JP2001004591A - キャピラリー電気泳動用ゲル及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 キャピラリーカラムの内壁に化学処理を施さ
なくても複数回の測定に渡ってキャピラリーカラムを使
用することができるキャピラリー電気泳動用ゲル及びそ
の製造方法を提供する。 【解決手段】 ９０〜１００℃の熱水にポリエチレンオ
キサイドポリマー粉末を溶解してポリエチレンオキサイ
ド水溶液を調製し、自然冷却で室温にもどした後、冷蔵
庫で５℃に保って一晩寝かせた。次に、尿素の濃度が７
Ｍになるように、４０〜６０℃の温度の温浴槽中で固形
尿素を溶解混錬してゲルを作製した。そのゲルを用い
て、１本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍｐ１８の塩基配列をシ
ーケンシングしたところ、約６８０ベースのシーケンシ
ングが可能であった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はキャピラリー電気泳
動において使用されるキャピラリー電気泳動用ゲル及び
その製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】電気泳動装置は核酸、蛋白質、アミノ酸
などの生体分子を分離分析するために使用されており、
特に、ＤＮＡの塩基配列の解析に重要な役割を果たして
いる。ヒトゲノムのような長大な塩基配列をもつＤＮＡ
の塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大処理能
力をもったＤＮＡシーケンサが必要となる。その１つの
方法として、平板状のスラブゲルを用いたものに代わっ
てゲルを充填したキャピラリーカラムを複数本配列した
マルチキャピラリー電気泳動装置が提案されている。キ
ャピラリーカラムは、スラブゲルに比べて、試料の取扱
いや注入が容易であるだけでなく、高速に泳動させて高
感度で検出できる。つまり、スラブゲルで高電圧を印加
すれば、ジュール熱の影響によりバンドが広がったり、
温度勾配が生じるなどの問題が生じるが、キャピラリー
カラムではそのような問題は少なく、高電圧を印加して
高速泳動をさせても、バンドの広がりが少なく高感度検
出ができるのである。

【０００３】通常、キャピラリー電気泳動では、シリカ
ガラス製のキャピラリーカラムが用いられ、分離媒体と
してそのキャピラリーカラムに架橋ポリアクリルアミド
が充填される。架橋ポリアクリルアミドなどの架橋マト
リックスゲルは、材料分子がキャピラリーカラムに充填
された後、キャピラリーカラム内で重合されることによ
りゲルマトリックスを形成するとともに、キャピラリー
カラムの内壁とゲルとが結合して架橋構造を形成するこ
とによって分離能力を示す。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、架橋マトリッ
クスゲルには、 １）キャピラリーカラム中での重合中に気泡が発生する
ことがあり、その場合はそのキャピラリーカラムは使用
できず、破棄しなければならないこと、 ２）電気泳動中にキャピラリーカラム端に気泡が発生す
ることがあり、分析の再現性が不安定になること、 ３）電気泳動中に電気浸透流の発生により、ゲルマトリ
ックスがキャピラリー端からずり出すこと、 ４）核酸分析において、鋳型核酸によりキャピラリーカ
ラムの入り口が汚染されること、などの問題があった。 このような問題により架橋マトリックスゲルを用いたキ
ャピラリーカラムは作製が難しく、さらに、キャピラリ
ーカラムの使用回数も良くて数回、通常は１回の測定に
しか使用できないという問題もあった。

【０００５】このような問題を解消すべく、最近ではメ
チルセルロースやヒドロキシエチルセルロースなどのセ
ルロース系ポリマーや線状ポリアクリルアミドといっ
た、予め重合させた非架橋マトリックスゲルを分離媒体
に用い、非架橋マトリックスゲルをキャピラリーカラム
に充填し、分析後に排出することにより、キャピラリー
カラムを数回以上の測定に渡って使用可能とする報告が
されている。しかし、セルロース系ポリマーを用いる場
合、キャピラリーカラムの内壁がシリカガラス素地のま
までは、セルロース系ポリマーとキャピラリーカラムの
内壁との相互作用が弱く、十分な核酸の分離が見られな
いので、キャピラリーカラムの内壁にポリマー膜を形成
するなどの化学処理を行なう必要がある。そのため、前
処理に手間がかかり、またその分コスト高になる。

