ITMI960263A1 - Uso di gradienti multipli per l'analisi di mutazioni in dna genomico umano - Google Patents

Abstract

La presente invenzione riguarda un frammento di DNA che codifica una sequenza amminoacidica di proteine isolate da fegato di mammiferi.

Description

"USO DI GRADIENTI MULTIPLI PER L'ANALISI DI MUTAZIONI IN DNA GENOMICO UMANO"

La presente invenzione riguarda l'uso di gradienti multipli (di denaturanti chimici, di denaturanti termici e di porosità della matrice elettroforetica)per la separazione di frarmenti di DNA, amplificati per PCR, sia normali che contenenti mutazioni puntiformi, in elettroforesi zonale su piastra e in elettroforesi capillare in presenza di soluzioni viscose di polimeri (sia lineari che ramificati). E' compreso nella presente invenzione sia l'uso di gradienti abbinati (chimici e di porosità) sia l'uso simultaneo dei tre gradienti nel caso di mutazioni puntiformi particolarmente altofondenti. E1 pure compreso, nel caso di elettroforesi zonale, l’uso di batterie di capillari, per l'analisi simultanea di campioni diversi. E' inoltre inclusa la rivelazione di frammenti di DNA tramite eccitazione di fluorescenza a raggio laser. Viene anche compresa la possibilità di operare, in elettroforesi capillare, con soluzioni di polimeri miste (e.g., poliacrilamidi a diversa lunghezza di catena) e con poliacrilamidi costituite da monomeri resistenti all'idrolisi (in genere N-sostituiti, tipo la Ν,Ν'-dimetil acrilamide,N-acriloil amino propanolo).

La rivelazione e localizzazione di differenze in una singola base (mutazioni puntiformi)in regioni specifiche del DNA genomico umano è di importanza fondamentale nell'analisi di mutazioni associate a malattie umane.Nell'analisi di malattie genetiche ereditarie e per lo screening genetico di massa è di fondamentale importanza per poter risolvere, in un tracciato elettroforetico, mutazioni puntiformi singole o multiple di DNA. Fino ad oggi, il metodo di più vasto impiego è stato quello di Fischer e Lerman ( Proc . Nati. Acad. Sci. USA 80, 1983, 1579-1583), consistente in un'elettroforesi su gel in gradienti di denaturanti chimici (di solito urea e/o formamide) (DGGE). Il principio della DGGE è che la mobilità di una molecola di DNA parzialmente fusa è notevolmente ridotta rispetto a quella di molecole sotto forma di doppia elica intatta. Le sequenze che si possono separare comprendono due dominii, uno a bassa ed uno ad alta temperatura di fusione; questo permette, in un intervallo ristretto di concentrazioni di denaturante, di ottenere intermedi di fusione contenenti catene singole e doppie di DNA. Quando una miscela di queste molecole, aventi la stessa lunghezza in basi ma differenti per una mutazione puntiforme,viene a migrare in un gel in un gradiente di condizioni denaturanti, si manifestano differenti equilibri tra forme native e fuse e loro intermedi e dette molecole saranno pertanto separabili durante la migrazione elettroforetica stessa. In genere la forma parzialmente fusa migrerà più lentamente rispetto alla forma completamente non-denaturata, in quanto il raggio di girazione della prima è maggiore di quello della seconda, per cui la resistenza frizionale al moto sarà maggiore per la forma parzialmente fusa. Nell'uso più comune di questa metodica, le catene di DNA mutate vengono mescolate a catene di DNA normale e si formano delle cosidette "eterodoppie eliche" tramite riscaldamento al di sopra della temperatura di fusione e successivo raffreddamento. Tali "etero-doppie eliche" hanno temperature di fusione inferiori a quelle di "omo-doppie eliche" a causa di un disaccoppiamento delle basi nella regione della mutazione. Quando queste miscele di "etero-" ed "omo-doppie eliche" vengono fatte migrare in un gradiente di denaturante, è possibile separarle appunto a causa delle diverse temperature di fusione. In genere, se la catena nomale (Wt) e la catena contenente una mutazione puntiforme (M) vengono mescolate come filamenti singoli e lasciati rinaturare a formare filamenti doppi, ci si aspetta, da un punto di vista statistico, la formazione di quattro tipi di doppie eliche: due omo-duplici (Wt/Wt e M/M)e due etero-duplici (Wt/M ed M/Wt). E' proprio sulla separazione e rivelazione della presenza di uno spettro di quattro bande, lungo il percorso elettroforetico in gradiente di denaturante, che si basa la diagnostica precisa della presenza di una mutazione puntiforme in un esone amplificato di un paziente in analisi. Una variante fondamentale della metodica di Fischer e Lerman, in cui si fa un uso quasi esclusivo di gradienti di denaturanti chimici (e.g. urea, formamide) è il metodo dei gradienti termici,pure denaturanti nei confronti di acidi nucleici. In tale metodo (chiamato TGGE,Riesner,Henco e Steger Advan. Electr. 4, 1991, 171-250) si fa uso di una piastra elettroforetica alle cui estremità viene applicato un gradiente di temperatura (e.g. da 30 a 90"C) o perpendicolare o parallelo alla direzione di migrazione degli acidi nucleici. In una variante di questo metodo, tale gradiente di temperatura viene creato all'interno di un capillare, non nello spazio del capillare stesso,ma nel tempo (gradienti a temperatura programmata) (Gelfi, C., Righetti, P.G., Cremonesi, L. and Ferrari, M., Electrophoresis 15, 1994,1506-1511).

