JPH11509001A - ゲルスラブ類及びキャピラリ類電気泳動での多重グラジエントの調製及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ゲルスラブ上での領域電気泳動によるか、又は種々のポリマー溶液（直鎖又は分岐）の存在でのキャピラリ電気泳動による、正常又は点突然変異を有する、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片類の分離のための、（ゲルマトリックスの化学的変性、熱変性及び多孔度の）多重グラジエントの用途に関する。そのような方法は、タンパクの変性の分析及びキャピラリ中の例えばキラル分離を最適化することに拡張することができる。本発明は、二重グラジエント（化学的及び多孔度グラジエント又は熱的及び多孔度グラジエント）の使用又は非常に高い融解点を有する点突然変異のための三重グラジエントの同時使用を含む。キャピラリ電気泳動の場合に、本発明は、数多くの試料の同時分析のための、キャピラリ電池の用途にも拡張される。更に、本発明は、レーザー誘導蛍光検出によるＤＮＡ断片（又はタンパク質及び他の被分析物）の検出、並びにキャピラリ電気泳動での混合ポリマー溶液及び高度に耐加水分解性を有するモノマーで得られるポリアクリルアミドでの操作の可能性を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ゲルスラブ類及びキャピラリ類電気泳動での多重グラジエントの調製及び用途 本発明は、ゲルスラブ領域電気泳動によるか又は種々のポリマー溶液（直鎖又 は分岐のいずれか）の存在でのキャピラリ電気泳動による、ＰＣＲ−増幅された ＤＮＡ断片類、すなわち正常又は点突然変異の両方の分離のための、（電気泳動 マトリックスの、化学的変性、熱的変性及び多孔度の）多重グラジエントの用途 に関する。この方法は、タンパク質の突然変異の分析及び例えばキャピラリ中で のキラル分離の最適化に対しても適用することができる。二重グラジエント（例 えば、化学的及び多孔度グラジエント）の使用又は高い融解点を有する点突然変 異の場合での三重グラジエント（化学的、熱的及び多孔度グラジエント）の同時 使用は、本発明に含まれている。本発明は、多数のサンプルの同時分析のための キャピラリ電気泳動の場合において、キャピラリ電池の用途にも拡張される。そ れは、レーザ−誘導の蛍光により、そのようなＤＮＡ断片（又はタンパク質及び 他の適切な被分析物）の検出を含む。本発明は、キャピラリ電気泳動の場合に、 混合ポリマー溶液（例えば、異なる長さの、ポリアミド類及びセルロース）及び 耐加水分解性モノマーから製造されたポリアクリルアミド（典型的には、Ｎ−置 換物、例えばＮ，Ｎ’−ジメチアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルアミノプロパ ノール）の用途にも拡張されている。ヒトゲノムＤＮＡの特定の領域での単一塩 基の差（点突然変異）の検出は、ヒトの疾患に関連した突然変異の分析において 、基本的な重要性を有する。受け継がれた遺伝的疾患の分析において、かつ遺伝 子の大量スクリーニングのために、ＤＮＡの単一又は多重点突然変異を、電気泳 動分離で検出することが必要である。現在まで、最も普及している方法は、化学 的変性（通常、尿素及び／又はホルムアミド）(変性化グラジエントゲル電気泳 動、ＤＧＧＥ)のグラジエントの存在でのゲルスラブ電気泳動からなる、Fischer and Lerman(proc．Natl．Acad．Sci USA 80，1983，1579-1583)の一つである。 この方法は、部分的に融解されたＤＮＡ分子の動きが、損傷を受けていない二重 らせんとして存在する同じＤＮＡの動きに比べて、著しく減少する事実に基づい ている。分離することができる配列類は、それぞれ低及び高融解点を有する典型 的には二つのドメイン（domain）からなる。