DE68919281T2

DE68919281T2 - Ladungsmodifizierte hydrophobe Membranmaterialien und Verfahren zur Herstellung.

Info

Publication number: DE68919281T2
Application number: DE68919281T
Authority: DE
Inventors: Malcolm G Pluskal; Michael J Steuck; David Wang
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1988-06-21
Filing date: 1989-06-15
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2009-06-16
Also published as: JPH02110139A; EP0347755A3; DE68919281D1; EP0347755B1; EP0347755A2; US5004543A

Description

Hintergrund der Erfindung

Mikroporöse Membranen lassen sich bekanntlich auf den verschiedensten Anwendungsgebieten zum Einsatz bringen. Zur Herstellung solcher Membranen wurden bereits zahlreiche Verfahren entwickelt. So beschreibt beispielsweise die US-PS 3 876 738 ein Verfahren zur Herstellung einer mikroporösen Membran durch Abschrecken einer Lösung eines filmbildenden Polyxners in einem Nicht-Lösungsmittelsystein für das Polymer. Die EP-A-O 005 536 beschreibt ein ähnliches Verfahren.
Handelsübliche mikroporöse Membranen, beispielsweise solche aus Nylon, werden von der Firma Pall Corporation, Glen Cove, N.Y. unter der Handelsbezeichnung "ULTIPOR N&sub6;&sub6;" vertrieben. Weiterhin sind in großem Umfang mikroporöse Membranen aus Celluloseacetat, Cellulosenitrat oder Mischungen derselben von den verschiedensten Lieferanten erhältlich. Andere Membranen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF) sind von Millipore Corporation, Bedford, MA unter der Handelsbezeichnung Durapor erhältlich. Die Nylon- und Nitrocellulosemembranen zeigen hydrophile Eigenschaften, die PVDF-Membranen dagegen hydrophobe Eigenschaften. Es ist jedoch möglich, die PVDF-Membranen mit Materialien zu beschichten, die sie hydrophil machen. Diese hydrophilen Durapor -Membranen werden ebenfalls von Millipore Corporation geliefert.
Für bestimmte Anwendungen, insbesondere für eine Filtration und Makromolekülübertragung, wurde vorgeschlagen, das Leistungsvermögen des Materials durch Bereitstellen einer an der Membranoberfläche haftenden, ionischen, funktionellen Gruppe, die dazu dienen kann, der Membran eine fixierte, formal positive Ladung zu verleihen, zu erhöhen. Solche ladungsmodifizierte Membranen wurden in den US-PS 4 512 896 und 4 673 504 für Makromolekülübertragungsanwendungen (beispielsweise DNA- und Protein-Blotting) vorgeschlagen. Darüber hinaus wurde in den US-PS 4 473 474 und 4 673 504 der Einsatz ladungsmodifizierter Membranen als Filtrationsmaterialien vorgeschlagen. In allen diesen Veröffentlichungen wurde die jeweilige Erfindung auf Verfahren zur Ladungsmodifizierung hydrophiler Meinbranen und den Einsatz derselben beschränkt. In der Tat liefern letztere beide Patente jeweils ein Beispiel für erfolglose Versuche zur Ladungsmodifizierung hydrophober Membranen. Diese Versuche führten in beiden Patenten zu der Schlußfolgerung, daß hydrophobe Polymermembranen nach den versuchten und beschriebenen Verfahren keiner Ladungsmodifizierung zugänglich sind.
Die für Makromolekül-Blotting- und Filtrations-Anwendungen benutzten, ladungsmodifizierten, mikroporösen Membranen machten als solche von hydrophilen Membranen als Ausgangsmaterialien Gebrauch.
Der Ausdruck "Makromolekül-Blotting" beschreibt hier und im folgenden Verfahren zur Übertragung biologischer Makromoleküle, z.B. von Nucleinsäuren und Proteinen, von Elektrophoresegelen auf eine (bestimmte) Art einer immobilisierenden Matrix. Historisch diente Nitrocellulose als geeignete Blotting-Matrix. Von besonderer Bedeutung ist ein Nucleinsäure-Blotting, z.B. DNA-Blotting. Es wurden bereits die verschiedensten DNA-Blotting-Techniken entwickelt. Die üblichste wird als "Southern Blotting" bezeichnet. Bei dieser Technik werden DNA-Fragmente durch chromatographische Techniken aufgetrennt und dann - noch in dem Gel - denaturiert. Das Gel wird neutralisiert und zwischen Saug- oder Löschpapier, das mit einem Puffer-Reservoir in Berührung steht, gelegt. Nach Aufbringen von Nitrocellulose auf die Oberseite des Gels wird auf die Nitrocelluloseoberseite trockenes Blotting-Papier gelegt. Wenn der Puffer in das Gel fließt, wird DNA eluiert und geht mit der Nitrocellulose eine Bindung ein. Hierbei werden die DNA-Fragmentmuster auf die Nitrocellulose übertragen. Das Fragmentmuster kann dann durch Hybridisierungstechniken unter Verwendung markierter Nucleinsäuren, die zu den speziell gebundenen Fragmenten komplementär sind, nachgewiesen werden.
Seit der Entwicklung der Southern-Blotting-Technik wurde eine Reihe von Änderungen und Verbesserungen dieser Technik gemacht. Wenn beispielsweise das Blotting-Papier mit Diazobenzyloxymethylgruppen unter Bildung eines üblicherweise als DBM-Papier bezeichneten Materials derivatisiert wird, können RNA und Proteine kovalent an das Material gebunden werden. Zu der Diazoform aktivierte, aminophenylthioetherbeschichtete Papiere (DPT-Papier) können ebenfalls zur Bindung von DNA, RNA und Proteinen verwendet werden. Andere Immobilisierungsverfahren bedienten sich bei Versuchen zur Verbesserung der Bindung von DNA, RNA und Proteinen hoher Salzkonzentrationen oder alkalischer Bedingungen.
Weitere Versuche zur Verbesserung des Bindungsverfahrens haben sich auf das Blotting-Substrat durch Ersatz von Nitrocellulose durch beispielsweise andere hydrophile Materialien, wie Nylon 66, konzentriert. Darüber hinaus schlagen die bereits genannten US-PS 4 512 896 und 4 673 504 auch noch andere Materialien, z.B. hydrophiles PVDF, zur Verwendung als Blotting-Substrate vor.
Diese Substrate sind jedoch wiederum auf die Herstellung ladungsmodifizierter, hydrophiler Materialien beschränkt. Während diese Materialien zwar eine Verbesserung gegenüber Nitrocellulose, DBM-Papier und DPT-Papier darstellen, lassen ihre Ladungshaltigkeit während der Hybridisierung und Recyclierung und ihr Leistungsvermögen unter alkalischen Bedingungen immer noch zu wünschen übrig.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ladungsmodifizierte, hydrophobe Substrate und Verfahren zur Herstellung und zum Einsatz derselben. Insbesondere betrifft diese Erfindung ladungsmodifizierte, hydrophobe, mikroporöse Membranen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Hauptteil der Ionenaustauschkapazität des Materials durch fixierte, formal positive Ladungsgruppen, die durch ein wasserlösliches organisches Polymer eines Molekulargewichts über etwa 1000 mit einer Polymerkette mit fixierten, formal positiven Ladungsgruppen sowie Halogenhydringruppen geliefert werden, bereitgestellt wird. Diese Materialien weisen eine Kombination ionischer und hydrophober Eigenschaften auf, die sie in hohem Maße für makromolekulare Adsorptionsanwendungen unter den verschiedensten Bedingungen befähigen.
