DE69422489T2 - Beschichtete kapillarsäulen und elektrophorese trennverfahren mit deren verwendung - Google Patents
Beschichtete kapillarsäulen und elektrophorese trennverfahren mit deren verwendungInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Kapillarsäulen mit Beschichtungen der Innenoberfläche und elektrophoretische Trennverfahren zu deren Anwendung. Die vorliegende Erfindung schließt insbesondere Kapillarsäulen mit einer geladenen, vernetzten Beschichtung auf ihren Innenwandoberflächen ein. Die geladene Beschichtung ergibt eine zusätzliche Steuerung bzw. Kontrolle des elektroosmotischen Flusses bzw. Strömung, verringert die Analyt-Wechselwirkung mit der Innenoberfläche der Kapillarsäule und trägt zur wirksamen elektrophoretischen Trennung von Aminen und verwandten Verbindungen bei.
- Elektrophoretische Trenntechniken wurden seit Jahren zur Trennung von Molekülen gemäß Unterschieden der effektiven bzw. wirksamen Ladung der Moleküle und/oder gemäß Unterschieden der Molekülgröße der Moleküle verwendet. Bis vor kurzem wurden elektrophoretische Trennungen in Gel-Platten bzw. -Tafeln oder offenen Gelbetten durchgeführt, die typischerweise aus Polyacrylamid-Gelmaterial hergestellt waren. Vor kurzem ermöglichten Kapillar-Elektrophorese-Techniken in Kombination mit photometrischen Nachweisverfahren die Automatisierung und schnelle quantitative Analyse von Molekülen. Hochauflösungs-Trennungen von Molekülen, die unterschiedliche effektive Ladungen aufweisen, wurden erreicht, indem elektrophoretische Prinzipien auf Puffer-befüllte oder Gel-befüllte enge Kapillarröhrchen angewendet wurden.
- Typischerweise werden Kapillarsäulen, die bei der Kapillarelektrophorese verwendet werden, aus Längsabschnitten von Silica-Röhren mit Durchmessern in der Größenordnung von 25 um bis 200 um und Längen von ungefähr 10 bis 200 cm hergestellt. Die Puffer- und Gel-Trennmedien werden direkt in das Innere der Säulen gepumpt und elektrophoretische Techniken werden zur Trennung vieler Molekülarten verwendet, die Peptide, Proteine und Oligonukleotide, Nukleinsäuren und andere geladene Molekülarten einschließen. Überdies erweitert sich das Fachgebiet kontinuierlich in Hinblick auf die Molekültypen und -größen, die unter Verwendung von Kapillarelektrophorese-Verfahren getrennt und nachgewiesen werden können.
- Die mit der Kapillarelektrophorese verbundenen Vorteile sind zahlreich. Eine quantitative Information kann mit sehr geringen Proben-Größen erzielt werden und die verbrauchte Gel- oder Puffermenge ist gering. Darüberhinaus wird die für die Trennungen erforderliche Zeit stark reduziert und die Technik eignet sich selbst zur Automatisierung und elektronischen Datenspeicherung und Daten-Manipulation. Bezeichnenderweise ist die Kapillarelektrophorese mit bestimmten Phänomenen verbunden, die bei einer traditionellen Platten-Gelelektrophorese nicht auftreten. Eine dieser Erscheinungen ist die nunmehr bekannte elektroosmotische Strömungserscheinung, die durch eine Massenströmung von Pufferlösungen in Richtung auf eine der Elektroden gekennzeichnet ist.
- Die elektroosmotische Strömung wird durch die Ionisation von Silanol-Funktionalitäten auf der Oberfläche der Silica-Kapillarröhre erzeugt. Die Ionisation führt zu einer Schicht von Protonen in der elektrophoretischen Pufferlösung an der Oberfläche der Silicaröhre. Bei Vorhandensein eines elektrischen Feldes ähnelt die Protonenschicht einer positiv geladenen Flüssigkeitssäule, die in Richtung auf die Kathode wandert, wodurch eine allgemeine Massenbewegung des Puffermediums hervorgerufen wird. In vorteilhafter Weise kann die elektroosmotische Strömung bei vielen Anwendungen dazu verwendet werden, elektrophoretische Trennungen zu verbessern. Wenn beispiels weise die elektrophoretische Wanderung oder Migration der Moleküle, die getrennt werden, in der zur elektroosmotischen Strömung entgegengesetzten Richtung erfolgt, so besteht das Endergebnis in einer Vergrößerung der effektiven Säulenlänge.
- Ob eine elektroosmotische Strömung für irgendeine bestimmte Trennung vorteilhaft ist oder nicht, es ist wünschenswert, die Strömung steuern zu können. Ein Verfahren zur Minimierung oder zur Steuerung einer elektroosmotischen Strömung ist es, eine Silica-Kapillarröhre bereitzustellen, die auf der Innenseite mit einem Polymermaterial beschichtet ist, um den Grad zu steuern bzw. zu kontrollieren, in dem eine Ionisation der Oberflächen-Silanol-Gruppen eintritt. Allgemein haben diese Beschichtungen ihren Zweck erfüllt. Jedoch besteht ein fortwährender Bedarf nach verbesserten Beschichtungen. Es ist insbesondere wünschenswert, Kapillarbeschichtungen bereitzustellen, die die Steuerung der elektroosmotischen Strömung unterstützen, und bei den elektrophoretischen Trennungen spezieller Arten von Proben-Bestandteilen Hilfestellungen bieten.
- Ein weiteres mit der Kapillar-Elektrophorese verbundenes Problem ist die Neigung der Proben-Bestandteile, an der Wand der Kapillar-Röhre und insbesondere der Silica-Röhre zu haften. Dies trifft insbesondere im Falle kleiner geladener Moleküle zu, die leicht von reaktiven Silica-Funktionalitäten angezogen werden. Wenn kleine Peptide und Amine in elektrophoretischen Trennmedien vorliegen, stehen sie sowohl elektrostatisch als auch hydrophob mit der Kapillar-Wand in Wechselwirkung. Die Folge ist eine Abnahme der Trennwirkung und eine unerwünschte Bandenverbreiterung, die falsche Trenn-Daten liefert.