このことは、変性濃度の狭い間隔の 範囲 に、部分的に非損傷の二重らせん及び損傷をうけていない二重らせんを含む融解 中間体類を得ることを可能にする。塩基の総数において同じ長さを有するが、単 一の点突然変異により異なるそのような分子の混合物が、変性グラジエントの存 在するゲル中で移動する場合、本来の分子（native molecular）と部分的に融解 された分子の間に異なる平衡が起こり、そのためにそのような分子類は、電気泳 動実施中に分離することができる。一般に、部分的に融解された分子は、本来の 分子に比べて、よりゆっくり移動する。何故なら、前者の回転運動の半径は、後 者のそれより大きく、そのために移動に対する摩擦抵抗は、部分的に融解された 種に対して大きくなるからである。典型的に用いられるものとして、このＤＧＧ Ｅ方法は、正常及び突然変異体ＤＮＡ鎖を混合し、その試料を（すべての鎖の） 融解点以上に加熱して、「ホモ−」及び「ヘテロ−」二重らせんの混合集団を形 成させ、続いて穏やかに冷却することを含む。ヘテロ−二重物類は、一般にホモ −二重物よりも低い融解点を有する。何故なら、前者において突然変異の領域で いくつかの塩基の不適当な組み合わせが起こるからである。結論として、ホモ− 及びヘテロ−二重物のそのような混合物が、変性のグラジエント中で移動する場 合、それらは、それらの異なる融解点のために異なるピークに分離することがで きる。一般に、正常な（野生−型、Wt）及び突然変異（M）鎖類が、融解され、 再アニーリングされるならば、統計的理由から二重らせんの４つのタイプ：二つ のホモ−二重物類（Wt/Wt及びM/M）及び二つのヘテロ−二重物類（Wt/M及びM/Wt ）の形成を期待することができるだろう。分析下の患者から増幅されたエキソン 中の点突然変異の存在の診断に期待することは、変性グラジエント中の移動経路 に従い、正確に４つのバンドのこのスペクトルの分離と検出である。Fischer an d Lermanの方法（そこでは、化学的変性のみが用いられている、例えば尿素、ホ ルムアミド）の基本的変法は、核酸の場合に丁度有効である、熱的変性の方法で ある。この最後の方法（熱変性ゲル電気泳動、ＴＧＧＥと呼ばれる、Riesner，H enco and Sterger，Advan．Electr．4，1991，171-250）において、温度グラジ エント（例えば、３０〜９０℃）が、移動方向に垂直又は平行のいずれかでゲル スラブの端に適用される。この方法の変法において、そのような温度グラジエン トは、キャピラリの部分ばかりでなく、丁度よい時間においてもキャ ピラリの内側にもたらされる(temperature programmed capillaryelectrophresi s，Gelfi，Righetti，Cremonesi and Ferrari，Electrophoresis 15，1994，150 6-1511)。 今日、点突然変異をスクリーニングするための最も通常の二つの分析方法は、 ＤＧＧＥ及びＴＧＧＥである。しかしながら、この両方法は、いくつかの欠点が あり、正確な診断をしばしば妨げている。先ず第一に、種々のＤＮＡ（それらは 、異なるエキソンから増幅されている）は、異なる構造及び広範囲に異なる融解 点（Tm）（それは、変性濃度の広い間隔を覆うことができる）を有するので、変 異のいかなるタイプにも適合させることできる実験条件（電気泳動の期間及び変 性のグラジエントの勾配）を見出すことが困難である。したがって、突然変異の 異なるタイプのために、この方法の定型的適用に対して行われる適切な電気泳動 条件を見出さねばならない。更に、二つのホモ−二重物を分離するために必要と する電気泳動時間は、二つのヘテロ−二重物のそれよりもしばしば長いので、後 者は、通常の蛍光挿入染料（例えば、エチジウムブロミド）による検出を逃れる ように電気泳動経路に沿って分散したバンドをしばしば生成する。四つのバンド の特性スペクトルが検出できないとき、この分析は診断的価値を失う。 