DE69218857T2

DE69218857T2 - Gel enthaltende Kapillarsäule mit Polyorgansiloxanüberzug

Info

Publication number: DE69218857T2
Application number: DE69218857T
Authority: DE
Inventors: Robert R Holloway
Original assignee: Hewlett Packard Co
Current assignee: HP Inc
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 1997-07-17
Anticipated expiration: 2012-08-15
Also published as: JPH05253448A; DE69218857D1; US5110439A; EP0529899A3; EP0529899B1; EP0529899A2

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf die Polymerchemie und insbesondere auf eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophoresesäule und ein Verfahren zum Herstellen derselben. Eine Hauptaufgabe der Erfindung besteht darin, eine Säule mit einer Gelmatrix zu erzeugen, die lückenfrei ist, und die der Belastung einer Hochspannungselektrophorese ohne einen Bruch oder eine Verschiebung widersteht.
Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE = Polyacrylamide gel electrophoresis) ist eine bekannte Methodik zum Analysieren von Proteingemischen. Bei einer typischen PAGE-Prozedur wird ein Proben-Proteingemisch an einem Ende einer Kapillarsäule eingebracht, welche eine Quarzglasröhre sein kann, die mit einer Polyacrylamid-Gel-Matrix befüllt ist. Die Gelmatrix weist eine Gitterstruktur mit Poren auf, die als ein molekulares Sieb wirken, das ermöglicht, daß kleine Partikel ohne weiteres durch dasselbe gelangen, das jedoch auf größere Partikel eine Reibungswiderstandskraft ausübt. Geladene Biomoleküle wandern durch das Gel in dem elektrischen Feld mit Geschwindigkeiten, die eine inverse Beziehung zu den Molekulargewichten derselben aufweisen. Die unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewirken, daß sich Gemischkomponenten in Bänder trennen, die erfaßt werden können, wenn dieselben einen Detektor durchlaufen, um eine Analyse zu liefern. Wenn es erwünscht ist, ein Protein zu isolieren, kann die Spannung abgeschaltet werden und das Gel kann aus der Röhre entfernt werden und durch ein Band getrennt werden.
Polyacrylamid-Gele sind dreidimensionale synthetische Vinyl-Polymere, die am üblichsten aus Acrylamid- und Bisacrylamid-Monomeren mit geringem Molekulargewicht gebildet sind, wobei die letztgenannten als ein Querverbinder wirken. Aufgrund der Wirkung eines Initiators werden die Monomer-Einheiten in einer Lösung chemisch gebunden, um ein Polymer mit Geleigenschaften zu bilden. Jedoch ist das Volumen, das durch das polymerisierte Gel besetzt wird, geringer als das der Monomerlösung. Acrylamid schrumpft um etwa 0,25 Milliliter (ml) pro Gramm bei der Polymerisation. Folglich kann dieses Schrumpfen das Gel von der inneren Wand der Röhre wegziehen, wobei nicht-siebende Kanäle belassen werden. Diese nicht-siebenden Kanäle verschlechtern die Fähigkeit der Gelsäule, molekulare Komponenten während einer Elektrophorese zu trennen. Außerdem kann das Gel während der Elektrophorese tatsächlich aus der Röhre gleiten, was den Trennprozeß beeinträchtigt.
Um das Problem der nicht-siebenden Kanäle in der Nähe der Wand der Röhre zu mindern, wurden die inneren Wände von Kapillarröhren mit silylatierenden (silylating) oder silanisierenden (silanizing) Reagenzien beschichtet, im allgemeinen kurze starre Kohlenstoffketten mit einer Vinyl-Doppelbindung an dem freien Ende. Die Acrylamid-Monomere binden sich kovalent an dem Beschichtungsmaterial, während die Polymerisation stattfindet, so daß das polymerisierte Gel fest an der Röhre befestigt ist. Diese Befestigung minimiert die Bildung nicht-siebender Kanäle in der Nähe der Röhrenwand. Jedoch induziert das Schrumpfen Belastungen in der Gelmatrix, so daß Lücken in dem Inneren des Gels auftreten können. Diese Lücken bilden Gelinhomogenitäten, die die Trennung der Probenkomponenten während der Elektrophorese stören und das Verhalten der Gelsäule verschlechtern. Ferner ist es möglich, daß unter der Belastung von dem Schrumpfen des Gels die Porengröße des Gitternetzwerks ungleichmäßig ist.