- Wie die elektroosmotische Strömung, war auch das Bereitstellen von Elektrophorese-Kapillaren, die zur Minimierung oder Steuerung des Grades an Proben-Bestandteil- und Wand-Wechselwirkung in der Lage waren, nicht vollkommen erfolgreich. Frühere Versuche schließen die Verwendung einer dynamischen Doppelschicht-Beschichtung ein. Diese Doppelschicht-Beschichtungen sind nicht stabil und erfordern Zusatzstoffe in den Laufpuffern bzw. Elektrophoresepuffern, die während des elektrophoretischen Vorgangs verwendet werden. Es wurde zur Trennung von Peptiden und Proteinen vorgeschlagen, daß geladene Polymer-Beschichtungen aufgebracht werden. Jedoch fehlt diesen Säulen-Beschichtungen die physikalische Integrität und Beschichtungs-Stabilität, und Säulen, die diese Beschichtungen aufweisen, haben eine verminderte Lebensdauer der Beschichtung und können Probleme mit nicht reproduzierbaren Trennungen haben. Überdies weisen kleine geladene Moleküle selbst keine ausreichende physikalische Integrität auf, um wirksame Kapillar- Beschichtungen zu bilden. Somit erfordern Verfahren zur Herstellung von Kapillarsäulen mit geladener Oberflächen- Beschichtung die Anwendung von Polymeren, die eine begrenzte Verfügbarkeit aufweisen.
- Eine Durchfluß-Geschwindigkeits- bzw. Strömungsgeschwindigkeitsgesteuerte Oberflächen-Ladungs-Beschichtung zur Kapillar-Elektrophorese wird in der WO-A-91/06851 vorgeschlagen, die ein hydrophobes Polymer mit mehrfachen bzw. vielfachen ionischen Bindungszentren, wie beispielsweise Polybren, umfaßt, wobei die Bindungszentren quartäre Amine sind, wobei das quartäre Amin-Zentrum teilweise mit Carbonat oder Sulphonat substituiert sein kann. Eine Elektrophorese-Vorrichtung und ein Verfahren wird beschrieben, wobei die aus Silica hergestellte Kapillarröhre auf der Innenoberfläche mit Polybren in einem Puffer eletrophoretisch beschichtet ist, und wobei eine Verlangsamung der elektroosmotischen Strömungsgeschwindigkeit beobachtet wird.
- Es ist demgemäß ein Ziel der vorliegenden Erfindung, neuartige beschichtete Kapillarsäulen bereitzustellen, die für Elektrophorese-Trennungen brauchbar sind, und die eine Steuerung der elektroosmotischen Strömung bereitstellen.
- Es ist zusätzlich ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kapillarsäulen bereitzustellen, die Wechselwirkungen zwischen Proben- Bestandteilen und der Kapillar-Innenwand verringern oder beseitigen.
- Es ist weiterhin ein Ziel der vorliegenden Erfindung Kapillaren bereitzustellen, die physikalisch stabile Beschichtungen aufweisen.
- Es ist zusätzlich ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kapillaren bereitzustellen, die für die elektrophoretische Trennung einer Vielzahl geladener Moleküle brauchbar sind.
- Die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert ist, genügt den vorstehend identifizierten Zielen, indem sie Innenoberflächen-Beschichtungen bereitstellt, die zur Verminderung der Interaktionshöhe zwischen Proben-Bestandteilen und der Innenoberfläche der Kapillarsäule beitragen. Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung tragen züsätzlich zur Erhöhung der Benutzer-Steuerung bzw. -Kontrolle des Grades an elektroosmotischer Strömung von Massenmaterial während elektrophoretischer Trennungen bei.
- Vorteile der Beschichtungsmaterialien aus vernetzten quartären Ammoniumverbindungen, die bei den Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen eine einfache Herstellung ein. Diese Beschichtungen werden aus Verbindungen mit relativ kleinem Molekulargewicht hergestellt, die das Erfordernis ausschließen, sich mit großen Polymermaterialien zu befassen. Überdies hat die Verwendung der Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung verbesserte Trennungen für mehrere Verbindungen, einschließlich Aminen, Peptiden und Proteinen, zur Folge.
- Die Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung schließen insbesondere einen Längsabschnitt einer Röhre mit einer Innenoberfläche ein, die negativ geladene chemische Funktionalitäten aufweist. Die Innenoberfläche weist eine Beschichtung vernetzter quartärer Ammoniumverbindungen auf, die zu einer Ionen- Wechselwirkung mit den geladenen chemischen Funktionalitäten der Innenoberfläche in der Lage sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Röhre aus Silica bzw. Siliziumdioxid hergestellt.
- Beispielhafte vernetzte quartäre Ammoniumverbindungen schließen diejenigen ein, die die folgende allgemeine Formel aufweisen:
- bei der: 0 ≤ n ≤ 20; 0 ≤ y ≤ 20
- p ≥ 1 ist; bei der
- X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Funktionalitäten mit der Formel Cl, Br und I besteht; bei der
- Z ein organisches Radikal ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Funktionalitäten mit der folgenden Formel besteht:
- C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl,
- und -HOCH-R&sub2;- O-R&sub3;-HOCH, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; jeweils unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus C&sub2;-C&sub2;&sub0;Alkyl besteht.
- Bei bevorzugten Ausführungsformen werden die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem zunächst eine geeignete sekundäre Amino-Verbindung vernetzt wird, und indem dann die sich ergebende vernetzte Amino-Verbindung mit einem geeigneten Alkylierungsmittel alkyliert wird, um die entsprechende vernetzte quartäre Ammoniumverbindung zu bilden. Zuletzt ergibt das Verursachen eines Inkontaktbringens der vernetzten quartären Ammoniumverbindung mit der Innenwand eines Längsabschnittes einer Kapillarröhre mit in geeigneter Weise geladenen chemischen Funktionalitäten, eine beschichtete Kapillarsäule, die zur Verwendung bei der elektrophoretischen Trennung geladener Verbindungen geeignet ist.
