JPH026740A - 改良毛細管ゲル電気泳動カラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は電気泳動に関する。さらに詳しくは、１　。

本発明は高性能電気泳動用のゲル含有毛細管カラムに関
する。

（従来技術） 電気泳動は生物学関係科学分野において最も広く使用さ
れている分離技術の１つである。ペプチド、蛋白質およ
びオリゴヌクレオチドのような分子種は、これらを電界
の下で緩衝液中において移動させることにより分離され
る。この緩衝液は通常低濃度から中濃度の適切なゲル化
剤、例えばアガロースまたはポリアクリルアミドと共に
用いられ、対流混合の発生を最４＼限に抑え、分子の大
きさによって分析物を分離する。

電気泳動には、２つの主要な分離機構が存在しており、
１つは分析物の有効電荷の差に基づく分離であり、もう
１つは分子の大きさに基づく分離である。前者の上記機
構はオリゴヌクレオチドな分離する場合に限られる。な
ぜならば高分子量を有する物質の有効電荷はかなり類似
しており、このためこれら物質を分離することが不可能
であるからである。蛋白質を分離する場合、電荷および
分子の大きさが別々に利用される。分子の大きさに基づ
く分離は、通常分子篩として考えられ、均一な気孔の大
きさを有する分離媒質ゲルマトリックスとして使用する
ことにより行な彩れる。そのような分離システムにおい
て、各分析物の有効電荷が同じである場合、分離番よ、
各大きさの異なる分子種のゲルマトリックス透過能力の
差によって行なわれる。小さな分子は、大きな分子より
比較的速やかに所定の大きさの気孔を有するゲルを通過
する。オリゴヌクレオチドおよび媒質から高分子量のポ
リペプチドおよび蛋白質に至るまで、通常分子篩電気泳
動により分離される。しかしなから蛋白質状物質の場合
、まず第１に、各分離すべき物質がすべて同じ有効電荷
な持つように、これら物質を変性することが必要である
。このことは通常５ＤＳ−ＰＡＧＥ誘導化方法を用いる
ことにより行なわれる。上記５ＤＳ−ＰＡＧＥ誘導化方
法は、例えば、Ｂ、Ｄ、　　Ｈａｍｅｓおよびり。

Ｒｉｃｈｗｏｏｄ共著、ｒＧｅｌ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓｉｓ　　ｏｆ　　ＰｒｏｔｅｉｎｓＪ、ＩＲ
Ｌ　　Ｐｒｅｓｓ発行、○ｘｆｏｒｄおよびＷａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ　　Ｄ、Ｃ０，１９８１年に述べられている
。この文献の内容は引用によりここに合体されたものと
する。

時には、変性の危険性の少ない条件の下で蛋白質状物質
を分離することが望ましい。場合によっては、尿素およ
びＳＤＳのような添加物を避けて、分子の大きさおよび
電荷の両方の差に基づいて分離を行なうこともできる。

現在、殆どの電気泳動分離はスラブまたは開放床内で行
なわれている。しかしなから、そのような分離はオート
メーション化または大量処理が難しい。さらに、ポリア
ミドゲル層は、かなり弱く且つ容易に破壊されてしまう
ことが知られている。そのようなゲル層に可塑性を付与
するために、且つ粘度を制御するために、ＯｇａＷａは
ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）
、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールおよび
ポリプロピレングリコールのような水溶性重合体添加剤
を採用した。例えば、米国特許第４．　６９９．　７０
５号、第４．　６５７．　６５６号、第４，６００，６
４１号および第４，５８２．６８６号参照。電気泳動用
平型ゲル層に関する他の問題点は、これらゲル層が高い
電界の下でジュール熱効果を受けるということである。

異なる有効電荷を有する物質の極端に高い精度の分離は
、開放管状自由領域電気泳動および細い毛細管内におけ
る等速電気泳動により行なお九でいた。さらに多量の処
理は電気浸透により行なわれ、非常に鋭いピークを形成
することができる。

しかしなから、そのような開放管状電気泳動は、媒質か
ら高分子量のオリゴヌクレオチドに至る物質の分離には
適用できない。なぜならばこれら物質は上記に述べたよ
うに、非常に良く似た有効電荷を有するからである。さ
らに、開放管状電気泳動では、蛋白質状物質を大きさに
より分離するこができない。従って、ゲル含有毛細管に
よる電気泳動を利用してオリゴヌクレオチドの高精度分
離が可能かどうか、そのような毛細管内における非変性
ゲルを使用して蛋白質状物質の分離が可能かどうか、ま
た５ＤＳ−ＰＡＧＥの従来の方法をそのような毛細管で
実施することが可能かどうかの問題がある。本明細書に
述べられているように、これら疑問に対する回答は本発
明により解決することができる。驚くべきことであるが
、毛細管ゲル電気泳動は、生物科学分野において分離技
術として重要であるにもかかわらず、殆ど注目されなか
った。Ｈｊ　ｅ　ｒ　ｔ　ｅ　ｎはｒＪｏｕｒｎａｌｏ
ｆ　　ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＪ、２７０巻、１
〜６．１９８３年、題名ｒＨｉｇｈ　　Ｐｅｒｆｏｒｍ
ａｎｃｅ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：　　Ｔ
ｈｅ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｔｉｃ　　Ｃｏｕｎｔ
ｅｒｐａｒｔ　　ｏｆ　　ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎ
ｃｅ　　Ｌｉｑｕｉｄ　　Ｃｈｒ。ｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙＪの論文を発表した。ここで彼は５０〜３００マイク
ロメートルの内径および１００〜２００マイクロメート
ルの肉厚を有する管内にポリアミドゲルを使用した。し
かしなから、この方法では、比較的大きな気孔の毛細管
、比較的低い電界、且つ高い電流を採用しているので、
効率が低く且つ性能が比較的悪い。彼はまた米国特許箱
３，７２８，１４５号を獲得し、この中で、メチルセル
ロースまたはポリアクリルアミドのような中性親水性物
質で大きな管の内壁を被覆し、電気浸透を滅ψさせる方
法な開示している。

毛細管ゲル電気泳動の場合、２つの化合物の分離は、バ
ンドの鋭敏性に影響を及ぼすすべての要因、例えば試料
の大きさ、試料中のイオン性物質およびゲル濃度により
左右される。後者のゲル濃度の要因は特に重要である。

なぜならばゲル濃度が高すぎると、分析物はカラムから
全部排出され、逆にゲル濃度が低すぎると、分子篩とし
ての作用が行なわれないからである。ゲル濃度に関して
は、蛋白質状物質またはオリゴヌクレオチドのあらゆる
混合物の分離に対して１つの定まった最適濃度が存在す
るわけではない。各特定の試料に対して適切な各ゲル濃
度を選ぶことが必要である。毛細管における電気泳動に
影響を及ぼす他の重要な変数は、印加する電界および採
用する電流である。

毛細管電気泳動に採用する電流は管の半径の２乗に比例
し、消費電力は所定の電圧において採用された電流の２
乗に比例する。従って、加熱効果を低い水準に保持する
ためには、低い電流が必要であり、このためにはさらに
、許す限りできるだけ小さな半径を有する管を使用する
ことが必要である。

