DE3620235A1 - System zur bestimmung der groessen von biologischen makromolekuelen - Google Patents

Description

Beschreibung

Deoxyribonukleinsäure (DNA) ist das zellenmäßige Makromolekül, welches für die Übertragung genetischer Information verantwortlich ist und es besteht aus vier Nukleotiden, Adenosin (A), Thymin (T), Cytidin (C) und Guanosin (G). Die Geschichte der Technologie zur Bestimmung der Sequenz von DNA begann 1970 mit der Entdeckung der Einschränkungsenzyme, die doppelsträngige DNA an be-HQ stimmten Sequenzen schnitten (1,2).

Die DNA-Sequenzbestimmung erfordert ein Verfahren zur Definition von Nukleotidpaaren an jeder Position längs der Doppelhelix. Da sich jedes Nukleotid für experimenteile Zwecke mit seinem Watson-Crick-Komplement in dem entgegengesetzten Duplexstrang komplementiert, erfordert das analytische Problem die Definition der Sequenz der Nukleotide A.T.G. und C längs eines (oder beider) Stränge der Doppelhelix. Ein zweiter Durchbruch war die Entwicklung der "Leiter"-Methode zur Bestimmung der DNA-Sequenz unter Verwendung von enzymatischen (3) oder chemischen (4) Verfahren.

Die beiden hauptsächlichen schnellen DNA-Sequenzbestirnmungsverfahren beruhen auf dünnen denaturierenden Polyacrylamid- Plattengele zur Fraktionierung einzelstrangiger DNA-Reaktionsprodukte. (5). Diese Verfahren haben viele Merkmale gemeinsam wie sich aus folgendem ergibt:

1. Sie basieren auf der Schaffung von Sammlungen aus strahlungsgekennzeichneten DNA-Fragmenten, die sich zufällig von einem Ende, festgelegt an einer speziellen Stelle aus zu einer der vier möglichen Basen in der DNA-Kette erstrecken.

2. Eine ähnliche Sammlung von Fragmenten wird im wesent-

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lichen für jede der vier Basen als ein Kettenende geschaffen .

3. Die Fragmente sind durch Hochauflösungsgelelektrophorese größenfraktioniert, und zwar unter Verwendung eines Hochspannungsfeldes als Antriebskraft.

4. Nach der Auflösung wird das Gel mehrere Stunden einem Röntgenfilm ausgesetzt, und sodann kann die DNA-Sequenz direkt aus der Selbst- oder Autoradiographie dieser Fragmente abgelesen werden. (6, 7, 8).

Die Gelelektrophorese ist eines der am häufigsten angewandten analytischen Verfahren in der Molekularbiologie und Genetik. Dieses Verfahren trennt körperlich Moleküle entsprechend den unterschiedlichen Geschwindigkeiten, mit der sie unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes dazu gezwungen werden, ein Gel hinabzulaufen. Typischerweise benötigt die Trennung mehrere Stunden und das Gel wird sodann entfernt und hinsichtlich der Stelle unterschiedlicher Molekulargruppen an der Oberfläche des Gels analysiert. Obwohl viele Markierungsmittel verwendet werden können, um die Molekulargruppen zu kennzeichnen, so haben sich doch Strahlungsisotopkennzeichnungen und Fluoreszenzkennzeichnungen als die üblichsten Kennzeichnungsmxttel oder Tracer erwiesen.

Die Gelelektrophorese in Polyacrylamid oder Agarosegelen wird insbesondere für die Trennung von DNA (Deoxyribonukleinsäure), RNA (Ribonukleinsäure) und Proteinen in ein (9-14) und zwei (15,16) dimensionalen Formaten verwendet. Mehrere Arten von Radiomarkierungen werden verwendet, aber am üblichsten sind Phosphor 32 (P32) und Schwefel 35 (S35), die beide Beta-Strahlen emittieren (11,17).

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Bei Anwendung einer Vorspannung von 5 bis 45 Volt/cm entlang der Länge des Gels werden die Moleküle das Gel hinunter durch die Wirkung des elektrischen Feldes auf ihre Ionenladung angetrieben. Ihre Geschwindigkeit ist eine umgekehrte Funktion des Molekulargewichts, was oftmals wie folgt ausgedrückt wird:

R = k/(log Mr)

dabei ist R = die Laufgeschwindigkeit bei einem elektrisehen Standardfeld;

k = die Verzögerungskonstante, die mit der GeI-

polymerkonzentration in Beziehung steht; Mr = das Molekulargewicht (11, 18, 1C, 20).

Demgemäß trennen sich über eine Zeitperiode hinweg die Moleküle entsprechend ihrem Gewicht, wobei kleinere Fragmente den Boden des Gels schneller erreichen.

Obwohl Proteine dieser logarithmischen Funktion gut entsprechen, ist nicht völlig klar, daß DNA und RNA unterschiedliches Verhalten zeigen, insofern als die Laufzeit über einen ziemlich großen Bereich der Molekulargewichte sich als umgekehrt proportional zum Molekulargewicht herausgestellt hat. Diese direkte Beziehung der Wanderungsgeschwindigkeit zum Molekulargewicht (nicht log Mr) wurde zum ersten Mal von Southern beobachtet (21, 22). Im interessierenden Größenbereich der DNA oder RNA-Sequenzexi -bewegen sich kleinere Fragmente von weniger als 50 b.p. langsamer als diese Beziehung und zeigen eine Banddiffusion am Boden des Gels. In der Schlüsseldekade 50 bis 500 b.p. ist die Wanderungsgeschwindigkeit eng proportional zur Inversion des Molekulargewichts.

Jeder Kanal in dem sequenzierenden Gel enthält ein Band, das einer bestimmten Basis,angeordnet an einer bestimmten Position in der DNA-Sequenz entspricht. In der Realität

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reflektiert die Position des Bandes in Abstand zwischen einem festen Punkt in der DNA-Sequenz (dem 5¹ oder 3¹ Ende eines Einschränkungs- oder Restriktionsfragments) und einer bestimmten Basis in dieser Sequenz. Da die Auflösungskraft des Gels die Fragmente, die sich in ihrer Länge um nur einen Nukleotid unterscheiden, in die Lage versetzt, deutlich voneinander aufgelöst zu werden, so ist es möglich, die Sequenz des nächstlängsten Fragments zu lesen. Die Entwicklung sehr dünner (0,1 bis 0,4 mm) Harnstoff enthaltender Polyacrylamidgele hat die räumliche Auflösung in Autoradiogrammen derartiger Hochauflösungstrennungen verbessert.

Um eine hinreichende Länge der Sequenz oder Folge aus einem Experiment zu bestimmen, ist es üblich, Aliquots ίaliquote Anteile) aus einer Reaktion auf zwei oder mehr Gelläufe für verschiedene Zeiten zu laden. Die Gelstärke wird ebenfalls verändert, da der niedrigere Acrylamidgehalt größere Fragmente dazu in die Lage versetzt, schnel-

2Q ler das Gel hinab zu wandern und in weniger Zeit räumlich aufgelöst zu werden. Es wäre vorteilhaft, in der Lage zu sein, mehr Sequenzdaten aus jedem Gel zu erhalten, weil dies entweder den Erhalt von mehr Gesamtsequenz oder weniger Gelläufe pro Reaktion gestatten würde. Eine der Hauptgrenzen hinsichtlich der Länge der Sequenz,erhältlich durch eine Autoradiographie ist die fortlaufend schlechter werdende Trennung der Bänder entsprechend den längeren DNA-Molekülen. Am gleichen Gel wird der Abstand zwischen den kürzeren DNA-Fragmenten breiter als dies für die korrekte Interpretation der Sequenzmuster erforderlich ist. Ein Puffergradientenverfahren wurde entwickelt, welches fortlaufend den elektrischen Widerstand pro Einheitslänge in dem niedrigeren Gel absenkt. Da der Strom durch das Gel hindurch konstant ist, nimmt gemäß dem Ohm¹ sehen Gesetz der Spannungsabfall pro Einheitslänge auch zur Anode (Boden) hin ab. Da die Spannungspotentialdifferenz am Gel

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die Polynukleotidwanderung antreibt, wird der Abstand zwischen kleineren Fragmenten reduziert. Dadurch, daß man das Gel für eine längere Zeit laufen läßt oder dadurch daß man die Länge des Gels erhöht, wird die räumliehe Auflösung der längeren Fragmente erhöht (23, 24) .