Oggi le due metodiche analitiche di uso corrente nello screening di massa di mutazioni genetiche sono appunto la DGGE e la TGGE. Tuttavia entrambe le metodiche soffrono di diversi difetti, che ne rendono l'uso, in parecchi casi, estremamente complicato dal punto di vista di una diagnosi sicura. Prima di tutto, poiché i DNA dei diversi esoni che vengono amplificati hanno strutture diverse e punti di fusione (Tm) che possono abbracciare un ampio intervallo di concentrazioni di denaturante,è molto difficile trovare condizioni sperimentali (tempo di corsa elettroforetica e pendenza del gradiente di denaturante) che si possano adattare ad ogni tipo di mutazione. Pertanto, per tipi diversi di mutazioni, occorre trovare condizioni sperimentali adatte, il che va a detrimento delle applicazioni di routine. Inoltre, poiché il tempo di separazione elettroforetica richiesto per risolvere le due bande degli omo-duplici è spesso molto più lungo di quello richiesto per risolvere le due bande degli etero-duplici, quest'ultimi spesso producono bande talmente diffuse lungo il cammino elettroforetico da non poter essere rivelate, alla fine dell'analisi, con le tipiche colorazioni in fluorescenza (intercalarsi del colorante bromuro di etidio). In mancanza dello spettro caratteristico di quattro bande, la diagnosi sulla presenza o meno di una mutazione puntiforme non può essere emessa.

