigungseinrichtung zur Halterung der Elektrophoresekassette in der Weise, daß die Außenoberfläche einer der Platten (10, 12) waagrecht auf der flachen Oberfläche der Grundplatte (200) aufliegt, sowie

- eine Einrichtung zum Einspritzen von Gel in die Elektrophoresekassette mit

- einer Einspritzvorrichtung mit einem Austrittsstutzen, die das einzubringende Gel enthält, das durch den Austrittsstutzen hindurch herausdruckbar ist,

- einem Füllverteiler (204), der an die untere Öffnung der Elektrophoresekassette anpreßbar ist und eine Öffnung (218) zur Aufnahme der Einspritzvorrichtung aufweist und das eingespritzte Gel vom Austrittsstutzen der Einspritzvorrichtung zur Bodenöffnung der Elektrophoresekassette weiterleitet,

und

- einem Klemmechanismus (202), mit dem der Füllverteiler (204) in zwei Positionen gebracht und darin gehalten werden kann, wobei der Füllverteiler (204) in der ersten Position mit ausreichender Kraft unter geldichter Abdichtung an das untere Ende der Elektrophoresekassette andrückbar ist und in der zweiten Position so vom unteren Ende der Elektrophoresekassette abklappbar ist, daß diese frei von der Grundplatte (200) abnehmbar bzw. auf diese auflegbar ist (Fig. 11, 12).

21 . Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Einspritzvorrichtung eine Injektionsspritze mit Kolben ist.

22. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichcnet, daß der Füllverteiler (204) einen Abdichtstreifen (205) aus elastischem Material mit flacher Oberfläche aufweist, mit dem der Füllverteiler (204) gegenüber dem unteren Ende der Elektrophoresekassette abdichtbar ist (Fig. 14).

23. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Abdichtstreifen (205) eine Vertiefung (222) in seiner flachen Oberfläche aufweist, die breiter ist als der Abstand der beiden Platten (10, 12) der Elektr-oph-oresekassette und im wesentlichen parallel zur unteren Öffnung der Elektrophoresekassette liegt und danach ausgerichtet ist, wenn sich der Klemmechanismus (202) bzw. der Füllverteiler (204) in der ersten Position befinden (Fig. 14).