Die Partialseguenzen werden aus der Familie der Gelläufe für das ausgewählte DNA-Fragment ausgelesen, aufgezeichnet und verglichen, um die gesamte Sequenz zu rekonstruieren. Zwei Quellen für triviale Fehler sind mit dieser Stufe assoziiert: Der eine betrifft die nicht sorgfältige Ablesung des Gels (beispielsweise Verwechseln der Kanäle oder Überspringen eines Bandes). Der andere Fehler umfaßt diejenigen Fehler, die dann eingeführt werden, wenn die Daten manuell aufgezeichnet werden. Fehler infolge manueller Aufzeichnung des Rontgenstrahlfilms, der dem Gel ausgesetzt wurde, wurden dadurch vermindert, daß man automatisch die Daten direkt von der Original-Autoradiographie in einem Computer eingibt. Ein digitalisiertes Tablett gestattet das direkte Einlesen der Sequenz in einem Computerspeicher. Dieses Tablett arbeitet dadurch, daß man die Stelle jedes Punktes auf der Oberfläche des Bereichs sendet, sobald dieser Punkt durch den Signalstift berührt ist. Die Stelle wird in der Form eines digitalisierten Satzes von X- und Y-Koordinaten repräsentiert. Durch Wiederholung des Leseverfahrens können die Ablesungen verglichen werden und Diskrepanzen können durch einen interaktiven Computer hervorgehoben werden, was eine Dateneingabeüberprüfunmg der entsprechenden Zone des Gels gestattet.

Nachdem die primären Geldaten gelesen sind, besteht der nächste Schritt darin, diese kurzen Segmente zu ordnen, um überlappende Strecken gemeinsamer Nukleotide zu finden und schließlich diese miteinander in einem langen Sequenzblock zu verbinden, der die primäre Struktur des Originalmoleküls

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repräsentiert. Verschiedene Computerprograirune wurden zur Unterstützung dieses Verfahrens geschrieben. Diese Programme sehen im wesentlichen drei Funktionen vor. Die erste Funktion besteht darin, jedes Teil der Sequenzdaten in ein Hauptarchiv (master archive) zu leiten, welches für die weitere Bezugnahme verwendet werden kann. Die zweite Funktion gestattet die Identifizierung derjenigen Blöcke der Sequenz, die homologe oder komplementäre Strecken enthalten - die Überlappungen. Die dritte Funktion besteht darin, irgendwelche zwei Stränge der Nukleotide zu verschmelzen, die überlappende Sequenzen enthalten. Wenn an einem Punkt Diskrepanzen auftreten, so werden diakritische Markierungen über dem betreffenden Nukleotid angebracht. Dies dient zur Identifizierung derjenigen Teile in einer Sequenz, wo entweder neue Daten benötigt werden oder irgendeine erneute Auswertung der alten Daten erforderlich ist. Während das Sequenzierprojekt sich fortsetzt, werden die ursprünglichen Stränge von kurzen Sequenzen allmählich in längere und längere Blöcke verschmolzen, bis die Rekonstruktion des ursprünglichen Makromoleküls erreicht ist.

Λ Aus der vorstehenden Beschreibung kann man erkennen, daß sowohl die Effizienz wie auch die technische Effektivität der DNA-Sequenzierung verbessert werden könnte, durch die Fähigkeit längere Gels zu lesen. Neben der Verwendung ultra-dünner Gels und der Gradientenpuffermethode erhöht die Verwendung von S35 als Strahlungskennzeichnung (Radiomarkierung) die Schärfe der autoradiographischen Bänder, aber auf Kosten einer längeren Belichtungszeit. Obwohl sowohl S35 wie auch P32 Beta-Teilchenemitter sind,so ist doch die Spitzenstärke von S35 nur ein Zehntel derjenigen von P32. Wenn das Gel dem Röntgenstrahlenfilm über Nacht durch direkte Berührung ausgesetzt wird, so wird vielweniger des Films durch die Winkelemission der Beta-Teilchen von dem Gel mit S35 belichtet, als dies für das stärkere P32 gilt, was eine di-

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mensionsmäßige Erweiterung des Bandbildes auf dem Röntgenstrahlfilm hervorruft. Die Eliminierung dieses Diffusionsmusters durch Verwendung von S35 vermindert die Bildgröße des Bandes und erhöht die räumliche Auflösung benachbarter Bänder, auf welche Weise die Länge der lesbaren Sequenz erhöht wird (9). Alle diese Verfahren erfordern eine Verzögerung beim Lesen der Daten, ein manuelles Interface beim Lesen der Daten und relativ kurze DNA-Fragmente zur Analyse, verglichen mit der DNA-Sequenz, die für einen typischen Forscher interessant ist.

Das Bandmuster kann durch Feststellung ihrer relativen Positionen gelesen werden oder unter Zuhilfenahme eines Digitalisierungssystems, welches von mehreren Gesellschaften verfügbar ist, beispielsweise DNASTAR, Madison, Wisconsin, USA; IntelliGenetics, PaIo Alto, CaI. USA. Tykva hat kürzlich mit einem ".off-line"-Verfahren der Abtastung von Gels experimentiert unter Verwendung eines Siliciumoberflächensperrendetektors (25, 26, 27). Diese Detektoren waren für Phosphor 32 nicht geeignet und wurden nicht in einem System mit irgendwelchen "on-line"-Fähigkeiten benutzt. In einem späteren Überblick einschließlich der Arbeit von Tykva wurde das Potential der Verwendung von Halbleiterdetektoren mit eingeschlossen, aber ohne eine mögliche Methodologie zur Verwendung in einem "on-line"-System (28).

Zusammenfassung der Erfindung. Die Erfindung hat sich zum Ziel gesetzt, eine verbesserte Vorrichtung und ein verbessertes Verfahren anzugeben ,und zwar zur Bestimmung der Nukleotidsequenz in Nukleinsäuremolekülen. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine verbesserte Vorrichtung und ein verbessertes Verfahren anzugeben, für die Gelelektrophorese für die Sequenzierung von DNA, RNA und Proteinmolekülen. Ferner hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung anzugeben, für die Gelelektrophorese zum Sequenzieren von Nukleinsäuremolekülen mit einer hohen

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Geschwindigkeit, wobei sich präzis definiertere Resultate ergeben. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung und ein Verfahren vorzusehen für das Sequenzieren von längeren Sequenzen von DNA und RNA mit einer verminderten Mühewaltung durch den Benutzer. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein verbessertes Gelelektrophoresissystem und ein ebensolches Verfahren anzugeben, wo die von den Strahlungskennzeichen an den Nukleinsäuremolekülen emittierten Strahlungsquanten gelesen und in elektrische Signale umgewandelt werden für die weitere Umwandlung in eine verständliche Ausgangsgröße. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung der vorstehenden Bauart anzugeben, die effizient und effektiv im Gebrauch ist, wirtschaftlich in der Herstellung und im Betrieb und schließlich von einfacher Bauart und zuverlässiger Leistungsfähigkeit ist. Weitere Ziele ergeben sich aus der Beschreibung sowie den Ansprüchen.

