DE3752102T2

DE3752102T2 - Füllmaterial und dessen Herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE3752102T2
Application number: DE3752102T
Authority: DE
Inventors: Yoshio Kato; Katsuo Komiya
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1986-11-17
Filing date: 1987-11-16
Publication date: 1998-03-26
Anticipated expiration: 2007-11-17
Also published as: EP0268243A2; US4835058A; JPS63127156A; EP0268243A3; JP2504005B2; DE3752102D1; EP0268243B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Füllmaterial für die Chromatographie. Insbesondere betrifft sie ein Füllmaterial, das besonders für Normalphasen-Verteilungsflüssigchromatographie und wäßrige Gelpermeationschromatographie verwendbar ist, und dessen Herstellungsverfahren.
Als Füllmaterial für die Chromatographie gibt es zwei Arten von Füllmaterialien, d.h. ein Füllmaterial aus einem anorganischen Träger, wie Silicagel oder porösem Glas, mit z.B. daran gebundenen 3-Glyceryloxypropylgruppen, Aminopropylgruppen oder Cyanopropylgruppen und ein Füllmaterial aus einem organischem Polymer, wie Polysaccharidgel, Polyacrylamidgel oder einem Ionenaustauscherharz. Beide Arten von Füllmaterialien sind porös und weisen eine hydrophile, große Oberfläche auf. Von diesen Füllmaterialien ist bekannt, daß sie als Füllmaterialien für Normalphasen-Verteilungschromatographie zur Trennung polarer Substanzen, wie Saccharide oder Alkohole, oder als Füllmaterialien für die wäßrige Gelpermeationschromatographie oder für die hydrodynamische Chromatographie zur auf den Molekülgrößen basierenden Trennung von z.B. Sacchariden, Proteinen und wasserlöslichen, synthetischen Polymeren verwendbar sind.
EP-A-0 161 058 offenbart poröse Materialien mit einer Doppeloberfläche und betrifft die Verwendung stabiler aber schnell reagierender Silane zur Umsetzung mit den Hydroxylgruppen auf den äußeren Oberflächen poröser Materialien, und anschließend die Verwendung eines zweiten reaktiven Silans zur Umsetzung mit den Hydroxylgruppen auf der porösen inneren Oberfläche des porösen Materials, wobei ein Material mit einer Doppeloberfläche in dem Sinn bereitgestellt wird, daß sich die Silicium enthaltenden Gruppen, die auf der äußeren Oberfläche gebundenen sind, von den Silicium enthaltenden Gruppen auf der Oberfläche des porösen Inneren des Materials unterscheiden.
GB-A-1 456 865 betrifft ein Verfahren zur Bindung eines Copolymers auf der Oberfläche eines starren, partikulären Trägers, umfassend Behandlung des Trägers mit einer Mineralsäure, um Hydroxylgruppen darauf zu induzieren, Umsetzung der Hydroxylgruppen mit einer Lösung einer Silicium enthaltenden Verbindung der Formel (I) oder (II) und Copolymerisieren des Reaktionsprodukts mit einem ungesättigten Monomer der Formel (III).
Diese Füllmaterialien sind jedoch, besonders unter den folgenden Gesichtspunkten, nicht völlig zufriedenstellend:
Das Füllmaterial aus einem anorganischen Träger (wie Silicagel oder porösem Glas), besonders das mit einer daran gebundenen hydrophilen, stationären Phase, weist nämlich eine schlechtere Beständigkeit in einem Wasser enthaltenden Lösungsmittelsystem auf und neigt, während der Verwendung sogar unter den gleichen Bedingungen, mit der Zeit zu einer Änderung der eluierten Menge. Man glaubt, daß dies der leichten Löslichkeit des anorganischen Grundmaterials, wie Silicagel in Wasser, zuzuschreiben ist.
Andererseits neigt das Polymerfüllmaterial, abhängig von der Salzkonzentration in dem Lösungsmittel, dem pH-Wert oder der Zusammensetzung der organischen Lösungsmittel, zum Quellen oder Schrumpfen. Ferner weist es, verglichen mit einem anorganischen, porösen Träger, eine schlechtere mechanische Festigkeit auf und ist in Form feiner Teilchen kaum verwendbar. Dies ist bei einem Füllmaterial für die Hochleistungsflüssigchromatographie, bei der die Verwendung feiner Teilchen ein wichtiger Faktor für die Verbesserung der Auflösung ist, besonders nachteilig. Für ein Füllmaterial für die Normalphasen-Verteilungsflüssigchromatographie oder Gelpermeationschromatographie in einem Wasser enthaltenden Lösungsmittelsystem ist es wichtig, daß es in dem Wasser enthaltenden Lösungsmittelsystem stabil ist und nicht zu einer wesentlichen Änderung der eluierten Menge führt, es infolge einer Änderung der mobilen Phase nicht quillt oder schrumpft und es für eine Verwendung in Form feiner Teilchen hart genug ist und eine hydrophile, stationäre Phase aufweist.