Das U.S.-Patent 4,810,456, erteilt an Bente und Myerson, offenbart eine Technik, um das Schrumpfen des Gels durch das Ausüben eines Hochdrucks auf die Monomerlösung während der Polymerisation zu reduzieren. Dieses Verfahren wird in Verbindung mit Beschichtungen verwendet, die die Gelmatrix an die Säulenwand binden. Die Technik versucht, Schrumpfungsdefekte durch das Komprimieren der Monomerlösung auf ein Volumen in der Nähe dessen, das von dem polymerisierten Gel erwartet wird, zu reduzieren, in anderen Worten durch ein Vorschrumpfen. Jedoch beseitigt diese Technik Verhaltensprobleme des Gels nicht vollständig. Die Gele scheinen in der Nähe der Mitte schwacher zu sein und halten nicht so lange wie erwünscht. Ferner erfordert die Technik eine Hochdruckausrüstung, die kostspielig ist.
Es besteht der Bedarf nach einer elektrophoretischen Gelsäule, die größeren elektrischen Feldern widerstehen kann und die ihre Unversehrtheit für eine größere Anzahl von Durchläufen beibehält. Als ein Zusatz ist ein Verfahren zum Herstellen einer solchen Säule erforderlich, wobei das Verfahren ökonomisch sein sollte und ein Gel zur Folge haben sollte, das sicher an der Säulenwand befestigt und frei von inneren Lücken ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung weist eine PAGE-Säule eine radial zwischenliegende organosiloxan-"Halteseil"-Schicht auf, die kovalent sowohl an eine Glaskapillarröhre als auch eine Polyacrylamid-Gel-Matrix gebunden ist. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt das Einbringen einer Polyorganosiloxan-Lösung, die mit Silanolgruppen auf der inneren Röhrenwand reagiert, um kovalente Bindungen zwischen dem Organosiloxan und der Wand zu bilden. Ein Vinyl-Koppelreagenz wird dann eingebracht, um sich kovalent an freie Enden der Organosiloxanschicht zu binden, so daß die freien Enden Vinyl-Gruppen werden. Die beschichtete Röhre wird dann mit einem Acrylamid-Vorpolymer, vorzugsweise einem Monomer, und einem quer-verbindenden Reagenz gefüllt. Während der Polymerisation werden die Vinyl-Gruppen in die Gelmatrix eingebaut, so daß die Gelmatrix über ungebrochene Ketten von kovalenten Bindungen, vorherrschend Si-O-Bindungen, kovalent an die Röhrenwand gebunden wird. Die Säule wird dann in ein ionisches Gleichgewicht mit zwei Pufferbehältern gebracht, einem an jedem Ende der Gelsäule, indem unterschiedliche elektrische Potentiale an den Behältern eingestellt werden, so daß das elektrische Feld entlang der Säule zumindest 500 Volt pro Zentimeter beträgt.
Vorzugsweise besteht die Glasröhre aus Quarzglas. Die organosiloxan-Lösung kann Silanol-abgeschlossenes Polydimethylsiloxan einschließen. Das Vinyl-Koppelreagenz kann Methacryloxypropyltrichlorosilan einschließen. Das quer-verbindende Reagenz kann Methylen-Bisacrylamid sein. Der Puffer kann ein SDS-PAGE-Puffer (Natriumdodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese), beispielsweise Tris-HCl, sein.
Bei der resultierenden Struktur ist die Gelmatrix über die Halteseilschicht an der Röhre gebunden. Jedes Halteseil ist ein Silan-abgeschlossenes Polyorganosiloxan-Polymersegment. Jedes Halteseil weist eine Polyorganosiloxankette und eine Organosilan-Verbindung auf. Jede Kette umfaßt zumindest 1.000, jedoch vorzugsweise etwa 20.000 Polyorganosiloxan- Segmente.