- Geeignete Amino-Derivate, die bei der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, sind Amino-Verbindungen, die zumindest drei Amino-Funktionalitäten aufweisen, und die dazu in der Lage sind, mit einem Vernetzungsreagenz vernetzt zu werden, das zumindest zwei in geeigneter Weise reaktive Funktionalitäten aufweist. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Vernetzungsmittel ein Diepoxid, wie beispielsweise Butadien-Diepoxid. Beispielsweise sind Alkylierungsmittel Verbindungen, wie beispielsweise niedere Alkylhalogenide, die zur Reaktion mit Amino-Funktionalitäten zur Bildung des quartären Ammoniumderivats des Amins in der Lage sind.
- Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung weisen beider elektrophoretischen Trennung von Analyten besondere Nützlichkeit auf, die Amino- und Amino-Derivat- Funktionalitäten aufweisen. Beispielhafte Analyt-Verbindungen schließen Amine, Aminosäuren, Peptide und deren Derivate, wie beispielsweise Aminhydrochloride ein.
- Diese und andere Vorteile, die mit der vorliegenden Erfindung verbunden sind, werden dem Fachmann nach dem Verstehen der Erfindung, wie sie in der ausführlichen Beschreibung der Erfindung in Kombination mit den folgenden Zeichnungen beschrieben ist, klar werden.
- Fig. 1 ist eine Darstellung einer bevorzugten quartären Ammonium-Verbindung, die ionisch mit der Innenoberfläche einer Silica-Kapillarsäule wechselwirkt.
- Fig. 2 ist ein Elektropherogramm, das sich aus der elektrophoretischen Trennung von sieben basischen Arzneistoffen in einer wäßrigen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt.
- Fig. 3 ist ein Elektropherogramm, das sich aus der elektrophoretischen Trennung von Proteinen in einer wäßrigen Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt.
- Die vorliegende Erfindung liefert beschichtete Kapillarsäulen, die bei elektrophoretischen Trennsystemen, wie beispielsweise den P/ACE-Serien Kapillar-Elektrophorese-Systemen besonders brauchbar sind, die von Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Kalifornien, hergestellt und vertrieben werden. Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung sind speziell als Trennmedien bei Anwendungen nützlich, bei denen eine Vielzahl von Molekülarten auf der Grundlage ihrer elektrophoretischen Mobilität getrennt werden. Diese Molekülarten schließen Makromoleküle, wie beispielsweise Proteine und Polynukleotide ebenso wie kleinere Verbindungen, wie beispielsweise basische Arzneistoffe und Nukleinsäuren, ein.
- Die hierin beschriebenen beschichteten Kapillarsäulen liefern eine zusätzliche Benutzerkontrolle der elektroosmotischen Strömung und können bei analytischen Bedingungen verwendet werden, bei denen eine erhöhte elektroosmotische Strömung bevorzugt wird. Als ein Merkmal der vorliegenden Erfindung sind die Beschichtungsmaterialien, die zur Bildung der beschichteten Säulen verwendet werden, vernetzte Verbindungen oder wechselwirkende Netzwerke bzw. Netze von Verbindungen, die durch kovalente Bindungen verbunden sind. Dies hat Beschichtungen zur Folge, die eine erhöhte physikalische Integrität aufweisen, die wiederum Säulen mit längerer Nutzlebensdauer und verbesserter Zuverlässigkeit und Präzision bei elektrophoretischen Trennverfahren ergibt. Die gesteigerte physikalische Integrität trägt weiterhin zu einer verlängerten Fähigkeit bei, die Wechselwirkung verschiedener Analyten mit der Wand der Kapillarsäule zu verhüten.
- Die beschichteten Kapillarsäulen 10 der vorliegenden Erfindung werden insbesondere und unter Bezugnahme auf eine repräsentative Querschnittsansicht einer in Fig. 1 dargestellten Säule, aus einem Längsabschnitt einer Kapillarröhre 12 hergestellt, die an ihrer Innenoberfläche 14 geladene chemische Funktionalitäten aufweist. Die Innenoberfläche weist weiterhin eine Beschichtung vernetzter organischer multivalenter ionischer Verbindungen auf, die zu einer ionischen Wechselwirkung mit den geladenen chemischen Funktionalitäten der Innenoberfläche in der Lage sind.
- Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Kapillarröhre aus Silica hergestellt, das Glas enthält, und die geladenen chemischen Komponenten sind Silanol- Funktionalitäten, SiO&supmin;¹, die leicht nach Aussetzen der Oberfläche von Quarzglas gegenüber nur leicht basischen Lösungen gebildet werden. Wie in der Technik der Kapillar-Trennsysteme bekannt ist, kann die Länge und der Durchmesser der Kapillarröhre variieren, die jeweils von der speziellen analytischen Anwendung abhängen. Typischerweise wird die Säule von zwischen ungefähr 10 cm bis 200 cm Länge und von 25 bis 200 um Innendurchmesser sein.
- Geeignete organische vielwertige bzw. mehrwertige Ionen-Verbindungen schließen quartäre Ammoniumverbindungen ein, die eine derjenigen Ladung der negativ geladenen chemischen Funktionalität auf der Innenoberfläche der Kapillare entgegengesetzte ionische Ladung aufweisen, und die eine Ionen-Wertigkeit von zumindest drei aufweisen. Weil die vernetzte Natur der Beschichtungsmaterialien ein Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, sind bevorzugte Verbindungen dazu in der Lage, mit einem Vernetzungsreagenz vernetzt zu werden, das zumindest zwei Funktionalitäten aufweist, die mit auf der mehrwertigen ionischen Verbindung vorliegenden Funktionalitäten reaktiv sind.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung und wie in Fig. 1 dargestellt, sind diejenigen bevorzugte beschichtete Kapillarsäulen, die aus einer Silica-Röhre mit einer Innenoberflächen-Beschichtung aus vernetzten quartären Ammonium-Verbindungen gebildet sind, die die folgende allgemeine Formel aufweisen:
- bei der: 0 ≤ n ≤ 20; 0 ≤ y ≤ 20
- p 1 ist; bei der
- X aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Funktionalitäten mit der Formel Cl, Br und I besteht; bei der
- Z ein organisches Radikal ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Funktionalitäten mit der folgenden Formel besteht:
- C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl,
- und -HCOH-R&sub2;- O-R&sub3;-OHCH, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; jeweils unabhängig C&sub2;-C&sub2;&sub0;-Alkyl sind.