Die fixierte, formal positive Ladung rührt bei einer Ausführungsform in hohem Maße von funktionellen quaternären Ammoniumgruppen her. Diese können auf der hydrophoben Oberfläche durch Inberührungbringen des hydrophoben Materials mit einer Lösung mit einem kationischen Polyamin- oder Polyamido-Polyamin-Epichlorhydrin-Harz zur Bildung eines Oberflächenüberzugs bereitgestllt werden. Es besteht keine Notwendigkeit, zur Stabilisierung des Überzugs oder Verstärkung der kationischen Ladung auf der mikroporösen Oberfläche ein weiteres (zweites) ladungsmodifizierendes Mittel einzusetzen.
Die erfindungsgemäßen Materialien eignen sich besonders gut auf Anwendungsgebieten, z.B. einem Makromolekül-Blotting und einer Filtration. Im Falle eines Makromolekül-Blottings liefert die Kombination aus hydrophoben und ionischen Wirkungen ein Material, das wirksam Makromoleküle zu binden vermag, sie während der Hybridisierung hält und über eine Reihe von wiederholten Rückführunqsstufen Signalstärke behält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Autoradiogramm zum Vergleich einer Nylonmembran mit einer ladungsmodifizierten mikroporösen Membran bei einer Punkt-Blot-Hybridisierungsanalyse.
Fig. 2 ist ein Autoradiogramm zum Vergleich der Materialien der Fig. 1 bei einer Southern Blotting-Analyse unter Verwendung einer ersten ³²P-markierten DNA-Sonde.
Fig. 3 ist ein Autoradiogramm ähnlich demjenigen der Fig. 2, bei dem eine zweite 32P-markierte DNA-Sonde verwendet wurde.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die kationischen, ladungsmodifizierten Substrate gemäß der Erfindung umfassen hydrophobe, mikroporöse Membranen, die mit fixierten, formal geladenen Gruppen mit einer positiven Nettoladung ladungsmodifiziert wurden. Das Leistungsvermögen dieser ladungsmodifizierten Membranen rührt aus einer Kombination der hydrophoben und ionischen Oberflächenwirkungen her.
Der Ausdruck "mikroporöse Membran" bezeichnet hier und im folgenden eine praktisch isotrope poröse Membran einer durchschnittlichen Porengröße von mindestens 0,05 um oder eines anfänglichen Blasenbildungspunkts (IBP) in Wasser von weniger als 840 kPa (120 psi). Die erfindungsgemäß maximal geeignete Porengröße beträgt etwa 10 um. Der Ausdruck "isotrop" oder "symmetrisch" bedeutet hier und im folgenden, daß die Porenstruktur über die gesamte Membran praktisch gleichförmig ist. Darüber hinaus sind auch "anisotrope" oder "asyxnmetrische" Membranen als Verbundgebilde zwischen einer dünnen Schicht eines Materials einer geringen durchschnittlichen Porengröße auf einem stärker porösen Träger verfügbar.
Erfindungsgemäß eignen sich als Membranen solche aus hydrophobem Polypropylen, Polyethylen, Polysulfon und Polytetrafluorethylen (PTFE), bevorzugt werden jedoch Membranen aus Polyvinylidenfluorid (PVDF). PVDF-Membranen sind beispielsweise aus den US-PS 4 203 848 und 4 203 847 bekannt. Weiterhin sind diese hydrophoben Membranen im Handel beispielsweise als mikroporöse Membranen Immobilon p (Handelsbezeichnung der Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts) erhältlich.
Bei dem erfindungsgemäß verwendeten Ladungsmodifizierungsmittel handelt es sich um ein wasserlösliches organisches Polymer eines Molekulargewichts von über etwa 1000. Das Polymer enthält Monomere, deren Hauptteil mit Epichlorhydrin zur Umsetzung gebracht wurde. Das Epichlorhydrin dient zur Umwandlung von zuvor auf dem Polymer befindlichen tertiären Aminstrukturen in Strukturen mit guaternärer Funktionalität. Dadurch entsteht ein stabiler Überzug, umfassend eine an das quaternäre Ammonium fixierte formale Ladung mit der Fähigkeit, dem hydrophoben Substrat eine positive Nettoladung zu verleihen.
Das Ladungsmodifizierungsmittel wird auf die Kontaktoberflächen der hydrophoben mikroporösen Membran aufgetragen. Der Ausdruck "aufgetragen" bezeichnet hier und im folgenden Ladungsmodifizierungsmittel, die so stark an der Membran haften, daß sie unter den beabsichtigten Einsatzbedingungen nicht in signifikanter Weise extrahiert werden.
Bei den ladungsmodifizierenden Harzen handelt es sich vorzugsweise um kationische Polyamin-Epichlorhydrin-Harze, z.B. solche, wie sie in den US-PS 2 926 116, 2 926 154, 3 224 986, 3 311 594, 3 332 901, 3 382 096 und 3 761 350 beschrieben sind.
Das Ladungsmodifizierungsmittel muß Halogenhydrinsubstituenten sowie fixierte, formal positive Ladungsgruppen enthalten. Mittel mit Epichlorhydrinsubstituenten und quaternären Ammoniumionen werden am meisten bevorzugt. Ein derartiges Ladungsmodifizierungsmittel ist das im Handel als R4308-Harz (Handelsbezeichnung der Hercules Corp., Wilmington, DE) erhältliche Polyamin-Epichlorhydrin-Harz. Bei diesem Harz bildet das geladene Stickstoffatom einen Teil einer heterocyclischen Gruppierung. Es ist über eine Methyleneinheit an eine daran hängende Chlorhydringruppe gebunden. Jede Monomergruppe des Hercules R4308 wird durch folgende allgemeine Formel wiedergegeben:
Ein weiteres bevorzugtes Ladungsmodifizierungsmittel ist Polycup 1884 (Warenzeichen der Hercular Corp., Wilmington, DE), dessen einzelne Monomere durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden:
Es muß jedoch darauf hingewiesen werden, daß andere Ionen als Ammoniumionen, z.B. Sulfonium, Phosphonium und dergleichen, die fixierte, formal positive Ladungsgruppen zu bilden vermögen, erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden können.
In seinem breitesten Sinne ist das erfindungsgemäße Verfahren auf eine kationische Ladungsmodifizierung eines hydrophoben organischen polymeren Materials, z.B. einer mikroporösen Membran, derart, daß der Hauptteil der Ionenaustauschkapazität des Materials durch die fixierten, formal positiven Ladungsgruppen bereitgestellt wird, gerichtet. Das Verfahren umfaßt die Applikation einer ladungsmodifizierenden Menge des kationischen ladungsmodifizierenden Mittels auf die Membran. Das Mittel beschichtet die Membranstruktur und wird über den Halogenhydrinsubstituenten und die restlichen tertiären Amine in dem Harz vernetzt. In seiner breitesten Ausführungsform umfaßt das Verfahren folgende Stufen:
a) Bereitstellen eines hydrophoben Materialsubstrats;
b) Kontaktieren des Substrats mit einer ladungsmodifizierenden Lösung, umfassend ein ladungsmodifizierendes Mittel in Form eines organischen Polymers mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 1000 und einer Polymerkette mit fixierten formal positiven Ladungsgruppen aufgrund einer Halogenhydrin-Substitution, wobei das ladungsmodifizierende Mittel in einer alkalischen, mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel lösung gelöst ist, und
c) Aushärten des mit kationischen Ladungen modifizierten, hydrophoben Substrats.