Während der Polymerisation schrumpft das Polyacrylamid-Gel. Die Polyorganosiloxan-Ketten dehnen sich aus, so daß sich die Organosiloxanschicht verdickt. Am Ende der Polymerisation ist die Polyorganosiloxan-Schicht mindestens zweimal so dick, wie sie ohne die Gel-induzierte Dehnung wäre. Da sich Organosiloxan jedoch auf das etwa zwölffache seiner ungedehnten Länge ausdehnen kann, wird eine relativ geringe mechanische Belastung eingeführt.
Da die Gelmatrix unter einer geringen mechanischen Belastung ist, ist dieselbe besser in der Lage, hohen Spannungen (500 Volt bis 4.000 Volt) während einer Vorelektrophorese und der Elektrophorese zu widerstehen. Höhere Spannungen bedeuten schnellere Durchsätze während der Säulenherstellung, während der Säulenvorbereitung und während der Elektrophorese. Die schnelleren Durchsätze übertragen sich in Kosten- und Zeit- Einsparungen. Diese und weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung bezugnehmend auf die folgenden Zeichnungen offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Schema eines Elektrophoresesystems, das eine Kapillarsäule gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist.
Fig. 2 ist eine schematische Querschnittansicht der Säule von Fig. 1.
Fig. 3 ist ein Flußdiagramm eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung, das verwendet wird, um die Säule von Fig. 1 herzustellen.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung einer Organosiloxan-Bindung an einer Silika-Kapillarröhre, wie sie durch den ersten Schritt des Verfahrens von Fig. 3 geliefert wird.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung einer Molekularstruktur mit einer Vinylgruppe, die kovalent an das Organosiloxan von Fig. 4 gebunden ist, wie dieselbe durch einen zweiten Schritt des Verfahrens von Fig. 3 geliefert wird.
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung der Molekularstruktur der Säule, die in den Fig. 1 und 2 dargestellt ist, und wie sie durch einen dritten Schritt des Verfahrens von Fig. 3 geliefert wird.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Eine PAGE-Säule 100 gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 1 während einer Vor-Elektrophorese-Prozedur gezeigt. Ein Ende der Säule 100 ist in einer Pufferlösung 102 in einem "positiven" Behälter 104 angeordnet, während das andere Ende der Säule 100 in einem "negativen" Behälter 106, der ebenfalls eine Pufferlösung 108 enthält, angeordnet ist. Eine Leistungsversorgung 112 lädt eine positive Elektrode 114 bezüglich einer negativen Elektrode 116. Die positive Elektrode 114 ist in dem positiven Behälter 104 angeordnet, während die negative Elektrode 116 in dem negativen Behälter 106 angeordnet ist. Während der Prozedur liefert die Leistungsversorgung 112 ein elektrisches Potential von insgesamt 15.000 Volt. Dies ergibt eine Feldintensität von 1.000 Volt pro cm, da die Säule 100 15 cm lang ist. Unter dem Einfluß des elektrischen Feldes wandern Pufferionen von beiden Behältern 104 und 106 in die Säule 100, wobei sie vor der Bearbeitung der Säule 100 geladene Rückstände aus der Säule 100 entleeren. Diese Entleerung ist vorbereitend für das Einbringen der Probe und die elektrophoretische Trennung der Probe.
Die Säule 100 weist eine Quarzglasröhre 202 und eine Polyacrylamid-Gel 204 in derselben auf, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Polyorganosiloxan-Halteseil-Schicht 206 kovalent an einer inneren Wand 208 der Röhre 202 und an dem Gel 204 befestigt, wodurch das Gel 204 in der Röhre 202 gebunden ist. Die Haltseil-Schicht 206 liefert eine ununterbrochene Kette kovalenter Bindungen zwischen der Wand 208 und dem Gel 204. Die Halteseil-Schicht 206 ist in der Radialrichtung etwa einen halben Mikrometer dick. Die Spannung, die während der Polymerisation in die