- Der Fachmann wird anerkennen, daß die positiven Ladungen auf den vorstehend beschriebenen vernetzten quartären Ammonium- Verbindungen, wenn sie einmal mit der Oberfläche von Silica- Säulen, wie nachstehend beschrieben, in Berührung gebracht werden, mit negativen Ladungen der ionisierten Silanol-Funktionalitäten auf der Oberfläche der Silica-Säule wechselwirken und ionisch an die Innenoberfläche der Kapillarsäule binden. Es wurde festgestellt, daß vernetzte quartäre Ammonium- Verbindungen, die aus sekundären Amino-Verbindungen mit nur drei Untereinheiten (der Wert von n in der vorstehenden Formel) hergestellt wurden, für die Kapillaren der vorliegenden Erfindung brauchbare Beschichtungen sind. Es gibt keine Begrenzung des oberen Molekulargewicht-Wertes, weil die Verbindungen mit hohem Molekulargewicht zur physikalischen Integrität beitragen und im allgemeinen leicht an die Oberfläche der Kapillare binden. Bevorzugte vernetzte quartäre Ammonium- Verbindungen stammen bevorzugt aus polymeren Amino-Verbindungen mit Molekulargewichten von ungefähr 1000 bis ungefähr 100.000.
- Die Ionenladungs-Dichte der vernetzten quartären Ammonium- Verbindung, die zumindest teilweise durch den Wert n bestimmt ist, sollte ausreichend groß sein, um mit den chemischen Funktionalitäten auf der Innenoberfläche der Kapillare stabil und ionisch wechselzuwirken. In ähnlicher Weise sollte die Ionen-Ladungsdichte ausreichend hoch sein, die Ladungen auf der Innenoberfläche der Kapillare zu maskieren bzw. abzudecken. Somit kann sich der Wert n beträchtlich verändern, wobei das einzige einschränkende Kriterium ist, daß die mehrwertige Ionen- Verbindung eine ausreichende Ladung trägt, um an die Oberfläche der Kapillarsäule zu binden. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Wert n von ungefähr 1 bis ungefähr 20.
- Die Vernetzungsdichte der vernetzten quartären Ammonium-Verbindungen sollte ausreichend groß sein, um eine physikalisch stabile und mechanisch sichere bzw. feste Beschichtung zu liefern. Bezugnehmend auf die beispielhafte Beschichtung von Fig. 1, ist der Wert n und die Menge an Vernetzungs-Reagenz, das in der Vernetzungsreaktion verwendet wird, zumindest teilweise für die Vernetzungsdichte entscheidend bzw. bestimmend. Die Mengen an Vernetzungsmittel, die zu bevorzugten Beschichtungen führen, sind nachstehend ausführlicher beschrieben.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Verfahren zur Herstellung von beschichteten Kapillarsäulen die allgemeinen Schritte ein, einen Längsabschnitt einer Röhre mit einer Innenoberfläche aus geladenen chemischen Funktionalitäten bereitzustellen, und eine vernetzte organische quartäre Ammonium- Verbindung bereitzustellen, die zu einer Ionen-Wechselwirkung mit den geladenen chemischen Funktionalitäten in der Lage ist. Dann wechselwirkt eine Schicht einer vernetzten mehrwertigen Verbindung ionisch mit der Innenoberfläche, indem verursacht wird, daß die organische quartäre Ammonium-Verbindung die Innenoberfläche berührt, wodurch eine beschichtete Kapillarsäule gebildet wird.
- Vorteilhafterweise werden die Verbindungen von Formel I hergestellt, indem zuerst zumindest eine sekundäre Amino-Verbindung mit der nachstehenden allgemeinen Formel II bereitgestellt wird
- [-(CH&sub2;)n-CH&sub2;-NH-(CH&sub2;)n-CH&sub2;-NH-(CH&sub2;)n-CH&sub2;-NH-]p II
- bei der: 0 ≤ n ≤ 20; und
- p ≥ 1 ist.
- Dann wird die Amino-Verbindung vernetzt und eine Reaktion der vernetzten Amino-Verbindung mit einem Alkylieningsreagenz führt zur Bildung einer vernetzten quartären Ammonium-Verbindung. Die Alkylierungsreaktion kann in irgendeinem von mehreren flüchtigen organischen Lösungsmitteln, einschließlich niederen Alkyl-Alkoholen und Ethern; erreicht werden. Somit kann im Anschluß an die Alkylierungsreaktion die Lösung der quartären Ammonium-Verbindung und das Lösungsmittel veranlaßt werden, die vernetzte quartäre Ammonium-Verbindung mit der Innenwand der Kapillare zu berühren, um die vernetzte Verbindung mit der Oberfläche der Innenwand ionisch zu binden.