Wie bereits ausgeführt, kann das hydrophobe Materialsubstrat aus einer Reihe hydrophober Membranen, beispielsweise solchen aus Polypropylen, Polyethylen, Polysulfon, PTFE und dergleichen, bestehen. Hydrophobes PVDF wird bevorzugt. Bei dem Ladungsmodifizierungsmittel handelt es sich vorzugsweise um ein Polyamin-Epichlorhydrin-Harz, das in der wäßrigen Lösung des mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittels in einer Menge von etwa 0,5 - 5, vorzugsweise von etwa 1 - 3 Gew.-% Feststoff vorhanden ist. Das organische Lösungsmittel kann aus irgendeinem der routinemäßig bei Industrieverfahren verwendeten, niedrigen Alkohole bestehen. Bevorzugt werden Methanol, Ethanol, Isopropanol und Mischungen derselben. Dieses Alkohol/Wasser-Gemisch ist in typischer Weise in Abhängigkeit vom Lösungsmittel ein 10 - 50 gew.-%iges Gemisch. Das Gemisch wird durch Zusatz eines Materials, wie NaOH, schwach alkalisch gemacht. Bevorzugt weist die Lösung einen pH-Wert zwischen etwa 9,0 und 12,0 auf.
Anders als andere bekannte ladungsmodifizierte, hydrophile Membranen erfahren die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten ladungsmodifizierten, hydrophoben Membranen keine Behandlung mit einem zweiten ladungsmodifizierenden Material, wie Tetraethylenpentamin. Historisch wurden sekundäre ladungsmodifizierende Mittel als Mittel zur Verstärkung der kationischen Ladung des primären ladungsmodifizierenden Mittels sowie als Mittel zur Vernetzung des primären ladungsmodifizierenden Mittels und Verstärkung seiner Bindung an der Membranoberfläche vorgeschlagen.
Zweckmäßig an den erfindungsgemäß ausgenutzten, fixierten, formal positiven Ladungsgruppen ist, daß sie dem Substrat eine hervorragende Leistung hinsichtlich der Bindung von Makromolekülen verleihen. Bei gemeinsamer Verwendung mit hydrophoben Membranen erfolgt eine Kombination der Ionenaustauschkapazität der fixierten, formal positiven Ladungsgruppen und der hydrophoben Natur der Membran zu einer hervorragenden Leistung auf Anwendungsgebieten, auf denen die Herbeiführung einer Bindung von Makromolekülen gewünscht wird. Solche Anwendungsgebiete sind ein Makromolekül-Blotting sowie eine Filtration.
Bei ihrem Blotting-Einsatz werden die erfindungsgemäßen, durch kationische Ladungen modifizierten hydrophoben Membranen in entsprechender Weise benutzt wie die Nitrocellulose, das DBM-Papier, das DPT-Papier und die ladungsmodifizierten hydrophilen Membranen auch bislang benutzt wurden. Die Kombination aus hydrophoben Eigenschaften und der fixierten, formal-positiven Ladung führt jedoch erfindungsgemäß zu Membranen mit gegenüber den derzeit benutzten Blotting-Matrizes verbesserter Leistung. Darüber hinaus haben sich die erfindungsgemäßen Materialien bei Verwendung unter Bedingungen, unter denen sich Blotting-Materialien, wie Nylon, als weniger zufriedenstellend erwiesen haben, d.h. in einer Umgebung hoher Ionenstärke, als wirksam erwiesen.
Darüber hinaus besitzen die erfindungsgemäßen Materialien gegenüber traditionellen Matrix-Materialien, wie Nitrocellulose, eine Reihe weiterer Vorteile. Werden beispielsweise immobilisierende Nitrocellulose-Matrizes als Material für ein DNA-Blotting verwendet, erfordern sie für eine angemessene Leistung eine hohe Salzkonzentration in der Pufferlösung. Die Bedingungen eines hohen Salzgehalts erfordern jedoch einen hohen Stromfluß, d.h. einen Stromfluß bis zu etwa 5 A. Dieser hohe Stromfluß kann Wärme freisetzen, wodurch die zu untersuchende DNA beeinträchtigt werden kann. Da Bedingungen eines hohen Salzgehalts bei Verwendung der erfindungsgemäßen Materialien nicht erforderlich sind, kann der Strom im Milliampere-Bereich gehalten werden, so daß sich eine thermische Schädigung ininimieren oder vollständig vermeiden läßt.
Das Übereinander-Anordnen von Blots oder übertragenen Elektrophoretogrammen läßt sich mit den erfindungsgemäßen Materialien in gleicher Weise durchführen, wie dies in der Vergangenheit mit anderen immobilisierenden Matrix-Materialien erfolgte. Da die Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Materialien derjenigen der bekannten Materialien überlegen ist, zeigen die vorliegenden Materialien eine erhöhte Fähigkeit zum Rückhalten gebundener Makromoleküle während der Hybridisierung sowie die Fähigkeit zur Beibehaltung eines starken Signal s über wiederholte Rückführungsstufen hinweg. Obwohl sich das erfindungsgemäße Material im Zusammenhang mit der Übertragung von Makromolekülen aus chromatographischen Gelsubstraten als besonders geeignet erwiesen hat, kann es (auch) im Zusammenhang mit praktisch sämtlichen sonstigen Makromolekül-Blotting-Techniken, einschließlich insbesondere solcher Techniken, bei denen die Übertragung über eine Konvektion oder Diffusion erfolgt, verwendet werden.
Nach dem zuvor beschriebenen Verfahren hergestellte, ladungsmodifizierte, hydrophobe Membranmaterialien werden beim Eintauchen in wäßrige Lösungen nicht augenblicklich feucht. Es ist vielmehr auf Anwendungsgebieten, auf denen die Materialien vor Gebrauch feucht sein müssen, z.B. bei der Makromolekül-Blotting-Anwendung, erforderlich, die Materialien vorher mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel entweder als solchem oder in wäßriger Lösung anzufeuchten. Wie zuvor kann das mit Wasser mischbare, organische Lösungsmittel aus irgendeinem der routinemäßig in der Industrie verwendeten niedrigen Alkohole, beispielsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol, bestehen. Diese Alkohole werden vorzugsweise in wäßriger Lösung mit einem Verhältnis Alkohol/Wasser von etwa 10 - 50 Gew.-% je nach dem gewählten Alkohol verwendet.
Als Alternative zu einer vorherigen Anfeuchtung mit einem wäßrigen Alkohol können Membranmaterialien, die auf ein vorheriges Feuchtmachen erfordernden Anwendungsgebieten eingesetzt werden, unter Einbau eines zugesetzten oberflächenaktiven Mittels oder Netzmittels in die Matrix hergestellt werden. In diesem Falle wird die hydrophobe Membran während der Stufe der Applikation des ladungsmodifizierenden Überzugs oder anschließend an die Härtungsstuf e mit einer wäßrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels oder Netzmittels in Berührung gebracht. Geeignete Netzmittellösungen sind wäßrige Lösungen entweder ionischer oder nicht-ionischer Detergenzien, wie Tween-20 (Warenzeichen von ICI United States, Inc.) oder Pluronic F-68 (Warenzeichen der BASF Corp.). Geeignete Netzmittel sind Tetraglyme (Tetraethylenglykoldimethylether), Glycerin und dergleichen. Eine derartige Behandlung macht das erfindungsgemäße Material beim Inberührunggelangen mit wäßrigen Medien benetzbar.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