Halteseil-Schicht 206 eingeführt wird, bewirkt, daß sich die Polyorganosiloxan-Polymersegmente auf zumindest das Doppelte ihrer Länge bei minimaler Energie dehnen. Folglich ist die Halteseil-Schicht zumindest doppelt so dick wie sie es beim Fehlen der Spannung, die durch das Gel 204 eingeführt wird, wäre. Da die Energie, die erforderlich ist, um das Organosiloxan um den notwendigen Betrag zu dehnen, relativ gering ist, sind die restlichen mechanischen Belastungen auf das Gel minimal. Das Minimieren der Gelbelastungen verbessert die Gel-Unversehrtheit unter hohen Spannungen und über mehrere elektrophoretische Durchläufe.
Die Säule 100 wird unter Verwendung eines Verfahrens 300 gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt, das in Fig. 3 gezeigt ist. In einem ersten Schritt 301 wird eine Schicht aus Polyorganosiloxan, speziell Polydimethylsiloxan (PDS) kovalent an der inneren Wand einer geeignet vorbereiteten Quarzglas-Kapillarröhre befestigt. In einem zweiten Schritt 302 werden Vinylgruppen kovalent an den freien Enden der jeweiligen Polyorganosiloxanmoleküle befestigt, was eine Vinyl-abgeschlossene PDS-Bindung an der Röhre zur Folge hat; die Vinylenden dienen als Verbindungen, um die Gelmatrix anzubinden.
In einem dritten Schritt 303 wird eine Vorpolymerlösung, die überwiegend ein Acrylamid-Monomer und einen entsprechenden Querverbinder enthält, Methylenbisacrylamid, in die Röhre eingeführt und polymerisiert, so daß dieselbe kovalent an dem funktionellen Reagenz haftet. Während der Polymerisierung werden die Vinylenden der Halteseil-Moleküle modifiziert, um in die Polymerketten der Gelmatrix eingeschlossen zu werden, die dadurch kovalent an dem Polyorganosiloxan und dadurch an der Röhre befestigt wird. In einem vierten Schritt 304 wird die Röhre in die Konfiguration von Fig. 1 eingefügt; ein elektrisches Feld von etwa 1.000 V/cm wird angelegt, um die Säule mit einem Puffer zu füllen und ungewollte geladene Polymerisations-Nebenprodukte zu beseitigen. Einzelheiten dieses Verfahrens 300 werden nachfolgend dargelegt.
Die Quarzglas-Kapillarröhre ist 15 cm lang und weist einen Durchmesser von 100 µm auf. Die Kapillarröhre wird durch ein dreiminütiges Spülen ihres Inneren mit einer wässrigen Lösung aus 6M-Natriumhydroxid vorbereitet, um das Vorliegen von Silanol-Strukturen (Si-O-H-Strukturen) an der inneren Wand zu maximieren. Diese Silanol-Strukturen sind die Befestigungsstellen für das Organosiloxan.
Organosiloxan wird durch das Einbringen einer Lösung aus Silanol-abgeschlossenem PDS (kommerziell erhältlich) von 5% Masseanteil in Chloroform in die Röhre befestigt. Das PDS weist einen Mittelwert von etwa 20.000 Dimethylsiloxy-Gruppen pro Molekül auf. Tetrabutyltitanat mit einer Konzentration von 1% Masseanteil des PDS, wird als ein Katalysator verwendet. Die Lösung wird in die Röhre getrieben, wobei ermöglicht wird, daß dieselbe für etwa zwölf Stunden in derselben verbleibt, um zu ermöglichen, daß sich eine PDS- Schicht auf der inneren Wand der Röhre bildet.
In einer vorherrschenden Reaktion bindet sich ein Silanolabgeschlossenes Ende des PDS kovalent an der Röhrenwand, um eine Silyl-Ether-Bindung (Si-O-Si) über eine Kondensationsreaktion mit den Hydroxylgruppen auf der Silika zu bilden; die anderen Silanol-abgeschlossenen Enden bleiben für eine Kopplung mit dem Gel durch ein Koppelreagenz verfügbar. Nach dieser Inkubation wird Stickstoff durch die Röhre getrieben, um das Chlorophorm zu beseitigen, wobei eine Polydimethylsiloxan-Kette 402, die kovalent an die Röhre 202 gebunden ist, verbleibt, wie in Fig. 4 gezeigt ist.