- Ein Vernetzen von multi-funktionellen Amino-Verbindungen kann erreicht werden, indem Amino-Funktionalitäten mit einer Verbindung mit zumindest zwei funktionellen Komponenten in Reaktion gebracht werden, die zur Reaktion mit dem Amin in der Lage sind. Weil Amine leicht mit mehreren unterschiedlichen chemischen Komponenten reagieren, sind eine breite Vielzahl von multifunktionellen Verbindungen verfügbar, oder können synthetisiert werden, um als Vernetzungs-Reagenzien zu dienen. Weil Diepoxide leicht mit Aminen in Ringöffnungsreaktionen reagieren, und weil Epoxide mit variierendem Molekulargewicht leicht erhältlich sind, werden die Diepoxide zur Vernetzung von multifunktionellen Aminen gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben, ist das am meisten bevorzugte Vernetzungsreagenz Butadien-Diepoxid und reagiert mit dem Amin, das in II vorstehend dargestellt ist, wie folgt:
- bei der: 0 ≤ n ≤ 20 und
- p ≥ 1 ist.
- Weitere Diepoxide sind ebenfalls geeignet, einschließlich derjenigen, die die folgende Formel aufweisen:
- wobei R aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Funktionalitäten mit der Formel
- (CH&sub2;)n,
- besteht und
- n eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist.
- Während, Diepoxide und insbesondere Butadien-Diepoxid, bevorzugte Vernetzungsreagenzien sind, wird der Fachmann anerkennen, daß andere multi-funktionelle Verbindungen verwendet werden können, einschließlich einer Vielzahl ähnlicher Diepoxide, Dialkylhalogenide, Diacylhalogenide und Disuccinimiden.
- Ein Reagieren von Diepoxiden mit einer multi-funktionellen Amino-Verbindung zur Vernetzung der Amino-Verbindung kann erreicht werden, indem eine Lösung von Amin und Diepoxid in einem geeigneten Lösungsmittel oder in einer Kombination von Lösungsmitteln refluxiert bzw. unter Rückflußkühlung erhitzt wird. Die Amin-Konzentration hängt von der Löslichkeit und Reaktivität des Amins ab. Für polymere Amine mit Molekulargewichten in der Größenordnung von 1800, erstrecken sich geeignete Konzentrationen von 0,01 Gew.-% bis ungefähr 50 Gew.-%. In ähnlicher Weise sollte die Konzentration des Diepoxids hoch genug sein, um mit einer maximalen Anzahl von Amin-Funktionalitäten zu reagieren und um eine hohe Vernetzungsdichte zu erzie len. Dem Fachmann wird zugetraut, daß er Konzentrationen und Reaktionsbedingungen verändern kann, um die erwünschten Ergebnisse zu erzielen. Die Vernetzungsreaktionen zwischen multifunktionellen Aminen und Diepoxiden erfordern keine hohen Temperaturen und relativ flüchtige Lösungsmittel können verwendet werden, einschließlich Ethern und Niederalkyl- Alkoholen. Diese Lösungsmittel können vor der Alkylierung des vernetzten Amins leicht entfernt werden, um das Vernetzungsendprodukt zu bilden.
- Die Umwandlung der vernetzten, multifunktionellen Amino-Verbindung in eine vernetzte quartäre Ammonium-Verbindung wird vorzugsweise unter Verwendung mehrerer geeigneter Alkylierungsmittel erreicht. Während die hierin beschriebenen Verfahren normale Alkyl-Halogenid-Alkylierungsmittel verwenden, sind andere Mittel ebenfalls geeignet. Die Bildung quartärer Ammoniumverbindungen aus primären, sekundären oder tertiären Aminen, unter Verwendung von Alkylhalogeniden ist weithin bekannt und dem Fachmann wird zugetraut, daß er das Wissen über diese Reaktionen besitzt. Eine typische Alkylierungsreaktion erfordert nur das Kombinieren eines ausgewählten Alkylhalogenids und des Vernetzungsamines in einer basischen Lösung und ein unter Rückfluß erhitzen für eine geeignete Zeitspanne. Das Erzeugnis dieser Reaktion ist eine mehrwertige ionische Verbindung in Form eines quartären Ammoniumsalzes.
- Nachdem die Alkylierungsreaktion abgeschlossen ist, kann die sich ergebende Lösung direkt auf die Innenoberfläche eines vorbereiteten Längsabschnitts einer Kapillarröhre aufgebracht werden. Wenn die Kapillarröhre aus Quarzglas besteht, wechselwirken die negativen Silanol-Funktionalitäten, die auf der Innenoberfläche der Silica-Kapillare vorliegen, ionisch mit den positiv geladenen, vernetzten quartären Ammoniumverbindungen oder binden an diese, um eine Beschichtung mit verbesserter physikalischer Integrität und elektrophoretischen Trenneigenschaften zu bilden.
- Die beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung werden leicht gebildet und sind zur Verwendung in jedem Kapillar-Elektrophorese-System angepaßt. Überdies erfordert ihre Verwendung keine speziellen Handhabungs-Verfahren und typische elektrophoretische Techniken können auf ihnen angewendet werden. Demgemäß können die Säulen der vorliegenden Erfindung, wenn sie einmal in einem Standard-Kapillar-Elektrophorese-Gerät angeordnet sind, in Verfahren zur Analyse von Proben-Zusammensetzungen nach Proben-Bestandteilen durch Kapillar-Elektrophorese verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung schließen diese Verfahren typischerweise die Schritte ein, ein Ende der beschichteten Kapillarsäule in ein anodisches Vorratsgefäß bzw. -reservoir einzutauchen, und ein zweites Ende der beschichteten Säule in ein kathodisches Vorratsgefäß einzutauchen. Dann verursacht ein Einbringen einer Proben-Zusammensetzung in das Innere der beschichteten Säule am einen Ende, und das Anlegen eines elektrischen Feldes quer über die Vorratsgefäße, daß die Probenbestandteile differentiell in der Kapillarsäule wandern. Wenn ein geeigneter Detektor, beispielsweise ein UV-Vis- Detektor oder Fluoreszenz-Detektor in geeigneter Weise an zumindest einem Ende der beschichteten Säule angeordnet wird, werden die getrennten Proben-Bestandteile erfaßt bzw. nachgewiesen und ein Elektropherogramm erzeugt.
- Die folgenden Beispiele sollen beispielhafte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Diese Beispiele sind nicht einschränkend und sollen nur beispielhaft sein.