BEISPIELE

Die im folgenden beschriebenen Beispiele veranschaulichen das Verfahren zur Herstellung und Verwendung von mit kationischen Ladungen modifizierten, hydrophoben Membranen. Diese Membranen eignen sich auf zahlreichen Einsatzgebieten, einschließlich einem Makromolekül-Blotting und einer Filtration.
Allgemein gesagt, werden die mit kationischen Ladungen modifizierenden Mittel nach folgenden Verfahren auf eine hydrophobe, organische, polymere Membran aufgetragen: Die hydrophobe Membran wird als erstes in einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel, d.h. einem Alkohol, und dann mit Wasser vorbenetzt. Danach wird diese Membran beschichtet, indem sie in eine wäßrige Lösung des Ladungsmodifizierungsmittels gelegt wird. Alternativ umfaßt das Verfahren das Inberührungbringen des hydrohoben Membransubstrats mit einer wäßrigen Lösung eines mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittels, d.h. eines Alkohols, das das Ladungsmodifizierungsmittel enthält. Das Auftragen kann durch Tauchen, Spaltbeschichten, Aufwalzen, Sprühen u.dgl. erfolgen. Danach wird die beschichtete Membran getrocknet und im festgehaltenen Zustand gehärtet. Geeignete Verfahren zum Trocknen und Härten sind die Verwendung einer Wärmeübertragungstrommel, ein Aufblasen von Heißluft, ein Erwärmen durch Bestrahlen oder eine Kombination dieser Verfahren.

Beispiel 1A

Herstellung einer ladungsmodifizierten mikroporösen Membran

Lagen mikroporöser Membranen (Immobilon pTM, ein hydrophobes Polyvinylidenfluorid, 0,45 um Porengröße und DuraporTM, ein hydrophiles Polyvinylidenfluorid, 0,65 um Porengröße, beide von Millipore Corporation, Bedford, MA) einer Größe von 15,0 x 25,0 cm wurden mit einer durch Zugabe von NaOH auf einen pH-Wert von 10,56 eingestellten 3%igen (v/v) Lösung von Hercules R4308 1 h lang bei Raumtemperatur beschichtet. Im Falle des hydrophoben Substrats wurde die Membran zunächst in Methanol und dann in Wasser vorbenetzt, bevor sie in die Beschichtungslösung gelegt wurde. Das hydrophile Durapor wurde direkt in die Beschichtungslösung gelegt. Nach dem Beschichten wurden die Membranen über Nacht luftgetrocknet, dann zwischen Polyesterfilmlagen gelegt und schließlich unter Festhalten 3 min lang auf 121ºC erwärmt.