Vinylgruppen werden durch das Einbringen eines Koppelreagenz in die Röhre befestigt. Eine Lösung aus Gamma-Methacryloxypropyltrichlorosilan von 2% Volumenanteil in Toluen wird veranlaßt, für 15 Minuten durch die Röhre zu fließen. Dies hat zur Folge, daß sich Vinylgruppen an den freien Organosiloxanenden befestigen. Eine Stickstoffspülung wird verwendet, um sämtliche Flüssigkeit zu beseitigen. Dieser folgt eine einminütige Spülung mit Wasser, um das HCl gelöst zu extrahieren, wenn sich das Methacryloxypropyltrichlorosilan über Silyl-Ether-Bindungen an dem organosiloxan bindet. Die resultierende Struktur weist ein Vinylende 504 auf, das kovalent an der Kette 402 befestigt ist, wie in Fig. 5 gezeigt ist. Das Vinylende weist zwei Kohlenstoffatorne 506 und 508 auf, die durch eine Doppelbindung 510 verbunden sind.
Danach wird die Röhre mit einer wässrigen Lösung aus Acrylamid-Monomer (10% Masseanteil in der Lösung), einem Querverbinder, einem freien radikalen Initiator und einem Puffer gefüllt. Der Querverbinder ist N, N'methylenbiscrylamid (3% im Verhältnis zu dem Acrylamid, 0,3% Masseanteil in der Lösung). Der radikale Initiator ist eine Kombination aus Ammonium-Persulfat (0,1 mM in der Lösung) plus eine gleiche Konzentration von Tetramethylethylendiamin (aka TMEDA oder TEMED). Der Puffer ist 50 mM Natriumphosphat, pH 7,2 @ 25ºC. Bevor das TEMED zugesetzt wird, wird die Lösung durch das Sprudeln von Helium durch die Lösung entgast.
Ein Druck wird ausgeübt, um die Monomerlösung in die Röhre zu zwingen. Der Druck, der die Lösung treibt, kann wenn nötig bis zu 20 Bar erhöht werden, um eine Fluß in die Röhre beizubehalten. Der Druck ist erforderlich, um dem Widerstand Rechnung zu tragen, der sich aufgrund der Viskosität der Polymerisationslösung aufbaut. Dieser Druck hilft dabei, zu verhindern, daß sich Gasblasen in dem Gel entwickeln. Der Druck wird für 30 Minuten beibehalten, wobei nach dieser Zeit die Polymerisation abgeschlossen ist. Typischerweise werden die organosilanenden 504 der Halteseile in die Polyacrylamid-Polymerketten eingebaut, so daß die resultierende Gelmatrix kovalent über die Halteseilschicht an der Röhre gebunden ist.
Die Struktur nach der Polymerisation umfaßt die Silika-Röhre 202, ein Silan-abgeschlossenes Polyorganosiloxan-Halteseil- Polymersegment 600 und eine Polyacrylamid-Polymerkette 610, wie in Fig. 6 gezeigt ist. Die Polyacrylamid-Polymerkette 610 ist ein Teil des Gels 204. Das Silanende 604 ist in das Polyacrylamid-Gel 204 eingebaut, wie durch das überlappen der Verbindung 604 und der Polyacrylamid-Kette 610 in Fig. 6 angezeigt ist. Das Halteseil 600 weist eine Polydimethylorganosiloxan-Kette 402 mit etwa 20.000 Si-O-Bindungen und eine Organosilan-Verbindung 604 auf.
Das Gel 204 ist durch eine einzelne Polyacrylamid-Kette 610 dargestellt; Fachleute werden erkennen, daß eine Vielzahl derartiger Ketten existiert, und daß die Ketten aufgrund der Wirkung des quer-verbindenden Reagenz untereinander verbunden sind. Die Polyacrylamid-Kette 610 weist einen Initiatorrückstand 1, ein erstes Polyacrylamid-Segment 612 mit m Einheiten und ein zweites Polyacrylamid-Segment 614 mit n Einheiten auf. Gemäß der Darstellung erstreckt sich das zweite Polyacrylamid-Segment 614 zu einer Reihe von Punkten, die die verschiedenen Möglichkeiten darstellen, auf die sich derartige Ketten bekanntermaßen fortsetzen und schließlich in einem Polyacrylamid-Gel enden. Während der Polymerisation wird die Doppelbindung 510 von Fig. 5 durch eine einfache Bindung 616 ersetzt, was ermöglicht, daß das Polyacrylamid- Segment 612 sich an das Kohlenstoffatom 506 bindet, während das Kohlenstoffatom 508 nachfolgend als eine Stelle zum Anwachsen des zweiten Polyacrylamid-Segments 614 dient.