Die oben genannten Ziele werden gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung mittels eines Systems erreicht, welche eine rohrförmige Elektrophoresegelzelle aufweist, einen Detektor für die "on-line"-Messung der ii radioaktiven Beta-Emissionen von radiomarkierten ten Molekular fr agnen-cen wobei Temperaturgleichförmigkeit über die Mehrfachgelbahnen vorgesehen wird und elektronische und Computermodule vorhanden sind, um die Detektorsignale zu verarbeiten und eine verständliche Ausgangsgröße zu erzeugen, die nicht die manuelle Interpretation von Gelbandpositionen erfordert.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:

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Fig. 1 ein schematisches Diagramm des erfindungsgemäßen Systems, wobei ein Stangengel und ein Detektor mit zugehöriger elektronischer Schaltung in allgemeinen Ausdrücken dargestellt ist;

Fig. 2 und 3 alternative Vorrichtung gemäß dem System der Fig. 1;

Fig. 4 eine Querschnittsseitenansicht einer Elektrophoresezelle gemäß einem Aspekt der Erfindung;

Fig. 5 eine Teilvorderansicht der Zelle gemäß Fig. 4;

Fig. 6 eine perspektivische Ansicht eines Rohrgels und eines Ringdetektors gemäß der Erfindung;

Fig. 7 und 8 perspektivische Ansichten von zwei unterschiedlichen Arten von Ringdetektoren der Fig. 5;

Fig. 9 ein schematisches Diagramm der Feststell- und Ausleseschaltung in einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung im einzelnen beschrieben. Als eine Alternative zu den üblichen autoradiographischen Verfahren, bei denen die relativen Positionen der Makromoleküle durch, die Belichtung eines Röntgenfilms in Berührung mit einem Gel bestimmt werden, bestimmt die Erfindung in ihren bevorzugten Ausbildungsformen die relativen Nukleotidpositionen dadurch, daß die Makromoleküle detektiert werden, während sie einen festen nuklearen Detektor passieren. Die Detektion wird durch Strahlungsdetektoren ausgeführt, die auf die Beta- oder Gamma-Strahlung ansprechen, welche von den radjomnrkiertön Fragmenten emittiert werden.

Die Detektoren sind benachbart zu dem Gel angeordnet, wobei

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ihr Gesichtsfeld derart eingeschränkt ist, daß sie nur die Strahlung detektieren können, die von einem schmalen horizontalen Abschnitt des Gels kommt. Die Ausgangsgrößen der Detektoren sind mit elektronischen Signalkonditionier- und Datenerfassungvorrichtungen verbunden.

Fig. 1 zeigt ein System gemäß der Erfindung ganz allgemein. Dieses System umfaßt eine Elektrophoresezelle 1. Die Zelle 1 umfaßt ein Paar von vertikalen, vorzugsweise aus Glas bestehenden Platten 3 und 5, wobei zwischen diesen ein Polyacrylamid oder Agarosegel 7 angeordnet ist. Die Platten und das Gel erstrecken sich zwischen einem oberen Pufferreservoir 9 und einem unteren Pufferreservoir 11. Eine Leistungsversorgung 13 ist mit einer negativen Elektrode 15 im oberen Reservoir 9 und einer positiven Elektrode 17 im unteren Reservoir 11 verbunden. Ein Strahlungsdetektor 19 ist benachbart zur Platte 5 angeordnet und steht elektrisch an seinem Ausgang mit einem Vorverstärker 21 in Verbindung. Die Ausgangsgröße einer Detektorvorspannungsversorgung 23 ist ebenfalls mit dem Vorverstärker verbunden. Der Ausgang der letztgenannten Vorrichtung steht mit einen Einkanalanalysator 25 in Verbindung, der seinerseits mit einem Zähler 27 in Verbindung steht. Eine voreingestellte oder vorgesetzte Zeitsteuervorrichtung 20 ist mit ihrem Ausgang mit sowohl Zähler 27 als auch mit einem Mehrkanalspeicher 31 verbunden, mit dem auch die Ausgangsgröße vom Zähler 27 verbunden ist. Die Ausgangskanäle des Speichers 31 sind mit einem Drucker 33 bzw. einem Anzeigeüberwachungsgerät 35 verbunden.

obwohl die Wanderungsgeschwindigkeit der Biomoleküle in der Gelelektrophorese durch Spannung und Temperatur beeinflußt werden, so hängt doch die Trennung zwischen Segmenten, die sich in ihrer Gröse um ein Nukleotid (n gegenüber n+1) unterscheiden, nur vom Molekulargewicht ab.

Die Labordaten der Anmelderin bestätigen die Beobachtung

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von Southern, daß die Wanderungsgeschwindigkeit der Segmente umgekehrt direkt proportional zum Molekulargewicht ist.

Ein Ausführungsbeispiel des Systems der Fig. 1 ist in Fig. 2 gezeigt. Dieses System umfaßt eine Elektrophoresezelle 100 mit parallelen, vertikalen Glasplatten 103 und 105, die derart bemessen sind, daß sie dazwischen ein Standard 10 cm langes Gel 107 aus 10 % Acrylamid enthalten. Die Zelle 100 weist ein negativ geladenes oDeres Pufferreservoir 109 und ein positiv geladenes unteres Pufferreservoir 111 auf. Ein Szintillator 119, der speziell ein Natriumjodidkristall ist, ist nahe der Basis des Gels 107 angeordnet. Der Szintillator 119 hat ein Eingangsfenster 120, welches in ein Bleiflächenelement 122 eingeschnitten ist und einen Horizontalsschlitz definiert, der als ein Collimator arbeitet. Eine Photovervielfacherröhre (PMT) 124 detektiert die Lichtausgangsgröße des Szintillators 119 und wird mit einer Hochspannungsversorgung 123 erregt. Die Ausgangsgröße von PMT ist mit einem Vorverstärker 121 verbunden. Der Vorverstärker 121 ist mit einem Einkanalanalysator 125 eines Mehrkanalanalysators (MCA) 126 verbunden. Der MCA 126 weist auch einen Zähler 127 auf, und zwar mit Eingangskanälen, verbunden mit dem Ausgang eines Einkanalanalysators 125 bzw. mit einer voreingestellten Zeitsteuervorrichtung 129. Der Zählerausgang ist mit einem Monitor 135 verbunden, der die akkumulierten Zählerstände anzeigt.

Das System der Fig. 2 wurde in einem Lauf A wie folgt verwendet. Markier- oder Kennzeichnungsmittel aus pBR322 wurden mit dem Einschränkungsenzym Mspl geschnitten, mit radioaktivem Jod 1-125 gekennzeichnet und auf ein Gel in üblicher Weise gegeben. Eine Spannung von 1000 Volt wurde zwischen den Puffertanks 109 und 111 angelegt. Die durch das radioaktive Jod emittierten Gamma-Strahlen lie-

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fen durch die Glasplatte, aber nur die jenigen,die auf einem Niveau mit dem Schlitz 120 in der Bleiabschirmung 122 waren, liefen zum Szintallationsdetektor und gaben einen Anstieg der Ausgangsimpulse vom PMT 124 des Detektors 119. Die Impulse vom Vorverstärker 121 wurden zu einem Einkanalanalysator 125 übertragen, wo einen niedrigen Pegel aufweisende Rauschimpulse ausgeschlossen wurden. Das NichtVorhandensein eines Bandes im Collimatorfenster erschien als ein niedriger Zählerstand oder eine Hintergrundansammlung im Überwacher 135, wohingegen das Vorhandensein eines Bandes als eine hohe Zählerstandsakkumalation erschient. Die gesamten Zählerstände wurden durch den MCA mit 30 Sekunden Intervallen registriert. Am Ende dieser Intervalle wurden die kumulativen durch MCA 126 registrierten Zählerstände abgelesen und von Hand notiert, der Zähler wurde auf Null zurückgesetzt. Es wurden den erwarteten 26 Markierungen entsprechende Spitzen festgestellt, wenn die Zählerstandsablesungen von Hand aufgetragen wurden »