Beisniel 1B

Herstellung einer ladungsmodifizierten mikroporösen Membran

Membranproben ähnlich denjenigen des Beispiels 1A wurden mit einer 3 Gew.-% Feststoffe enthaltenden Lösung von Hercules R4308-Harz in 25% (v/v) Isopropanol/Wasser, die unter Verwendung 50%iger (g/g) NaOH auf einen pH-Wert von 10 eingestellt worden war, beschichtet. Die Membranproben wurden in diese Lösung 0,5 - 1,0 min lang eingetaucht und dann aus der Beschichtungslösung entnommen. Überschüssige Harzlösung wurde durch Abquetschen unter Verwendung von Wischerschienen entfernt. Danach wurde die Membran unter Festhalten - eingefügt zwischen Polyesterfilmlagen - durch Kontakt mit einer Wärmeübertragungstrommel 3 min lang bei einer Temperatur von 95ºC getrocknet. Prüflinge der Membran wurden hinsichtlich Dicke, anfänglichem Methanolblasenbiidungspunkt, Fließzeit, BET-Oberfläche und Ionenaustauschkapazität (IEC) bewertet. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 1. TABELLE 1 Chemische und physikalische Eigenschaften einer ladungsmodifizierten, hydrophoben, mikroporösen PVDF-Membran Membran Vergleichsprüfling Ladungsmodifizierter Prüfling Dicke in mm (mils) Anfänglicher Blasenbildungspunkt kPa (psi)¹ Fließzeit (cm³/min/cm²)² BET-Oberfläche (m²/g) IEC-Kapazität³
¹ Scheibenförmige Membranprüflinge eines Durchmessers von 47 mm wurden in einen Testhalter, der die Kante der Membranscheibe abdichtet, eingesetzt. Über der Membran und in direktem Kontakt mit ihrer Oberseite befand sich ein perforiertes Tragesieb aus nichtrostendem Stahl, das die Membran gegen Deformation oder Reissen bei Ausüben eines Luftdrucks von ihrer Unteseite her schützt. Danach wird auf die Membran Methanol gegossen. Unter die Membran wird nun aus einer gesteuerten Quelle Druckluft geblasen und so lange gesteigert, bis durch die Membran der erste Strom von Luftblasen emittiert wird. Dieser Druck wird als anfänglicher Blasenbildungspunkt in kPa (psi) bezeichnet.
² Die Fließzeit wird in einer ähnlichen Vorrichtung wie zuvor beschrieben nach der ASTM-Methode F317/72 bestimmt.
³ Zur Bestimmung der gesamten IEC-Kapazität werden Membranprüflinge in Form 47 mm großer Scheiben 5 min lang in 100 ml 0,1 M HCl in 50%igem (v/v) Ethanol gelegt und dann 1 h lang bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Anschließend werden die Membranscheiben in 100 ml eines 80%igen (v/v) Methanol/Wasser-Gemischs, dem 2 ml einer 5M NaNO&sub3;-Lösung zugesetzt worden waren, angefeuchtet. Schließlich wurde unter Verwendung eines computerunterstützten Fisher-Titrationsgeräts die Chloridionenkonzentration durch Differentialtitration mit Silbernitrat (0,0282 M AgNO³) bestimmt. Die IEC-Kapazität wird als Milliäguivalent/g Gewicht der Scheibe angegeben.

Beispiel 2

Bindung einer Nucleinsäure an ladungsmodifizierte mikroporöse Membranen
In diesem Beispiel wird die Bindung von DNA an Prüflinge mikroporöser Membranen, die entsprechend Beispiel 1A mit dem ladungsmodifizierenden Mittel beschichtet worden waren, im Rahmen eines Punkt-Blot-Sammlertestformats untersucht. Bei diesem Testformat bildet ein Membranprüfling die Grundlage einer Ausnehmung, in die zur Inkubation mit der Membran Flüssigkeit gefüllt werden kann. Danach kann die Flüssigkeit durch die Membran unter Vakuum abgezogen werden. Bei dieser Untersuchung wurde eine Probe einer doppelsträngigen DNA aus der replikativen Form (RF) des Bakteriophagen M13, der mit dem Restriktionsenzym Hind III (NE Biolabs) verdaut worden war, verwendet, um die DNA-Bindungsgrade von Nylon ein der ladungsmodifizierten PVDF-Oberfläche zu vergleichen. Die RF-DNA wurde wie von J. Messing in "Methods in Enzymology", 101, Recombinant DNA [Teil C]:20-78, Herausgeber R. Wu, L. Grossman, K. Moldave, Academic Press, New York (1983), beschrieben, isoliert. Die DNA war mit einem handelsüblichen Besteck (NEN /Dupont, Teil Nr. NEK 009) unter Verwendung des Enzyms terminale Desoxynucleotidyltransferase und [alpha-³²P] 3'-dATP als Markierung 3'-endmarkiert. Die markierte DNA wurde mit nicht-markiertem Material bis zu einer spezifischen Aktivität von 10 000 cpm/ug DNA kombiniert. Danach wurde die DNA in die Ausnehmung des Punkt-Blot-Sammlertests in einem Volumen von 0,050 ml in einem der folgenden Reagenssysteme: 0,125 M NaOH, 0,125xSSC (Standardkochsalzcitrat, 18,75 mM NaCl, 2,1 mM Na-Citrat), 10xSSC (1,5 N NaCl, 0,17 N Na-Citrat, pH-Wert: 7,4) und 25 mN Na Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,4) gegeben. In letzteren beiden Puffern wurde die DNA durch 5-minütiges Erwärmen auf 100ºC und anschließendes rasches 10-minütiges Abkühlen in Eis vor Applikation auf die Testmembranprüflinge einsträngig gemacht. Nach 30 min wurde jegliche Restflüssigkeit durch die Membran unter Vakuum gesaugt. Danach wurden die Membranen im Sammler unter niedrigem Vakuum mit 0,100 ml desselben jeweils verwendeten Puffers gewaschen. Schließlich wurde die Membranlage entfernt und luftgetrocknet. Die einzelnen Membranscheiben wurden in ein Szintillationszählfluidum gelegt und der Einbau von ³²P bestimmt.
Weitere Proben wurden auf die Rückhaltung von radioaktiv markierter DNA unter Bedingungen, die eine Hybridisierungsanalyse simulierten (vgl. in der veröffentlichten Literatur "Molecular Cloning", Seiten 387-389, Herausgeber T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Press, 1982), analysiert. Darüber hinaus wurde die gebundene DNA den Alkali-"Abstreif"-Bedingungen (0,4 M NaOH bei 42ºC während 30 min) unterworfen, um gebundene radioaktiv markierte DNA-"Sonde" zu entfernen. Dies simulierte die Bedingungen, denen die Membran ausgesetzt wäre, wenn die geblottete DNA erneut sondiert würde. Die Ergebnisse eines Vergleichs eines hydrophoben mit einem nahe verwandten hydrophilen Substrats sind in den Tabelle 2 und 3 zusammengefaßt. TABELLE 2 Bindung von DNA an ladungsmodifizierte mikroporöse Membranen unter Benutzung eines Dot-Blot-Sammlerformattests (anfängliche Rückhaltung von DNA) Prozentuale Rückhaltung an DNA gegenüber der eingesetzten¹ Menge in folgenden Puffern: Alkali² Phosphat&sup4; Membrantyp: Mit R4308, beschichtete hydrophobe PVDF Mit R4308, beschichtete hydrophile PVDF Nylon&sup5;
¹ 1 ug M13 RF-DNA in einem der genannten Probenpuffersymsteme wurden in einem Volumen von 0,050 ml bei einer spezifischen Aktivität von 9 000 bis 13 000 cpm (counts per min)/ug DNA eingesetzt. Nach der Szintillationszählung wurden die ug an rückgehaltener DNA berechnet und als % von 1 ug an anfänglich aufgegebener Probe ausgedrückt.
² 125 mM NaOH, 18,75 mM NaCl, 2,1 mM Natriumcitrat.
³ 1,5 M NaCl, 0,17 M Natriumcitrat, pH-Wert: 7,4.
&sup4; 25 mM Natriumphosphat, pH-Wert: 7,4.
&sup5; Bei der verwendeten Nylon-Probe handelt es sich um Genescreen Plus (NEN /DuPont). TABELLE 3 Rückhaltung membrangebundener DNA nach Einwirkung der Reagenzbedingungen einer Hybridisierungsanalyse und alkalischer Recyclisierung Auf der Membranoberfläche¹ rückgehaltene prozentuale Menge DNA Probenpuffer Membrantyp Nach der Hybridisierung nach dem Abstreifen Alkali Phosphat mit R4308 beschichtetes hydrophobes PVDF mit R4308 beschichtetes hydrophiles PVDF Nylon
¹ Die Menge an rückgehaltener DNA nach Einwirkenlassen der Reagenzbedingungen der Hybridisierungsanalyse und eines Zyklus eines alkalischen Abstreifens (zur Simulierung einer Entfernung der DNA-Sonde während des erneuten Sondierens) wird als % der anfänglich auf die Membran aufgegebenen DNA- Menge (1 ug) ausgedrückt.
Die Ergebnisse dieser Studie veranschaulichen, daß die Ladungsmodifizierung einer mikroporösen hydrophoben PVDF-Membranoberfläche zu einer Membran mit verbesserten DNA-Bindungs- und Rückhalteeigenschaften unter Bedingungen, die eine Hybridisierungsanalyse und Resondierung simulieren, führt. Die in diesem Beispiel untersuchten Versuchsbedingungen liefern einen repräsentativen Bereich für Bedingungen, wie sie wahrscheinlich bei einer Membran zur Verwendung beim Festphasennucleinsäure-Blotten auftreten. Von speziellem Interesse ist die vollständige Abwesenheit einer DNA-Bindung an die mit R4308 beschichtete, hydrophile PVDF-Oberfläche unter Bedingungen hoher Ionenstärke (d.h. 10xSSC = Standardkochsalzcitrat), die bei der Hauptanwendung eines der Southern-Blottings benutzt werden. Im Gegensatz dazu zeigt die hydrophobe Oberfläche eine hervorragende DNA-Bindung. Der festgestellte Leistungsvorteil stützt die Theorie, daß eine hybride ionische/hydrophobe Mikroumgebung ein Makromolekül-Blotting noch wirksamer macht. Dies stellt ein wichtiges Attribut der ladungsmodifizierten hydrophoben Oberfläche dar.