本発明の目的は、電気動力学方法において、正常又は点突然変異を有するＤＮ Ａ断片を分離するために、篩マトリックス（一般的に、排他的ではないがポリア クリルアミド）中の多孔度の共−線形グラジエントと組み合わせたＤＧＧＥ（又 はＴＧＧＥ）グラジエントの用途である。最初のグラジエントが時間の経過によ り二つのホモ−及びヘテロ−二重物を変性するために、したがって四つのバンド の特性スペクトルを生成させるために用いられるならば、（多孔度の）第二のグ ラジエントは、分散したバンド類（ホモ−及びヘテロ−二重物の両方）を再び密 にするために必要であり、それぞれの領域の理論的プレート高さを劇的に減少さ せ、したがって、特定の染色及び密度的に良好に視認し得る非常にまとまったバ ンドを生成させる。更に、（多孔度の）第二のグラジエントは、種々のＤＮＡ類 の移動を減少させる（それは、「孔の限界」に対して漸近的に減少し、移動は結 局終了する）ので、本発明で意図する方法は、ＤＮＡ突然変異のいかなるタイプ のための標準移動時間を適用することを可能にするので、したがって ＤＧＧＥ及びＴＧＧＥの両方の定型的適用を可能にする。更に、本発明は、キャ ピラリ電気泳動での、多孔度及び化学的（及び／又は熱的）変性のそのような二 重グラジエントの適用を可能にする。粘稠なポリマー溶液（直鎖又は分岐のどち らか）の用途は、本発明の部分であり、それは、本来の又は部分的に非損傷の分 子の回転半径に基づいてそのような核酸の篩、例えば多種、同時分析のためにキ ャピラリ電池を用いる可能性、並びにレーザー誘導の蛍光によりそのような核酸 領域を示す可能性を用いている。変性グラジエントの１種以上の同時使用、例え ば化学的（尿素及び／又はホルムアミド）及び熱的変性の多孔度グラジエントの 用途に組み合わせた組み合わせも本発明の部分である。変性のそのような組み合 わせた用途は、十分に低い温度を（ゲルスラブ形式又はキャピラリ中のどちらか で）溶媒の沸騰温度（典型的には、限定しないが水性溶媒）での適用を可能にす る。 現在まで用いられている標準のグラジエント（例えば、多孔度グラジエントが 存在しない場合に）を超える、本発明による多孔度グラジエントに組み合わせた 変性グラジエントの利点は、下記に説明されている。 ポリアクリルアミドゲルスラブ中でのＤＮＡ点突然変異類の分離 図１は、単一グラジエント（上のパネル）又は二重グラジエント（下のパネル ）のいずれかでの、正常な個体（Wt）及び点突然変異（Ｒ５５３Ｘ、１７８９ Ｃ→Ｔ）を有する患者から増幅されたＤＮＡ断片（嚢胞性繊維症）の分離を示し ている。上のパネルにおいて、分離は、定常濃度ゲル（６．５％Ｔ、ここで、Ｔ ＝全モノマー濃度）及び１０〜６０％（尿素又はホルムアミド）の変性グラジエ ントの存在下に行われた。下のパネルにおいて、分離は、しかしながら初めのも のと共−線形の多孔度の第二のグラジエントに組み合わせた同じ変性グラジエン ト（１０〜６０％）で行われた。この多孔度グラジエントは、マトリックス中で の全モノマー含量（％Ｔ）を、６．５〜１２％の間隔で変化させることにより得 ることができる。両方のグラジエント類は、移動軸に沿って配向されており、そ のために（化学的変性での低い含量及びモノマーの低い％を有する）グラジエン トの低い部分は、試料析出部位（陽極部位）に位置しているが、一方、グラジエ ントの高い部分は、陰極ゲル側に位置している。両方の場合（単一及び二重グラ ジエント）において、このゲルスラブは、同じ実施緩衝液（４０mM Ｔｒｉｓ、２０mMＥＤＴＡ、pH７．６；ＴＥＡ緩衝液）で、組み込まれている。 両方のゲルスラブは、以下の寸法を有している：０．７５mm厚さ、１５cm巾及び １５cm長さ。単一のグラジエントの場合において、電気泳動の実施は、１６０Ｖ で５時間行われ、二重グラジエントの場合には、７５Ｖで１５時間継続された。 実施の終了時に、両方のゲルは、エジウムブロミドで染色し、ＵＶ照射下に撮影 された。