CN100357450C - 检测样品中核酸片段突变的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测核酸样品(例如血液、精液、唾液、细胞…)多态性的方法和装置。为提高已知方法(例如DGGE、SSCP和TGGE)的效率和可靠性，实际检测步骤以前在聚丙烯酰胺凝胶之中或其上进行扩增过程(例如PCR)。通过凝胶平板区带电泳或毛细管电泳，使用(化学变性剂、热变性剂以及多孔性凝胶基质)多种梯度分离DNA片段。

Description

检测样品中核酸片段突变的方法和装置
本发明涉及检测样品中核酸片段的一个或多个突变的方法和装置，其中该方法包含按适当顺序进行的下列步骤：
(a)扩增存在于样品中的核酸片段；
(b)在使步骤(a)中形成的双链核酸片段至少部分解链的梯度存在下，通过凝胶电泳分开该核酸片段，以便在凝胶的特定位置固定部分解链的核酸片段；以及
(c)检测分开的核酸片段。
例如，这种方法已知用于筛选核酸片段、特别是DNA片段确定的突变。众所周知，DNA突变可导致遗传性疾病和/或特定形式的癌症。因此，证明患者样品DNA存在这种突变，对于确定该患者是否是特定遗传病异常基因的携带者，或者进行可靠诊断，都是重要的。DNA突变研究对于诸如确定特定类型癌症的发生危险、设计肿瘤治疗、对于疾病和特定遗传缺陷之间关联的科学研究以及组织分型，也是重要的。
为了能够检测样品中核酸片段(例如DNA)的突变，样品中的核酸片段通常以太低的拷贝数或作为大的核酸片段的一部分存在于样品中，必须首先扩增，以便获得足够的材料。为此目的，一般使用常规扩增方法，例如PCR。扩增步骤以后，扩增的双链DNA片段必须在检测前彼此分开。为此，一般使用基于凝胶电泳的方法。但是，现有方法的缺点在于，扩增步骤和分开步骤均费时，完成方法需要大量时间。由于往往必须筛选大量样品，最好是开发一种方法，能够对于大量样品快速、简便地检测样品核酸片段中存在的一个或多个突变。
因此，本发明目的在于提供检测样品中核酸片段的一个或多个突变的方法，其中能够在短时间内检测大量样品是否存在突变。
本发明在凝胶之中或其上进行扩增步骤(a)，实现本发明这个目的。
在凝胶之中或其上进行扩增步骤，使本方法能够短时内完成。在扩增步骤之后，立刻在扩增后的凝胶上施加电压，开始电泳，使扩增的核酸片段就地彼此分开。因此，在扩增步骤完成之后，不再需要将样品放到凝胶上，进行随后的电泳步骤。在胶上扩增的过程中，PCR混合物(通常由酶、引物、核苷酸等组成)置于凝胶上面。此处PCR混合物只在边界面上与例如丙烯酰胺凝胶接触。至于胶内扩增，则PCR混合物位于凝胶内。这样PCR混合物与丙烯酰胺充分接触。
突变与无突变的核酸片段的大小之间没有或几乎没有差别，因此根据结合能的差异使本发明的不同片段彼此分开。结合能取决于该片段的核酸组成。若核酸片段存在突变，例如核苷酸置换，其结合能将不同于无突变片段的结合能。
为了使带有突变的核酸片段与无突变核酸片段分开，应用引起双链核酸片段至少部分解链的梯度，例如升高的温度梯度。由于突变的双链核酸片段与无突变的双链核酸片段结合能不同，该片段将在不同温度下变成至少部分单链(解链)。片段由于至少部分解链而定位于凝胶内特定位置。由于结合能的差异，无突变的双链核酸片段定位于凝胶中的位置不同于突变片段。这样能够在凝胶中使突变的核酸片段与无突变的核酸片段分开(图1)。
为确保片段定位于凝胶中特定位置，不能在引起至少部分解链的梯度影响下使双链片段完全解链。例如为此目的，可以给一个扩增引物添加富含GC的尾部(″GC夹″；大约15-60个GC对)。在引起至少部分解链的梯度下，GC夹仍保持双链。