- Das folgende Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines vernetzten polymeren Alkylamins oder Polyemins (PEI), das die folgende allgemeine Formel aufweist:
- [-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-]p
- Eine Vielzahl unterschiedlicher Molekulargewichte von PEI ist von ungefähr 160 bis ungefähr 1.000.000 verfügbar. Das nachstehend beschriebene Verfahren ist auf die Herstellung von vernetzten PEI 1800, PEI 1200 und PEI 600, ebenso wie auf eine Vielzahl von mehrwertigen Aminen anwendbar, die ähnliche Molekulargewichts-Eigenschaften aufweisen.
- Eine Menge von 10 g PEI 1800 wurde einer Lösung von 20 ml Methanol und 300 ml Tetrahydrofuran zugesetzt. Nachdem das PEI vollständig gelöst war, wurde eine 1,0 g Menge an Butadien- Diepoxid der PEI-Lösung zugesetzt. Die sich ergebende Lösung von PEI und Butadien-Diepoxid wurde 16 Stunden lang unter Rückflußkühlung erhitzt und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Darauf wurden der abgekühlten Lösung 100 ml Wasser zugesetzt und die Methanol- und Tetrahydrofuran-Lösungsmittel wurden aus der Lösung in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck abgedampft. Die zurückbleibende wäßrige Lösung von vernetztem PEI ist zur Verwendung in einem nachfolgenden Alkylierungsverfahren geeignet.
- Das folgende Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Vernetzung mehrwertiger Amine mit niedrigem Molekulargewicht.
- Das beschriebene Verfahren wurde austauschbar zur Vernetzung von Pentaethylenhexamin und Triethylentetramin mit 6 bzw. 4 Amin-Funktionalitäten verwendet.
- Eine Menge von 10 g entweder von Pentaethylenhexamin oder von Triethylentetramin wurde zu 200 ml Tetrahydrofuran zugesetzt. Nachdem das Amin vollständig gelöst war, wurde eine Menge von 1 g Butadien-Diepoxid der Tetrahydrofuran-Lösung zugesetzt, und das sich ergebende Diepoxid und die Aminlösung wurden 16 Stunden lang unter Rückflußkühlung erhitzt. Die unter Rückflußkühlung erhitzte Lösung ließ man auf Raumtemperatur abkühlen und der abgekühlten Lösung wurden darauf 100 ml Wasser zugesetzt. Die Tetrahydrofuran-Menge des Lösungsmittels wurde auf einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck abgedampft und die sich ergebende wäßrige Lösung eines vernetzten Amins war zur Verwendung in einer Alkylierungsreaktion geeignet.
- Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht ein typisches Verfahren, das zur Alkylierung vernetzter polymerer Amine und kleinerer vernetzter Amino-Verbindungen geeignet ist, einschließlich der vernetzten PEI's und des vernetzten Pentaethylenhexamins und Triethylentetramins, das vorstehend beschrieben wurde. Obwohl Methyljodid das in diesem Beispiel verwendete Alkylierungsreagenz war, ist eine große Anzahl von Alkylierungsmitteln, einschließlich Chlor- und Brom-Alkylverbindungen mit dem Methyljodid austauschbar.
- Ein Volumen von 200 ml Methanol, 30 g Natriumcarbonat, 100 ml Wasser und 50 ml Methyljodid wurden einer wäßrigen Lösung zugesetzt, die 10 g einer mehrwertigen Amino-Verbindung enthielt, die wie in BEISPIEL 1 oder BEISPIEL 2 beschrieben, vernetzt war. Man ließ das Reaktionsgemisch 16 Stunden lang unter Rückflußkühlung erhitzen, und das Methanol wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers unter reduziertem Druck entfernt. Die sich ergebende wäßrige Lösung mit der quartären Ammonium-Verbindung wurde auf ein Gesamt-Volumen von 1000 ml verdünnt und dann durch einen Filter einer Porengröße von 0,45 um filtriert. Diese filtrierte Lösung ist zur Aufbringung auf die Innenoberfläche einer Kapillarröhre geeignet, um eine ionisch wechselwirkende Beschichtung zu bilden.
- Das folgende Beispiel ist für Verfahren, die zur Herstellung einer Kapillarröhre geeignet sind, und für Verfahren zur Bildung der Beschichtung auf der Innenoberfläche der Röhre beispielhaft, um die endgültige beschichtete Kapillarsäule zu liefern.
- Die Innenoberflächen eines Längsabschnitts einer Kapillarröhre mit einem Durchmesser von 50 um, die von Polymicro, Phoenix, Arizona bezogen wurde, wurde mit einer Lösung von 1 N HCl Minuten lang gespült. Die HCl-Lösung wurde entfernt und das Innere der Röhre wurde mit einer 1 N-Lösung von NaOH Minuten lang gespült, woran sich eine Spülung mit reinem Wasser für 15 Minuten anschloß. Darauf wurde der vorbereitete Längsabschnitt der Kapillarsäule 15 Minuten lang mit einer wäßrigen Lösung gespült, die ungefähr 1 Gew.-% an vernetzter quartärer Ammonium-Verbindung enthielt. Im Anschluß an diesen Spülschritt war die beschichtete Kapillarsäule zur Verwendung in Kapillar-Elektrophorese-Standardverfahren geeignet.
- Das nachfolgende veranschaulicht beispielhafte Anwendungen der beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung. Insbesondere sind die beschichteten Säulen der vorliegenden Erfindung, wie nachstehend beschrieben und in Fig. 2 dargestellt ist, bei der Trennung kleiner geladener Teilchen, wie beispielsweise basischer Arzneistoffe und größerer Proteine brauchbar.