Ein weiteres spezielles Ausführungsbeispiel des Systems gemäß Fig. 1 ist in Fig. 3 gezeigt. Dieses System umfaßt eine Elektrophoresezelle, identifiziert durch das Bezugszeichen 200, und diese umfaßt drei parallele, vertikale Glasplatten 203, 204 und 205. Die Platten 203 und 204 sind durch einen Horizontalspalt von 3 mm getrennt und sie sind mit einer 10 mal Eintausendstelzoll Polyesterschicht 206 ausgekleidet, so daß von den P-32 Isotopkennzeichnungen emittierte Beta-Strahlen durch den Horizontalspalt zwischen den Platten 203 und 204 laufen können. Obere und untere Pufferreservoirs 209 und 211 werden in der zuvor beschriebenen Weise geladen und stehen mit dem Gel 207 in Verbindung. Ein Bleicollimator 222, wie der beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. 2, ist in Verbindung mit einem Cadmiumtellurit-Detektor 219 vorgesehen. Die letztgenannte Vorrichtung kann ein experimentelles "odell

sein, hergestellt von der Firma Radiation Monitoring Devices, Inc. Der Detektor 219 ist mit einem Vorverstärker 221 verbunden, über den er auch mit einer Detektorvorspannungsversorgung 223 in Verbindung steht. Eine geeignete Vorspannungsversorgung ist eine Strahlungsüberwachungsvorrichtung Modell PSP-1. Ein Mehrkanalanalysator (MCA) 226 ist mit einem Vorverstärker 221 verbunden. Diese Einheit arbeitet als ein Mehrkanalimpulshohenanalysator und weist eine ADC-Eingangsgröße 227, verbunden mit dem Vorverstärker 221 auf. Ein Canberra-Modell 40 hat sich als ein effektiver MCA herausgestellt. Der Eingang eines Mehrkanalspeichers 231 ist mit dem ADC 226 verbunden und der Ausgang der Vorrichtung 231 ist mit einem Anzeigemonitor 235 verbunden, der Impulshöhenverteilung darstellt.

Mit dem System der Fig. 3 wurde ein Test durchgeführt, um nachzuweisen, daß mit unterschiedlichen Isotopen, in diesem Falle P-32 und 1-125, markierte Nukleotidfragmente unterschieden werden können. Wenn jede Gruppe oder Band von Makromolekülen durch den Spalt und Collimator liefen, so ging ein Teil der Strahlen hindurch und traf den Detektor. Die Beta-Strahlung von P-32 besteht aus Elektronen, wobei der größte Teil ihrer Energien um 60 0 KeV (maximal 1700 KeV) verteilt ist, wohingegen die 1-125 Gamma-Strahlenenergie scharf nahe 30 KeV verteilt ist. Ein Beta- oder Gamm -strahl gegebener Energie, der auf den empfindlichen Teil des Detektors auftrifft, kann abhängig von der Effizienz des Detektors für die Energie einen Ausgangsimpuls von dem Detektor abgeben. In diesem Falle gab ein Cadmiumtellurid-Detektor 219 unterschiedliche charakteristische Impulshöhen für die Gamma-Strahlen, emittiert durch das Jod und die Beta-Strahlen, emittiert durch den Phosphor ab. Die Verwendung des MCA 226 gestattete dem Benutzer zwischen den vom P-32 gegenüber dem von 1-125 herrührenden Impulse zu unterscheiden. Wie im Lauf A des Systems der Fig. 2 wurde bei diesem Lauf B die Probe

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oben in die Zelle eingegeben, die Spannung für Elektrophorese wurde angelegt und alle 30 Sekunden wurde die Anzahl der Zählerstände,registriert durch den MCA in den vorhergehenden 30 Sekunden, gelesen und notiert. Die Probe bestand aus 14 Oligonukleotiden von 1 bis 14 Basispaaren in Längen mit 1 und 14, und zwar markiert mit P-32, der Rest mit 1-125. Segmente 1 und 14 wurden detektiert und identifiziert als mit P-32 gekennzeichnet; vom Rest wurden 2,3,4,5,8,9,10,11,12 und 13 klar gesehen und als mit 1-125 gekennzeichnet identifiziert. Diese Oligonukleotide ergaben sich aus einer tatsächlichen DMA-Sequenzierung "A+G" des Maxam-Gilbert chemischen Zerfalls.

Die Fig. 4 und 5 zeigen eine bevorzugte Ausbildungsform der Elektrophoresezelle 300 und des Detektors 319. Dieses System wurde in erster Linie zur Verbesserung der Empfindlichkeit und Auflösung gebaut, so daß eine Probe aus Mehrfachfragmenten, gekennzeichnet nur mit P-32, die sich bis zu und über 1000 Basispaare erstreckt, detektiert werden konnte. Die Zelle 300 weist vertikale, parallele, entgegengesetzt liegende Glasplatten 303, 304 und 305 auf. Die Platten 303 und 304 haben eine Schicht oder einen Film 306 von 10 Tausendstelzoll Polyester mit ihrer Innenfläche verbunden und ein Gel 307 ist zwischen der Polyesterschicht 306 und der Platte 305 angeordnet. Die Schicht 306 sieht eine Seitenwandstützung für das Gel 307 vor und gestattet, daß die Beta-Strahlung zum Detektor (der weiter unten diskutiert wird) hindurchdringen kann, und zwar mit einer insignifikanten Strahlungsabsorption von weniger als 20 %. Die Platten 303 und 304 sind mit Abstand angeordnet, wobei dieser Abstand ausreicht, so daß die Platten 303 und 304 dazwischen einen Detektorkristall 310 des Detektors 319 aufnehmen können. Ein Acrylcollimator 322 ist zwischen dem Detektor 319 und dem Flächenelement (Schicht) 306 angeordnet, um die Auflösung des Detektor zu verbessern. Fig. 5 zeigt ein Paar von Abstandeleraenten

308, die Plastikstreifen aufweisen, die vorzugsweise 0,5 mm dick sind und an jeder Seite 2,5 cm breit sind. Ein weiterer Satz von Abstandsstreifen 312 mit der gleichen Dicke, wie die der Abstandselemente 308, sind zwisehen jeder Bahn eines Satzes von Bahnen 314, 316, 318 und 320 der Zelle 3OQ angeordnet, und zwar auf jeder Seite jedes Satzes von Quellen 322. Die Abstandsstreifen 312 erstrecken sich von der Oberseite zur Unterseite des Gels 307. Wenn die Zelle 300 zusammengebaut wird, so wird Druck an die Glasplatten 303, 304 und 305 angelegt, um die Abstandselemente zwischen Platte 305 und Schicht 306 zusammenzudrücken. Die Abstandselemente und 312 dienen sowohl zur Aufrechterhaltung einer genauen und konstanten Geldicke und auch zur Sicherstellung, daß die Spur der Makromoleküle direkt vor dem Detektor 319 vorbeiführt.

Der Vorverstärker 321 verstärkt die Impulse vom Detektor 319 in hinreichender Weise derart, daß sie über feste Zeitperioden hinweg in üblichen elektronischen Zählern gezählt werden können. Solche Zähler können beispielsweise Maßstabszähler (sealer) in Mehrkanalanalysatoren (wie gezeigt) sein oder Zähler in Ortec guad-Zeit/Zähler. Beide Reservoirs sind bezüglich der Menge des Gels 307 groß, um lange Läufe zu ermöglichen, wobei die Integrität von Gel und Puffer aufrechterhalten bleibt. Die Elektrolyte sind durch eine Negativelektrode 315 bzw. durch eine Positivelektrode 317 geladen, die von dem Elektrolyt umgeben sind, in dem sie angeordnet sind. Der Detektor ist mit seinem Vorverstärker durch Koaxialkabel verbunden. Speziell ist der Detektor 319 ein Modell A101/P4 Cadmiumtellurid-Detektor, hergestellt von der Firma Radiation Monitoring Devices, und sein Eingangsfenster ist 2 mm hoch und 10 mm breit.