E' oggetto della presente invenzione l'uso di un gradiente DGGE (o di un TGGE) abbinato ad un gradiente co-lineare di porosità della matrice setacciente (in genere, ma non esclusivamente, poliacrilamidi), per la separazione di frammenti di DNA, normali o contenenti mutazioni puntiformi, in metodiche elettroforetiche. Mentre il primo gradiente serve a denaturare, in una sequenza temporale, i due omo- ed eteroduplici,producendo così lo spettro caratteristico di quattro bande, il secondo gradiente (di porosità) serve a ricompattare le bande diffuse (sia degli etero- che degli omo-duplici) in modo da ridurre drasticamente l'altezza del piatto teorico di ogni zona e da formare così zone molto ristrette e ben visibili alla rivelazione con coloranti specifici ed alla densitometria. Inoltre, poiché il secondo gradiente (di porosità) rallenta drasticamente la corsa elettroforetica dei vari tipi di DNA (che migrano asintoticamente al "poro limite", dove la migrazione cessa), l'uso della metodica oggetto della presente invenzione permette di uniformare i tempi di corsa praticamente di ogni tipo di DNA mutante, rendendo così possibile l'applicazione routinaria sia della metodica DGGE che di quella TGGE. Inoltre, la presente invenzione rende possibile la creazione di tali gradienti di porosità e di denaturanti chimici (e/o termici) anche in elettroforesi zonale capillare. Fanno parte della presente invenzione anche l'uso di soluzioni viscose di polimeri lineari e/o ramificati, che esercitano un "setacclamento" di tali acidi nucleici in base al raggio di girazione di molecole native e parzialmente denaturate, e la possibilità di usare batterie di capillari, per analisi multiple simultanee, come pure la possibilità di rivelare tali acidi nucleici per fluorescenza indotta da raggio laser.E compreso nella presente invenzione anche l'uso abbinato di gradienti di denaturanti, e.g. l'uso simultaneo di denaturanti chimici (quali ad esempio urea e formamide)e di denaturazione al calore accoppiati all'uso di gradienti di porosità. Tale uso abbinato permette di ottenere temperature (o su piastra di gel o all'interno del capillare) inferiori alla temperatura di ebollizione del solvente (in genere,ma non esclusivamente,acquoso).

I vantaggi dei gradienti di denaturanti abbinati a gradienti di porosità secondo l'invenzione su quelli finora usati (in assenza di gradienti di porosità)vengono posti in evidenza qui di seguito.

Separazione di mutanti puntiformi di DNA su Piastre di poliacr lamide

La Fig. 1 mostra la separazione di frammenti di DNA amplificati (gene della fibrosi cistica, CFTR, esone 11) da individuo normale e da un paziente portatore di una mutazione R553X (1789 C->T)in presenza di gradiente singolo (pannello superiore) e in presenza di doppio gradiente (pennello inferiore). Nel pannello superiore, la separazione viene condotta in un gel a concentrazione totale di monomeri (%T) costante ed uguale a 6.5%T, in presenza di un gradiente di denaturante (urea e formamide)dal 10 al 60%.Nel pannello inferiore, la separazione avviene in presenza dello stesso gradiente di denaturante (10-60%) ma abbinato ad un secondo gradiente, co-lineare col primo, di porosità della matrice.Tale gradiente di porosità è ottenuto variando il contenuto di monomeri totali nella matrice (%T) nell'intervallo 6.5-12%T. Entrambi i gradienti sono orientati lungo l'asse di separazione in modo che la parte bassa del gradiente (a basso contenuto di denaturanti chimici e a basso contenuto di monomeri nella matrice) si trovi al punto di semina del campione da analizzare (cioè verso il catodo) e la parte alta del gradiente sia in direzione dell'anodo. In entrambi i casi (singolo e doppio gradiente)le piastre di gel contengono lo stesso tipo e molarità di tampone (40 mM Tris, 20 mM NaOH, 1 mM EDTA,pH 7.6; tanpone TEA).Le piastre di gel, in entrambi i casi, hanno le seguenti dimensioni: spessore di 0.75 mm, larghezza di 15 era ed altezza di 15 cm. Nel caso del singolo gradiente la corsa elettroforetica è stata di 5 ore a 160 V; nel caso del doppio gradiente la corsa è stata di 15 ore a 75 V. Alla fine della corsa, entrambi i gels vengono colorati con bromuro di etidio e fotografati in luce ultravioletta. I due pannelli rappresentano scansioni densitometriche delle foto dei gels. Come si può notare dal pannello superiore, la densitometria non è in grado di rivelare la presenza dei due etero-duplici (che non sono distinguibili nemmeno per ispezione visiva del gel dopo colorazione) ed a malapena rivela una doppietta di picchi, rappresentanti i due omo-duplici (Wt/Wt e M/M) che tuttavia sono risolti soltanto all'apice dei picchi. In questo caso non è stato possibile emettere una diagnosi precisa. Al contrario, nel caso del gel a doppio gradiente (pannello inferiore) lo spettro di quattro picchi, caratteristico di una mutazione puntiforme, è chiaramente visible (Wt/M, M/Wt ed M/M/, Wt/Wt) ed è stato possibile emettere una diagnosi accurata della presenza di tale mutazione puntiforme. Si noti inoltre che, mentre nel secondo caso la linea di base del tracciato elettroforetico è bassa e costante,nel caso del gradiente singolo tale linea è molto irregolare e in continua salita, il che rende molto difficile l'attribuzione dei picchi.