毛細管電気泳動による分離に及ぼす印加電界の効果につ
いて、バンドの幅を広げることが軸方向の拡散のみによ
るものと仮定して、ＧｉｄｄｉｎｇｓはｒＳｅｐａｒａ
ｔｉｏｎ　　５ｃｉｅｎｃｅ」、４巻、１８１〜１８９
頁、１９６９年に述べているように、次の式を誘導した
： Ｒｓ＝　　Δｔｔ　Ｅ　ｆＴ／　４　ｆ７π式において
、Ｒｓは混合物の２つの成分の間の分離精度であり、Δ
μは２つの各溶質の電気泳動における移動度の差であり
、Ｅは印加した電界であり、ｔは電気泳動分析の時間で
あり、Ｄは媒質中における溶質の拡散係数（通常蛋白質
の場合、約１０−’ｃｍ２／秒である）である。ここで
、ｔ　　＝　　Ｌ／ＥＩＬｅｐ 式において、Ｌは注入点から検出地点までの管の長さで
あり、μｅｐは電気泳動における移動度であり、上記式
にｔを代入すると、 Ｒｓ　＝Δμ（ＥＬ）””　／４　（２μｅｐＤ）””
これらの式によれば、バンド幅の拡大が軸方向の拡散に
よる場合、印加電界Ｅを増加させることは、あらゆる状
況において分離を高める。しかしなから、理解されるよ
うに、印加電位を増加させることは電流を増加させ、さ
らに熱を増加さ、この熱は最終的に放出しなければなら
ないものである。従って、最善の分離効果設得るために
、最後の分析において、取り扱い可能な熱的作用の下で
最も高い印加電界を使用しなければならない。従って、
高い印加電界を受は入れることができ、且つそのような
電界により生成された熱作用を受けないゲル含有毛細管
電気泳動カラムが大変望ましいわけである。

（発明の目的） 先行技術の多くの欠点は、高性能電気泳動用の改良ゲル
含有毛細管？提供する本発明により解決され、且つ上記
要求事項もまた本発明により満たされる。

（発明の構成） 本発明は、毛細管と、この毛細管の内腔にポリエチレン
グリコールのような親水性重合体を含む架橋重合体ゲル
と、好ましくはさらに、毛ｍ管の壁の内面および重合体
ゲル材料の間における連結材料の非常に薄い層とから成
り、この連結材料の屡は毛細管壁および重合体ゲルの両
方に共有結合されている。好ましい毛細管構成材料は溶
融シリカであり、好ましい架橋重合ゲル材料はアクリル
アミドとＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミドとの
共重合体である。毛細管の壁および重合体ゲルの間にお
ける連結材料の層は、毛細管壁お内面上の反応性基、例
えばシラノール基と反応可能な第１反応性基、および重
合した時に重合体ゲルを構成する架橋剤およびビニルモ
ノマーと反応可能な第２反応性基を有する２官能性試薬
である。

親水性重合体添加物はゲルのカラムを安定化させて、破
壊および発泡を押える。また親水性重合体添加物を用い
わば、予想しないことであったが、比較的高いジュール
熱にもかかｂらず、非常に高い電界（即ち、正確には高
い電力）において毛細管カラムの操作が可能となり、非
常に高い分離性能が得られる。

ゲルが毛細管壁に結合している本発明の好ましいゲル含
有毛細管は幾つかの段階を経て生成される。まず、毛細
管の内面が基礎材料と接触されて、活性化し、次にこの
毛細管は、毛細管壁および毛細管内に生成される重合体
ゲルと共有結合可能な適切な２官能性試薬の溶液で処理
される。活性化した毛細管を上記２宜能性試薬の溶液で
処理すると、２官能性試薬の層が毛細管壁の内面に共有
結合により付着する。この反応に続いて、未反応の２官
能性試薬が除去され、次に被覆された毛細管は、ポリエ
チレングリコールのような親水性重合体、少なくとも１
つのモノマー、少なくとも１つの架橋剤、および少なく
とも１つの遊離基源を含む溶液で処理され、この混合物
は毛細管内で重合し、最終的に架橋重合体マトリックス
を生成する。このマトリックスは親水性重合体を含み、
また２官能性試薬を介して毛細管壁に共有結合されてい
る。最終段階として、ゲル含有毛細管の１端部は滑らか
に且つ直角に切断される。

ゲルを毛細管壁に結合させるのに２官能化試薬を採用し
ない場合、２官能性試薬に関する操作は省略され、毛細
管番よ、親水性重合体、モノマー、架橋剤および遊離基
源を含む溶液で簡単に処理され、上記に述べたように重
合が行なわれる。

（発明の効果） 本発明のゲル含有毛細管は通常安定であり、且つ一般的
に１，０ＯＯＶ／ｃｍ以上の印加電界および約５０マイ
クロアンペア以上の下で適切に作用する。これらの条件
の下では、極少量の材料で非常に高い分解性能が得られ
る。さらに、本発明の毛細管は、分析物の混合物なこれ
らの分子量の対数の一次関数として分離する。従って、
本発明の毛細管によれば、ナノグラム以下の量の未知の
生１体高分子の分子量が好都合に且つ正確に決定するこ
とができる。

（実施例） 次に、本発明を図面に従って詳細に説明する。

第１図に示されているように、本発明の改良ゲル含有毛
細管カラムは、毛細管１０、この毛細管の孔内における
架橋重合体ゲル物質１２、および好ましくはさらに、重
合体ゲル１２および毛細管壁の内面］−６の両方に共有
結合した連結層１４を含んでいる。さらに、重合体ゲル
１２はポリエチレングリコールのような親水性重合体を
含んでいる。

電気泳動において採用する検出方法が適切に作用する限
りにおいて、上記毛細管はどのような材料からでも製造
することができる。望ましい材料としてはガラス、アル
ミナ、ベリリアおよびテフロンが挙げられるが、これら
材料のすべてが、本発明の好ましい具体例において毛細
管壁にゲルを結合させる２官能性試薬と反応するおけで
はない。好ましくは、毛細管は溶融シリカから製造され
る。

通常、毛細管の構造に関して２つの点が重要である。そ
の１つは、毛細管の内径が減少すると、電流および特定
の印加電界により生成される熱が減少する、ということ
である。もう１つは、毛細管壁が薄ければ薄い程、毛細
管からの熱移動が良好となる、ということである。従っ
て、最も高い分離状態を得るために、毛細管は最小限の
内径および最小限の肉厚を有することが望ましい。しか
しなから、本発明の改良親木性重合体含有毛細管の場合
、これら条件は以前はど重要でない。なぜならば本発明
の改良毛細管は、そのような添加物を含まない毛細管よ
りも熱に対して明らかに安定しているからである。従っ
て、１０〜２，０００マイクロメートルの内径および２
５〜４００マイクロメートルの肉厚な有する毛細管であ
れば充分に機能することができる。内径の好ましい範囲
番よ、２５〜２００マイクロメートルであり、肉厚の好
ましい範囲は４０〜１００マイクロメートルである。明
らかなことであるが、もし肉厚が小さすぎる場合、毛細
管は実際の使用において破壊し易くなる。毛細管にポリ
イミドを被覆すると、肉厚が薄くても、毛細管の取り扱
いが容易になる。

使用する重合体ゲル材料１２は気孔構造を有する架橋ポ
リマーであり、この気孔構造は、千ツマ−および架橋剤
の量および反応条件により左右される。そのような重合
体の例としては、ポリアクリルアミドおよびアガロース
とポリアクリルアミドとの混合物がある。好ましい重合
体ゲル材料はアクリルアミドおよびＮ、Ｎ’　−メチレ
ンビスアクリルアミドを基材としており、このＮ、Ｎ’
メチレンビスアクリルアミドは架橋剤として作用する。