- Eine wäßrige, sieben basische Arzneistoffe enthaltende Probe wurde hergestellt, indem jeweils 1,0 mg Desipramin, Imipramin, Nordoxepin, Doxepin, Nortriptylin, Amitriptylin und Protriptylin 1,0 ml Wasser zugesetzt wurden. Eine 37 cm · 50 um Kapillarsäule, die mit vernetztem und alkyliertem PEI 1800 beschichtet war (vernetzt und alkyliert wie in BEISPIEL 1 und BEISPIEL 2 beschrieben) wurde in einem P/ACE Kapillar-Elektrophorese-Gerät angeordnet (hergestellt von Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Die Säule wurde mit einem Puffer von 50 mM bis-tris-Propan gefüllt, der auf einen pH von 6,5 eingestellt war. Die Probe der basischen Arzneistofflösung wurde in ein Ende der Säule unter Verwendung einer 10 sek. Druckinjektion injiziert und 400 V/cm oder 14,8 kV wurden quer über die Elektrophorese-Vorratsbehälter bei einer Temperatur von 25ºC angelegt. Die getrennten basischen Amine wurden mit einem UV-Detektor bei 214 nm nachgewiesen. Fig. 2 stellt das Elektropherogramm dar, das nach weniger als 8 Minuten Wanderung erhalten wurde. Jedes der basischen Amine wurde von den anderen Aminen durch eine Grundlinien-Trennung getrennt. Die Reihenfolge der Wanderung, von links nach rechts auf dem Elektropherogramm, ist Doxepin, Nordoxepin, Imipramin, Desipramin, Amitriptylin, Nortriptylin und Protriptylin.
- Das nachfolgende veranschaulicht eine beispielhafte Anwendung der beschichteten Kapillarsäulen der vorliegenden Erfindung. Die beschichteten Säulen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere, wie nachstehend beschrieben und in Fig. 3 dargestellt, bei der Trennung von Proteinen brauchbar.
- Eine wäßrige, fünf Proteine enthaltende Probe, wurde durch Zusatz von jeweils 1,0 mg Carboanhydrase, Myoglobin, α-Chymotrypsinogen A, Cytochrom C und Lysozym zu 1,0 ml Wasser hergestellt. Eine 37 cm · 50 um Kapillarsäule, die mit vernetztem und alkyliertem PEI 1800 beschichtet war (vernetzt und alkyliert wie in BEISPIEL 1 und BEISPIEL 2 beschrieben), wurde in einem P/ACE-Kapillar-Elektrophorese-Gerät angeordnet (hergestellt von Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Die Säule wurde mit einem HEPES-Puffer gefüllt, der auf einen pH von 7,0 eingestellt war. Die Probe der basischen Arzneistoff-Lösung wurde in ein Ende der Säule unter Verwendung einer sek. Druckinjektion injiziert und 300 V/cm oder 11,1 kV wurden quer über die Elektrophorese-Vorratsbehälter bei einer Temperatur von 25ºC angelegt. Die getrennten basischen Proteine wurden mit einem UV-Detektor bei 214 nm nachgewiesen. Fig. 3 stellt das Elektropherogramm dar, das nach weniger als 8 Minuten Wanderung erhalten wurde. Jedes der Proteine wurde von den anderen Proteinen durch eine Grundlinientrennung getrennt, wobei die Wanderungsreihenfolge von links nach rechts auf dem Elektropherogramm Carboanhydrase, Myoglobin, α-Chymotrypsinogen A, Cytochrom C und Lysozym war.
Claims (18)
1. Kapillarsäule (10) für elektrophoretische Trennungen von
Proben-Bestandteilen, wobei die Kapillarsäule folgendes umfaßt:
einen Längsabschnitt einer Röhre (12) mit einer
Innenoberfläche (14), wobei die Innenoberfläche negativ geladene
chemische Funktionalitäten aufweist; und
eine Beschichtung auf der Innenoberfläche, wobei die
Beschichtung zumindest eine vernetzte quartäre
Ammonium-Verbindung umfaßt, die zu einer ionischen Wechselwirkung mit den
geladenen chemischen Funktionalitäten der Innenoberfläche in
der Lage ist.
2. Kapillarsäule nach Anspruch 1,
bei der die Röhre aus Silika hergestellt ist, und die geladenen
chemischen Funktionalitäten ionisierte Silanol-Funktionalitäten
einschließen.
3. Kapillarsäule nach Anspruch 1,
bei der die quartäre Ammonium-Verbindung aus Verbindungen
ausgewählt ist, die zumindest drei quartäre
Ammonium-Funktionalitäten aufweisen.
4. Kapillarsäule (10) für elektrophoretische Trennungen
von Proben-Bestandteilen, wobei die Kapillarsäule folgendes
umfaßt:
einen Längsabschnitt einer Silika-Röhre (12) mit einer
Innenoberfläche (14), wobei die Innenoberfläche geladene,
dissoziierte Silanol-Funktionalitäten aufweist; und
eine Beschichtung auf der Innenoberfläche, wobei die
Beschichtung vernetzte quartäre Ammonium-Verbindungen umfaßt,
die zu einer ionischen Wechselwirkung mit den dissoziierten
Silanol-Funktionalitäten in der Lage ist.
5. Kapillarsäule nach Anspruch 4,
bei der die vernetzten quartären Ammonium-Verbindungen
Verbindungen mit zumindest drei quartären Ammonium-Funktionalitäten
einschließen, die mit einer Diepoxid-Verbindung vernetzt sind.
6. Kapillarsäule nach Anspruch 1 oder Anspruch 5,
bei der die vernetzte quartäre Ammonium-Verbindung aus
Verbindungen mit der Formel:
ausgewählt ist,
bei der: 0 ≤ n ≤ 20; 0 ≤ y ≤ 20;
P ≥ 1;
X aus Cl, Br und I ausgewählt ist;
Z ein organisches Radikal ist, das aus
C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl, -CO-R&sub1;-CO-, und -HOCH-R&sub2;-
O-R&sub3;-HOCH- ausgewählt ist, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; jeweils
unabhängig C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl sind.