Nun wurde gefunden, daß durch die Verwendung eines harten, anorganischen Trägers als Grundmaterial ein Silan mit vinylpolymerisierbaren organischen Resten chemisch auf der Oberfläche des Trägers gebunden wird, und anschließend Acrylamid auf den silangebundenen Träger copolymerisiert wird, wodurch nicht nur das Silan durch die chemische Bindung einfach auf dem anorganischen Träger fixiert wird, sondern auch die organischen Reste des Silans in Form eines Copolymers mit einem Acrylamidpolymer in Polymermoleküle eingebracht werden, und es möglich ist, ein Füllmaterial zu erhalten, in dem Polymermoleküle, die eine organische, stationäre Phase bilden, durch zahlreiche Siloxanbindungen chemisch an den Träger gebunden werden. Es wurde auch gefünden, daß sogar in dem Wasser enthaltenden Lösungsmittelsystem mit diesem Füllmaterial in Normalphasen-Chromatographie mit der Zeit keine Änderung beobachtet wird, eine auf den Molekülgrößen basierende Trennung durch wäßrige Gelpermeationschromatographie durchgeführt werden kann, und es möglich ist, ein Chromatogramm mit der Zeit mit keiner wesentlichen Änderung zu erhalten. Somit war es möglich, die vorstehenden Probleme dadurch zu lösen, und die Lösung der vorliegenden Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Erkenntnisse erreicht.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Füllmaterial für die Chromatographie bereit, umfassend einen hydrophilen Träger mit Silanolresten auf seiner Oberfläche, wobei das Si in den Silanolresten zusammen mit dem Silicium in einer Silylgruppe der nachstehenden Formel I
in der jeder der Reste R&sub1; und R&sub2; eine Hydroxylgruppe, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe, eine Trimethylsiloxygruppe, eine Triethylsiloxygruppe oder ein Sauerstoffatom ist, das an Si in einem Silanolrest auf der Oberfläche des Trägers gebunden ist, R&sub3; eine 3-Carbonyloxypropylgruppe, eine 1-Phenylenethylgruppe oder eine 2-Phenylenethylgruppe ist, R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, und m und n jeweils eine ganze Zahl von wenigstens 1 sind, und dem Si in einer Silylgruppe der nachstehenden Formel II
in der jeder der Reste R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert ist, und R&sub5; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine 3-Glyceryloxypropylgruppe ist, eine Si-O-Si-Bindung bildet, und das auf der Gesamtmenge an Silylgruppen basierende Molverhältnis der Silylgruppe der Formel II 0 bis 2/3 beträgt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung dieses Füllmaterials für die Chromatographie bereit, das die Umsetzung von Silanolresten auf der Oberfläche des Trägers mit einem Organosilan der nachstehenden Formel III
in der jeder der Reste R&sub6; und R&sub7; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe, eine Trimethylsiloxygruppe, eine Triethylsiloxygruppe oder ein Halogenatom ist, R&sub8; ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe oder ein Halogenatom ist, und R&sub3; und R&sub4; wie vorstehend definiert sind, und einem Organosilan der nachstehenden Formel IV
in der jeder der Reste R&sub6;, R&sub7; und R&sub8; wie vorstehend definiert ist, und R&sub1;&sub1; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine 3-Glycidoxypropylgruppe ist, in solchen Anteilen, daß das auf der Gesamtmenge an Organosilanen basierende Molverhältnis des Organosilans der Formel IV 0 bis 2/3 beträgt, bei einer Temperatur von 20 bis 200ºC, wobei Si-O-Si-Bindungen gebildet werden, und anschließend die Copolymerisation mit Acrylamid bei einer Temperatur von 20 bis 200ºC umfaßt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung an Hand der bevorzugten Ausführungsformen ausführlich beschrieben.
In der Begleitzeichnung ist Figur 1 ein Diagramm eines Infrarotdifferenzspektrums des in Beispiel 6 erhaltenen Füllmaterials der vorliegenden Erfindung und des Silicagelträgers als Ausgangsmaterial.
Als der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Träger können Silicagel, poröses Glas, Kieselgur oder ein Zeolith mit hohem Siliciumdioxidgehalt erwähnt werden. Zur dichten Bedeckung seiner Oberfläche mit dem Organosilan und ferner zur Bildung einer Polymerschicht, in der Acrylamid an das Organosilan gebunden ist, weist der Träger bevorzugt wenigstens einen Silanolrest/nm², besonders bevorzugt wenigstens zwei Silanolreste/nm², auf seiner Oberfläche auf. Der Träger kann eine beliebige mögliche Form aufweisen. Eine kugelförmige Form ist jedoch besonders für die Flüssigchromatographie bevorzugt. Der Träger weist bevorzugt eine Teilchengröße von 1 bis 500 µm, besonders bevorzugt von 1,5 bis 200 µm, auf. Im Fall eines Trägers mit Poren weist er bevorzugt eine mittlere Größe von wenigstens 3 nm (30 Å) auf.
Das die Obertläche des Trägers der vorliegenden Erfindung bedeckende Copolymer, das an das Siliciumatom in den Silanolresten auf der Obertläche des Trägers durch eine Si-O- Si-Bindung gebunden ist, wird durch die Formel 1 dargestellt. Das Copolymer ist das, das durch die Polymerisation des Vinylgruppenanteils des Vinylgruppen enthaltenden Organosilans der Formel III mit dem Vinylgruppenanteil von Acrylamid gebildet wird, wodurch ein ausgezeichneter, hydrophiler Träger, der gegenüber einem Wasser enthaltenden, eluierenden Lösungssystem beständig ist, gebildet werden kann.
Ferner kann der Überzug für den Träger nicht notwendigerweise nur aus dem Copolymer bestehen, und vorausgesetzt, daß das Copolymer die Obertläche des Trägers ausreichend bedecken kann, kann eine Silylgruppe der Formel II durch eine Si-O-Si-Bindung an einen Silanolrest auf der Oberfläche des Trägers gebunden werden. Das auf den gesamten Silylgruppen basierende Molverhältnis der Silylgruppe der Formel II muß innerhalb eines Bereiches von 0 bis 2/3 liegen. Wenn das Molverhältnis 2/3 übersteigt, wird der Überzug durch das Copolymer nicht ausreichend und ist somit unerwünscht.