Sobald die Polymerisation abgeschlossen ist, werden beide Enden der Röhre 202 in die Elektrophorese-Pufferbehälter 104 und 106 eingebracht, wie in Fig. 1 gezeigt ist. Der bevorzugte SDS-PAGE-Puffer ist 100 mM Tris-HCl, pK 8,4; "Tris" ist tris(hydroxymethyl)aminomethan. Eine Spannung von 15 kV wird über die Säule, die 15 cm lang ist, angelegt, so daß die Feldstärke 1.000 V/cm beträgt. Das Feld wird für 15 Minuten beibehalten, während Pufferionen andere mobile Ionen entlang der Säule ersetzen. Der Vor-Elektrophorese-Schritt bewirkt, daß die Pufferionen möglicherweise schädliche, geladene Produkte der Polymerisationsreaktion ersetzen. Die resultierende Struktur ist die Säule 100, wie sie im Querschnitt in Fig. 2 gezeigt ist.
Das Gel behält seine Unversehrtheit beim Vorliegen des wiederholten Anlegens von starken Feldern bei, da dasselbe an der Wand gebunden ist, jedoch frei von Lücken und einer minimalen inneren Belastung unterworfen ist. Nachfolgende Vor-Elektrophorese- und Elektrophorese-Prozeduren können ebenfalls mit Feldstärken über 500 V/cm durchgeführt werden, um einen hohen Säulendurchsatz beizubehalten.
Obwohl oben die vorspringenden Merkmale des bevorzugten Verfahrens und der Struktur beschrieben wurden, werden Fachleute erkennen, daß bestimmte Abweichungen inhärent enthalten sind. Beispielsweise haften einige PDS-Moleküle an anderen PDS-Molekülen, so daß dieselben keinen Anschluß für das Gel liefern. In einem bestimmten Fall kann die Gelmatrix an zwischenliegenden Stellen entlang eines PDS-Moleküls haften. Obwohl die oben beschriebene Struktur und das Verfahren bevorzugte Ausführungsbeispiele darstellen, liefert die vorliegende Erfindung einen Bereich von Alternativen, von denen einige nachfolgend genannt werden.
Es existieren unterschiedliche Kapillarröhren. Quarzglas ist das bevorzugte Material, wobei jedoch viele alternative, auf Silika basierende Gläser verwendet werden können. Die Abmessungen können geändert werden. Der innere Durchmesser kann von 5 µm bis 500 µm schwanken. Die Röhre muß keinen kreisförmigen Querschnitt aufweisen, sondern kann ebenso gut rechteckig oder elliptisch sein. Die Länge kann von 5 cm bis 200 cm variieren. Es ist nicht notwendig, daß das Material oder die Abmessungen über die Länge der Kapillarröhre gleichmäßig sind. Die Länge einer Kapillarröhre muß am Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht die gleiche sein wie am Ende desselben. Beispielsweise kann eine relativ lange Gel-gefüllte Kapillarröhre geteilt werden, um eine oder mehrere Kapillarsäulen einer gewünschten Länge zu ergeben.
Es existieren verschiedene Verfahren zum Aktivieren der Röhrenoberfläche. Andere kaustische wässrige Lösungen können verwendet werden, um Silanolstellen zu maximieren. Alternativ kann eine starke Mineralsäure, beispielsweise Schwefelsäure (H&sub2;SO&sub4;) oder Stickstoffsäure (HNO&sub3;) verwendet werden.
In einigen Fällen kann eine ausreichende Anzahl von Stellen ohne eine spezielle Aktivierungsprozedur vorliegen.
Es existieren unterschiedliche Organosiloxan-Lösungen. Eine Zinnseife, Dibutyltin-Dilaurat, kann als ein Katalysator statt des Tetrabutyltitanats für die Silanisierung verwendet werden. Es existieren unterschiedliche Endpunkte. Beispielsweise kann ein Chlorodimethylsiloxy-abgeschlossenes PDS verwendet werden. Chlorodimethylsiloxy-abgeschlossenes PDS kann aus kommerziell erhältlichem Silanol-abgeschlossenem PDS vorbereitet werden, indem Chlor für die Hydroxylgruppen auf dem Ende substituiert wird. Die Lösung wird veranlaßt, durch die Kapillarröhre zu fließen, wodurch, in einer vorherrschenden Reaktion, ein Chlorodimethylsiloxy-Ende an einem Ende eines Organosiloxan-Moleküls mit einer Oberflächen-gebundenen