その他の使用可能な架橋剤としては、Ｎ。

Ｎ’　−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビスアク
リルアミド、Ｎ、Ｎ’　−ジアリル酒石ジアミド、Ｎ、
Ｎ’　−シストアミン−ビスアクリルアミドおよびＮ−
アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
がある。上記以外のモノマーおよび他の架橋側番よ当業
者にとって明らかであろう。

重合反応は過硫酸アンモニウムおよびＮ、Ｎ。

Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチレンエチレンヂアミンにより
開始することが好ましいが、当業者にとって公知のよう
に、他の遊離基含有重合開始剤を採用することもできる
。

好ましくは、重合体ゲルおよび毛細管壁の内面の間に用
いられる連結層１４は、２官能性試薬から誘導すること
が好ましい。この２官能性試薬は毛細管壁と、ゲル材料
を生成する重合反応に用いられるモノマー即ち架橋剤と
の両方に化学的に結合可能なものである。この２官能性
試薬は、通常その両端部に適切な反応性基を有する分子
鎖であるが、適切な官能基を有する非鎖状分子もまた使
用可能である。２官能性試薬の１端番よ、毛細管壁の内
面上のシラノール基または他の反応性の基に化学的に結
合することのできる反応性基を保有している。このよう
な反応性基は通常トリアルコキシシラン、トリクロロシ
ラン、モノ−、ジーまたはトリーエノラートシランおよ
びアミノシランのような反応性シランであり、このケイ
素原子は容易に置換可能な夕なくとも１つの基を保有し
ている。上ｆｉｌ！　２官能性試薬の他端は、重合体ゲ
ル材料と共有結合を形成することのできる他の反応性基
な有している。そのような官能基としてはビニル基、置
換したビニル基または開裂時に遊離基を生成する基が挙
げられるが、実用的にはビニル基が好ましい。なぜなら
ばビニル基は毛細管内で重合体ゲルを生成することがで
き、且つ同時に毛細管壁にこの重合体ゲルな化学的に結
合させることができるからである。代表的な２官能性試
薬としては、次にａ）およびｂ）として示されている３
メタクリルオキシプロピルトリメトキシシランおよび３
−メタクリルオキシプロピル−ジメチルエトキシシラン
がある。

ａ）　　ＣＨｘ　＝Ｃ（ＣＨ３）　　Ｃ０２−（ＣＨ２
）　３　　Ｓ　ｉ　（ＯＣＨ３）　３ｂ）　　ｃＨｘ　
　ｃ　（ＣＨ３）　　ｃｏｘ（ＣＨｚ　）　３Ｓ　ｉ　
（ＣＨ３）　２０　Ｃ２Ｈ５その他の使用可能な２官能
性試薬としては、ビニルトリアセトキシシラン、ビニル
トリ（β−メトキシエトキシ）シラン、ビニルトリクロ
ロシランおよびメチルビニルジクロロシランがある。こ
れら試薬（よ例示的なものであり、限定を意図するもの
ではない。

２官能性試薬が結合しない毛細管、例えばテフロン製毛
細管が使用される場合、連結層１４が用いられず、ビニ
ル基のような反応性基凝有する重合体の層が毛細管壁に
吸着し、次に重合体ゲル１２がこの重合体層に結合する
。

本発明において有用な親水性重合体としては、ポリオキ
シメチレンのようなポリオキシド；ポリエチレンオキシ
ドのようなポリエーテル；ポリエチレンイミンのような
ポリアルキルイミン；ポリアクリルアミド、ポリメチル
アクリルアミド、ポリＮ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド
、ポリイソプロピルアミドおよびポリアクリリルグリシ
ンアミドのようなポリアミド；ポリエチレングリコール
およびポリプロピレングリコールのようなポリアルキレ
ングリコール；およびポリビニルアルコール、ポリ酢酸
ビニルおよびポリビニルピロリドンのようなビニル性物
質の重合体がある。親水性重合体の分子量は４，０００
〜５００，０００ドルトンまたはそれ以上であり、好ま
しくは約８，０００〜２００，０００ドルトンの範囲内
にある。

親水性重合体は線状重合体であることが好ましい。セル
ロース、デキストラン、アガロースおよびキサンタンガ
ムのようならせん状親水性重合体の場合、その作用は本
発明の毛細管内において比較的弱いことが分かっている
。親水性重合体はゲル中において約１〜約４０重量／容
量％、好ましくは５〜２０重ｊ１／容量％、さらに好ま
しくは約５型量／容量％の濃度で用いられる。ポリエチ
レングリコールは好ましい親水性重合体である。

ポリエチレングリコールが重合体ゲルの成分として用い
られる改良毛細管の場合、このポリエチレングリコール
は約ｓ、ｏｏｏドルトン以上の平均分子量を有している
ことが好ましいが、４，０００〜３５，０００ドルトン
の平均分子量を有する材料もまた使用可能である。４，
０００ドルトンよりずっと少ない平均分子量を有するポ
リエチレングリコールは、一定のｐＨの値において水と
共に２つの相を生成する傾向がある。これに対して、約
ｓ、ｏｏｏドルトン以上の平均分子量を有するポリエチ
レングリコールは均質な水溶液を生成する。従ってその
ようなポリエチレングリコールは、本発明で用いられる
水性系において使用するのに望ましいものである。

最善の分離効果を得るためには、ゲル含有毛細管の少な
くとも前端部が滑らかで且つ毛細管の軸線方向に対して
垂直であることが必要である。毛細管の端部に露出する
重合体ゲル物質の表面がざらざらした状態であると、試
料の均一な細いバンドを形成することが不可能であり、
その結果ピークは幅の広いものとなる。実際、カラムの
端部は滑らかに且つ毛細管の軸線に対して垂直に好都合
に切断することが可能である。即ち、まず毛細管の端部
の回りにテフロンまたは他のプラスチック材料の鞘を緊
密に形成し、次にミクロトームで鞘を通して毛細管を切
断する。別な方法の場合、毛細管の端部にサファイア製
のカッターでその軸方向に対して直角に注意深く切れ目
を入れ、次に毛細管を折り曲げて滑らかに切断する。

本発明のゲル含有毛細管は通常次のように製造される。

まず、カラムが１００℃を越える温度で通常数時間加熱
され、これによりカラムを活性化させ、次に毛細管内面
なアンモニアガスまたは塩基の溶液のような塩基性物質
と接触させる。上記加熱段階において番よ、１００〜２
００℃の温度を好都合に用いることができる。このよう
な加熱時間は数時間から一晩またはそれ以上に及ぶ。１
つの具体例において、塩基物質との接触段階は、通常２
０〜３５℃の温度、好ましくは室温で約２時間毛細管に
乾燥アンモニアガスをフラッシュ（ｆｌｕｓｈ）するこ
とにより行なわれる。別の方法の場合、上記のようにカ
ラムが加熱され、これによりカラム位活性化し、次にカ
ラムがアルカリ金属水酸化物、例えばＯ，ＩＮのＮ　ａ
　ＯＨ溶液のような塩基溶液で充填され、毛細管内のこ
の溶液が通常２０〜３５℃の温度、好ましくは室温で保
持され、さらに水がフラッシュされる。