7. Verfahren zur Herstellung einer Kapillarsäule, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Bereitstellen eines Längsabschnitts einer Röhre mit einer
Innenoberfläche, wobei die Innenoberfläche negativ geladene
chemische Funktionalitäten aufweist;
Bereitstellen einer vernetzten quartären
Ammonium-Verbindung, wobei die Verbindung zu einer ionischen Wechselwirkung
mit den geladenen chemischen Funktionalitäten in der Lage ist;
Verursachen, daß die Verbindung die Innenoberfläche
berührt, wodurch sich eine Schicht der vernetzten Verbindung
bildet, die ionisch mit der Innenoberfläche wechselwirkt.
8. Verfahren nach Anspruch 7,
bei dem das Bereitstellen einer vernetzten quartären Ammonium-
Verbindung erreicht wird, indem
zumindest eine Amino-Verbindung bereitgestellt wird,
wobei das Amin zumindest drei Amino-Funktionalitäten pro Molekül
aufweist;
die Amino-Verbindung zur Bereitstellung einer vernetzten
Amino-Verbindung vernetzt wird; und
die vernetzte Amino-Verbindung mit einem
Alkylierungsmittel zur Bildung einer vernetzten quartären
Ammonium-Verbindung in Reaktion gebracht wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8,
bei dem die Amino-Verbindung aus der Gruppe von Aminen
ausgewählt ist, die die Formel
-[(CH&sub2;)n-CH&sub2;-NH-(CH&sub2;)n-CH&sub2;-NH-(CH&sub2;)n-
CH&sub2;-NH-]p-
aufweisen, wobei 0 ≤ n ≤ 20; p ≥ 1 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 7,
bei dem das Vernetzen der Amino-Verbindung durch Reagieren von
Amino-Funktionalitäten des Amins mit einem Vernetzungsmittel
erreicht wird, das aus Diepoxiden, Dialkylhalogeniden,
Diacylhalogeniden und Disuccinimiden ausgewählt ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10,
bei dem das Diepoxid aus Verbindungen ausgewählt ist, die die
Formel:
aufweisen,
bei der R aus Funktionalitäten mit der Formel
-(CH&sub2;)n-, -CO-,
ausgewählt ist, und bei der n eine ganze Zahl zwischen 1 und
20 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 8,
bei dem ein Reagieren der vernetzten Amino-Verbindung mit einem
Alkylierungsmittel zur Bildung einer vernetzten quartären
Ammonium-Verbindung erreicht wird, indem die vernetzte Amino-
Verbindung mit einem Alkylhalogenid-Alkylierungsmittel in
Reaktion gebracht wird.
13. Verfahren zur Untersuchung einer Probenzusammensetzung
nach Proben-Bestandteilen durch Kapillarelektrophorese, wobei
das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:
Bereitstellen einer Kapillar-Elektrophorese-Säule,
die folgendes umfaßt:
einen Längsabschnitt einer Kapillarröhre mit einer
Innenoberfläche, einem ersten Ende und einem zweiten Ende,
wobei die Innenoberfläche negativ geladene chemische
Funktionalitäten aufweist; und
eine Beschichtung auf der Innenoberfläche, wobei die
Beschichtung vernetzte quartäre Ammonium-Verbindungen umfaßt,
die zu einer ionischen Wechselwirkung mit den geladenen
chemischen Funktionalitäten der Innenoberfläche in der Lage ist;
Eintauchen des ersten Endes in ein anodisches
Vorratsgefäß und Eintauchen des zweiten Endes in ein kathodisches
Vorratsgefäß;
Einbringen der Probenzusammensetzung in den
Längsabschnitt einer Kapillarröhre an dem ersten Ende oder dem zweiten
Ende; und
Anlegen eines elektrischen Feldes quer über die
Vorratsgefäße, wobei das elektrische Feld dazu in der Lage ist, zu
verursachen, daß die Proben-Bestandteile in unterschiedlichen
Geschwindigkeiten im Hinblick auf jeden Proben-Bestandteil
in der Kapillarsäule wandern.
14. Verfahren nach Anspruch 13,
bei dem die Probenbestandteile aus Peptiden, Proteinen und
Aminen ausgewählt sind.
15. Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 13,
bei dem die vernetzte quartäre Ammonium-Verbindung aus
Verbindungen mit der folgenden Formel ausgewählt ist:
bei der: 0 ≤ n ≤ 20; 0 ≤ y ≤ 20;
p ≥ 1;
X aus Cl, Br und I ausgewählt ist;
Z ein organisches Radikal ist, das aus
C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl, -CO-R&sub1;-CO-, und -HOCH-R&sub2;-
O-R&sub3;-HOCH- ausgewählt ist, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;
jeweils unabhängig C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl sind.
16. Kapillar-Beschichtungsmaterial das eine vernetzte
quartäre Ammonium-Verbindung mit der allgemeinen Formel:
umfaßt,
bei der: 0 ≤ n ≤ 20; 0 ≤ y ≤ 20;
p ≥ 1;
X aus Cl, Br und I ausgewählt ist;
Z ein organisches Radikal ist, das aus
C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl, -CO-R&sub1;-CO-, und -HOCH-R&sub2;-
O-R&sub3;-HOCH- ausgewählt ist, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;
jeweils unabhängig C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl sind.
17. Wäßrige Lösung zur Verwendung als eine Kapillar-
Beschichtungszusammensetzung, mit einer vernetzten quartären
Ammonium-Verbindung, die aus einer polymeren Amino-Verbindung
mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 100.000 gebildet ist.
18. Wäßrige Lösung nach Anspruch 17, bei der die quartäre
Ammonium-Verbindung die folgende allgemeine Formel aufweist:
bei der: 0 ≤ n 20; 0 ≤ y ≤ 20;
p ≥ 1;
X aus Cl, Br und I ausgewählt ist;
Z ein organisches Radikal ist, das aus
C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl, -CO-R&sub1;-CO, und -HOCH-R&sub2;-
O-R&sub3;-HOCH- ausgewählt ist, wobei R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;
jeweils unabhängig C&sub1;-C&sub2;&sub0;Alkyl sind.
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