この二つのパネルは、両方のゲルの写真濃度的スキャンを表わしている 。上のパネルで示されているように、写真濃度的プロフィールは、二つのヘテロ −二重物（それらは、染色した後のゲルの目視による調べでさえも区別すること はできない）を明らかにすることができず、二つのホモ−二重物（wt/Wt及びM/M ）を表わす、先端でほとんど分離していない二重線をかろうじて検出できるだけ である。この場合、正確な診断はできない。逆に、二重グラジエント（下のパネ ル）を含むゲルにおいて、点突然変異の存在を特徴ずける四つのピークのスペク ルが、明確に見られ（Wt/M、M/Wt及びM/M、Wt/Wt）、一義的な診断を可能にする 。更に、第二の場合に記録のベースラインが低くかつ一定であるが、単一グラジ エントゲルの場合には、このベースラインが、ピークの帰属を妨げるように、波 打ちかつ高く不規則であることに注目すべきである。 図２は、単一グラジエント（上のパネル）又は二重グラジエント（下のパネル ）での前の実施例と同様に分析されたＣＦＴＲ遺伝子（エキソン２０、Ｓ１２５ Ｎ、３３８４ Ｇ→Ａとして既知）での別の点突然変異の分析を示しており、こ の変異物が高い融解温度を有するので、ゲルは傾斜がよりするどいグラジエント ２０〜７０％を含むことが異なる。この場合、単一グラジエントゲルは、二つの ホモ−二重物（M/M及びWt/Wt）を十分に分離するが、二つのヘテロ−二重物（こ れは、仮にWt/M及びM/Wtと記した二つのものに帰属させた）の存在についての明 確な糸口は与えていない。ここでまた、ベースラインの記録された波打ちは、小 さなピークの明確な同定を可能にしない。これとは逆に、二重グラジエントを含 むゲルは、その本来の、分散したバンドを再び集める能力のために、四つのバン ドのスペクトルをすべてを分離し、明確に同定（下のパネル）し、正確な診断を 可能にしている。又、この場合、ベースラインは、波打たず一定である。 図３は、単一グラジエント（上のパネル）又は二重グラジエント（下のパネル ） での、図１の実施例と同様に分析されたＣＦＴＲ遺伝子（エキソン１、Ｓ１２５ Ｇ／Ｃとして知られている）での別の点突然変異の分析を示しており、この変異 物が高い融解温度を有するので、用いられた変性グラジエントは、４０〜９０％ の濃度範囲に広がることが異なる。この場合、対照（上のパネル）は、二つのヘ テロ−二重物（Wt/T及びM/Wt）の良好な分離を示すが、二つのホモ−二重物の領 域では単一のピーク（それは、多分むしろ類似のＴｍを有する）を示している。 これに反して、二重グラジエントを含むゲルは、ベースラインは、一定ではない が、二つのヘテロ−二重物の優れた分離及び二つのホモ−二重物の良好な分離を 示している。 キャピラリ電気泳動でのＤＮＡ点突然変異類の分離 上記の方法は、キャピラリ電気泳動（ＣＺＥ）に適用され、単一のグラジエン トの方法に比べて顕著に改善された結果を与えた。（数マイクロリッターの単位 で）混合されるべき液体の非常に少量のために、化学物質のグラジエントを調製 することは、現在まで不可能であった。微量取り扱い技術により、そのようなキ ャピラリを、化学的変性及び多孔度の両方のグラジエントで満たすことが可能で ある。図４は、そのような分析の結果を示している。溶融シリカキャピラリは、 先ず内浸透性電流を避けるために、内部壁を、高い親水性、かつアルカリ加水分 解に対する高い耐性を有するポリ（Ｎ−アクリロイルアミノエポキシエタノール ）のポリマーを繋ぎ止めるように処理される。対照において、キャピラリは、ア クリルアミドモノマーの一定濃度（例えば、６％Ｔ）（これは、次いでその場所 で重合される）の存在下に、緩衝液（ＴＢＥ：８．９mMＴｒｉｓ、８．９mMホウ 酸塩、１mMＥＤＴＡ、６M尿素、１０mMＮａＣｌ、pH８．３）で満たされる。ア クリルアミドは、架橋剤なしに重合することができ、したがって粘稠なポリマー 溶液を形成し、それは、またＤＮＡ被分析物の良好な篩として働く。