Silanol-Gruppe reagiert, um ein Oberflächen-gebundenes PDS mit einer Chlorodimetyhlsiloxy-Gruppe, die an dem freien Ende desselben verfügbar ist, zu bilden. Die Reaktion hat ein HCl-Nebenprodukt zur Folge. Die gebundene Organosiloxan-Schicht wird mit Wasser gewaschen, um eine Hydroxyl- Gruppe für das Chlor an dem freien Endabschluß zu substituieren und das HCl zu ersetzen. Eine ähnliche Prozedur kann verwendet werden, um ein Trichlorosilyloxy-abgeschlossenes Polydimethylsiloxan zu binden. Dieses Material liefert zwei zusätzliche Hydroxyl-Gruppen zum Binden eines Gels, ist jedoch schwieriger zu synthetisieren.
Das Koppelreagenz kann unterschiedliche Formen annehmen. Beispielsweise kann das bevorzugte Methacryloxypropyltrichiorosilan in Xylen aufgelöst sein, und nicht in dem bevorzugten Toluen. Acryloxypropyltrichlorosilan ist ein alternatives Chlor-haltiges Koppelreagenz. Alternativ können Alkoxy-Reagenzien, beispielsweise Methacryloxypropyltrimethoxysilan oder Methacryloxypropyltriethoxysilan oder andere Trialkoxysilane, verwendet werden, obwohl die resultierenden Reaktionen zeitaufwendiger sind und eine Erwärmung erfordern.
Die Alkoxy-Koppelreagenzien können bei 2% Volumenanteil in einem Gemisch von 90% Wasser, 9,9% Ethanol mit etwa 0,1% Essigsäure aufgelöst sein. In der Lösung ist das Trialkoxysilan hydrolisiert, um ein Trihydroxysilan zu bilden. Diese Lösung wird getrieben, um für drei Minuten durch die Röhre zu fließen. Wenn dieses Molekül zu dem befestigten PDS eingebracht wird, bindet eine Kondensationsreaktion das Trihydroxysilan kovalent an dem PDS an der abschließenden Hydroxyl-Gruppe. Ein Katalysator, beispielsweise Tetrabutyltitanat, kann in diesem Schritt zugesetzt werden, um eine rechtzeitige Reaktion sicherzustellen. Alternativ kann Dibutyltin-Dilaurat als ein Katalysator verwendet werden. Danach wird die Röhre mit Ethylalkohol für eine Minute gespült, um die Essigsäure zu entfernen. Einer zehnsekündigen Stickstoffspülung folgt ein Backen bei 100ºC für zehn Minuten; es wird angenommen, daß diese Erwärmung Wasser beseitigt, wodurch eine Wasserstoffbindung in eine Silyl-Ether- Bindung umgewandelt wird. Diese Silyl-Ether-Bindung beläßt Vinyl-Monomergruppen an den freien Enden der Organosiloxan- Haltesei 1-Moleküle.
Es existieren unterschiedliche Gel-Formulierungen, Querverbinder und Katalysatoren. Beispielsweise kann Stanno-Octoat als der Katalysator für die Gelmatrix verwendet werden. Ferner können unterschiedliche Puffer verwendet werden. Beispielsweise können Tris-Borat und Tris-Glycin als SDS-Puffer verwendet werden. Es können andere Detergenzien als SDS verwendet werden, wobei die Wahl des Detergenz die Wahl des Puffers beeinflussen kann. Wenn die Analyte, beispielsweise Nukleinsäuren, keine komplexen Proteine sind, müssen in dem Puffer keine Detergenzien enthalten sein, wobei die Auswahl des Puffers entsprechend durchgeführt werden kann.
Obwohl die Schritte der Erfindung in ihrer bevorzugten Reihenfolge dargeboten wurden, ist die Chronologie der Schritte nicht fest. Die Vinylgruppen können an dem Organosiloxan befestigt werden, bevor das Organosiloxan an der Kapillare befestigt wird. In anderen Worten heißt das, daß die Schritte 301 und 302 in umgekehrter Reihenfolge stattfinden können. Beispielsweise kann Vinyl an beiden Enden befestigt werden, wobei eine Vinylgruppe später beseitigt wird. Alternativ kann ein Organosiloxan-Ende blockiert sein, wodurch nur möglich ist, daß Vinyl an einem Ende haftet. Diese und weitere Abweichungen und Modifikationen der beschriebenen Ausführungsbeispiele werden durch die vorliegende Erfindung geliefert, deren Bereich nur durch die folgenden Ansprüche begrenzt ist.