Es hat sich herausgestellt, daß zwei Arten von Strahlungsdetektoren recht effektiv sind, nämlich Szintillations-

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detektoren und Festkörperdetektoren. Szintillationsdetektoren, wie beispielsweise Detektor 119 in Fig. 2 , wandeln die einfallende Strahlung in Licht um, welches mit einer Photovervielfacherrohre gesammelt wird, die zur Rauschbegrenzung ausgelegt ist. Drei Arten von Szintillationsdetektoren sind Natriumjodidkristall, modifiziert mit Thallium, Calciumfluoridkristall, modifiziert mit Europium und Kunststoff. Die Nal-Bauart wird von der Firma Harshaw Chemical Company und von der Firma Bicron Inc. hergestellt. Dieser Detektor ist für die beiden Isotopen (1-125 und P-32) hochempfindlich und arbeitet ohne Verschlechterung bei 55 ⁰C. Die Nal-Bauart ist jedoch hygroskopisch und muß daher abgedichtet werden. Es ergibt sich somit eine gewisse Dämpfung im Gehäusefenster der Betas mit niedrigerer Energie. Die Nal-Bauart mißt sowohl Beta- wie auch Gamma-Strahlen.

Die CaF-Bauart wird ebenfalls von der Firma Harshaw Chemical Company hergestellt. Diese Bauart ist weniger empfindlich als die Natriumjodidbauart, ist aber gegenüber sämtlichen interessierenden Beta- und Gamma-Strahlen empfindlich. Die CaF-Bauart des Szintillationsdetektors arbeitet ohne Verschlechterung bei 55 ⁰C und ist nicht hygroskopisch. Dieser Detektor erreicht daher ein höheres Ausmaß an Sammel- oder Kollektionseffizienz selbst bei Beta-Strahlen mit niedriger Energie und bei Gamma-Strahlen mit niedriger Energie, und zwar dann, wenn der Detektor nahe dem Gel angeordnet ist, da er keine Feuchtigkeitsabdichtung benötigt.

Eine dritte Ezintillationsdetektorbauart ist die Plastikbauart. Diese Bauart verwendet üblicherweise Anthracen, gemischt in einer Polyvinyltoluolbasis. Diese Bauart ist außerordentlich störunanfällig und, wenn sie dick genug ist, weist sie einen hohen Sammelwirkungsgrad für Betastrahlen auf. Eine Bauart des erwähnten Detektors wird von der Nuclear Enterprises Ltd. in England hergestellt.

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Festkörperdetektoren, wie beispielsweise der Detektor 219 in Fig. 3 wandeln die einfallende Strahlung in Elektronen um und werden als ein Halbleiter zur Sammlung der Elektronen. Zwei Arten von Festkörperdetektoren sind Cadmiumtelluridkristall (CdTe) und die Siliciumoberflächensperrbauart. Die CdTe-Type wird von der Firma Radiation Monitoring Devices und von Dositec Inc. hergestellt. Die CdTe-Type hat eine ausgezeichnete theoretische Empfindlichkeit, insbesondere für Beta-Strahlen niedriger Energie. Sie ist geeignet für die Detektion von eine niedrige Energie aufweisende Gamma-Strahlung, wie sie beispielsweise von 1-125 ermittiert wird.

Die andere Art eines Festkörperdetektors ist die Siliciumoberflächensperrbauart. Für diese Bauart eines Detektors wird eine Goldschicht auf einer Silicium- oder Germaniumbasis angeordnet und bildet eine aktive Zone innerhalb des Halbleiters, die linear auf die Energie eines einfallenden Teilchens anspricht. Diese Detektoren werden deshalb bevorzugt, weil sie eine kompakte Größe besitzen, und weil sie ein schnelles lineares Ansprechen zeigen. Diese Detektorbauart umfaßt eine Scheibe aus hochreinem Silicium, angeordnet in einem Gehäuse mit einer dünnen Schicht aus Gold, abgeschieden auf der Oberseite des Siliciums. Im Betrieb wird eine umgekehrte Vorspannpolarität über die Ausgangsverbindung an den hinteren Kontakt angelegt, um eine Zone eines hohen elektrischen Feldes, die Verarmungszone, in dem Silicium unter der Goldschicht zu erzeugen. Die Eindringtiefe der einfallenden Beta-Strahlen ist typischerweise nur einige wenige Mikrometer und sie verlieren daher ihre gesamte Energie innerhalb der Verarmungszone. Da die Goldschicht dünn ist, tritt der dominante Energieverlust innerhalb des Siliciums auf und die Anzahl der erzeugten geladenen Träger ist proportional zur Energie der Alpha-Teilchen. Die innerhalb der Siliciumverarmungsschicht erzeugten

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Elektronen und Löcher werden durch das elektrische Feld innerhalb der Verarmungsschicht oder -lage weggewischt. Die Bewegung der Träger erzeugt einen Stromimpuls, der als ein schnell ansteigender Spannungsimpuls an dem Ausgangslastwiderstand auftritt. Die Höhe des Spannungsimpulses ist direkt proportional zur Energie des einfallenden Teilchens/Wodurch Impulshohenanalysatoren in die Lage versetzt werden, das Energiespektrum der Teilchen, wie dies zuvor beschrieben wurde, weiter zu verarbeiten und anzuzeigen. Diese Bauart des Detektors kann Gammastrahlen nicht messen.

Die Ausgangsgröße des Mehrkanalanalysators (MCA) 226 kann mit einem Centronics printer verbunden sein. Der MCA wurde in der Mehrfachmaßsstabsbetriebsart betrieben, in der Eingangsimpulse als erstes durch einen Fensterdiskriminator geleitet wurden, eine feste Zeitperiode lang gezählt wurden und sodann in sukzessiven Datenkanälen gespeichert wurde. Durch diese Mittel wird ein Zeithistogramm der Zählerstandsrate oder -geschwindigkeit vom Detektor für die darauffolgende Analyse gespeichert. Dieses Zeithistogramm wurde auf dem MCA-Schirm angezeigt, was dem Benutzer die Überwachung des Fortlaufs des Experiments gestattet.

In einem nachweislauf C des Systems der Fig. 3 wurden die in der Literatur beschriebenen Standardplattengc-l elektrophorese-Verfahrensschritte angewandt. Das Gel war ein 4,5 % Polyacrylamid. Die zu analysierende Probe war eine Mischung aus Hinc II und Hae III Digesten von phi-X174RF DNA, gekennzeichnet mit 32P-dATP. Dieser Digest enthielt 24 DNA-Fragmente im Bereich von 72 bis 1353 Basispaaren. Drei Mikroliter einer Lösung der obigen Fragmente in Formamid wurde in die Quelle eingegeben und 600 Volt wurden an das Gel angelegt und die Datenakkumulation begann im MCA. Der Fensterdiskriminator im MCA wurde

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derart eingestellt, daß die Mehrzahl der eine niedrige Amplitude besitzende Rauschimpulse ausgeschlossen wurde, chne daß dabei signifikanterweise die gewünschte Signalzählerstandsgeschwindigkeit oder Rate vermindert wurde. Die voreingestellte Zählerzeit wurde auf 30 Sekunden eingestellt. Wenn die Fragmente am Detektor vorbeiliefen, so erhöhte sich der akkumulierte Zählerstand in jeder Zeitperiode, was Spitzen in dem Zeithistogramm ergab.