二重グラジ エントの場合に、このキャピラリは、同じ緩衝液、しかしモノマー濃度のグラジ エント（例えば、６〜８％又は６〜１０％）を含む緩衝液で、（下に示したよう に、段階的濃度プラトーの一連の溶液の連続注入により）満たされる。図４に関 して、（変性の）第二のグラジエントは、両方の場合に、熱的グラジエントであ り、それは、種々のホモ−及びヘテロ−二重物類(ＣＦＴＲ遺伝子のエキソン１ １、 １７１７１Ｇ→Ａとして知られている)のＴｍ値を包含するように、５６〜５８ ℃の温度間隔を包含している。ＣＺＥの変性として熱的グラジエントを用いたと き、緩衝液は、１０mMＮａＣｌと共に加えられ、それは、ＤＮＡの変性を助け、 ジュール効果（一時的な熱的グラジエントは、電圧経路を経由する実施の間に、 Gelfi et al.，Electrophoresis 15，1994，1506-1511により記載されているよ うに、活性化される）により、熱的グラジエントの調製を助ける。ＤＮＡバンド 検出は、２６０nmでのＤＮＡの本来のＵＶ吸収により、キャピラリ経路に沿って 、その場所で行われる。図４のパネルＤは、熱的及び多孔度の両方のグラジエン トなしでの、対照実験を示している。変性グラジエントがないので、二重らせん の部分的な解旋がなく、（８０分での）溶出されたピークは、ホモ−及びヘテロ −二重物の四つのバンドの包含物を示している。パネルＡは、単一グラジエント （５６〜５８℃での熱的変性）の存在での分析を示している。二つのホモ−二重 物は、良好に分離されているが、二つのヘテロ−二重物は、非常に分散した領域 （これは、仮にWt/M及びM/Wtとして記入されている）を与えている。パネルＢに おいて、同じ分析が繰り返されたが、６〜８％Ｔの多孔度グラジエントが存在し ている。二つのヘテロ−二重物は、今や良好に見ることでき、容易に同定するこ とができる。最後に、パネルＣにおいて、より傾斜のするどい多孔度グラジエン ト（６〜１０％Ｔ）の存在で、同じ分析が繰り返された。二つのホモ−二重物は 、ベースラインで分離されていることを今や評価することができる。 キャピラリ中での化学的及び／又は多孔度グラジエントの調製 そのようなグラジエントは、コンピュータ駆動マイクロシリンジ及び微量混合 室を含む微量操作装置の助けにより調製することができた。非常に簡単な方法が ここに記載されている。所望の多孔度（若しくは化学的変性、又は両方）グラジ エントの段階的濃度を含む一連の溶液が調製されている。これらの溶液は、キャ ピラリ電気泳動装置（例えば、Beckman P/ACE 5100、Bio Rad Bio Focus 2000な ど）回転試料台に順番に配置され、キャピラリ中に順番に注入される（典型的な 注入圧は、０．５psi、すなわち３４４８．４Pa）。もし、段階的に変化する化 学濃度を含む溶液を注入するならば、キャピラリ中の濃度プロフィールは、段階 的であると期待される。しかしながら、加圧注入の間にキャピラリ中に起こる、 放物線流のプロフィールは、特に大きなグラジエント領域で、濃度を不均一に減 ずる更なる分散要因として働く。これらの領域は、一つの濃度プラトーが他のも のに続いている隣り合った階段の間の一つである。この過程はよく知られており 、Taylor(Proc．R．Soc．London，Ser．A，219，1953，186-200)により展開され ているように、キャピラリ中の分散理論に基づいている。合理的な平滑なグラジ エントを得るために、どの位の数の濃度段階が注入されるべきかの問題が残る。 された。最終結果は、図５に示されており、そこでは、３〜８％(増加分、０． ５％)間隔濃度のアクリルアミドを含む１１の溶液を順番に注入して得た濃度プ ロフィール、及び３３cmのキャピラリ長さ（したがって、有用な分離軸、検出窓 の丁度先含む）の広がりを示している。注入点近傍でのいくらかの波打ちパター ンを除いて、濃度グラジエントは、特に検出点、すなわち分離キャピラリの最も 重要な部分、へ向かう領域で顕著に平滑である。