毛細管の活性化に必要な時間および温度は、毛細管を充
分に活性化し、毛細管と２官能性基との結合が良好に行
なわれるように選ばれる。

次に、この活性化した毛細管には、カラムゲルを管壁に
結合させる際に用いられる少なくとも１００管分の容量
の２官能性試薬溶液がフラッシュされ、その後、反応が
２０〜３５℃の温度で少なくとも１時間、好ましくは２
時間以上行なわれ、毛細管は上記２官能性試薬溶液で充
填される。２官能性試薬溶液はアルコール、エーテルま
た番よ適度に極性のあるハロゲン化溶媒のような非水性
溶媒中で生成され、通常４〜６０容量％の２官能性試薬
殻含んでいる。代表的な溶媒はメタノール、ジオキサン
および塩化メチレンである。２官能性試薬が毛細管の内
壁と反応した後、カラムがメタノールのような望ましい
溶媒で、その後さらに水でリンスされ、過剰の未反痣２
官能性試薬を除去する。通常、少なくとも１００管分容
量の溶媒および水が用いられる。

次に、重合反応用のモノマー、架橋剤、開始剤および遊
離基源を含む分離原料溶液は、通常７〜８モルの水溶性
尿素中で生成される。なお、この水溶性尿素の濃度は、
これよりも高い濃度も低い濃度も使用可能である。非変
性状態であるべきゲルは、尿素または他の変性添加物を
使用せずに生成され、このように生成されたゲルＣよ良
好に作用する。これら各試薬の濃度は、各試薬溶液の所
望のアリコートを採取し、−緒に混合した時に所定濃度
の千ツマー１架橋剤および重合触媒を有する重合混合物
を生成するように選ばれる。これら試薬のアリコートを
一緒に混合する前に、各溶液は別々に沙なくとも１時間
ガス抜きされる。このガス抜き操作は当業者にとって公
知の任意の方法で行なうことができるが、通常約２０〜
３０水銀ミリメートルの低い真空状態の下で各溶液を機
械的に攪拌するか、または超音波で攪拌することにより
行なわれる。これら溶液の調製は当業者にとって公知の
通りであり、例えばＨａ　ｍｅ　ｓおよびＲｉ　ｃ　ｋ
　ｗ　ｏ　ｏ　ｄにより呈示された方法で行なわれる。

１つの具体例によれば、ポリエチレングリコールな含む
改良毛細管を形成する場合、まずポリエチレングリコー
ルがガス抜きされ、３回蒸留され、且つ約１０℃に冷却
された水と混合され、その後温度がゆっくり室温まで上
昇する間、攪拌される。その結果、沈殿物を含まない透
明なポリエチレングリコール溶液が得られる。この溶液
は毛細管な形成する際に用いられる緩衝液および他の試
薬の原料溶液を調製するのに用いられる。上記の方法と
異なり、ポリエチレングリコールを温水に溶解し、得ら
れた溶液を冷却すると、沈殿が生じる。このような溶液
は使用できない。

このような系における七ツマ−の合計濃度および架橋剤
の濃度は、通常Ｈｊ　ｅ　ｒ　ｔ　ｅ　ｎの技術用語を
採用してそれぞれ％Ｔおよび％Ｃで表すされる。本発明
において好ましく用いられるアクリルアミド／Ｎ、Ｎ’
　−メチレンビスアクリルアミド系の場合、％Ｔおよび
％Ｃの定義は次の通りである。

％Ｔ＝（アクリルアミドのグラム数＋ビスアクリルアミ
ドのグラム数）／（溶媒の １００ミリリツトル） ％Ｃ＝（ビスアクリルアミドのグラム数Ｘ１００）／　
（ビスアクリルアミドのダラム数＋アクリルアミドのグ
ラム数） モノマーおよび架橋剤の濃度は所望の重合体マトリック
スの気孔率に応じて決定される。しかしなから、反応混
合物中の開始剤および重合触媒の濃度は通常実験により
決定される。この濃度決定は、開始剤および重合触媒の
量を変化させずに、所望の％Ｔおよび％Ｃを含む幾つか
の試験溶液を調製して行なわれる。５ＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動が意図される場合、所望量のドデシル硫酸ナトリ
ムがさらに反応混合物中に含まれる。これら試験溶液は
電気泳動を実施する温度で重合され、重合反応の経過は
、紫外線分光分析法を用いてビニル二重結合の吸収の増
加を観察することによりモニターされる。別の方法では
、毛細管を視覚により観察する。開始剤および重合触媒
の量は、重合な適切な時間、例えば約４５〜６０分でほ
ぼ完了さ＝　３４ せるように選ばれる。

このように正確な試薬濃度が決定されると、重合試薬の
新鮮な混合物が調製され、その後泡を作らないように毛
細管に注入される。ポリエチレングリコールのような親
水性重合体を含む毛細管カラムの場合、親水性重合体は
、上記に説明したように、重合試薬溶液中に含まれる。

上記毛細管に番よ小さな内径テフロン管を介して注入器
が接続される。この注入器番１毛細管に重合体を充填す
るために用いるものである。毛細管に重合体混合物敦充
填した後、注入器が取り外され、次に毛細管の両端部は
「流れている」緩衝液、即ち電気泳動に用いられる緩衝
液中に浸漬され、重合反応が起こっている間そのまま保
持される。

重合反応は、その後の毛細管カラムの電気泳動に用いら
れる温度で行なうことが好ましい。重合反応が行なわれ
ている間、反応は反応混合物の各アリコート中でビニル
基による吸光度の減少を紫外線分光分析法または視覚に
より観察することでモニターされる。カラム中における
重合反応は、別のモニター溶液中の重合反応と同じであ
る。試験溶液の重合反応がほぼ完了（４５〜６０分で完
了すべきである）した後、「流れている」緩衝液中に毛
細管靴なお保持し、且つ上記温度を維持しなから、上記
反応はさらに約２時間継続される。

毛細管中における重合反応が完了した後、毛細管端部が
「流れているｊ緩衝液から取り出され、これら端部の少
なくとも１＠が滑らかに且つ直角に切断される。このよ
うな切断を行なう１つの方法は、切断すべき端部を直径
の小さなテフロン管で緊密に被覆し、次に毛細管のテフ
ロン被覆端部をミクロトームで毛細管の軸線に対して滑
らかに且つ直角に切断することである。このミクロトー
ムはテフロン鞘を通して毛細管材料および重合体ゲル＆
９１断じ、この結果、ゲル物質の非常に滑らかな面が毛
細管の１端部に露呈される。別な方法では、毛細管に切
れ目を入れ、上記に述べたように毛細管を切断する。こ
のように切断された毛細管の端部は顕微鏡で検査され、
露呈した重合体ゲルの切断面が必須の平面状態であるか
どうかを確認する。必要に応じて、さらに切断を行ない
、望ましい平坦端部を形成する。通常、毛細管の両端部
はこのように処理されるが、実際には毛細管の前端部の
みな直角に切断すればこと足りる。

最後に、カラムＣよ所望の電気泳動装置に配置され、約
１００〜１５０　Ｖ　／　ｃ　ｍの低い電界が約１時間
印加される。非常に乱雑な基線または零位電流状態はカ
ラムの形成が不適当であることを示している。この場合
、毛細管は作り直さなければならない。

電気泳動において本発明のゲル含有毛細管カラムを採用
する場合、開放管自由領域毛細管電気泳動分野における
当業者にとって一般的に公知の装置および技術が用いら
れる。例えば、Ｓ、Ｔｅｒａｂｅ等、ｒＡｎａｌ、　　
Ｃｈｅｒｎ、Ｊ、５６巻、１１１〜１１３頁、１９８４
年およびＪ。