然后可以用常规方法在凝胶中检测相互分开的片段。例如为此目的，在电泳步骤之前或其间，向样品中加入可结合核酸片段的溴化乙锭，借此能利用紫外线使片段可见。但本发明也可以使用其它已知的检测方法。
在本发明方法特别适合的优选实施方案中，该方法包含以下步骤：
(d)在步骤(b)之前使样品中存在的双链核酸片段完全解链为单链核酸片段，并由这些单链核酸片段重新组成双链片段，其中除同源双链(homoduplex)核酸片段之外，还形成异源双链(heteroduplex)核酸片段。
如果两个″正常″(即无突变)的单链核酸片段或两个突变的单链核酸片段配对形成双链核酸片段，产生同源双链核酸片段(下文称为同源双链片段)。如果一个正常的单链核酸片段与一个突变的单链核酸片段配对，形成异源双链核酸片段(下文称为异源双链片段)(图2)。由于两条链不完全互补，异源双链片段比同源双链片段的结合能低。
例如，通过加热样品使双链片段解链，再冷却样品使单链片段重新形成双链核酸片段，可以实现将双链核酸片段完全解链为单链片段，并由这些单链片段重新组成双链核酸片段，然后利用凝胶电泳彼此分开。
如上所述，然后在引起片段部分解链的梯度下，根据其结合能的差异，使不同的核酸片段互相分开。鉴于异源双链片段的结合能低于同源双链，因而部分解链，并很快定位于凝胶中。
如果存在杂合突变，将形成四个不同的双链核酸片段，两个同源双链片段和两个异源双链片段，如图2所示。异源双链片段的特征在于至少一个碱基不配对，也就是说，不能与对应碱基结合。两个异源双链片段具有较低的结合能，因而将比同源双链片段更早地部分解链，并定位于凝胶中不同的特定位置。由于该碱基对影响相邻碱基对的结合能(对紧相邻的碱基对影响较多，较远的碱基对影响较少)，两个不同的异源双链片段应具有不同的结合能。由于两种异源双链片段结合能的相对差异，它们在凝胶中不同位置解链(例如不同温度)，并因而定位于不同的位置。按这样的方式，例如可以相互分开不同的等位基因。
本发明方法进行的电泳优选毛细管电泳。该方法基于在毛细管中放置凝胶，例如聚丙烯酰胺。将样品放置在毛细管中，然后对毛细管施加电压。样品中的分子根据其大小和/或电荷，以不同的速度在毛细管中迁移，从而彼此分离。毛细管电泳的优点在于，由于可以给毛细管中的凝胶施加较高的电压，分子(此处为核酸片段)可以在毛细管中更快迁移。因而可以在非常短的时间内完成电泳步骤。这是由于毛细管很细，故毛细管中凝胶的电阻高。在凝胶上存在高电压时，电流及因而的热量产生会保持低。此外毛细管的表面积与体积比很高，以致可以更容易、更快速地释放产生的热量。也可以在毛细管中放置粘度更低的凝胶(几乎是液体)。因此可以选择更低密度的以及固体凝胶基质。另外的优点在于，能够分析非常小的样品，当得到的材料较少时，这点尤其重要。
由于毛细管壁很薄以及表面积：体积比高，还可能快速传递热量，并能够施加急剧升降的温度梯度。因此，扩增步骤可能很快速，从而能够相当快速地完成本发明方法。
在另一个优选实施方案中，本方法进一步包含：
(e)在步骤(b)之后改变电泳条件，以使至少部分解链的核酸片段重新变为双链，使分开的核酸片段以几乎相同的速度，从其胶中特定位置进一步迁移。
优选在其离开毛细管时检测此处分开的核酸片段。分开的核酸片段通过进一步电泳，不同片段将按确定顺序离开毛细管。例如，此处可以在分开以前标记核酸片段，例如荧光标记，并在片段离开毛细管之前或当时立刻用正确波长的激光激发，而自动检测片段。然后利用光电管检测荧光。用于DNA片段的标记可由荧光材料制成，不过也可能使用其它形式的标记。通过标记片段，该方法变得更加敏感，需要的材料更少。