IQ Am Ende des Laufs C wurden die im MCA gespeicherten Daten auf dem Centronics-Drucker ausgedruckt, und zwar mit einem Punkt pro Kanal, die Zählerstandsakkumalation für diesen Kanal repräsentierend. Eine Linienverbindung jedes Punktes wurde von Hand vorgenommen, was eine Serie von 12 wohl definierten Spitzen ergab.

Die vorstehenden Ausführungsbeispiele können in unterschiedlicher Beziehung modifiziert werden. Betrachtet man die Elektrophoresezellen 100, 200 und 300 und die mit diesen zusammenarbeitenden Detektoren, ferner die zwei Glasplatten 303 und 304, so können die zwei Glasplatten 303 und 304 auf der Detektorseite dichter zusammenbewegt werden, so daß sie innerhalb ungefähr eines Millimeters der Berührung sich befinden, und der Detektor kann zurückbewegt werden, so daß die Platten selbst den Collimator bilden. Es können auch die Glasplatten durch 1/8 Zoll Acrylplatten ersetzt werden, in denen das Strahlungsaustrittsfenster /Collimator direkt eingearbeitet ist, um einen Horizontalschlitz von 1 mm Höhe und 10 mm Breite zu bilden, und die Bearbeitung kann auf eine Tiefe von annähernd 0,1 mm von der entfernt gelegenen Oberfläche (oder vom Gel) erfolgen. Dies läßt ein Acrylfenster übrig, welches dünn genug ist, um die Eindringung der Majorität der von den mit P-32 gekennzeichneten Proben emittierten Beta-Strahlung zu gestatten. Die Acrylplatte kann mit zwei Teilen von 1/8 Zoll dickem Aluminium verbunden werden, und zwar eines ober-

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halb und eines unterhalb der Detektoren, um sowohl Starrheit wie auch Wärmeleitung für gleichförmige Temperatur über das Gel hinweg vorzusehen. Diese Konfiguration elimiert den Polyesterfilm und erleichtert den Zusammenbau der Patrone. Es hat sich jedoch als schwierig herausgestellt, diese Plattengele daran zu hindern, sich bei längerem Gebrauch in einer wäßrigen Umgebung zu verformen.

Eine weitere Modifikation der vorstehenden Ausführungsbeispiele sind in Fig. 6 gezeigt. Das Gel für jede Elektrophoresebahn ist in ein Rohr 407 oder Rohre eingezeichnet, und zwar verbunden zwischen einem oberen Elektrolytreservoir 409 und einem unteren Elektrolytreservoir 411 und mit einem Detektor 419, der ein Ringdetektor, wie weiter unten beschrieben wird, sein kann. Das Rohr 407 sollte eine kleine Bohrung (1 bis 3 mm) und eine dünne Wand (0,2 bis 0,3 mm) besitzen und aus Glas oder Kunststoff hergestellt sein. Die Rohre können innerhalb eines einzigen größeren Rohrs 408 enthalten sein, und zwar mit einem Wärmeaustauschmedium, welches durch eine Pumpe 410 zirkuliert werden kann, um eine isothermische Geloperation sicherzustellen. Wenn somit die Vorrichtung der Fig. 6 mit einer Zelle mit vier Bahnen der verbundenen Analyse gemäß Fig. 5 verwendet wird, so können die vier Rohre in einer einzigen größeren Säule enthalten sein, die auch eine zirkulierende Flüssigkeit mit einer Masse 10 bis lOOmal größer als die Gesamtmasse des Gels enthält. Zu den Vorteilen dieser Geometrie gehören die folgenden:

(a) Lange Gellängen sind leicht erhältlich, die eine

größere Trennung der Bänder gestatten; (b) Mehrfachrohre, eines für jede Bahn, können miteinander in einer enggesteuerten Temperaturumgebung betrie hen werden, auf welche Weise eng angepaßte Eigenschaften zwischen einer Bahn und einer weiteren sichergestellt werden;

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(c) die Bahnwanderung und die Bahnabschrägung werden eliminiert;

(d) die inhären-te Festigkeit eines Rohrabschnitts gestattet die Verwendung extrem dünner Glaswandrohre und die Maximierung der übertragung der Beta-Strahlen;

(e) die Ringdetektofkonfiguration kann die Detektionseffizienz um das 2- bis 3fache erhöhen;

(f) ein niedrigerer Stromverbrauch um einen Faktor bis zu fünf ist erhältlich, und zwar für einen gegebenen Spannungsgradienten, weil die kleinere Querschnittsfläche vorliegt, und

(g) Gele können vor-gezogen werden und die Rohre werden an dem einen oder anderen Ende abgedichtet, was die LangZeitaufbewahrung des Gels ermöglicht.

Eine Einzelheit eines Ringdetektors 419 ist in Fig. 7 gezeigt. Eine Siliciumoberflächensperr-Detektoranordnung 519 ist dargestellt und weist ein Gelrohr 507 der oben diskutierten Art auf und eine Anordnung von vier mit gleichen Winkeln angeordneten Siliciumoberflächensperr-Detektoren 520 umgeben von Rohr 507 zur Aufnahme von Strahlungsenergie von den mit Radio-^isotopen gekennzeichneten Fragmenten der Makromoleküle im Rohr 507.

Ein Szintillationsdetektor 419 ist in Fig. 8 gezeigt. Detektor 619 in Fig. 8 ist ein ringförmiger Fluoridscintillationsdetektor, in dem ein Kunststoffgelrohr (ND 120) 607 durch einen Plastikscintillator 620 befestigt an einem Photovervielfacherohr 622 läuft. Die Strahlung von den mit Radioisotop gekennzeichneten Makromolekülen im Rohr 607 bewirkt die Erzeugung von Licht durch den Szintillator 620 und dieses Licht wird durch die Photover vielfacherröhre 622 abgefühlt, die infolgedessen elektrische Signale erzeugt.

Fig. 9 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel der Detektor- und Ausleseschaltung, verbunden mit den Elektrophoresezellen der oben beschriebenen Art. Demgemäß ist ein Silicium-

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Q £ 9 Π ? Ί 5

oberflächensperrdetektor 719, der mit einer Elektrophoresezelle zusammenarbeitet, mit einem Vorverstärker 721 verbunden. Eine Detektorvorspannungsversorgung 723 ist mit dem anderen Eingang des Vorverstärkers 721 verbunden. Der Ausgang des Vorverstärkers 721 steht mit einem Verstärker/ Einzelkanalverstärker (SCA) 722 in Verbindung, dessen Ausgang wiederum mit einem Zähler 727 verbunden ist. Der Vorverstärker 721, der SCA 722, die Detektorvorspannversorgung 723, und der Zähler 727 bilden gemeinsam Impulsver-TO arbeitungsmittel. Eine Sammelleitung (bus) 728 verbindet den Zähler mit einem Laborrechner ("SCA") 736.