Ｗ、　　Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎおよびに、Ｄ、Ｌｕｋａｃ
ｓ、ｒＳｃｉｅｎｃｅＪ　、２２２巻、２６６〜２７２
頁、１９８３年参照。特に、試料はいわゆる「電気泳動
の注入」技術により注入することが好ましいが、当業者
にとって公知の他の技術も使用可能である。そのような
他の注入技術の例としては、注射器注入および等速電気
泳動注入がある。電気泳動の注入技術において、電気泳
動毛細管の前端部は適切な極性を有する電極を含む試料
溶液に浸漬されており、約５０〜１００Ｖ／ｃｍの電界
が数秒間印加され、毛細管の端部内に少量の試料溶液を
電気泳動させる。次に、毛細管な「流れている」緩衝液
の溶液に戻し、所望の電気泳動電界が印加され、正規の
方法で電気泳動が行なわれる。

毛細管の冷却を助けるため、毛細管の前端部および後端
部のみを除き、その長さのほぼ全体に渡って冷却ジャケ
ットまたは類似の装置が用いられる。上記毛細管の前端
部および後端部は緩衝液に浸漬され、且つ電気泳動シス
テムの検出器に接続される。ＣＣ１４のような冷却液が
このジャケットな通って循環され、所望の温度を保持す
る。別な方法では、電気的に制御された機械的冷却装置
が毛細管カラムの回りに用いられる。そのような「積極
的な」冷却は、所望の毛細管温度を保持する際に空冷法
よりも効果的である。

分析目的のために高性能分子篩電気泳動を実施する方法
は、まず分離すべき分析物を含む試料のアリコートを本
発明のゲル含有毛細管カラムに注入し、４００−１　、
　ＯＯＯＶ　／　ｃ　ｍの電界を印加し、通常約４０マ
イクロアンペア未満の電流を毛細管に流し、且つ分離し
た分析物が検出器を通過する際に機器により連続して分
析物を検出および測定することから成る。

本発明のゲル毛細管は分子量の対数の一次関数として分
析物な分離する。従って、基準電気泳動条件の下におけ
る移動度と、基準物質の移動度に対するその基準物質の
分子量の対数をプロットした検量線図とを比較すること
により、未知の分析物の分子量を決定することができる
。

分析物の分子量を決定する方法は次の通りである。即ち
、本発明のゲル含有毛細管カラムを形成し、電気泳動操
作パラメーターの基準値を選定する。ただし印加電界は
通常４００〜１，０００Ｖ　／　ｃ　ｍ以上であり、電
流は通常約５０マイクロアンペア未満である。次に、こ
の毛細管カラムに既知分子量の幾つかの基準分析物を含
む基準溶液のアリコートを注入し、電気泳動操作パラメ
ーターの選ばれた基準値を毛細管カラムに与えて、基準
物を分離し、電気泳動の条件の下で既知基準物の移動度
を測定し、基準操作条件の下で各基準物質の移動度に対
してこの基準物質の分子量の対数をプロットする。その
後、同じ条件の下で同じカラムで未知の溶液を電気泳動
で分析し、ここに含まれている分析物の移動度を測定し
、最後に検量線との比較からこれら分析物の分子量を決
定する。

親水性重合体添加物を含む改良型毛細管カラムは、その
ような添加物を含まない類似カラムより容易に且つ高い
再現性で製造される。なぜならば泡な生成せずに毛細管
を重合体混合物で容易に充填することができ、且つ重合
反応が円滑に起こるからである。本発明の毛細管カラム
は、親水性添加物仕官まないカラムより長い寿命および
使用中により高い安定性を有する。最も重要で且つ予期
し得ないこととして、本発明の改良毛細管カラムは著し
く高い電界強度で操作することができ、このため極端に
高い分離性能が非常に短い分析時間で達成され得る。

次の実験的実施例は例示的なものであり、本発明の範囲
を限定または定義するものではない。

見見Ｉ アクリルアミド、Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド
、Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’　−テトラメチレンエチレンジ
アミン（ＴＥＭＥＤ）、過硫酸アンモニウム、ドデシル
硫酸ナトリウム、ＴＲｌ５緩衝液およびリン酸水素二ナ
トリウムは、すべてオハイオ州、クリーブランド市のＳ
　ｗ　ａ　ｒ　ｔ　ｚ　／　Ｍ　ａｎｎ　　Ｂｉｏｔｅ
ｃｈから得られる超純粋、または電気泳動用の高品質物
質であった。別の会社からの幾分純度の低いアクリルア
ミド番よ、このアミドな３回再結晶し且つイオン交換樹
脂で処理して脱イオン化することにより望ましい状態に
純化することができた。尿素は新鮮な状態で得られ、水
メタノールから３回再結晶された。ポリビニルアルコー
ルおよびポリビニルピロリドンはミズーリ州、セントル
イス市のＳｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏｍｐ
ａｎｙから得られた。

蛋白質およびペプチドもまたＳｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　　Ｃｏｍｐａｎｙから得られ、用いられた。組
換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）およびアミノ酸１４
２と１４３との間に蛋白質連結部な有する上記ホルモン
に類似の「２鎖」物質はＧｅｎｅｎｔｅｃｈから得られ
た。上記「２鎖」物質を構成するｒｈＧＨのアミノ酸１
４２および１４３がこの間で結合開裂しても、「２鎖」
物質は２つの成分に分解することはない。なぜならばｒ
ｈＧＨの二値化物結合が変化せずそのままの状態な保持
するからである。

水は３回蒸留され且つ脱イオンされた。ポリエチレング
リコール番よＡ　ｌ　ｄ　ｒ　ｉ　ｃ　ｈまたは一８ｉ
ｇｍａから得られ、分析試薬としての品質を有していた
。本発明において好ましく用いられる溶融シリカ毛細管
は、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　　Ｇｌａｓｓ　　Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ　　Ｉｎｃ、から得られた。この会社も
またさまざな大きさの毛細管な供給している。毛細管の
端部を切断する際に眉いられるサファイア製カッターは
０１７６０、マサチューセッツ州、５ｏｕｔｈ　　Ｎａ
ｔｉｃｋ、２２　　Ｐｌｅａｓｅｎｔ　　５ｔｒｅｅｔ
＋Ｅａｌｉｎｇ　　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｔｉｃｓ　　Ｃｏ
ｒｐ＋から得られた。

毛細管を充填する細孔テフロン管（内径＝０゜２〜０．
２５ミリメートル）は日本の京都大学のＳ、、　　Ｔｅ
ｒａｂｅから得られた。すべての溶波巻よナイロン６６
または０．２マイクロメートルの気孔度を有するメチル
セルロース濾過膜を通して濾過された。分析用試料は使
用前には−２０”Ｃに凍結保存され、実験用のこれら試
料のアリコートは一４℃で保存された。５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ川蛋白用は当業者にとって公知の方法で調製された。

Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　　ｆｏｒ　　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、　
　Ｉｎｃ、のＳｏｍａ　　Ｓ−３２０７検出器が使用さ
れ、この検出器は、Ｓ、　　Ｔｅｒａｂｅ等、ｒＡｎａ
ｌ、　　Ｃｈｅｍ、Ｊ、５６巻、１１１〜１１３頁、１
９８４年の論文に述べら九でいるように、毛細管作業用
に変更された。データーはＮｅ１ｓｏｎ　　Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　　Ａ／ＤＩｎｔｅｒｆａｃｅモデル７６２
ＳＡを用いてデジタル形式に変換され、且つＩＢＭ　　
ＰＣ／ＸＴコンピュータを使用して保存された。当業者
にとって公知の他の装置もまた使用された。