La Fig. 2 mostra l'analisi di un'altra mutazione nel gene CFTR (esone 20, nota come S125N, 3384 G->A) analizzata essenzialmente come sopra in presenza di gradiente singolo {pannello superiore) o di doppio gradiente (pannello inferiore) con la differenza che, in entrambi i casi, avendo la mutazione un Tm più elevato, i gels contengono un gradiente di denaturante chimico più ripido, dal 20% al 70%. In questo caso il gel a gradiente singolo risolve bene i due omo-duplici (M/M e Wt/Wt)ma presenta delle notevoli difficoltà di identificazione dei due etero-duplici, che tentativamente vengono assegnati alle due "gobbe" inarcate Wt/M ed M/Wt. Anche qui le notevoli fluttuazioni della linea di base non permettono di discemere con precisione i due picchi minori, difficilmente rilevabili anche a un'ispezione visiva. Al contrario, il gel contenente il doppio gradiente, in virtù della sua capacità di ricompattare le bande diffuse, risolve ed individua molto bene tutto lo spettro di quattro bande (pannello inferiore) permettendo una diagnosi accurata.Si noti anche qui la linea di base molto bassa e costante.

La Fig. 3 mostra l'analisi di un'altra mutazione nel gene CFTR (esone 1, nota come 125G/C)analizzata essenzialmente come in Fig. 1 in presenza di gradiente singolo (pannello superiore) o di doppio gradiente (pannello inferiore) con la differenza che, in entrambi i casi, avendo la mutazione un Tm ancor più elevato, i gels contengono un gradiente di denaturante chimico molto più elevato,dal 40% al 90%. In questo caso il controllo (pannello superiore) mostra una buona risoluzione dei due eteroduplici (Wt/M ed M/Wt) ma un singolo picco nella zona dei due omoduplici,che probabilmente hanno un Tm molto simile.Al contrario, il gel contenente il doppio gradiente non solo mostra un'ottima separazione dei due etero-duplici, ma anche una buona separazione dei due omoduplici che,per quanto non risolti alla linea di base, sono chiaramente visibili come due picchi distinti.