In Bezug auf die 3-Carbonyloxypropylgruppe, die 1-Phenylenethylgruppe oder die 2-Phenylenethylgruppe als R&sub3; in der Formel 1 oder in der Formel III ist die Propylgruppe oder die Ethylgruppe an das Siliciumatom in dem Organosilan gebunden, und die Carbonylgruppe oder die Phenylengruppe ist an das an R&sub4; gebundene Kohlenstoffatom gebunden.
Das Füllmaterial der vorliegenden Erfindung kann durch Umsetzung der Silanolreste auf der Oberfläche des Trägers und des Organosilans, wobei Si-O-Si-Bindungen gebildet werden, und anschließende Copolymerisation mit Acrylamid erhalten werden.
Üblicherweise wird ein Organosilan der Formel III als das Vinylgruppen enthaltende Organosilan verwendet. Das Organosilan der Formel III schließt zum Beispiel Styrylethyltrimethoxysilan, Methacryloxypropyldimethylchlorsilan, 3-Methacryloxypropylmethyldiethoxysilan, 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan, 3-Methacryloxypropyltris(methoxyethoxy)silan, 3-Acryloxypropyltrimethoxysilan und 3-Acryloxypropylmethyldimethoxysilan ein.
Als ein weiteres Organosilan, das keine Vinylgruppen aufweist, ist eine funktionelle Gruppe stark hydrophober Art unerwünscht, und üblicherweise wird ein Organosilan der Formel IV verwendet. Das Organosilan der Formel IV schließt zum Beispiel 3-Glycidoxypropyldimethylethoxysilan, 3-Glycidoxypropylmethyldiethoxysilan, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, Methylbromdichlorsilan, Methyldimethoxychlorsilan, Methyltriethoxysilan, Methyltriace toxysilan, Dimethyldiethoxysilan, Triethylchlorsilan, Methoxyethylmethyldichlorsilan, Trimethylchlorsilan, Trimethyl-n-propoxysilan und Trimethyldisilan ein.
In der vorliegenden Erfindung kann zur Bildung von Si-O-Si-Bindungen durch Umsetzung von Silanolresten auf der Oberfläche des Tragers nut diesen Organosilanen ein herkönnnliches Verfahren angewendet werden. Die Anteile des Organosilans mit einer Vinylgruppe und des Organosilans ohne Vinylgruppe sind derart, daß das Organosilan ohne Vinylgruppe in einem Molverhältnis von nicht mehr als 2/3, bezogen auf die Gesamtmenge an Silanen, vorliegen muß. Innerhalb des Bereiches dieser Anteile können das Vinylgruppen enthaltende Organosilan allein oder das Vinylgruppen enthaltende Organosilan und das Organosilan ohne Vinylgruppe zusammen oder getrennt mit den Silanolresten des Trägers umgesetzt werden. Die Verwendung eines Lösungsmittels unter dem Gesichtspunkt der Reproduzierbarkeit der Umsetzung oder der Effizienz der Arbeitsweise ist bevorzugt. Die Umsetzung kann jedoch in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt werden.
Das Lösungsmittel kann ein beliebiges Lösungsmittel sein, vorausgesetzt, daß es in der Lage ist, die Organosilane zu lösen und gegenüber dem Träger und den Organosilanen inert ist. Zum Beispiel können Ether, wie n-Butylether, Ethylenglycoldimethylether, Diethylenglycoldimethylether, Tetrahydrofüran und Dioxan, Kohlenwasserstoffe, wie Toluol, Xylol und n-Hexan, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chlorbenzol und Dibrombutan, Amide, wie Dimethylformamid, Diethylacetamid und N-Methylpyrrolidon, und Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid, allein oder kombiniert als Gemisch verwendet werden.
Wenn die Reaktionstemperatur niedrig ist, ist die Reaktionsrate gering, und die Menge der gebundenen Organosilane ist nicht ausreichend. Im Gegensatz dazu findet wahrscheinlich eine Polymerisation der ungesättigten, organischen Reste durch Hitze statt, wenn die Reaktionstemperatur hoch ist. Daher wird die Umsetzung in der Regel innerhalb eines Temperaturbereiches von 20 bis 200ºC, bevorzugt von 40 bis 150ºC, durchgeführt.
Um den Fortschritt der Polymerisationsreaktion während der Bindung der Organosilane zu verhindern, kann ein Polymerisationsinhibitor in einer nicht größeren Menge als 1 %, bezogen auf die Menge der Organosilane, zugegeben werden. Ein üblicherweise verwendetes Phenol oder Hydrochinon kann als dieser Polymerisationsinhibitor verwendet werden.
Die Menge des Organosilans, bezogen auf den porösen Träger, hängt von der Menge der auf dem Träger vorliegenden Silanolreste ab. Das in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Organosilan mit einem ungesättigten, organischen Rest kann höchstens nur in einer Menge von 4 µmol/m² binden, und daher kann das Organosilan in einer Menge von wenigstens (Oberfläche des Trägers in m²) × (4 µmol/m²) verwendet werden.
Anschließend wird der durch die vorstehende Umsetzung erhaltene, Silan-behandelte Träger mit Acrylamid copolymerisiert. Ms Verfahren für diese Copolymerisation kann ein Verfahren, in dem Acrylamid und ein Polymerisationsinitiator auf der Oberfläche des Silanbehandelten Trägers aufgetragen werden, mit anschließender Suspensionspolymerisation in einem Lösungsmittel, in dem Acrylamid unlöslich ist, oder Polymerisation unter Erhitzen in Abwesenheit eines Lösungsmittels, oder ein Verfahren, in dem der Träger, Acrylamid und ein Polymerisationsinitiator in einem Lösungsmittel, in dem Acrylamid löslich ist, gemischt werden, mit anschließender Polymerisation angewendet werden. Hinsichtlich des hier zu verwendenden Initiators gibt es keine besondere Einschränkung. Ein üblicherweise für die Polymerisation von Acrylamid verwendeter Initiator, wie ein Peroxid, eine Azoverbindung oder ein Redoxinitiator, kann verwendet werden.