Eine experimentelle Version des Elektrophoresesystem der Fig. 6 und die Schaltung der Fig. 9 wurde getaut, und

•j 5 zwar unter Verwendung eines Glaskapillarrohrs der Firma Wilmad Glass Co., als Rohr 407. Dieses Rohr war 23 cm lang mit einem Innendurchmesser von 1,5 mm und einer Wandstärke von 0,15 mm. In einem Lauf D wurde das Rohr mit 6 % denaturierendem Gel gefüllt, und zwar dadurch, daß man es vertikal hielt und das Gel durch eine Spritze,verbunden mit dem Boden des Rohrs einspritze. Das obere Ende des Acrylamids war mit Isoamylalkohol überschichtet, um eine flache Geloberfläche zu bilden. Nachdem man 2 Stunden im Hinblick auf eine vollständige Polymerisation des Gels gewartet hat, wurde die Spritze entfernt. Ein Collimator, bestehend aus zwei Messingrohren jedes mit 3 mm Außendurchmesser und 1,5 mm Innendurchmesser wurde verwendet. Dieser Messingcollimator wurde über das Glasrohr derart geschoben, daß die Glasrohre 0,5 mm Abstand hatten und so ein Fenster bildeten, wobei das Glasrohr mit den oberen und unteren Reservoirs in Verbindung stand. Zwei Oberflächensperrdetektoren wurden nahe dem Collimatorfenster, und zwar einer auf jeder Seite derart angeordnet, daß die empfindlichen Oberflächen direkt auf den Spalt zwischen den Messingrohren hinwiesen. Die Reservoire waren mit Elektrolyt gefüllt und eine Spannung von 700 Volt wurde 2 Stunden lang angelegt. Ein Aliquot aus DNA-Fragmenten wurde aus 4N (einem Abkömmling von pBR 322) mit Hinfl ge-

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Q Q Ί Γ O Q - 28 -

schnitten. Es wurde in der üblichen Weise mit einem radioaktiven Triphosphat mit einer speziellen Aktivität von 400 Curies/Millimol gekennzeichnet, in einem Formamid aufgenommen und vollständig denaturiert durch lOminütiges Erhitzen bei 65 ⁰C. Nach einem sanften Abwaschen der Oberfläche des Gels mit einem Puffer mittels einer Spritzpipette wurde die Probe auf die Geloberfläche aufgebracht. Eine Spannung von annähernd 750 Volt wurde aus einer KonstantStromversorgung angelegt, um einen Strom von 0,4 HiA zu ergeben.

Die Impulsverarbeitungsmittel (Glieder 721, 722, 723 und 727 in Fig. 9) empfingen und zählten Impulse über aufeinanderfolgende 10-Sekundenperioden. Am Ende jeder 10-Sekundenperiode wurde der Zählergesamtwert zu individuellen Speicherplätzen des HP86 Mikrocomputers übertragen. Die Computer- oder Rechnermittel verwendeten die im Speicher gespeicherten Daten, um einen Ausdruck des Histogramms der Zählerstandsrate, abhängig von der Zeit zu liefern. Spitzen wurden auf dem Histogramm an denjenigen Zeitpunkten beobachtet, wo strahlungsgekennzeichnete Makromoleküle den Detektor durchliefen.

Nach einem lOstündigen Lauf waren Strahlungspitzen entsprechend den Fragmenten der Länge 72, 75, 83, 110, 154, 220, 221, 296, 310, 346, 398, 506, 517 Basen deutlich identifiziert, wobei nur die Doppelwerte bei 200 und Basen als einzige Spitze unaufgelöst blieben. Im Lauf D waren die Strahlungsdetektoren 719 ein Paar von Ortec-Oberflächensperrmodellen Nr. BR-XX-3X25-300-S, der Vorverstärker 721 war ein Ortec-Modell 142IH, der Verstärker /Einkanalanalysator 722 war ein Ortec-Modell 590A, die Detektorvorspannungsversorgung 723 war ein Ortec-Modell 428 (eingestellt auf .150 V) und der Zähler 727 war ein Ortec-Modell 874.

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Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung der gleichen Ausrüstung wie im Lauf D durchgeführt mit der Ausnahme, daß das Rohr 25 cm lang war und die Detektoren wurden 21,5 cm unterhalb der Geloberfläche angeordnet. Dieser Lauf E wurde verwendet, um nachzuweisen, daß das System verwendet werden kann, um die Komponenten einer Dideoxyreaktxonsmischung zu identifizieren, wie sie normalerweise in einer der vier Bahnen der DNA-Sequentierung verwendet wird. Im Lauf E war die verwendete Probe hergestellt durch eine Dideoxy-G-Reaktion an einem Stück unbekanntem DNA. Das in dieser Reaktion verwendete radioaktive Triphosphat hatte eine spezifische Aktivität von 400 Curies/Millimol. Die Gelherstellung und der Vorlauf war gleich wie beim Lauf D. Ein 1 μΐ Aliquot der Probe wurde vollständig durch Erhitzung auf 70 ⁰C 10 Minuten lang denaturiert und unmittelbar darauf auf das Gel aufgeladen. Die Spannung wurde auf annähernd 750 Volt bei einem Strom von 0,4 mA eingestellt. Die Impulsverarbeitungs- und Rechnermittel waren die gleichen wie beim Lauf D und nach 6 Stunden Versuchslauf zeigte der Druckerausdruck mehrere Spitzen. Im Bereich von 40 bis 150 Basen wurden deutlich 23 Spitzen identifiziert, um diese Spitzen zu bestätigen, wurde ein zweites Gel in genau der gleichen Weise hergestellt und einem Vorlauf unterworfen. Eine größere Probe, 2,5 μΐ, wurde denaturiert durch Erwärmung und sodann auf das Gel als Lauf F aufgegeben. Das Gel wurde mit annähernd 800 Volt bei einem konstanten Strom von 0,4 mA betrieben. Strahlungspitzen vom Lauf F bestätigten sämtliche Spitzen des Laufs E und wegen der größeren Signalstärke ergaben sich fünf weitere Spitzen , so daß sich insgesamt 28 Spitzen ergaben. Dies ist die Anzahl von Spitzen, die man im Durchschnitt für eine einzige Reaktion erwarten würde, und zwar bei dem 110 Basenbereich von 40 bis 150 Basen. Die Messung von Dideoxy A, T und C wird in gesonderten Bahnen in der gleichen Weise erfolgen. Der Lauf E bestätigt die grundsätzliche Fähigkeit des Systems, die Information

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zu erzeugen, die notwendig ist, um eine DNA/RNA-Seguenz zu bestimmen.

Die in den Systemen der Fig. 1, 2 und 3 verwendete Daten-Verarbeitungseinheit ist ein Mehrkanalanalysator (MCA). Ein MCA ist das funktioneile Äquivalent von mehreren (bis zu 1000) Einkanalanalysatoren, in denen der Energiediskriminationsbereich der Analysatoren in einem Kontinuum von Schritten eingestellt ist, und zwar von der niedrigsten interessierenden Energie bis zur höchsten interessierenden Energie. Das heißt, jeder Analysator hat sein einzigartiges Energiefenster. Seine Ausgangsimpulse werden gezählt und der Gesamtwert wird auf der MCA-Videoanzeige als ein von der Energie abhängendes Histogramm dargestellt. Diese Darstellung zeigt die Energieverteilung der ankommenden Impulse gegenüber einer Zeitperiode hinweg. In der Praxis wird die Impulshöhenanalyse durch einen Hochgeschwindigkeits analog zur Digitalumwandler vorgenommen, der bei Bestimmung der impulshöhen (Energie) einen Zählerstand in die entsprechende Speicheradresse des MCA einaddiert. In den Systemen der Fig. 2 und 3 werden die MCAs 126 und 226 in dieser Weise benutzt.

Das MCA hat eine Mehrfachmaßstabsbetrxebsrate, in der die Energieauflösung durch einen konventionellen Einka sator ausgeführt wird und die Zählerstände werden in die aufeinanderfolgenden Speicheradressen zu gegebenen zeitlichen Inkrementen geführt. Dieses Verfahren wird ebenfalls auf dem Videoschirm angezeigt, und zwar als ein Zeithistogramm der Impulsrate oder Impulsgeschwindigkeit.

Obwohl der MCA ein zweckmäßiges Werkzeug für diese Anordnung ist, so ist er jedoch nicht reflexibel. Eine bessere und wirtschaftlichere Anordnung verwendet einen Einzelkanalanalysator (oder zwei für Dualisotopmessungen), verbunden mit einem Zählet, der mit einem Mikrocomputer verbunden isL.