Beisniel 3

Bindung einer Nucleinsäure an ladungsmodifizierte mikroporöse Membranen und Simulierunci von Zyklen einer Resondierung der geblotteten DNA

In diesem Beispiel werden entsprechend Beispiel 1A hergestellte Membranprüflinge im Rahmen eines Sammler-Dot-Blot- Tests in einer Reihe von fünf Hybridisierungsanalysezyklen benutzt. Das Beispiel veranschaulicht die verbesserte Leistung der ladungsmodifizierten hydrophoben Membran gegenüber einem für die betreffende Anwendung derzeit verfügbaren Nylonsubstrat.
Bei diesem Test wurde die gemäß Beispiel 2 isolierte M13-RF DNA wie folgt radioaktiv markiert:
1) Nach der Verdauung mit dem Hind III-Restriktionsenzym wurde eine Probe 3'-endmarkiert und unter Einhaltung von Bedingungen hoher Ionenstärke (10xSSC) entsprechend Beispiel 2 zur Bestimmung der DNA-Bindung benutzt;
2) Eine Probe intakter RF-DNA wurde unter Verwendung eines handelsüblichen Bestecks (NEN /DuPont, Teil Nr. NEK 004) mit (alpha-³²P) d-ATP nick-translatiert, um eine spezielle Aktivität von 10&sup7; cpm/ug DNA zu erreichen. Sie diente als Sonde bei der Hybridisierungsanalyse. Dieser Test wurde dann entsprechend Beispiel 2 unter Verwendung eines Dot-Blot-Sammlers (BioRad) durchgeführt.
Zwei mit Hind III (1 ug in 0,050 ml) verdaute DNA-Probensätze wurden auf den Testmembranen wie folgt absorbiert:
1) DNA, die mit der ³²P 3'-Endmarkierung spurenmarkiert wurde (diese diente zur Bestimmung der Rückhaltung von DNA).
2) Unmarkierte DNA (diese diente zur Verfolgung der Hybridisierungsanalyse mit der nick-translatierten Sonde).
Nach einem Hybridisierungszyklus entsprechend der Beschreibung in Beispiel 2 wurde ein Probensatz zur Szintillationszählung zurückbehalten, der Rest wurde dann zur Entfernung der radioaktiven Sonden-DNA einer Alkali-"Abstreifung" unterworfen. Letztere Proben wurden dann durch das Hybridisierungsverfahren rückgeführt. Dieses wurde insgesamt 5mal wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabellen 4 und 5 zusammengefaßt. TABELLE 4 DNA-Bindung/-Rückhaltung während fünf Zyklen einer simulierten Hybridisierungsanalyse Membrantyp Zyklus Nr. ug gehaltene DNA¹ % Gesamt² Mit R4308 beschichtetes hydrophobes PVDF Nylon
¹ Mit Hind III verdaute M13 RF-DNA wurde bis zu einer spezifischen Aktivität von 15 780 cmp/ug ³²P 3'- endmarkiert. Proben (1 ug in 0,05 ml) wurden entsprechend Beispiel 2 in einem Dot-Blot-Sammler an die genannten Membranprüflinge gebunden. Die Membranen wurden dann aus dem Sammler entfernt und Bedingungen einer zyklischen Hybridisierungsanalyse und "Alkali-Abstreifung" unterworfen, um fünf Zyklen einer wiederholten Sondierung zu simulieren. Die Menge an rückgehaltener DNA wird durch Szintillationszählung bestimmt.
² Kontrollwerte von auf die Membranprüflinge vor Hybridisierungsanalyse geladener DNA waren folgende:
mit R43098 beschichtetes hydrophobes PVDF 1,14 ug
Nylon 0,98 ug
³ Zu Vergleichszwecken wurde Genescreen plus -Nylon verwendet. TABELLE 5 Hybridisierungsanalyse unter Verwendung einer nicktranslatierten Sonde: Simulierung von fünf Zyklen wiederholter Sondierung Membrantyp Zyklus Nr. CPM Hybridisierung¹ Mit R4308 beschichtetes hydrophobes PVDF Nylon²
¹ Dot-geblottete M13 RF-DNA wurde unter Verwendung einer "nick-translatierten" Sonde mit einer spezifischen Aktivität von 10 cpm/ug DNA nach dem festgelegten Protokoll (Molecular Cloning, S. 387-389) hybridisiert. Nach stringenter Wäsche wurden Prüflinge der Membran (im Doppel) mit gebundener ³²P-Sonde einer Szintillationszählung unterworfen. Das Ausmaß der Hybridisierung ist als an das adsorbierte nicht-markierte Hind III-Verdauungsprodukt von Lambda DNA gebundene CPM-Menge angegeben.
² Genescreen Plus -Nylon wurde zu Vergleichszwecken verwendet.
Aus den Ergebnissen der Tabelle 4 geht hervor, daß auf der mit R4308 beschichteten hydrophoben PVDF-Oberfläche im Vergleich zu Nylon die DNA besser zurückgehalten wird. In beiden Fällen war jedoch offensichtlich während des ersten Gebrauchszyklus eine große Menge der anfänglich auf diesen Oberflächen adsorbierten DNA verlorengegangen. Danach blieb sie auf konstantem Wert. Die in Tabelle 5 dargestellte Hybridisierungsanalyse reflektiert die Leistungsvorteile einer stärkeren DNA-Rückhaltung durch die ladungsmodifizierte hydrophobe PVDF-Oberfläche. Die verbesserte Dot-Blot- Testleistung veranschaulicht ein wichtiges Attrobut der hybriden ionischen/hydrophoben Membranoberfläche.