Claims

1. Eine Kapillarsäule (100) für die Polyacrylarnid-Gel- Elektrophorese, wobei die Säule folgende Merkmale aufweist:

eine Glaskapillarröhre (202) mit einer inneren Wand (208);

eine Polyacrylamid-Gelmatrix (204) in der Röhre; und

eine Polyorganosiloxan-Schicht (206) radial zwischen der inneren Wand und der Matrix, wobei die Polyorganosiloxan-Schicht kovalent an der inneren Wand und der Gelmatrix gebunden ist, so daß die Gelmatrix über ununterbrochene Reihen von kovalenten Bindungen an der Röhre befestigt ist, wobei jede der Reihen über 1.000 Si-O-Bindungen aufweist.

2. Eine Säule gemäß Anspruch 1, bei der die Polyorganosiloxan-Schicht unter Spannung ist, die durch die innere Wand und die Gelmatrix eingeführt wird, so daß die radiale Dicke derselben zumindest doppelt so groß ist wie sie beim Fehlen der Gelmatrix wäre.

3. Eine Säule gemäß Anspruch 1, bei der die Organosilan- Schicht Organosilan-abgeschlossene Polyorganosiloxan- Polymersegmente (600) aufweist, wobei die Segmente Organosilanenden (604) aufweisen, die kovalent an der Gelmatrix gebunden sind.

4. Ein Verfahren (300) des Vorbereitens einer Säule für die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

kovalentes Befestigen (301) einer Schicht von Organosiloxan an der inneren Oberfläche einer Glaskapillarröhre;

kovalentes Befestigen (302) von Organosilan-Enden an dem Organosiloxan;

Befüllen der Röhre mit Acrylamid-Vorpolymer und einem quer-verbindenden Reagenz und initiieren einer Polymerisation (303), so daß die resultierende Polyacrylamid-Gel-Matrix die Organosilanenden enthält; und

Einbauen (304) von Pufferionen in die Matrix durch das Anlegen eines elektrischen Feldes entlang der Länge der Glaskapillarröhre, wobei das Feld eine Feldstärke von zumindest 500 Volt pro cm aufweist.

5. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem der Schritt des kovalenten Befestigens der Organosilanenden an dem Organosiloxan vor dem Schritt des kovalenten Befestigens der Schicht des Organosiloxans an der inneren Oberfläche stattfindet.

6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem der Schritt des kovalenten Befestigens der Organosilanenden an dem Organosiloxan nach dem Schritt des kovalenten Befestigens der Schicht aus Organosiloxan an der inneren Oberfläche stattfindet.

7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem das Organosiloxan ein Polydimethylsiloxan ist.

8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem das Glas Quarzglas ist, bei dem das Organosilan Gamma-Methacryloxypropyltrichlorosilan ist, und bei dem das quer-verbindende Reagenz Methylenbisacrylamid ist.