Das Lösungsmittel, das in der Lage ist, Acrylamid zu lösen und zur Polymerisation verwendbar ist, schließt Wasser und wasserlösliche organische Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol, Acetonitril, Ethylenglycol, Diethylenglycol, Glycerin, Methylcarbitol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid, Dioxan und Aceton und Gemische davon ein.
Das Lösungsmittel, in dem Acrylamid unlöslich ist und das zur Suspensionspolymerisation des Acrylamid-beschichteten, Silan-behandelten Trägers verwendbar ist, schließt hydrophobe Lösungsmittel, wie n-Hexan, Kerosin, n-Paraffin, Benzol, Toluol, Xylol, Methylisobutylketon, 1,1-Trichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Dibutylether und Chlorbenzol, und Lösungsmittelgemische davon ein.
In der vorstehenden Copolymerisationsreaktion kann die Polymerisation bei niedrigen Temperaturen ablaufen, aber die Reaktionsrate ist in der Regel für die praktische Anwendung zu gering. Andererseits finden bei hohen Temperaturen wahrscheinlich verschiedene Nebenreaktionen statt, und die Lebensdauer erzeugter Radikale kann kurz sein, während die Vernetzung zwischen Organosilanen nicht ausreichend sein kann. Folglich ist die Haltbarkeit des Füllmaterials in einem wäßrigen Lösungsmittel kurz oder eine irreversible Adsorption wird erzeugt, die unerwünscht ist. Im besonderen wird die Copolymerisation in der Regel innerhalb eines Temperaturbereiches von 20 bis 200ºC durchgeführt. Die Temperatur wird in erster Linie abhängig von der Art des Initiators ausgewählt. Die Copolymerisation wird bevorzugt innerhalb eines Bereiches von 30 bis 150ºC durchgeführt.
Das so erhaltene Füllmaterial enthält Polyacrylamid, das nicht chemisch an das Füllmaterial gebunden ist, und nicht-umgesetztes Monomer. Dieses Polymer und Monomer sind in Wasser löslich und können durch Waschen ohne weiteres entfernt werden.
Das Füllmaterial der vorliegenden Erfindung weist, verglichen mit den herkömmlichen Trägern, ausgezeichnete Eigenschaften als Füllmaterial für die wäßrige Gelpermeationschromatographie oder für die Normalphasen-Verteilungschromatographie auf. Die Eigenschaften als Füllmaterial für wäßrige Gelpermeationschromatographie schließen die Eigenschaften einer geringen Adsorption und die Fähigkeit der Bereitstellung hoch reproduzierbarer Werte ein. Die Wechselwirkung zwischen der Trägeroberfläche und dem gelösten Stoff ist nämlich minimal, da die poröse Oberfläche des Trägers mit einer Schicht aus Polyacrylamid bedeckt ist, das ein hydrophiles Polymer ist. Ferner wird die organische, stationäre Phase sogar durch die Hydrolyse von Siloxanbindungen oder durch die Gleichgewichtsreaktion von Dehydratisierung und Kondensation, die in der Wasser enthaltenden Lösung stattfinden, von dem Träger kaum fteigesetzt, da die Polymerschicht durch zahlreiche Siloxanbindungen an das Silicagel gebunden ist. Somit können, sogar wenn das Füllmaterial für eine lange Zeitdauer in einer Wasser enthaltenden Lösung verwendet wird, hoch reproduzierbare Meßergebnisse erhalten werden. Außerdem kann das Grundmaterial für den Träger Silicagel oder poröses Glas sein, das ein durch ein herkömmliches Verfahren hergestellter anorganischer Träger ist. Dieser Träger ist ein hartes, poröses Material, das in der Regel eine engere Porengrößenverteilung als die eines Trägers aus einem organischen Polymer aufweist, und das keine wesentliche Änderung des Quellgrades aufgrund eines Wechsels des Lösungsmittels erfährt. Somit kann es in Form feiner Teichen verwendet werden, wodurch eine hohe Auflösung (oder Leistung) erhalten werden kann und eine Trennung mit hoher Geschwindigkeit ohne weiteres möglich wird. Die Porengröße hängt von dem Träger als Grundmaterial ab. Die Grundmaterialien mit verschiedenen Porengrößen können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Somit ist der durch die vorliegende Erfindung erhaltene hydrophile Träger als Füllmaterial für wäßrige Gelpermeationschromatographie für die auf der Wirkung eines Molekularsiebs basierende Trennung in einem System einer wäßrigen Lösung von z.B. Proteinen, Polypeptiden, Nudeinsäuren, Nucleotiden, Sacchariden oder wasserlöslichen synthetischen Polymeren äußerst wirksam.
Andererseits werden ähnliche Eigenschaften auch bei einem Füllmaterial für Normalphasen-Verteilungschromatographie angewendet. Es weist eine ausgezeichnete Auflösung und Reproduzierbarkeit besonders für die Trennung von Polyolen oder Sacchariden durch Normalphasen-Verteilungschromatographie in einem Wasser enthaltenden Lösungsmittelsystem auf In einem bekannten wäßrigen Lösungsmittelsystem zeigt es auch eine Leistung, die im wesentlichen der herkömmlicher anorganischer Träger-Grund-Füllmaterialien entspricht.
Nun wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele ausführlicher beschrieben. Man sollte jedoch verstehen, daß die vorliegende Erfindung durch diese speziellen Beispiele keineswegs eingeschränkt wird. In den Beispielen bedeuten "Teile" "Gewichtsteile".