Separazione di mutanti puntiformi di DMA per elettroforesi capillare Il metodo sopra descritto è stato anche adattato all’elettroforesi capillare (CZE), con risultati notevolmente migliorati rispetto al metodo convenzionale del gradiente singolo. In CZE, non era stato fino ad ora possibile creare gradienti di sostanze chimiche, a causa del piccolissimo volume di sostanze da mescolare (dell'ordine di pochi microlitri). Con tecniche di micromanipolazione è stato possibile riempire tali capillari con gradienti sia di sostanze chimiche, sia di porosità.La Fig. 4 mostra i risultati di tali analisi. Il capillare di silice fusa è stato prima di tutto passivato ancorando covalentemente alla parete interna un polimero di poli(N-acriloil amino etossi etanolo), idrofilo ed altamente resistente all'idrolisi basica. Nel controllo, il capillare viene riempito di soluzione tampone (TBE: 8.9 mM Tris, 8.9 mM borato, 1 mM EDTA, 6 M urea, 10 mM NaCl, pH 8.3) in presenza di una concentrazione costante di monomeri acrilamidici (e.g., 6%T), che viene poi lasciata polimerizzare in situ. L'acrilamide può essere anche polimerizzata in assenza di cross-legante, formando così una soluzione viscosa di polimeri, che hanno pure un buon potere setacciante.Nel caso del doppio gradiente, il capillare viene riempito (con l'aiuto di due microsiringhe e di una micro-camera di mescolamento) con la stessa soluzione tampone, ma contenente un gradiente di concentrazione di monomeri (ad es., 6-8% o 6-10%T). Nella situazione relativa alla Fig. 4, il secondo gradiente (denaturante), in entrambi i casi, è un gradiente termico, che copre l'intervallo di temperatura da 56 a 58*C, che abbraccia i Tm dei vari omo- ed etero-duplici in questione (esone 11 del gene CFTR, mutazione nota come 17171G->A). Quando si usa il gradiente termico come denaturante in CZE, il tampone viene addizionato anche di 10 mM di NaCl, che facilita la denaturazione del DNA ed aiuta la creazione del gradiente termico per effetto joule (il gradiente termico è temporale e viene attivato da rampe di voltaggio durante la corsa, come descritto in Gelfi et al., Electrophoresis 15, 1994,1506-1511).La rivelazione delle bande di DNA viene fatta in situ, lungo l'asse del capillare, tramite assorbimento intrinseco dei DNA a 260 nm. Il pannello D in Fig. 4 mostra una corsa di controllo, in assenza sia di gradiente termico che di gradiente di porosità. In assenza di appropriate quantità di agenti denaturanti non si ha svolgimento parziale delle doppie eliche e l'unico picco che transita (min 80)rappresenta un inviluppo delle quattro potenziali bande di omoed etero-duplici. Il pannello A mostra un'analisi in gradiente singolo (denaturante termico, da 56 a 58eC). I due picchi di omo-duplici sono ben separati,ma anche qui i due eteroduplici danno zone molto diffuse e difficilmente identificabili, che tentativamente sono state marcate nell'elettroferogramma come Wt/M e M/Wt). Nel pannello B la stessa analisi è stata ripetuta, ma in presenza anche di un gradiente di porosità dal 6 all'8%T. I due picchi degli etero-duplici sono ora chiaramente visibili e ben identificabili,anche qui in presenza di una linea di base piatta e costante. Infine, nel pannello C, la stessa analisi è stata ripetuta in presenza di un gradiente di porosità più ripido (da 6 a 10%T). Si nota ora che anche i due omo-duplici sono ora risolti alla linea di base.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per la separazione e identificazione di frammenti di DNA genomico in metodiche elettroforetiche su piastre di gels o in capillari, caratterizzato dall'uso di un gradiente di porosità abbinato a un gradiente di denaturante chimico e/oppure a un gradiente di temperatura.
2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, per la separazione e identificazione di mutazioni puntiformi in MIA genomico umano.
3. 3. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-2, condotto su piastre di gels setaccienti scelti nel gruppo costituito da poliacrilamidi,agarosi modificati, cellulose, derivati cellulosici e corrispondenti miscele fisiche o polimeri cross-legati.
4. 4. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-2, condotto in batterie di capillari a sezione circolare o rettangolare riempiti di un gradiente di porosità formato da poliacrilamidi o altri polimeri setaccienti, abbinato con un gradiente di denaturanti chimici e/oppure con un gradiente termico.
5. 5. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-4, caratterizzato dal fatto che il gradiente di porosità è costituito da soluzioni viscose di polimeri lineari e/o ramificati.
6. 6. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-5,caratterizzato dal fatto che il gradiente di porosità è formato da poliacrilamidi resistenti all'idrolisi, sia come omopolimeri sia come copolimeri di monomeri diversi.
7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che le poliacrilamidi sono scelte nel gruppo costituito da poli(N,N-dimetil-acrilamide), poli(M-acriloilamino-etossietanolo), poli(N-acriloilamino-propanolo), poli(N-acriloilanmino-butanolo), corrispondenti copolimeri e loro miscele.
8. 8. Procedimento secondo le rivendicazioni 1-7,caratterizzato dal fatto che la rivelazione viene effettuata in fluorescenza, anche per eccitazione con raggio laser.