CN1038362C - 一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱 - Google Patents

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一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱是将均三嗪类染料通过偶联剂键合到毛细管的管壁上，而制成均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱；所谓均三嗪类染料为含有三嗪杂环的一类染料二氯均三嗪或一氯均三嗪类；偶联剂为γ-缩水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷或γ-氨丙基三乙氯基硅烷。该柱可对一系列重要的酶，具有很高的选择性，同时又能用于普通蛋白质和肽等高分子物质的分离。

Description

一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱
本发明提供一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱。该电泳柱也可以用于普通蛋白质和肽等高分子物质的分离。
毛细管电泳技术在80年代后期崛起，它使传统的电泳过程在25～100μm内径的毛细管内实现，具有前者无法比拟的高效、快速、微量和自动化的特点。亲和电泳是利用大分子所具有的专一的亲和力而设计的电泳技术，通常把在毛细管内实现的亲和电泳技术称之为毛细管亲和电泳。与本发明的技术较为接近(Anal.Chem.1991.63.2038～2042)曾报导在凝胶(聚丙烯酰胺)中加入一种可溶性配基以提高选择性。但是作为该技术基础的凝胶栓，需要向柱内灌入丙烯酰胺并使之聚合，制备困难又难以重复。同时所提供技术还不能对一些酶提供一定的选择性。
本发明的目的是提供一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱。利用该柱可对一系列重要的酶，例如乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、己糖激酶、核糖核酸酶等具有很高的选择性，同时又能用于普通蛋白质和肽等高分子物质的分离。
本发明借鉴亲和色谱，亲和电泳技术，考虑到毛细管电泳的各种性能，将三嗪染料通过偶联剂键合到电泳毛细管的管壁上，而制成均三嗪染料亲和毛细管电泳柱。本发明的电泳柱可用下结构式(I)表示：上结构式(1)中，B为毛细管壁； 为偶联剂与石英或玻璃毛细管的管壁S1元素键合的偶联剂基团，偶联剂可用结构式(2)表示：
Figure C9210993800043
式(2)所表示的偶剂是指带有易水解基团的三取代的硅烷衍生物，其中X为易水解基团，如烷氧基(三甲氧基、三乙氧基等)或氯、水解后通常生成硅醇。Y为相应的有机管能团，如乙烯基、甲基、氨丙基、烯丙基、甲基丙烯酸丙酯基及乙二胺基等。
结构式(1)中-Z为均三嗪类染料基团，具体地说为含有三嗪杂环的一类染料，而杂环通常是氮杂环，如二氯均三嗪和一氯均三嗪类，可用下结构式(3)、(4)及(5)表示：一氯均三嗪类：染料基团：
Figure C9210993800044
Figure C9210993800045
二氯均三嗪类：上式中D为染料生色体系，如葱醌环、苯磺酸基或萘磺酸基等，其典型的化合物及国际通用名称如，汽巴蓝(Clbacron Blue，F3G-A)，普施安蓝(Proclon Blue MX-R)及普施安黄(Proclon Yellow，HA)。
本发明均三嗪染料亲和毛细管电泳柱的制备方法是按下述步骤：
1、取一定内径(25～100μm)的石英或玻璃毛细管，分别用碱(KOH或NaOH)和无机酸(HNO3，HCl，H2SO4)进行洗涤；
2、然后将硅烷类偶联剂水溶液用真空泵抽入毛细管内，偶联剂溶液在管内和管壁进行反应，时间应不少于15分钟，最好为1～5小时，偶联剂将与管壁中S1元素形成S1-0键，使偶联剂键合在毛细管壁上；
3、将均三嗪染料溶液通入毛细管，在管内染料将和偶联剂反应，反应时间应不少于1小时，染料基团(结构式(3)～(5))将与偶联剂键合，即通过偶联剂使均三嗪染料键合到毛细管的管壁上。再经水洗，用惰性气体吹干可制成本发明的电泳柱。在上述碱、酸洗涤毛细管时，可采用重量浓度为1～20％的NaOH或KOH溶液及重量浓度为1～30％无机酸作洗涤液，偶联剂可采用重量浓度为0.01～5％的溶液，而染料可采用浓度为0.01～0.1M的溶液。下面通过实施例对本发明的技术给予进一步地说明。
实例1  均三嗪染料亲和毛细管电泳柱的制备1
先后用5％KOH和10％的HCl洗柱，各半小时，每次洗完后用两次水冲3分钟，用丙酮脱水、氮气吹干，把r-缩水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷水溶液通入柱子逾5分钟，后再静止15分钟，再通氮气20分钟以吹去残余偶联剂，用2％HCl冲柱10分钟，水洗至中性，再把0.01ml/L的Clbacron蓝F3G-A通入柱内2小时，水洗至滴出液无色，即可供电泳使用。
实例2  电泳柱的制备2
柱子预处理过程和所用偶联剂同例1，用0.005mol/L的Prlclon蓝MX-R溶液代替Clbacron蓝参与反应，清洗过程仍和例1相同。
实例3  电泳柱制备3
柱子预处理过程同实例1，用r-氨丙基三乙氯基硅烷代替r-缩水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷，完成管壁的硅烷化反应，仍用0.01mol/L的Clbacron蓝F3G-A通入柱内反应，其余过程同例1。
实例4  亲和柱的选择性实验
用按上述实例1制备的亲和毛细管柱对核糖核酸酶的迁移值进行测定，用胰酶和牛血清白蛋白作对照样品，用未涂渍柱作为对照柱，在同样的操作条件下核糖酸酶在亲和柱和空白柱上淌度的变化远远大于对照样品(胰酶和牛血清白蛋白)在相应柱上的变化。
表1  亲和柱的选择性(以胰酶为标准)
样  品     牛胰核糖核酸酶     胰  酶
淌度μ(m2/V.S) 空柱     1.058×10-8     2.103×10-8