然而，例如片段在毛细管内迁移过程中，其它本身已知的检测形式也是可能的。例如，有可能在不同时刻将毛细管暴露于紫外光，利用照相机进行记录。这样也可以确定片段在凝胶中的特定位置。
本发明方法特别适合的优选实施方案另外包含从凝胶中分离已分开的核酸片段。该分离的片段可以随后用于进一步分析，例如序列测定。
例如可以在其离开毛细管时分离分开的核酸片段。另一分离方法包括在确定毛细管内特定位置(例如，如上所述使用照相机)之后，从凝胶中分离片段。例如，为此可以在正确位置断开(一次性使用的)毛细管，然后从该段毛细管残留的凝胶中分离核酸片段。例如，可以利用该方法分选分开的等位基因。
本发明引起双链核酸片段至少部分解链的梯度优选温度梯度。通过渐进或分段式提高温度，有可能以简单方法实现双链核酸片段根据其结合能解链，从而定位于凝胶中特定位置。例如温度梯度可以从毛细管上端作用到下端，但也可以是按时间(即实验的由始至终)作用的温度梯度。
本发明方法的另一个特别适合的实施方案中，引起至少部分解链的梯度是化学梯度。
此处优选由尿素和甲酰胺形成的化学梯度。升高尿素和甲酰胺的浓度，核酸片段将会解链，具有较低的结合能的片段将更快定位于凝胶中。
除上述梯度以外，本发明还可以应用引起双链片段解链的其它梯度。如果引起部分解链的梯度由温度梯度和化学梯度联合组成，则得到本方法另一优选实施方案。
本发明方法特别优选的实施方案中，只要核酸片段已经彼此分开并定位于凝胶中特定位置，就如上所述改变电泳条件，以使部分解链的核酸片段重新变为双链，使分开的片段从其毛细管中特定位置按相同速度进一步迁移。此处改变电泳条件优选包括降低温度。通过降低毛细管的温度，部分解链的片段将再次变为双链，以几乎相同的相对速度，从其凝胶的特定位置进一步迁移，并按确定顺序离开毛细管。突变的双链核酸片段的大小与无突变核酸片段的大小没有或几乎没有差别，故其相对速度相同。
如果核酸片段在凝胶中的分开受到应用化学或其它梯度的影响，那么可以按同样方法在分开之后降低温度，使至少部分解链的片段再次成为双链。
希望检测其核酸中一个或多个突变的样品可以由来自个体的任何适当的物质组成，如血液、精液、唾液和/或各种组织细胞，其中遗传物质以核酸形式存在，例如DNA和/或RNA。可以首先处理样品，以分离核酸。根据技术人员已知的标准方法提取并纯化核酸。如果样品中核酸由单链片段，例如RNA组成，必须首先利用已知方法制成双链核酸片段。例如就RNA而言，为此可以使用已知的PT-PCR方法。
本申请中术语″突变″涉及核酸片段相对于″正常″(野生型)遗传物质的任何改变。此处突变核酸的核苷酸序列显示与相应非突变核酸的核苷酸序列的一个或多个差异。例如这种突变可以是点突变(通常其中单个碱基对不同，一般替换为另一碱基对)，或者插入或缺失一个或多个核苷酸。本发明术语突变还另外涉及所谓的多态性，即在自然群体中发生的对于某一确定基因的等位基因差异。
本发明进一步涉及并提供可以用来实现上述方法的装置。
本发明装置包含若干装有凝胶的毛细管(其中毛细管内凝胶的上下两端与带电极的液池接触)、在凝胶上施加电压的电压源、电泳过程中改变电泳条件的设备、以及检测分开的DNA片段的设备。本发明方法的装置可以简单快速地使用。
本发明装置的优选实施方案中，该装置包含大量毛细管，其中毛细管中凝胶的上端与一个基本上所有毛细管的共用液池接触，共用液池中装有电极，毛细管中每个凝胶的下端与分开的液池接触，在每个分开的液池中装有电极。
利用合适的内设电压源，在毛细管内凝胶的电极之间施加电压。作用于凝胶的电压可以但不必须变化。
可用于本发明装置中的检测设备可以是例如层析中常用的常规检测设备，如紫外/可见光分光光度计。因更敏感而优选使用荧光检测设备。然而为此目的，必须首先标记样品中核酸片段。