７５マイクロメートルの内径、３０マイクロメートルの
肉厚およびポリイミド被膜を有する溶融シリカ毛細管が
採用された。この管は４０〜４５Ｃｍの長さで用いられ
、ゲル含有毛細管を形成した。ポリイミド被膜は燃焼に
より管の一方の端部から１ｃｍの長さに渡って取り除い
た。この端部は最後に電気泳動装置の検出器に接続され
た。

毛細管番よ空気中において約１２０℃で一晩加熱され、
次にこの毛細管には約３０℃で約２時間乾燥アンモニア
をフラッシュした。この明細書において、上記操作およ
びその他の操作における３０℃の温度は室温を意味する
。即ち、ここで室温は通常的３０℃士約３℃である。次
に、メタノール中の３−メタクリルオキシプロピルトリ
メトキシシランの５０％溶液の１００μｌが約３０℃の
温度で毛細管に導入され、これにより毛細管をこの２官
能性試薬溶液で充填した。毛細管の各端部は短いテフロ
ン製の管（同様に２官能性試薬溶液で充填されている）
を介して接続された。この封鎖され且つ試薬を充填した
毛細管は約３０℃で一晩放置された。次に、テフロン管
は毛細管の一方の端部から取り外され、毛細管はメタノ
ールおよび水のそれぞれ２５０μｌで連続してフラッシ
ュされ、未反応の２官能性試薬を除去した。次に、被覆
した毛細管は電気泳動装置の検出器に取り付けられた。

このように処理された毛１ＩＩｌｌＩ管は２０ｃｍより
幾分長めに切断され、テフロンの鞘がその「前」端部に
嵌め込まれた。

緩衝波巻よ、まず１００　ｍ　ｌの７モル尿素溶液に１
．１ｇのＴＲｌ５緩衝液を溶解し、Ｏ，ＯｌｇのＥＤＴ
ＡおよびＯ，Ｉｇのドデシル硫酸ナトリウムを加え、さ
らに二水素リン酸ナトリウムを添加してｐＨを８．６に
調節することにより調製された。

アクリルアミドおよびＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリ
ルアミドの溶液は、１００　ｍ　ｌの緩衝液中で２９ｇ
のアクリルアミドと１ｇのＮ、Ｎ’　−メチレンビスア
クリルアミドとな混合し、且つ％Ｔの３０％および％Ｃ
の３．３％を有する溶液を加えることによりｕ製した。

硫酸アンモニウムの溶液は、２ｍｌの緩衝液に０．２ｇ
の過硫酸アンモニウムを溶解して調製した。

緩衝液、モノマーおよび過硫酸アンモニウムを含有する
各溶液は別々に０．２マイクロメートルのフィルターを
通して濾過され、且つ２０〜３０ｍｍ水銀の真空の下で
２時間超音波処理することによりガス抜きされた。

１０ｎ＋１のアクリルアミド−ビスアクリルアミド溶液
は緩衝液で３０ｍ１まで希釈され、％Ｔ１０％および％
Ｃ＝３．’３％な有する最終溶液に得た。この溶液の１
　ｍ　ｌのアリコートは過硫酸アンモニウム溶液および
ＴＥＭＥＤの量な変えて実験的に処理された。重合時間
はモニターされ、過硫酸アンモニウム溶液およびＴＥＭ
ＥＤの正確な使用量を決定した。２．５μｌのＴＥＭＥ
Ｄおよび４μｍの過硫酸アンモニウム溶液を添加した場
合、重合時間は約４５分であることが１４認された。

アクリルアミド−ビスアクリルアミド溶液の１０　ｍ　
ｌのアリコートはｌｌｌ液液３０ｍ１まで希釈され、次
に２．５μｍのＴＥＭＥＤおよび４μｍの過＋８！ｉ酸
アンモニウム溶液が加えられた。毛細管から泡がでなく
なるまで、この重合混合物の５０μｍを越える量が毛細
管に強制的に導入された。

注入な続けなから、泡が毛細管内に入り込まないように
、注入針はテフロンから注意深く取り外された。最後に
、毛細管の両端部が「流れている」緩衝液に浸漬され、
重合が約３０℃で行なわれた。重合混合物の重合は外部
からモニターされる。重合が完結したように見えてから
、この重合系はさらに２時間以上そのまま保持され、重
合を完全に終結させた。その後、毛細管の前端部が（前
端部から検出器に向かって）２０ｃｍの位置でミクロト
ームにより切断された。最終ゲル含有毛細管はユＯＯＶ
　／　ｃ　ｒｎの印加電界の下で１時Ｍ評価され、その
結果この毛′Ｉａ管は満足なものであることが分かった
。

４つの蛋白質、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロ
ブリン、トリプシノーゲンおよびペプシンの混合物が、
当業者にとって公知の標準的な方法で５ＤＳ−ＰＡＧＥ
電気泳動用に調製された。

次に、この溶液の試料は、１００　Ｖ　／　ｃ　ｍの電
界を１５秒間印加することにより毛細管カラム内に電気
泳動的に注入された。電気泳動は２０ｃｍの移動距離に
渡って４００　Ｖ　／　ｃ　ｍおよび２４μＡで行なお
れた。結果は第２図に示されている。

組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）および対応する「
２鎖」物質の混合物が、当業者にとって公知の標準的な
方法で電気泳動用に調製された。

次に、この溶液の試料は、１００　Ｖ　／　ｃ　ｍの電
界および６μＡの電流を６０秒間印加することにより毛
細管カラム内に電気泳動的に注入された。電気泳動は２
０ｃｍの移動距離に渡って４００Ｖ／ｃｍおよび２４μ
Ａで行なおれた。結果は第３図に示されている 上記試験において使用されたものと同じ溶融シリカ毛細
管が採用された。この毛細管は上記のように前処理され
且つ２官能性試薬と反応した。

溶融シリカ管を２官能試薬で被覆した後、この被覆した
毛細管は電気泳動装置の検出器に取り付けられた。

緩衝液は、３回蒸留した水における５０ｍ１の２０重量
／容量％ポリエチレングリコール８０００１：３．０２
５ｇ（７）ＴＲＩＳ＊衝液を溶解シテ調製され、さらに
ホウ酸触媒が加えられｐ　Ｈ１ｌｉ−８，０±０．１に
調節した。ポリエチレングリコール溶波巻よ、上記に述
べられたように、冷却した水とポリエチレングリコール
を混合し、得られた混合物を攪拌しなからゆっくり室温
まで暖めることにより調製された。

アクリルアミドとＮ、Ｎ’　−メチレン−ビスアクリル
アミドの溶液は、５０ｍ１の緩衝液中で１４　、５　ｇ
（７）７７１Ｊ／ｌ／７’ミドを０．５　ｇ（７）Ｎ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドと混合し、さらにＴ
の３０％およびＣの３．３％を含む溶液を加えて調製し
た。