BEISPIEL 1

Das als das Grundmaterial verwendete Silicagel wies die nachstehenden physikalischen Eigenschaften auf
Form: kugeltörmig, Teilchengröße 8-12 µm,
spezifische Oberfläche: 250 m²/g,
mittlere Porengröße: 25 nm (250 Å).
Dieses Silicagel wurde in einem Trockner mit reduziertem Druck bei 10 mmHg 16 Stunden bei 80ºC getrocknet. 2 Teile 3-Acryloxypropyltrimethoxysilan, 50 Teile Toluol, 0,01 Teile Phenol und 4 Teile Diethylaminoethanol wurden mit 10 Teilen dieses getrockneten Silicagels gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 75ºC reagieren. Das entstandene Silan-behandelte Silicagel wurde durch Filtration aufgenommen, dann zweimal mit 50 Teilen Toluol und anschließend dreimal mit 50 Teilen Methanol gewaschen und unter reduziertem Druck 16 Stunden bei 30ºC getrocknet. 10 Teile des so erhaltenen Silan-behandelten Silicagels wurden in 50 Teilen einer 25 %igen wäßrigen Methanollösung suspendiert, und 1 Teil Acrylamid und 0,1 Teile Kahumpersulfat wurden zugegeben. Das Reaktionssystem wurde mit Stickstoff gespült, anschließend auf 60ºC erhitzt und 6 Stunden polymerisiert. Der so erhaltene Träger wurde durch Futration aufgenommen und mehrmals mit Wasser gewaschen, um nicht an den Träger gebundenes Polyacrylamid zu entfernen. Das so erhaltene Füllmaterial wurde durch ein Verfahren zum Einfüllen von Aufschlämmungen in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 7,5 mm und einer Länge von 30 cm gefüllt, und seine Eigenschaften als Füllmaterial für Gelpermeationschromatographie in einem wäßrigen Lösungsmittelsystem wurden unter den nachstehenden Bedingungen untersucht:

Vorrichtung:

Pumpe: CCPD Hochdruckpumpe, Detektor: RI-8 (1)ifferentialreftaktometer), UV-8 (Ultraviolettabsorptionsmeßgerät 280 nm), alle von TOSOH CORPORATION hergestellt