本发明改变毛细管电泳条件的设备，优选由电泳期间改变毛细管温度的设备组成。
本发明装置中，改变温度的设备优选包含所谓的珀尔帖(Peltier)元件夹紧毛细管，或者珀尔帖圈绕在毛细管上。珀尔帖元件由两种不同的金属条组成。通过改变该元件电流的强度和/或方向，该元件既可冷却又可加热(所谓的珀尔帖效应(Peltier effect))。其它可以在电泳期间改变毛细管温度的设备也可以，例如加热毛细管周围区域的加热设备，如(卤素)灯，以及例如沿着毛细管吹冷空气以降低毛细管温度的冷却设备，如风扇。
由于每个毛细管的凝胶下端与分开的液池接触，在一个特定片段离开毛细管以后，通过更换液池的简单方法，可以分离分开的核酸片段。液池含有已知的标准电泳缓冲液，能够利用已知方法，例如沉淀或浓缩，从中回收分离的核酸片段，并用作进一步分析。
该装置特别适当的优选实施方案中，至少一根毛细管装有测量温度的设备。扩增步骤中必须快速并尽可能精确地调节毛细管的温度。通过在毛细管中安装温度测量设备，获得扩增步骤过程中毛细管现时(prevailing)温度的极可靠指示。
此处包含适于此目的的任何方式的温度测量设备。温度测量设备优选包含安装在至少一个毛细管中的铂电阻丝。例如此处毛细管可以充满水并密封，以便得到与其它毛细管的热容量几乎相同的毛细管。
该装置进一步特别优选的实施方案中，毛细管包被引物和dNTPs，以便在毛细管凝胶之中或其上扩增样品中的核酸片段。这样毛细管上只需上样待检测其中突变的样品和聚合酶。毛细管更优选包被引物、dNTPs和聚合酶。
本发明也涉及并提供用于上述方法和装置的毛细管，其中该毛细管包被引物和dNTPs，更优选包被引物、dNTPs和聚合酶。例如，为此目的使用内侧包被的一次性毛细管。
本发明进一步参照附图进行说明，其中
图1显示部分解链的DNA片段的示意图(本发明方法的步骤b)；
图2显示同源和异源双链的形成示意图(本发明方法的步骤d)；
图3显示本发明装置优选实施方案的示意图(局部横截面)；
图4显示图3的细节；以及
图5为本发明装置另一合适的优选方案的局部横截面的示意图。
如图3所示，装置1在容器3内包含很多毛细管2，其中毛细管内装有凝胶。毛细管2中凝胶的上端4和下端5与液池6、7接触，其中分别装有阴极8和阳极9。毛细管2中凝胶的上端4与毛细管的共用液池6(其中带有阴极8)接触，每个毛细管2中凝胶的下端5与分开的液池7接触，其中每个分开的液池7装有阳极9。其更多细节如图4所示。装置1进一步包含电压源10以及改变温度的设备11，其由所谓的珀尔帖部分组成，固定夹紧毛细管，其示意图也如图4所示。
图4所示优选实施方案中带有设备12，用来检测分开的核酸片段，在核酸片段离开毛细管2时检测它们。例如，检测设备包含二极管激光器13，其激发标记的核酸片段，由荧光检测器12检测其中片段发射的荧光。
图5显示本发明装置的另一个有利的实施方案。此处装置1同样包含很多装有凝胶的毛细管2，其上端4接触所有毛细管的共用液池6(其中装有阴极8)，其下端5接触分开的液池7(其中装有分开的阳极9)。此实施方案中的改变温度的设备11由提高毛细管温度的加热设备(未显示)，以及沿着毛细管吹出冷空气的冷却设备构成。
本发明方法中的检测方法使用诸如紫外曝光和高分辨率CCD照相机。例如可以用此方法检测EtBr或SyBr-金标记的片段。例如可以利用彩色CCD照相机检测荧光标记的片段；此处使用滤光片阻挡紫外线。以后利用合适的软件，可以见到不同颜色。

Claims (22)

1.检测样品中核酸片段的一个或多个突变的方法，其包含按适当顺序进行的下列步骤：
(a)扩增样品中存在的核酸片段；