１０％過硫酸アンモニウムの溶液は２　ｍ　ｌの緩衝液
に０．２ｇの過硫酸アンモニウムを溶解することにより
調製された。

すべての溶液は濾過され、且つ２〜５　ｍ　ｍ水銀の下
で変なくとも２時間ガス抜きされた。

２ｍｌのアクリルアミド−ビスアクリルアミド溶液は、
３回蒸留した水における２０重！／容量％ポリエチレン
グリコールで１０　ｍ　ｌに希釈され、Ｔ＝６％および
Ｃ＝３．３％を有する最終溶＝　５０ 液を得た。この溶液の１ｒｎｌのアリコートは、過硫酸
アンモニウム溶液およびＴＥＭＥＤの量を変更して実験
的に処理され、重合時間がモニターされ、過硫酸アンモ
ニウム溶液およびＴＥＭＥＤの正確な使用量を決定した
。３．０μｍのＴＥＭＥＤおよび５μｍの過硫酸アンモ
ニウム溶液を添加した場合、重合時間は約４５分である
ことが確認された。

アクリルアミド−ビスアクリルアミド希釈溶液の１．０
ｍｌのアリコート、３μｍのＴＥＭＥＤおよび５μｍの
過硫酸アンモニウム溶液が加えられ、毛細管から泡が出
なくなるまで、この重合混合物の５０μｍを越える量が
強制的に毛細管に導入された。注入を続けなから、泡が
毛細管内に入り込まないように、注入針が注意深く取り
外された。最後に、毛細管の両端部が「流れているＪ緩
衝液中に浸漬され、重合が室温で行なわれた。

最終ゲル含有毛細管は９２６Ｖ／ｃｍの印加電流の下で
４日間（２４時間７日）評価され、その結果、この毛細
管は満足なものであることが分かつた・ 組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）および対応する「
２鎖」物質の混合物は、当業者にとって公知の標準的な
方法で電気泳動用にｍ製さ九、その後、この溶液の試料
が、４００Ｖ／ｃｍの電界および６μＡの電流を６０秒
間印加することにより毛細管カラム内に電気泳動的に注
入された。

電気泳動は１２ｃｍの移動距離に渡って９２６Ｖ　／　
ｃ　ｍおよび１４μＡの電流で行なわれた。結果は第４
図に示されており、この図面では、これら極端に類似す
る物質間で優れた分離がポリエチレングリコール含有毛
細管により達成されたことを示している。

ポリエチレングリコールを含む毛細管カラムは上記のよ
うに調製された。ただしこの場合、約２ｏ、ｏｏｏドル
トンの平均分子量を有するポリエチレングリコールが使
用され、且つゲルにおけるポリエチレングリコールの濃
度が５重量／容量であった。組換えヒト成長ホルモンお
よび対応する「２鎖」物質の混合物の電気泳動の場合、
分離結果はほぼ第４図に示されいる通りであり、また、
感度は高い結果を示した。なぜならばこの場合、ゲルが
２０重量／容量％のポリエチレングリコールを含む上記
カラムの場合より澄んでいたからである。

ポリエチレングリコールを含むカラムとして、長さが約
５０ｃｒｎで、且つゲル中に５０重量／容量％のポリビ
ニルアルコールおよびポリビニルピロリドンをそれぞれ
含む２つの毛細管カラムは、上記において詳細に説明し
たように調製された。

各ポリマーの平均分子量は約４０，０００ドルトンであ
った。これらのカラムはかなり容易に調製でき、また７
　００　Ｖ　／　ｃ　ｍの印加電界に対しても損傷する
ことなく耐え得ることが分かった。この電界は、電源が
このような比較的長いカラムに供給することのできる最
大限の電界レベルである。

２つのカラムは同じ条件の下で実際に試験されたが、１
，０ＯＯＶ／ｃｍ以上のより高い電界に対して、短い方
のカラムが良く耐え、また各カラムはそのような高い電
圧の下でもかなりの長い時間耐えることができた。

本発明の他の具体例は、この明細書またはここに開示さ
れているような本発明の実施例から当業者にとって明ら
かである。明細書および実施例の記載は単に例示的なも
のであり、本発明の実際の範囲および精神は特許請求の
範囲に示されている通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のゲル含有毛細管の端部の拡大斜視図で
ある。 第２図は１０％の合計モノマー、３．３％の架橋剤を含
むが親水性重合体を含まないゲル含有毛細管カラムにお
けるα−ラクトアルブミン、βラクトグロブリン、トリ
プシノーゲンおよびペプシンの４つの標準的な蛋白質の
電気泳動写真であリ、この場合、緩衝液のｐＨは８．６
であり、電気泳動は４００　Ｖ　／　ｃ　ｍの印加電界
および２４マイクロアンペアの電流の下で２０センチメ
ートルの移動距離に渡って行なわれた。 第３図は、第２図に示されている分離操作に用いられた
毛細管カラムおよび電気泳動条件を採用した場合の組換
えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）および類似の「２鎖」
物質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離状態を示す。 第４図は、９２６　Ｖ　／　ｃ　ｍの印加電界の下で２
０％のポリエチレングリコール８０００を含むがＳＤＳ
または尿素を含まない本発明の改良毛細管によるｒｈＧ
Ｈおよび対応する「２鎖」物質の電気泳動分離殻示して
いる。第４図には、この電気泳動曲線の鋭敏なピークが
明確に示されている。 １０　・・・　毛細管 １２　・・・　重合体ゲル材料 １４　・・・　連結層 １６　・・・　内面 、・７Ｘ