Meßbedingungen

Elutionsmittel: Wasser oder 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0, mit 0,1 M Natriumchlorid), Durchflußrate: 1 ml/min, Menge der aufzutragenden Probe: 50 µl 0,1 %ige Proteine, 50 µl 0,1-0,5 %ige weitere Substanzen
Zuerst wurde ein Gemisch aus Dextran (MG: etwa 500000, Dextran T-500, von Pharmacia AB hergestellt) und Ethylenglycol unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel gemessen, und die Gelkapazität wurde erhalten.
(Gelkapazität) = (eluierte Menge an Ethylenglycol) - (eluierte Menge an Dextran T- 500)/(eluierte Menge an Dextran T-500)
Hier betrug die Gelkapazität 1,20.
Anschließend wurden die Elutionsvolumina und die Wiedergewinnungsraten verschiedener Proteine unter Verwendung der Phosphatpufferlösung als Elutionsmittel gemessen. Man ließ das Elutionsmittel unter den gleichen Bedingungen weitere 200 Stunden hindurchfließen, und die Elutionsvolumina und die Wiedergewinnungsraten verschiedener Proteine wurden erneut gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. Die Wiedergewinnungsrate wird durch den Prozentsatz aus der Summe der Oberflächen der Peaks (Hauptpeaks und Peaks von Verunreinigungen) der Ultraviolettabsorption durch Proteine, wenn die Probe durch die gefüllte Säule geleitet wird, und der Oberflächen der Peaks der Ultraviolettabsorption durch Proteine, wenn die Probe durch eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm und einer Länge von 3,7 cm geleitet wird, dargestellt. Die Messung wurde dreimal wiederholt, und der Mittelwert der gemessenen Werte wurde erhalten.
Die Analysenergebnisse der Zusammensetzung des Trägers nach der Silanbehandlung und des Trägers nach der Copolymerisationsreaktion in getrocknetem Zustand in dem vorliegenden Beispiel werden nachstehend gezeigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 1

3 Teile 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan und 50 Teile Toluol wurden mit 10 Teilen des gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Silicagels gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 100ºC reagieren. Das behandelte Silicagel wurde durch Filtration aufgenommen, einmal mit 50 Teilen Toluol, anschließend zweimal mit 50 Teilen Aceton und ferner zweimal mit 50 Teilen reinem Wasser gewaschen. Das so erhaltene Silan-behandelte Silicagel wurde mit 100 Teilen einer wäßrigen Chlorwasserstoffsäurelösung (pH: 3,0) gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 40ºC reagieren, um die Epoxygruppe der 3-Glycidoxypropylgruppe zur Ringöffnung zu hydrolysieren. Das Produkt wurde mit Wasser und anschließend mit Methanol gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. Der so erhaltene Träger wurde in einem nassen System in die gleiche wie in Beispiel 1 verwendete Säule gefüllt, und die eluierten Mengen an Proteinen wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 2

3 Teile 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, 0,5 Teile 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan, 50 Teile Toluol und 0,01 Teile Phenol wurden mit 10 Teilen des gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Silicagels gemischt, und anschließend wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 mit Silan behandelt und mit Acrylamid copolymerisiert. Der so erhaltene Träger wurde in einer wäßrigen Chlorwasserstoffsäurelösung auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 der Ringöffnung der verbleibenden Epoxygruppe unterzogen, und der so erhaltene Träger wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 in eine Säule gefüllt, und die Elutionsvolumina der Proteine wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse werden ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt.

BEISPIELE 2 BIS 4

Unter Verwendung des gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Silicagels und verschiedener wie in Tabelle 2 identifizierter Organosilane, Katalysatoren und Lösungsmittel wurde die Umsetzung unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei Träger erhalten werden. Der Kohlenstoff- und Stickstoffgehalt in jedem Träger werden in Tabelle 2 gezeigt. Jeder Träger wurde in die gleiche wie in Beispiel 1 verwendete Säule gefüllt, und die Wiedergewinnungsraten von Proteinen (Humanserum-γ-globulin, Eialbumin, Cytochrom C) wurden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Die Reaktionstemperatur für die Silanbehandlung in Beispiel 3 betrug jedoch 50ºC und unterschied sich von der Reaktionstemperatur in Beispiel 1.

BEISPIEL 5

2 Teile Styrylethyltrimethoxysilan, 2 Teile 3-Glycidoxypropylmethyldiethoxysilan, 50 Teile Toluol und 0,01 Teile Phenol wurden mit 10 Teilen des gleichen wie in Beispiel 1 verwendeten Silicagels gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 110ºC reagieren. Das so erhaltene Silan-behandelte Silicagel wurde durch Filtration aufgenommen, zweimal mit 50 Teilen Toluol und anschließend dreimal mit 50 Teilen Methanol gewaschen und unter reduziertem Druck bei 40ºC getrocknet. Dann wurden 10 Teile des so erhaltenen getrockneten Gels mit 0,2 Teilen 2,2'-Azobis(isobutylamid)dihydrat, 2 Teilen Acrylamid und 40 Teilen einer 90 %igen wäßrigen Methanollösung gemischt, und anschließend wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der so erhaltene Träger wurde in Xylol suspendiert und zur Polymerisation 6 Stunden bei 80ºC umgesetzt. Das Produkt wurde durch Filtration aufgenommen, dreimal mit 50 Teilen Aceton gewaschen und anschließend sorgfältig mit Wasser gewaschen. Der so erhaltene Träger wurde mit 100 Teilen einer wäßrigen Chlorwasserstoffsäurelösung (pH 3) gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 40ºC reagieren, um die Epoxygruppe in der 3-Glycidoxypropylgruppe einer Ringöffnung zu unterziehen. Der so erhaltene Träger wurde auf die gleiche Art und Weise wie in Beispiel 1 in eine Säule gefüllt, und die Messung von Proteinen wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Die Analysenergebnisse der Zusammensetzung des so erhaltenen Trägers in getrocknetem Zustand werden nachstehend gezeigt. Tabelle 1 Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 2