(b)通过凝胶电泳，在引起步骤(a)中形成的双链核酸片段至少部分解链的梯度存在下分开该核酸片段，以使部分解链的核酸片段定位于电泳凝胶中特定位置；以及
(c)检测分开的核酸片段，其特征在于在电泳凝胶之中或其上进行扩增步骤(a)。
2.权利要求1的方法，其特征在于该方法另外包含：(d)在步骤(b)之前使样品中存在的双链核酸片段完全解链为单链核酸片段，并由这些单链核酸片段重新组成双链片段，其中除同源双链核酸片段之外，还形成异源双链核酸片段。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于该凝胶电泳是毛细管凝胶电泳。
4.权利要求1、2或3的方法，其特征在于该方法另外包含：
(e)在步骤(b)之后改变电泳条件，以使至少部分解链的核酸片段重新变为双链，使分开的核酸片段从其电泳凝胶中特定位置以几乎相同的速度进一步迁移。
5.权利要求3或4中任一项的方法，其特征在于分开的核酸片段在其离开毛细管时被检测。
6.上述权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于该方法另外包含从电泳凝胶中分离分开的核酸片段。
7.上述权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于电泳凝胶中引起双链核酸片段至少部分解链的梯度为温度梯度。
8.上述权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于引起双链核酸片段至少部分解链的梯度为化学梯度。
9.权利要求8的方法，其特征在于该化学梯度由尿素和甲酰胺形成。
10.权利要求7、8或9的方法，其特征在于该梯度由温度梯度和化学梯度联合组成。
11.上述权利要求2-10中任一项的方法，其特征在于改变电泳条件，包括降低电泳凝胶温度，以使至少部分解链的核酸片段重新形成双链核酸片段。
12.上述权利要求1-11中任一项的方法，其特征在于样品包含来自个体的遗传物质，其中该遗传物质以核酸形式存在。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述样品为血液、精液、唾液和/或组织细胞。
14.检测样品中核酸片段一个或多个突变的装置，包含很多装有电泳凝胶的毛细管，其中毛细管内电泳凝胶的上下两端与带电极的液池接触，以及在电泳凝胶上施加电压的电压源、电泳过程中改变电泳条件的设备和检测分开DNA片段的设备，其特征在于毛细管包被有引物和dNTPs，用于在电泳凝胶中扩增样品中的核酸片段。
15.权利要求14的装置，其特征在于毛细管内凝胶的上端接触一个基本上所有毛细管的共用液池，其中在共用液池中装有电极，每个毛细管电泳凝胶的下端接触分开的液池，其中每个分开的液池中装有电极。
16.权利要求14或15的装置，其特征在于改变毛细管电泳条件的设备是改变毛细管温度的设备。
17.权利要求16的装置，其特征在于改变温度的设备包含珀尔帖元件。
18.上述权利要求14-17中任一项的装置，其特征在于至少一个毛细管中装有温度测量设备。
19.权利要求18的装置，其特征在于温度测量设备包含装在至少一个毛细管中的铂电阻丝。
20.权利要求14-19中任一项的装置，其特征在于毛细管另外包被有聚合酶，用于在电泳凝胶中扩增样品中的核酸片段。
21.权利要求1-13中任一项方法和/或权利要求14-20中任一项装置所使用的毛细管，其特征在于毛细管包被有引物和dNTPs。
22.权利要求21的毛细管，其特征在于该毛细管另外包被有聚合酶。
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