亲和柱     0.143×10-8     1.637×10-8
  μ1/μ1′     7.4     1.3
 表2    亲和柱的选择性(以牛血清白蛋白为标准)
  样品   牛胰核糖核酸酶   牛血清白蛋白
  淌度μ(m2/V.S )  空柱   7.019×10-9   26.06×10-9
亲和柱   0.781×10-9   21.16×10-9
  μ2/μ2＇     9.0     1.2
μ为扣除电渗后的电泳淌度计算方法如下： μ ≈ lL V ( l t - l t o ) 其中：  l为柱的有效长度
    L为柱总长度
    V为运行电压
    t为样品迁移时间
    t.为测电渗用的二甲基亚砜迁移时间操作条件：  进样电压：12KV  时间12秒
          运行电压：10KV
          缓冲液：  PH6.83   0.1M磷酸盐
          柱总长：  54.8cm(亲和柱)
内径：50μm
检测：紫外200nm0.01AUFS
仪器：HPE-100(Blo-Rad)
实例5  亲和柱的性能实验
除此之外，上述亲和柱还具有一段涂渍柱的通用性，即能作为改性柱用于毛细管区带电泳操作模式下，肽和蛋白的分离，柱效、对照性、重复性和寿命均佳。表3为一组标准肽的基本性质，图1为标准肽在实例2所制亲和柱上的谱图，表4为各组分的柱效和拖尾因子，表5为三次恒压操作所得的相对标准偏差值，此柱在PH2.5下运行50余次，在PH6.83下运行100余次，仍未见柱性能下降迹象。
图1所示为标准肽在实例2所制亲和柱上的谱图中操作条件为：
进样电压：10KV  时间6秒
运行电压：10KV
缓冲液：  PH2.5 0.1M磷酸盐；
检测：    紫外200nm，0.01AuFs
仪器：    HPE-100(Blo-Rad)
毛细管内径：50μm
毛细管柱长：31.4cm。
表3  标准肽的某些性质
峰序号     名    称   分子量 电荷数 M1/3/Z
    1 舒缓激肽 1060.30     3     34.66
    2 血管紧张肽 1046.30     3     34.35
    3 α-促黑素细胞激素 1665.10     3     48.83
    4 促甲状腺激素释放激素 362.40     1     50.83
    5 促贵体生成激素释放激素 1182.40     2     55.91
    6 (2-5)亮体啡肽 392.50     1     53.61
    7  Bombesin 1620.10     2     68.97
    8 蛋白啡肽 573.80     1     69.05
    9 催产素 1007.40     1    100.49
表4    实例2制亲和柱(Leff＝28.6cm)的柱效及拖尾因子
峰序号     t  t(min) 柱效(理论塔板数/米) 拖尾因子
    1     6′46″   0.093     10.26×10     1.02
    2     7′47″   0.103     11.06×10     1.09
    3     8′25″   0.084     19.45×10     1.03
    4     8′49″   0.100     15.06×10     1.02
    5     9′45″   0.109     15.50×10     1.06
    6    11′57″   0.109     23.28×10     1.13
    7    13′45″   0.138     19.23×10     1.16
    8    14′25   0.160     15.73×10     1.06
    9    17′03″   0.188     15.93×10     1.04
表5  自制亲和柱一标准肽的迁移时间及其相对标准偏差
峰序号     1     2     3 相对标准偏差(％)
    1     7′23″      7′21″     7′18″     0.57
    2     8′27″      8′24″     8′24″     0.34
    3     9′15″      9′12″     9′06″     0.83
    4     9′41″      9′38″     9′29″     1.08
    5    10′45″     10′41″    10′31″     1.02
    6    13′14″     13′11″    12′50″     1.67
    7    15′11″     15′09″    14＇34″     2.32
    8    15′53″     15＇49″    15′14″     2.29
    9    19′15″     19′15″    18＇01″     3.03
上述实例，本发明提供的亲和毛细管电泳柱对酶具有很高的选择性，也可作为微制备的手段。同时该电泳柱的制备过程简单有效。此外，本发明还可作为一种亲的柱改性方法，用于普通肽、蛋白质的毛细管区带电泳分离，其柱效，对称性，重复性和寿命等基本参数都达到其它改性柱的水平。
对附图的说明：
附图1为标准肽在实例2所制亲和柱上的谱图。图中峰序号所代表的化合物由表3给出。

Claims (2)

1.一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱，其特征在于是将均三嗪类染料通过偶联剂键合到毛细管的管壁上而制成均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱；所谓均三嗪类染料为含有三嗪杂环的一类染料，即二氯均三嗪或一氯均三嗪类，偶联剂为γ-缩水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷或γ-氨丙基三乙氯基硅烷。
2.按照权利要求1所述的毛细管电泳柱，其特征在于毛细管是采用内径为25～100μm的石英或玻璃毛细管。
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