【０００６】線状ポリアクリルアミドはシリカガラスと
の相互作用が強く、セルロース系ポリマーのようにキャ
ピラリーカラムの内壁に化学処理を施さなくても使用可
能である。そこで本発明は、線状ポリアクリルアミド以
外に、キャピラリーカラムの内壁に化学処理を施さなく
ても複数回の測定に渡ってキャピラリーカラムを使用す
ることができるキャピラリー電気泳動用ゲル及びその製
造方法を提供することを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明のキャピラリー電
気泳動用ゲルは、数平均分子量（以下、単に平均分子量
という）が２０,０００〜２０,０００,０００のポリエ
チレンオキサイドを１〜５wt％と、５〜７Ｍの尿素とを
含有するものである。ポリエチレンオキサイドは水溶性
のポリマーである。平均分子量が２０,０００〜２０,０
００,０００のポリエチレンオキサイドを１〜５wt％の
濃度で含有するように水溶性ゲル（ポリエチレンオキサ
イド水溶液）を調製すると、高い分離能力をもつ非架橋
マトリックスゲルを作製することができる。その水溶性
ゲルにおいて、架橋マトリックスゲルのもつ問題点は生
じない。さらに、変性剤として５〜７Ｍの濃度で尿素を
混錬するので、核酸の高次構造を壊して、電気泳動時の
検出ピークのコンプレッション（重なり）を抑えること
ができる。

【０００８】ポリエチレンオキサイドの濃度が１wt％未
満の場合はシーケンシングにおいて十分な分離が見られ
ないことがあり、また、５wt％を越える場合は粘度が高
くなるのでキャピラリーカラム内にゲルを充填するのに
手間がかかり、さらに泳動が遅くなるので測定時間が長
くなる。また、平均分子量が２０,０００未満の場合は
ポリエチレンオキサイド濃度が１wt％未満の場合と同様
の問題を生じ、また、平均分子量が２０,０００,０００
を越える場合は粘度が高くなるのでポリエチレンオキサ
イド濃度が５wt％を越える場合と同様の問題を生じる。
そこで、平均分子量が２０,０００〜２０,０００,００
０のポリエチレンオキサイドを用い、そのポリエチレン
オキサイドの濃度を１〜５wt％とする。

【０００９】本発明のキャピラリー電気泳動用ゲルの製
造方法は、平均分子量が２０,０００〜２０,０００,０
００のポリエチレンオキサイドを１〜５wt％で含有する
ようにポリエチレンオキサイド水溶液を調製する工程
と、そのポリエチレンオキサイド水溶液を４０〜６０℃
に加温しつつ、それに尿素を５〜７Ｍの濃度で混錬する
工程とを含むものである。

【００１０】ポリエチレンオキサイドを分離媒体として
用いた場合、常温のポリエチレンオキサイド水溶液への
高濃度の尿素の添加はその水溶液中に白濁物の析出を生
じる。そこで、固形尿素を溶解混錬するときに、ポリエ
チレンオキサイド水溶液を４０〜６０℃に加温しておく
ことにより、尿素を７Ｍまでの濃度で混錬することがで
きる。ここでは、ポリエチレンオキサイド濃度を表す単
位としてwt％（重量％）を用い、尿素濃度を表す単位と
してＭ（モーラー）を用い、ホルムアミド濃度を表す単
位としてvol％（体積％）を用いる。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のキャピラリー電気泳動ゲ
ルにおいて、濃度が１５vol％までのホルムアミドをさ
らに含有することが好ましい。１本鎖核酸の分離分析を
正確に行なうべく、水素結合による核酸の高次構造を壊
すことを目的として、一般には８Ｍ以上の尿素をゲルに
添加し、また場合によってはホルムアミドをゲルに添加
する。しかし、本発明にかかるキャピラリー電気泳動ゲ
ルでは、尿素を７Ｍまでの濃度でしか含有できない。そ
こで、さらに１５vol％までのホルムアミドをさらに含
有することにより、核酸の高次構造形成を阻害する十分
な量の変性剤を含ませることができる。