BEISPIEL 6

Die physikalischen Eigenschaften des als das Substrat verwendeten Silicagels waren wie nachstehend:
Form: kugelförmig, Teilchengröße: 6-9 µm,
spezifische Oberfläche: 330 m²/g,
mittlere Porengröße 10 nm (100 Å).
Dieses Silicagel wurde in einem Trockner mit reduziertem Druck bei 10 mmHg 16 Stunden bei 80ºC getrocknet. 2 Teile 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan, 50 Teile Toluol und 0,1 Teile Phenol wurden mit 10 Teilen des getrockneten Silicagels gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 80ºC reagieren. Das Silan-behandelte Silicagel wurde durch Filtration aufgenommen, dann zweimal mit 50 Teilen Toluol und anschließend dreimal mit 50 Teilen Methanol gewaschen und unter reduziertem Druck 16 Stunden bei 30ºC getrocknet. 10 Teile des so erhaltenen Silan-behandelten Silicagels wurden in 100 Teilen einer 25 %igen wäßrigen Methanollösung suspendiert, und 12 Teile Acrylamid und 0,2 Teile Kaliumpersulfat wurden zugegeben. Das Reaktionssystem wurde mit Stickstoff gespült, anschließend auf 60ºC erhitzt und 8 Stunden umgesetzt. Wasser wurde zu der so erhaltenen Trägersuspension gegeben, der Träger wurde durch Sedimentation mit einer Zentrifuge abgetrennt und wiederholt mit Wasser gewaschen, um nicht an den Träger gebundenes Polyacrylamid zu entfernen. Das so erhaltene Füllmaterial wurde in eine Säule aus rostfteiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 25 cm gefüllt, und die Eigenschaften als Füllmaterial für Normalphasen- Verteilungschromatographie wurden unter den nachstehenden Bedingungen untersucht. Die Vorrichtung war die gleiche wie in Beispiel 1 verwendet.

Meßbedingungen

Elutionsmittel: Gemisch aus Acetonitril und Wasser (Volumenverhältnis: 75/25), Durchfiußrate: 1,0 ml/min, Menge der aufzutragenden Probe: 20 µl 0,2 %ig, Probe: Polyole (Glycerin, Erythrit, Xylit, Mannit, Inosit)
Die eluierten Mengen der Polyole betragen 5,6 ml, 6,9 ml, 8,5 ml, 10,2 ml beziehungsweise 18,0 ml. Die jeweiligen Komponenten wurden vollständig voneinander getrennt. Nach einem 200-stündigen Lauf unter den Meßbedingungen trat keine Änderung der eluierten Menge jeder Komponente auf, und keine Anderung der Trennwirkung der Säule wurde beobachtet. Somit wurden hinsichtlich der Reproduzierbarkeit gute Werte erhalten. Die Analysenergebnisse der Zusammensetzung des Trägers nach der Silanbehandlung und nach der Copolymerisationsreaktion in getrocknetem Zustand werden nachstehend gezeigt.
Das Differenzspektrum der Infrarotabsorptionsanalysen des Trägers und des Silicagelsubstrats nach der Copolymerisation wurde gemessen, wobei eine Absorption bei 3200 cm&supmin;¹, die der Wasserstoffbindung in N-H zuzuschreiben ist, bei 2950 cm&supmin;¹, die einer aliphatischen C-H-Bindung zuzuschreiben ist, bei 1675 cm&supmin;¹, die einer C=O-Bindung eines Amids zuzuschreiben ist, bei 1610 cm&supmin;¹, die einer NH&sub2;-Bindung eines Amids zuzuschreiben ist, und bei 1320 cm&supmin;¹, die einer C-N-Bindung zuzuschreiben ist, beobachtet wurden, wodurch gezeigt wird, daß die organische stationäre Phase Polyactylamid als die Hauptbestandteile umfaßt. Das Infrarotspektrum wird in Figur 1 gezeigt.