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Das System der Fig. 9 ist von dieser Bauart, wobei der Mikrocomputer ein Hewlett-Packard HP-86 ist. Die Software für das System der Fig. 9 sieht die folgenden Funktionen vor:
5

(a) eine Realzeitvideodarstellung der Signalintensität, abhängig von der Zeit,

(b) einen Ausdruck der gleichen Information auf Papier,

(c) Möglichkeiten zur Ausmittlung statistischer Veränderungen im Signal.

Der Computer der Einheit ist vorzugsweise voll kompatibel mit anderen Mikrocomputern, wie beispielsweise dem IBM-Modell PC/XT oder kompatiblen Einheiten. Geeignete Softwares für die Handhabung der DNA/RNA-Sequenzierung, der Proteinanalyse, den Einschränkungsplätzen und der Darstellung sowie Vergleiche mit privaten Daten oder genetischen Datenbasen sind verfügbar.

Zusammenfassend sieht die Erfindung folgendes vor:

Ein Elektrophoresessystem zur Bestimmung der Größen von strahlungsgekennzeichneten biologischen Makromolekülen, wobei folgendes vorgesehen ist: Eine Zelle, die ein Elektrophoresegel enthält und mindestens eine Bahn aufweist, wobei eine Spannungsquelle am Gel liegt, um die Bewegung der Makromoleküle in der Bahn ai bewirken. Ein Detektor ist bezüglich der sich bewegenden Moleküle befestigt, um elektrische Impulse zu erzeugen, die auf die von den strahlungsgekennzeichneten Molekülen ausgehen. Ein Impulsprozessor zählt die Impulsrateund eine Rechnervorrichtung vergleicht die Impulsrate mit einem vorbestimmten Wert.

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Claims (26)

DBH-8428 System zur Bestimmung der Größen von biologischen Makromolekülen Patentansprüche

1. Elektrophoresesystem zur Bestimmung der Größen von radiomarkierten biologischen Makromolekülen, wobei das System folgendes aufweist:

Zellenmittel zum Enthalten eines Elektrophoresegels, wobei die Zellenmittel Bahnen definieren, Spannungsquellenmittel verbunden über die Zellenmittel zum Aufbau eines Spannungsdifferentials längs jeder Bahn zur Bewirkung der Bewegung der Makromoleküle,

Detektormittel angeordnet an einem Teil der entsprechenden Eahnen der Zellenmittel und befestigt bezüglich der sich bewegenden Makromoleküle zur Feststellung von Signalen emittiert von den radiomark ierten Makromolekülen, die an den Detektormitteln vorbeilaufen und zur Umwandlung der Signale in elektrische Impulse,
Impulsverarbeitungsmittel, die elektrisch mit den Detektormitteln verbunden sind, um die elektrischen Impulse von den Detektormitteln zu empfangen und um die Impulsrate (Impulsfrequenz) von den entsprechen-

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den Bahnen über vorbestimmte aufeinanderfolgende Zeitperioden hinweg zu bestimmen, und Rechenmittel zum Empfang der Impulsfrequenzen und zur Berechnung der Funktion der Impulsfrequenz, abhängig von der Zeit und zur Berechnung der Korrelationsfunktion der Impulsfrequenzfunktion mit einer gespeicherten Funktion und zum Vergleich des Werts der Korrelationsfunktion mit den vorbestimmten Werten.

2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die Zellenmitteln das Gel in einer nicht-horizontalen Orientierung enthalten, daß die Zellenmittel obere und untere Teile aufweisen, und wobei ferner

•j 5 die Spannungsquellenmittel ein Spannungsdifferential längs der Vertikaldimension des Gels aufbauen, um die Bewegung der Fragmente von dem oberen Teil zum unteren Teil der Zellenmittel zu bewirken, und wobei schließlich die Detektormittel an den unteren Teilen der entsprechenden Bahnen angeordnet sind.

3. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Makromoleküle DNA aufweisen.

4. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Makromoleküle RNA aufweisen.

5. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Makromoleküle Proteine aufweisen.

6. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Makromoleküle Fragmente von strahlungsgekennzeichneten (radiomarkierten) Nukleotiden aufweisen.

7. System nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenmittel eine Bahn für jedes Nukleotid aufwei-

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sen, daß die Detektormittel Signale, emittiert von den Nukleotiden in den entsprechenden Bahnen detektieren, und daß die Rechenmittel die relativen Größen der Makromoleküle in den entsprechenden Bahnen bestimmen, um den Nukleotiden zu folgen.

8. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das System ferner Mittel aufweist, um den vorbestimmten Wert (oder die vorbestimmten Werte) mit den "on-line" berechneten Werten auf den neuesten Stand zu bringen.

9. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenmittel das Gel in einer nicht-horizontalen Orientierung enthalten, wobei die Zellenmittel obere und untere Teile aufweisen, wobei ferner die Spannungsquellenmittel ein Spannungsdifferential entlang der Vertikaldimension des Gels aufbauen, um die Bewegung der Makromoleküle vom oberen Teil zum unteren Teil der Zellenmittel zu bewirken und wobei ferner die Detektormittel an den unteren Teilen der entsprechenden Bahnen angeordnet sind.

10. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenmittel ein Paar von parallelen, entgegengesetzten Vertikalplatten aufweisen, die mit Abstand angeordnet sind, um zwischen einander einen Hohlraum für das Elektrophoresegel zu definieren.

11. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenmittel ein Rohr sind, welches jede der Bahnen definiert.

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12. System nach Anspruch 11, wobei ferner ein Mantel vorgesehen ist, der die Rohre umgibt und der ein Wärmeaustauschmedium enthält, um eine gleichförmige Temperatur des Gels innerhalb der Rohre aufrechtzuerhalten.

13. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektormittel einen Festkörperdetektor aufweisen, um die einfallenden Strahlungsquanten in einen Elektronenfluß umzuwandeln und um als ein Halbleiter zur Sammlung der Elektronen zu arbeiten.

14. System nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörperdetektor ein Cadmiumtelluridkristalldetektor ist.

15. System nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Festkörperdetektor ein Detektor der Siliciumoberflächensperrtype ist.

16. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektormittel einen Szintillationsdetektor aufweisen, um die einfallende Strahlung in Licht umzuwandeln und um elektrische Impulse proportional zum Lichtwert zu erzeugen.

17. System nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Szintillationsdetektor ein Natriumjodidkristalldetektor ist.

18. System nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Szintillationsdetektor ein Calciumfluoridkristalldetektor ist.

19. System nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Szintillationsdetektor ein Kunststoffdetektor ist

20. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Collimatormittel zwischen den Zellenmitteln und den Detektormitteln angeordnet sind, um Signale zu collimieren, die durch die strahlungsgekennzeichneten Makromoleküle emittiert werden, welche durch die Collimatormittel laufen.

21. System nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Collimatormittel eine strahlungsundurchdringliche Wand aufweisen mit einem Fenster für den Einlaß der Signale.

22. System nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spannungsmittel Reservoirs von entgegengesetzt geladenen Pufferlösungen in Verbindung mit den Zellenmitteln aufweisen.

23. System nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Spannungsmittel ferner eine Spannungsversorgung aufweisen und entgegengesetzt geladene Elektroden, verbunden mit der Spannungsversorgung und angeordnet in den entsprechenden Reservoirs.

24. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rechnermittel Ausgangsmittel aufweisen, um die Ausgangssignale in verständlicher Form darzustellen.

25. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spannungsmittel entgegengesetzt geladene Pufferreservoirs aufweisen, und zwar in Verbindung mit unterschiedlichen Teilen des Gels, und ferner Mittel zum Zirkulieren der Pufferreservoirs.

26. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenmittel eine schmale Querabmessung aufweisen.

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