【００１２】

【実施例】ポリエチレンオキサイド水溶液をキャピラリ
ー電気泳動ゲルとして用いる場合のポリエチレンオキサ
イド及び変性剤の濃度の適当な条件を検討した。キャピ
ラリー電気泳動ゲルにおいては、ポリマー濃度が高いほ
ど、また平均分子量が大きいほど分離能力が高くなる
が、その反面ゲル粘性も高くなる。ゲル粘性が高すぎる
と、試料の分離時間が長くなり、また、キャピラリーカ
ラムへのゲルの充填などの操作性が悪くなる。そこで、
通常の測定時間及び操作性の点から、平均分子量が２
０,０００〜２０,０００,０００のポリエチレンオキサ
イドを用い、そのポリエチレンオキサイドを１〜５wt％
の濃度で含有するようにゲルを作製することが好まし
い。実施例では、平均分子量が８,０００,０００、濃度
が３wt％のものを用いた。また、作製したゲルの分離能
力を検討するために、内径が５０μｍ、分離長が５０ｃ
ｍのキャピラリーカラム（Polymicrotechnology 社製）
を内壁に化学処理を施さずに用いた。

【００１３】ポリエチレンオキサイドは水溶性のポリマ
ーであるが、常温の水に大量のポリエチレンオキサイド
ポリマー粉末を入れると凝集体（ママコともよばれる）
ができやすく、均一に溶解することは難しい。そこで、
９０〜１００℃の熱水を用いると、ポリエチレンオキサ
イドポリマー粉末を均一に溶解することができた。この
ポリエチレンオキサイド水溶液を自然冷却で室温にもど
し、冷蔵庫で５℃に保って一晩静置した。

【００１４】次に、上記で調製したポリエチレンオキサ
イド水溶液に固形尿素を様々な濃度で混錬した。本発明
者の実験によれば、８Ｍの濃度になるように固形尿素を
室温で溶解させたが、尿素過剰によるポリエチレンオキ
サイドとの化合物と思われる白濁析出物が生じ、測定に
使用できるようなものにはならなかった。そこで、４０
〜６０℃の温度の温浴槽中で、８Ｍの濃度になるように
固形尿素を溶解混錬したところ、見た目には均一溶解し
ているゲルができた。しかし、そのゲルを室温で放置し
ておいたところ、上記の白濁析出物と同じものと思われ
る白濁物が析出した。そこで、尿素の濃度が７Ｍになる
ように、４０〜６０℃の温度の温浴槽中で固形尿素を溶
解混錬してゲル（サンプル１）を作製したところ、約１
ヵ月間室温で放置しても析出物は生じなかった。このこ
とから、析出物を生じることなくゲルを作製するには、
４０〜６０℃の温度の温浴槽中で、尿素濃度が７Ｍまで
の濃度になるように固形尿素を溶解混錬することが好ま
しい。また、核酸の高次構造を壊すべく、５Ｍ〜７Ｍの
濃度の尿素を含有するように作製することが好ましい。

【００１５】また、核酸試料の種類によっては、ホルム
アミドを変性剤として用いる場合がある。また、上記に
示したように、この実施例においては尿素を７Ｍの濃度
までしか混錬することができないので、変性剤として７
Ｍ以上の量の尿素を必要とする場合は、ホルムアミドを
添加することにより対応することができる。

【００１６】次に、上記で調製したポリエチレンオキサ
イド水溶液に様々な濃度で尿素及びホルムアミド、又は
ホルムアミドのみを混錬してゲルを作製した。ポリエチ
レンオキサイド水溶液に、尿素を３．５Ｍの濃度で温浴
槽中で溶解混錬した後、自然冷却で室温にしてからホル
ムアミドを３０vol％の濃度で混錬した（サンプル
２）。ポリエチレンオキサイド水溶液に、ホルムアミド
のみを６０vol％の濃度で室温で混錬した（サンプル
３）。ポリエチレンオキサイド水溶液に、尿素を６Ｍの
濃度で温浴槽中で溶解混錬した後、自然冷却で室温にし
てからホルムアミドを１５vol％の濃度で混錬した（サ
ンプル４）。

【００１７】このようにして作製したサンプル１〜４を
用いて、１本鎖ＤＮＡであるＭ１３ｍｐ１８の塩基配列
をシーケンシングした。表１に、各サンプルの尿素濃
度、ホルムアミド濃度及びシーケンシングベース数を示
す。