VERGLEICHSBEISPIEL 3

4 Teile 3-Aminopropyltriethoxysilan und 50 Teile Toluol wurden mit 10 Teilen des gleichen wie in Beispiel 6 verwendeten Silicagels gemischt, und man ließ das Gemisch 3 Stunden bei 90ºC reagieren. Das behandelte Silicagel wurde durch Filtration aufgenommen und einmal mit 50 Teilen Toluol und dreimal mit 50 Teilen Aceton gewaschen. Das so erhaltene Füllmaterial wurde in die gleiche wie in Beispiel 6 verwendete Säule gefüllt, und die eluierten Mengen an Polyolen wurden unter Verwendung der gleichen Vorrichtung und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 6 gemessen. Die eluierten Mengen an Glycerin, Erythrit, Xylit, Mannit und Inosit betrugen sofort nach dem Füllen 5,1 ml, 6,1 ml, 7,4 ml, 8,7 ml beziehungsweise 15,0 ml. Nach einem 72-stündigen Lauf unter den Meßbedingungen betrugen die eluierten Mengen der jeweiligen Polyole jedoch 4,0 ml, 4,6 ml, 5,2 ml, 5,9 ml beziehungsweise 9,0 ml, obwohl keine wesentliche Anderung der Trennwirkung der Säule beobachtet wurde.

Claims

1. Füllmaterial für Chromatographie, umfassend einen hydrophilen Träger mit Silanolresten auf seiner Oberfläche, wobei das Si in den Silanolresten zusammen mit dem Si in einer Silylgruppe der nachstehenden Formel I

in der jeder der Reste R&sub1; und R&sub2; eine Hydroxylgruppe, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe, eine Trimethylsiloxygruppe, eine Triethylsiloxygruppe oder ein Sauerstoffatom ist, das an Si in einem Silanolrest auf der Oberfläche des Trägers gebunden ist, R&sub3; eine 3-Carbonyloxypropylgruppe, eine 1-Phenylenethylgruppe oder eine 2-Phenylenethylgruppe ist, R&sub4; ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, und m und n jeweils eine ganze Zahl von wenigstens 1 sind, und dem Si in einer Silylgruppe der nachstehenden Formel II

in der jeder der Reste R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert ist, und R&sub5; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine 3-Glyceryloxypropylgruppe ist, eine Si-O-Si-Bindung bildet, und das auf der Gesamtmenge an Silylgruppen basierende Molverhältnis der Silylgruppe der Formel II 0 bis 2/3 beträgt.

2. Füllmaterial nach Anspruch 1, wobei der Träger wenigstens einen Silanolrest/nm² auf seiner Oberfläche aufweist.

3. Füllmaterial nach Anspruch 1, wobei der Träger aus kugelförmigen, porösen Teilchen mit einer Teilchengröße von 1 bis 500 µm und einer mittleren Porengröße von wenigstens 3 nm (30 Å) besteht.

4. Verfahren zur Herstellung eines Füllmaterials für Chromatographie, das die Umsetzung von Silanolresten auf der Oberfläche eines Trägers mit einem Organosilan der nachstehenden Formel III

in der jeder der Reste R&sub6; und R&sub7; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe, eine Trimethylsiloxygruppe, eine Triethylsiloxygruppe oder ein Halogenatom ist, R&sub8; ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe oder ein Halogenatom ist, R&sub9; eine 3-Carbonyloxypropylgruppe, eine 1 -Phenylenethylgruppe oder eine 2-Phenylenethyl gruppe ist, und R&sub1;&sub0; ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, und einem Organosilan der nachstehenden Formel IV

in der jeder der Reste R&sub6; und R&sub7; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe, eine Trimethylsiloxygruppe, eine Triethylsiloxygruppe oder ein Halogenatom ist, R&sub8; ein Alkoxyrest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, eine Phenoxygruppe, eine Acetoxygruppe oder ein Halogenatom ist, und R&sub1;&sub1; eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe oder eine 3-Glycidoxypropylgruppe ist, in solchen Anteilen umfaßt, daß das auf der Gesamtmenge an Organosilanen basierende Molverhältnis des Organosilans der Formel IV 0 bis 2/3 beträgt, bei einer Temperatur von 20 bis 200ºC, wobei Si- O-Si-Bindungen gebildet werden, und anschließend Copolymerisation mit Acrylamid bei einer Temperatur von 20 bis 200ºC.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Organosilan der Formel III Styrylethyltrimethoxysilan, Methacryloxypropyldimethylchlorsilan, 3-Methacryloxypropylmethyldiethoxysilan, 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan, ³-Methacryloxypropyltris(methoxyethoxy)silan, 3-Acryloxypropyltrimethoxysilan oder 3-Acryloxypropylmethyldimethoxysilan ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Organosilan der Forrnel IV 3-Glycidoxypropyldimethylethoxysilan, 3-Glycidoxypropylmethyldiethoxysilan, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, Methylbromdichlorsilan, Methyldimethoxychlorsilan, Methyltriethoxysilan, Methyltriacetoxysilan, Dimethyldiethoxysilan, Triethylchlorsilan, Methoxyethylmethyldichlorsilan, Trimethylchlorsilan, Trimethyl-n-propoxysilan oder Trimethyldisilan ist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Organosilan der Formel III in einer Menge von wenigstens 4 µmol pro m² der Oberfläche des Trägers verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Umsetzung bei einer Temperatur von 40 bis 150ºC durchgefhhrt wird, und die Copolymerisation bei einer Temperatur von 30 bis 150ºC durchgeführt wird.