したがって、黄金律として、そ れぞれの濃度プラトーは、注入されたとき、合理的な平滑グラジエントを得るた めに、約３cmの全キャピラリ長さを占有すべきである。 いくつかの異なる特徴において、本発明は、また、非−平等条件を必要とする 全ての電気泳動による分離のためのゲルスラブ又はキャピラリでの、組み合わせ た（すなわち多重の）グラジエントの用途にも関する。 本発明の教示は、またタンパク質の突然変異、サブユニットへの解離、形態的 移行の、ゲル−スラブ形式及びキャピラリの両方での分析のための、変性剤若し くは手段（化学的又は熱的のいずれか）のグラジエントに組み合わされた多孔度 グラジエント、又は組み合わされた三重グラジエントの用途、並びにキャピラリ 電気泳動でのキラル分離を最適化するための、上記のグラジエント（熱的、化学 的、多孔度の、単一又は組み合わせて）の用途に関する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ゲルスラブ又はキャピラリのどちらかでの電気泳動手法でのゲノムＤＮＡの 断片の分離及び同定のための方法であって、変性剤若しくは手段（化学的又熱的 のいずれか）のグラジエントに対して組み合わせた多孔度グラジエントを用いる ことを特徴とする方法。 ２．ヒトゲノムＤＮＡの点突然変異の分離及び同定のための、請求項１記載の方 法。 ３．ポリアクリルアミド類、改質アガロース類、セルロース類、セルロース誘導 体類及び相当する物理的混合物類又は架橋したポリマー類からなる群から選択さ れる篩い分けゲルスラブ上で実施される、請求項１又は２記載の方法。 ４．円形又は直角横断面を有し、ポリアクリルアミド類又は他の篩い分けポリマ ー類で形成された多孔度グラジエントで満たされ、化学的変性剤、若しくは熱的 変性手段又はそれらの両方のグラジエントと組み合わせた、キャピラリ電池で実 施される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 ５．多孔度グラジエントが、直鎖又は分岐ポリマーの粘性溶液で構成されている ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 ６．多孔度グラジエントが、ホモポリマーとしてか又は異なるモノマーのコポリ マーとしてかのいずれかとして、加水分解−耐性ポリアクリルアミド類で構成さ れていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。 ７．ポリアミド類が、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ア クリロイルアミノエトキシエタノール）、ポリ（Ｎ−アクリロイルアミノプロパ ノール）、ポリ（Ｎ−アクリロイルアミノブタノール）及び相当するコポリマー 並びにそれらの混合物類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項６ 記載の方法。 ８．検出が、レーザービームによっても誘導される蛍光によって行われることを 特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。 ９．非−平等条件を必要とするすべての電気泳動による分離のための、ゲルスラ ブ又はキャピラリ中での組み合わせた（すなわち、多重の）グラジエントの用途 。 １０．ゲルスラブ形式及びキャピラリ中の両方で、サブユニット類への解離、構 造的移行についての、タンパク質類の突然変異の分析のための、変性剤若しくは 手段（化学的又は熱的のいずれか）のグラジエント又は組み合わされた三重グラ ジエントに組み合わされた多孔度グラジエントの用途。 １１．キャピラリ電気泳動でのキラル分離を最適化するための、上記のグラジエ ント類（熱的、化学的、多孔度の、単一又は組み合わせてかのいずれかで）のい ずれかの用途。