【００１８】

【表１】

【００１９】サンプル１では、生データで約６８０ベー
スのシーケンシングが可能であった。その生データには
検出ピークのコンプレッションが見られなかったことか
ら、ゲルに混錬した尿素により、核酸の水素結合による
高次構造を壊せたことがわかる。この場合は、尿素を７
Ｍの濃度で混錬することにより、変性剤の量は十分であ
るといえる。サンプル２では、生データにフロンティン
グが見られ、シーケンシングも３００ベースに満たない
結果となり、サンプル１に比較して著しく分離能力が低
下した。ここで、フロンティングとは、検出ピークの最
高値がその検出ピークの中央よりも時間的に後方に出現
し、検出ピークの中央に対する対称性が失われることを
いう。フロンティングが生じたデータからは正確な解析
を行なうことは困難である。

【００２０】サンプル３では、シーケンシング信号自体
が見られなかった。このことから、ポリエチレンオキサ
イドとホルムアミドの組合せは、ポリエチレンオキサイ
ドの分離能力を低下させることがわかる。サンプル４で
は、約６００ベースのシーケンシングが可能な結果が得
られた。サンプル１と比べて若干分離能力が低下してお
り、サンプル４の生データをサンプル１の生データと比
べると、若干ピーク間隔が狭くなっていた。図１及び図
２に、サンプル４を用いてＭ１３ｍｐ１８の塩基配列を
シーケンシングした結果を表す生データを示す。横軸は
ベース数である。図に示されるように、約６００ベース
まで解読できている。

【００２１】これらのことから、混錬する尿素を減らし
てホルムアミドを加えたことによってゲルの粘度の低下
が起こり、分離能力が低下したと考えられないことはな
い。ホルムアミドによる分離能力低下の影響は払拭でき
ないが、少なくともホルムアミド濃度が３０vol％と１
５vol％では大きな違いがあり、ホルムアミド濃度が１
５vol％以下であればシーケンシングに使用可能である
と判断できる。以上より、ポリエチレンオキサイドを用
いたゲルについて、変性剤の含有濃度範囲として、尿素
は５〜７Ｍ、ホルムアミドは０〜１５vol％が適してい
るといえる。

【００２２】

【発明の効果】本発明のキャピラリー電気泳動用ゲル
は、平均分子量が２０,０００〜２０,０００,０００の
ポリエチレンオキサイドを１〜５wt％と、５〜７Ｍの尿
素とを含有する非架橋マトリックスゲルであり、ポリエ
チレンオキサイドはキャピラリーカラムの内壁と十分な
相互作用をもつので、キャピラリーカラムの内壁に化学
処理を施さなくても十分な分離能力を示し、さらにゲル
の交換により複数回の測定に渡ってキャピラリーカラム
を使用することができる。本発明のキャピラリー電気泳
動用ゲルの製造方法は、平均分子量が２０,０００〜２
０,０００,０００のポリエチレンオキサイドを１〜５wt
％で含有するようにポリエチレンオキサイド水溶液を調
製する工程と、そのポリエチレンオキサイド水溶液を４
０〜６０℃に加温しつつ、それに尿素を５〜７Ｍの濃度
で混錬する工程とを含むので、ポリエチレンオキサイド
水溶液を白濁物析出を生じることなく作製することがで
きる。また、本発明のキャピラリー電気泳動ゲルにおい
て、濃度が１５vol％までのホルムアミドをさらに含有
すると、核酸の高次構造形成を阻害する十分な量の変性
剤を含ませることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 一実施例を用いてＭ１３ｍｐ１８の塩基配列
をシーケンシングした結果を表す生データの前半部を示
す波形図である。

【図２】 同データの後半部を示す波形図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 数平均分子量が２０,０００〜２０,００
   ０,０００のポリエチレンオキサイドを１〜５wt％と、
   ５〜７Ｍの尿素とを含有することを特徴とするキャピラ
   リー電気泳動用ゲル。
2. 【請求項２】 濃度が１５vol％までのホルムアミドを
   さらに含有する請求項１に記載のキャピラリー電気泳動
   用ゲル。
3. 【請求項３】 数平均分子量が２０,０００〜２０,００
   ０,０００のポリエチレンオキサイドを１〜５wt％で含
   有するようにポリエチレンオキサイド水溶液を調製する
   工程と、前記ポリエチレンオキサイド水溶液を４０〜６
   ０℃に加温しつつ、それに尿素を５〜７Ｍの濃度で混錬
   する工程と、を含むことを特徴とするキャピラリー電気
   泳動用ゲルの製造方法。