Beispiel 4

Dot-Blot-Hybridisierungsanalyse unter Verwendung ladungsmodifizierter mikroporöser Membranen

In diesem Beispiel wurden Prüflinge einer nach dem Verfahren des Beispiels 1B ladungsmodifizierten hydrophoben PVDF-Membran im Rahmen eines Dot-Blot-Sammlertests zum Vergleich der Hybridisierungstestleistung der ladungsmodifizierten PVDF- Oberfläche gegenüber Nylon benutzt. Mit dem Restriktionsenzym Hind IIII verdaute Bakteriophagen-M13 RF-DNA wurde in 10xSSC wärmedenaturiert und in einem in Beispiel 2 beschriebenen Dot-Blot-Sammler aufladungsmodifizierte hydrophobe PVDF- und Nylon-Membranprüflinge in 10xSSC appliziert. Der benutzte Konzentrationsbereich war folgender: 0,32, 1,6, 8,0 40, 200 bzw. 100 ng/Ausnehmung. Die dot-geblottete DNA wurde dann entsprechend Beispiel 3 mit einer nick-translatierten ³²P-markierten Sonde hybridisiert. Ein Beispiel des erhaltenen Autoradiogramms (Kodak XAR-5-Film, 18 h Belichtung mit Verstärkerschirmen) ist in Fig. 1 dargestellt.
Aus dem in Fig. 1 wiedergegebenen Autoradiogramm geht hervor, daß die Hybridisierungstestleistung auf der auf die ladungsmodifizierte, hydrophobe PVDF punkt-geblotteten DNA unter den Bedingungen dieses Experiments besser ist als diejenige auf Nylon. Unter Verwendung der PVDF-Oberfläche können auf dem Autoradiographen bereits 8 ng geblottete DNA nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu ist auf der Nylonmembranprobe unter denselben Bedingungen die DNA bei dem 200 ng-Wert lediglich marginal nachweisbar.

Beispiel 5

Southern-Blotting-Analyse unter Verwendung ladungsmodifizierter mikroporöser Membranen

Bei dem Southern-Blotting-Verfahren werden DNA-Fragmente durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt und dann durch Kapillarwirkung auf einen Membranträger übertragen. Dieses Verfahren kann folgende Stufen umfassen:
1) Säureguanidinabspaltung zur Verbesserung der Übertragung großer DNA-Moleküle;
2) Alkalidenaturierung zum Einsträngigmachen der DNA für die Übertragung und
3) Neutralisation und Ins-Gleichgewicht-setzen mit einem Übertragungspuffer hoher Ionenstärke (10xSSC).
Bezüglich weiterer Einzelheiten vgl. "Molecular Cloning", Seiten 387-389.
Nach der Kapillarübertragung auf die Membran wird die geblottete DNA einer Hybridisierungsanalyse unterworfen. Bei dem Hybridisierungsverfahren werden folgende Stufen durchgeführt:
1) Zunächst erfolgt eine Vorhybridisierung zur Verminderung der unspezifischen Bindung von DNA an die Membranoberfläche;
2) auf die Membranen werden homologe ³²P-markierte DNA- Sonden (einsträngige DNA, die zu der an die Membran gebundenen DNA komplementär ist) unter Bedingungen aufgebracht, die eine Hybridisierung zwischen der Sonde und ihren Target-DNA-Seguenzen auf der Membran gestatten, und
3) überschüssige unspezifisch zurückgehaltene Sonde wird durch Bedingungen einer zunehmenden Stringenz gewaschen
(bezüglich Einzelheiten vgl. "Molecular Cloning", Seiten 387-389).
In diesem Beispiel werden zwei Versuche beschrieben:
1) DNA-Fragmente aus der Hind III-Verdauung von Lambda-DNA wurden an den 5'-Enden mit ³²P-dCTP (Besteck von DuPont/NEN) markiert. Die daraus resultierende spezifische Aktivität der DNA-Sonde wurde mit 106 cpm/ug DNA bestimmt. Bei diesem Versuch wurde insgesamt 1 ug verwendet. Die zurückgehaltene DNA-Sonde wurde durch 18- stündiges Belichten eines Röntgenfilms sichtbar gemacht (Fig. 2).
2) Bei einem ähnlichen Versuch zu dem unter 1) beschriebenen wurde eine DNA-Sonde unter Verwendung zahlreicher kleiner willkürlicher Oligonucleotide als Primer für DNA-Polymerase (Pharmacia-Besteck) bis zu einer spezifischen Aktivität von 10&sup9; cpm/ug DNA markiert. Für den Versuch wurde 0,2 ug verwendet. Die zurückgehaltene DNA-Sonde wurde durch 10-minütiges Belichten eines Röntgenfilms sichtbar gemacht (Fig. 3).
In Fig. 2 werden die DNA-Bindefähigkeiten einer Nylonmembran und der ladungsmodifizierten, hydrophoben Oberfläche verglichen. Aus den Ergebnissen (mit Ausnahme der Bahn 2 für das Nylon, die atyptisch ist) geht hervor, daß letztere Membran einen besseren Signalnachweis unter den Bedingungen dieses Versuchs ermöglicht. Aus Fig. 3 ergibt sich im wesentlichen dasselbe Ergebnis bei Verwendung einer anderen Sonde höherer spezifischer Aktivität. Die verbesserte Southern-Blotting- Leistung der ladungsmodifizierten hydrophoben Oberfläche stellt im Vergleich zu Nylon bei Benutzung akzeptierter Southern-Blotting-Techniken ein wichtiges Attribut.