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. （１）内腔および内面付きの壁を有する毛細管と、 上記内腔内における架橋結合重合体ゲルと、上記重合体
   ゲル中の親水性重合体とから成る高精度高性能電気泳動
   用のゲル含有毛細管カラム。
2. （２）上記壁の内面と上記重合体ゲルとの間に連結物質
   の層をさらに含み、この連結物質は上記毛細管内面およ
   び上記重合体ゲルに共有結合している請求項１記載の毛
   細管カラム。
3. （３）上記連結物質は２官能性試薬から誘導され、この
   ２官能性試薬は上記毛細管内面上の官能基と反応可能な
   反応性シラン官能基、および重合して上記ゲルを生成す
   るモノマー分子と反応可能なビニル基を保有している請
   求項２記載の毛細管カラム。
4. （４）上記２官能性試薬は、３−メタクリルオキシプロ
   ピルトリメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロピ
   ルジメチルエトキシシラン、ビニルトリアセトキシシラ
   ン、ビニルトリ（β−メトキシエトキシ）シラン、ビニ
   ルトリクロロシランおよびメチルビニルジクロロシラン
   から成る群より選ばれる請求項３記載の毛細管カラム。
5. （５）上記毛細管が、シリカ基材材料、アルミナ、ベリ
   リアまたはテフロンから製造される請求項１記載の毛細
   管カラム。
6. （６）上記毛細管が溶融シリカから製造される請求項５
   記載の毛細管カラム。
7. （７）上記毛細管が１０〜２０００マイクロメートルの
   内径を有する請求項１記載の毛細管カラム。
8. （８）上記毛細管が２５〜４００マイクロメートルの肉
   厚を有する請求項１記載の毛細管カラム。
9. （９）上記重合体ゲルがアクリルアミドおよび少なくと
   も１つの架橋剤の共重合体をさらに含む請求項１記載の
   毛細管カラム。
10. （１０）上記架橋剤が、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリ
    ルアミド、Ｎ，Ｎ′−（１，２−ジヒロキシエチレン）
    −ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−ジアリル酒石ジアミ
    ド、Ｎ，Ｎ−シストアミンビスアクリルアミドおよびＮ
    −アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
    ンから成る群より選ばれる請求項９記載の毛細管カラム
    。
11. （１１）上記親水性重合体が１〜４０重量／容量％の量
    で上記重合体ゲル中に存在する請求項１記載の毛細管カ
    ラム。
12. （１２）上記親水性重合体が５〜２０重量／容量％の量
    で上記重合体ゲル中に存在する請求項１記載の毛細管カ
    ラム。
13. （１３）上記親水性重合体が４，０００〜５００，００
    ０ドルトンの平均分子量を有する請求項１記載の毛細管
    カラム。
14. （１４）上記親水性重合体が８，０００〜２００，００
    ０ドルトンの平均分子量を有する請求項１記載の毛細管
    カラム。
15. （１５）上記親水性重合体がポリエチレングリコールで
    ある請求項１記載の毛細管カラム。
16. （１６）上記ポリエチレングリコールが４，０００〜３
    ５，０００ドルトンの平均分子量を有する請求項１５記
    載の毛細管カラム。
17. （１７）上記ポリエチレングリコールが少なくとも約８
    ，０００ドルトンの平均分子量を有する請求項１６記載
    の毛細管カラム。
18. （１８）上記毛細管が少なくとも１つの滑らかで且つ直
    角に切断された端部を有する請求項１記載の毛細管カラ
    ム。
19. （１９）高精密高能率電気泳動用のゲル含有毛細管カラ
    ムを製造する方法において： シリカ基材毛細管の内面を基礎材料と接触させ、 上記毛細管を２官能性試薬含有第１溶液で処理して、反
    応性シランを介して上記毛細管の壁の内面に上記試薬を
    共有結合させ、この試薬はシラノール基と反応可能な反
    応性シラン官能基およびモノマーと重合可能なビニル官
    能基を有しており、少なくとも１つのモノマー、少なく
    とも１つの架橋剤および少なくとも１つの遊離基の源を
    含む第２溶液で上記毛細管を処理して、重合させ、上記
    毛細管の内腔において架橋重合体ゲルを生成させ、且つ
    上記ビニル基を介して上記２官能性試薬に上記ゲルを共
    有結合させることから成る毛細管カラムの製造方法。
20. （２０）上記接触段階に先立って、１００℃を越える温
    度で上記毛細管を加熱する段階をさらに含む請求項１９
    記載の方法。
21. （２１）上記加熱段階が１１０〜２００℃の温度で行な
    われる請求項２０記載の方法。
22. （２２）上記接触段階において、上記基礎材料がアンモ
    ニアガスであり、上記接触段階が毛細管の内面を活性化
    させるのに充分な時間上記毛細管に上記アンモニアガス
    をフラッシュすることから成る請求項１９記載の方法。
23. （２３）アンモニアガスをフラッシュする上記段階が２
    ０〜３５℃の温度で行なわれる請求項２２記載の方法。
24. （２４）上記接触段階において、上記基礎材料がアルカ
    リ金属水酸化物の溶液であり、上記接触段階が、上記毛
    細管を上記溶液で充填し、毛細管の内面を活性化させる
    のに充分な時間上記毛細管内に上記溶液を保持すること
    をさらに含む請求項１９記載の方法。
25. （２５）上記接触段階が２０〜３５℃の温度で行なわれ
    る請求項２４記載の方法。
26. （２６）２官能性試薬を含む第１溶液で処理する上記段
    階が、少なくとも１時間行なわれる請求項１９記載の方
    法。
27. （２７）２官能性試薬を含む第１溶液で処理する上記段
    階が、２０〜３５℃の温度で行なわれる請求項１９記載
    の方法。
28. （２８）２官能性試薬を含む第１溶液で処理する上記段
    階の後、未反応の２官能性試薬を除去する段階をさらに
    含む請求項１９記載の方法。
29. （２９）モノマー、架橋剤および遊離基の源を含む第２
    溶液で処理する上記段階において、上記第２溶液は電気
    泳動に用いられる緩衝液として生成され、ガス抜きされ
    た溶液である請求項１９記載の方法。
30. （３０）得られるゲル含有毛細管による電気泳動用の温
    度で上記毛細管内において上記モノマー、架橋剤および
    遊離基源の上記重合を行なう段階をさらに含む請求項１
    ９記載の方法。
31. （３１）モノマー、架橋剤および遊離基源を含む第２溶
    液で処理する上記段階において、上記第２溶液中のモノ
    マーおよび架橋剤の濃度はあらかじめ定められており、
    遊離基源の濃度は、試験溶液中の遊離基源の濃度を変化
    させ、且つ重合反応をモニターして、約４５〜６０分で
    ほぼ完全な重合が行なわれる遊離基源の濃度を見いだす
    ことにより実験的に決定される請求項１９記載の方法。
32. （３２）上記毛細管の端部を滑らかに且つ直角に切断す
    る最終段階をさらに含む請求項１９記載の方法。
33. （３３）上記第２溶液が親水性重合体をさらに含む請求
    項１９記載の方法。
34. （３４）上記親水性重合体が上記第２溶液中に１〜４０
    重量／容量％の濃度で存在する請求項３３記載の方法。
35. （３５）上記親水性重合体が上記第２溶液中に５〜２０
    重量／容量％の濃度で存在する請求項３４記載の方法。
36. （３６）上記親水性重合体が４，０００〜５００，００
    ０ドルトンの平均分子量を有する請求項３３記載の方法
    。
37. （３７）上記親水性重合体が８，０００〜２００，００
    ０ドルトンの平均分子量を有する請求項３６記載の方法
    。
38. （３８）上記親水性重合体がポリエチレングリコールで
    ある請求項３３記載の方法。
39. （３９）上記ポリエチレングリコールが４，０００〜３
    ５，０００ドルトンの平均分子量を有する請求項３８記
    載の方法。
40. （４０）上記ポリエチレングリコールが少なくとも約８
    ，０００ドルトンの平均分子量を有する請求項３９記載
    の方法。
41. （４１）上記２官能性試薬は、３−メタクリルオキシプ
    ロピルトリメトキシシラン、３−メタクリルオキシプロ
    ピルジメチルエトキシシラン、ビニルトリアセトキシシ
    ラン、ビニルトリ（β−メトキシエトキシ）シラン、ビ
    ニルトリクロロシランおよびメチルビニルジクロロシラ
    ンから成る群より選ばれる請求項１９記載の方法。
42. （４２）上記２官能性試薬の溶液がこの試薬を４〜６０
    容量％含有する請求項１９記載の方法。
43. （４３）高分離分子篩電気泳動を実施する方法において
    ： 分離すべき分析物を含む試料のアリコートを請求項１の
    ゲル含有毛細管カラムに注入し、この毛細管カラムに少
    なくとも４００Ｖ／ｃｍの電界を印加して、上記毛細管
    カラムにより上記分析物を分離し、 分離した分析物を機器により引き続き検出および測定す
    ることから成る方法。
44. （４４）分析物の分子量を決定する方法において： 既知分子量の幾つかの基準分析物を含む溶液のアリコー
    トを請求項１のゲル含有毛細管カラムに注入し、 少なくとも４００Ｖ／ｃｍの所定基準値電界を上記毛細
    管に印加して、上記毛細管カラムにより上記基準分析物
    を分離し、 分離した各基準分析物を機器により検出し、その移動度
    を測定し、 標準条件の下でその移動度に対して各基準分析物の分子
    量の対数をプロットして、検量線を作成し、 同じ条件の下で、同じカラムで未知分子量分析物の試料
    溶液を電気泳動により分析し、上記試料溶液中に存在す
    る分析物の移動度を測定し、且つ検量線から分析物の分
    子量を決定することから成る分子量の決定方法。