Claims

1. Hydrophobes Substrat, das derart mit einem vernetzten, kationischen ladungsmodifizierenden Material beschichtet ist, daß der Hauptteil der Ionenaustauschkapazität des beschichteten Substrats durch fixierte formal positive Ladungsgruppen, die durch ein wasserlösliches organisches Polymer eines Molekulargewichts über etwa 1000 mit einer Polymerkette mit fixierten formal positiven Ladungsgruppen sowie Halogenhydringruppen geliefert werden, unter Bildung eines beschichteten Substrats, in dem die Ionenaustauschkapazität der fixierten formal positiven Ladungsgruppen mit der hydrophoben Natur des Substrats kombiniert ist, bereitgestellt wird.

2. Hydrophobes Substrat nach Anspruch 1, umfassend eine hydrophobe mikroporöse Membran.

3. Hydrophobe mikroporöse Membran nach Anspruch 2 aus Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polyethylen, Polysulfon oder Polytetrafluorethylen.

4. Substrat nach Anspruch 2, wobei die Halogenhydringruppen Epichlorhydringruppen umfassen.

5. Substrat nach Anspruch 1, wobei die fixierten formal positiven Ladungsgruppen aus der Gruppe quaternäres Ammonium, quaternäres Phosphonium und quaternäres Sulfonium ausgewählt sind.

6. Substrat nach Anspruch 3, wobei die fixierte formal positive Ladung durch einen Polyaminoepichlorhydrin-Oberflächenüberzug geliefert wird.

7. Substrat nach Anspruch 1, zusätzlich enthaltend ein in das Material eingearbeitetes Netzmittel oder Benetzungsmittel.

8. Verwendung eines hydrophoben Substrats nach Anspruch 1 bis 7 im Rahmen eines Makromolekül-Analysenverfahrens, umfassend die Stufen Herstellen eines chromatographischen makromolekularen Musters auf einer Gelmatrix, Kontaktieren der Gelmatrix mit einer unbeweglich machenden Matrix, Eluieren des makromolekularen Musters auf die unbeweglich machende Matrix und Hybridisieren des eluierten Materials zum Nachweis des makromolekuklaren Musters, gekennzeichnet durch die Bereitstellung eines zuvor benetzten hydrophoben Substrats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als unbeweglich machende Matrix.

9. Verfahren zur Herstellung eines hydrophoben Materials mit einem Überzug, der fixierte formal positive Ladungsgruppen liefert, umfassend folgende Stufen:

a) Bereitstellen eines hydrophoben Materialsubstrats;

b) Kontaktieren des Substrats mit einer ladungsmodifizierenden Lösung, umfassend ein ladungsmodifizierendes Mittel in Form eines organischen Polymeren mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 1000 und einer Polymerkette mit fixierten formal positiven Ladungsgruppen sowie Halogenhydringruppen, wobei das ladungsmodifizierende Mittel in einer alkalischen, wäßrigen organischen Lösungsmittellösung gelöst ist, und

c) Aushärten des beschichteten hydrophoben Substrats.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das hydrophobe Substrat eine hydrophobe, mikroporöse Membran umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die hydrophobe mikroporöse Membran aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polyethylen, Polysulfon und Polytetrafluorethylen, besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die ladungsmodifizierende Lösung bei einem pH-Wert zwischen etwa 9,0 und etwa 12,0 gehalten wird.

13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Härtung aus einer Trocknung des beschichteten hydrophoben Substrats unter Wärmeeinwirkung besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die fixierten formal positiven Ladungsgruppen aus der Gruppe quaternäres Ammonium, quaternäres Phosphonium und quaternäres Sulfonium ausgewählt sind.

15. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Halogenhydringruppen Epichlorhydringruppen umfassen.

16. Verfahren nach Anspruch 9, mit der zusätzlichen Stufe einer Kontaktierung des beschichteten hydrophoben Substrats mit einer wäßrigen Benetzungsmitteloder Netzmittellösung nach der Härtungsstufe.

17. Verfahren zur Herstellung eines hydrophoben Materials mit einem Überzug, der fixierte formal positive Ladungsgruppen liefert, nach Ansprüchen 9 bis 15 in folgenden Stufen:

a) Bereitstellen eines hydrophoben, mikroporösen Polyvinylidenfluoridsubstrats;

b) Bereitstellen einer Lösung von etwa 25 Vol.-% Alkohol in Wasser mit zwischen etwa 0,5 und 5 Feststoffgew.-% eines Polyaminepichlorhydrinharzes, deren pH- Wert des weiteren auf etwa 9,0 bis 12,0 eingestellt ist;

c) etwa 0,5 bis 1,0 minütiges Eintauchen des Substrats in die Lösung;

d) Entfernen des Substrats aus der Lösung und

e) etwa 3 minütiges Trocknen des Substrats bei einer Temperatur von etwa 95ºC.

18. Verwendung des hydrophoben Substrats nach Ansprüchen 1 bis 7 als Filtrationsmaterial, umfassend eine hydrophobe, mikroporöse Membran, die mit einem vernetzten, kationischen ladungsmodifizierenden Material derart beschichtet ist, daß der Hauptteil der Ionenaustauschkapazität der beschichteten Membran durch fixierte formal positive Ladungsgruppen geliefert wird, wobei ein Filtrationsmaterial bereitgestellt wird, das sowohl ionische als auch hydrophobe Oberflächenwirkungen entfaltet.