JPH02110139A - 帯電改質された疎水性膜材料及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、帯電改質された疎水性膜材料及びその製造方
法に関するものである。

［従来の技術］ 微孔質膜は、広範な種類の用途を有することが示されて
いる。たとえば、この種の膜を製造する多くの方法が開
発されている。たとえば米国特許第３．８７６、７３８
号公報は、非溶剤系における薄膜形成性重合体の溶液を
急冷することによる微孔質膜の製造方法を記載している
。ヨーロッパ特許出願筒０００５５３６号も同様な方法
を記載している。

たとえばナイロンからなる市販の微孔質膜が、登録商標
ウルチポールＮ６６としてニューヨーク州、グレン・コ
ープ在、ボール・コーポレーション社から入手できる。

さらに酢酸セルロース、硝酸セルロース又はその混合物
で作成された微孔質膜も、種々の供給業者から広く入手
することができる。ポリ弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ）か
らなる他の膜が、登録商標デュラボア（登録商標）［マ
サチューセッツ州、ベツドホード在、ミリポア・コーポ
レーション社］として入手できる。ナイロン及びニトロ
セルロース膜は親水性を示す一方、ＰＶＤＦ膜は疎水性
でおる。しかしながらＰ　Ｖ　Ｄ　Ｆ膜を、親水性にす
る材料で被覆することも可能である。これらの親水性デ
ュラポア（登録商標）膜もミリボア・コーポレーション
社から市販されている。

成る種の用途（特に濾過及び高分子移動）については、
固定ホルマール陽電荷を膜に付与づるよう作用するイオ
ン性官能填を膜表面に結合させることにより膜の性能を
向上させうろことが示唆されている。この種の帯電改質
膜は、高分子移動用途（たとえばＤＮＡ及び蛋白のプロ
ツチング）に関し、米国特許筒４，５１２，８９６号及
び第４，６７３，５０４号公報に示唆されている。さら
に帯電改質膜は、濾過材としての使用につき、米国特許
筒４．１１７３，４７４号及び第４，６７３，５０４号
公報に示唆されている。しかしながら、これら米国特許
はいずれも親水性膜の帯電改質方法及びその使用に限定
されている。事実、後者の両米国特許はそれぞれ、疎水
性膜を帯電改質する不成功例を示している。

これら各米国特許の不成功例における結論は、記載され
た方法では疎水性重合体膜が帯電改質に推奨できないと
いうことである。

たとえば、高分子プロツチング及び濾過の用途に使用さ
れる帯電改質された微孔質膜は、出発物質として親水性
膜を利用している。

水明細書に用いる「高分子プロツチング」という用品は
、たとえば核酸及び蛋白のような生物高分子を電気泳動
ゲルから成る種の固定化マトリックスまで移動させる方
法を意味する。。従来、適するプロツヂング用マトリッ
クスとしてはニトロセルロースが使用された。特に重要
なものは、たとえばＤＮＡプロツチングのような核酸プ
ロツチングである。各種のＤＮＡプロツチング技術が開
発されている。最も一般的な技術は「サウザン・プロッ
ト分析」と称される。この技術においては、ＤＮＡ断片
をクロマトグラフ技術により分離し、次いでケル中に存
在する間に変性させる。ゲルを中和しかつ吸取紙間に置
いて、これを緩衝剤貯蔵部と接触させる。次いで、ニト
ロセルロースをゲルの頂部に載置し、かつ乾燥プロツチ
ング紙をニトロセルロースの頂部に載置する。緩衝剤が
ゲル中に流動する際、ＤＮＡが溶出されてニトロセルロ
ースと結合し、これによりニトロセルロース上にＤＮＡ
断片のパターンが移動する。次いで、断片パターンは特
異的結合断片に対し相補的で必る標識核酸を用いるハイ
ブリッド化技術により検出することができる。

サウザン・プロット技術の開発以来、この技術に関する
多数の改変及び改良が開発されている。

たとえば、プロツチング紙をジアゾベンジルオキシメチ
ル基で誘導化することによりＤＢＭ紙と一般的に呼ばれ
る材料を形成すれば、この材料にＤＮＡ及び蛋白を共有
結合させることができる。

ジアゾ型まで活性化されたアミノフェニルチオエーテル
被覆紙（ＤＰＴ紙）もＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白を結合さ
せるために使用することができる。

他の固定化法はＤＮＡ、ＲＮＡ及び蛋白の結合を向上さ
せる試みにおいて高い塩若しくはアルカリ条件を用いて
いる。

結合処理を向上させる他の試みは、二ｌヘロセルロース
の代りに、たとえばナイロン６６のような伯の親水性材
料を用いることによるプロツチング基質に集中している
。ざらに、上記米国特許筒４．５１２，８９６号及び第
、ｉ、　６７３．５０４号は、プロツチング基質として
使用するための、たとえば親水性ＰＶＤＦのような他の
材料を示唆している。しかしながら、これらの基質も、
帯電改質された親水性材料の製造に限定されている。こ
れら材料はニトロセルロース、ＤＢＭ紙及びＤＰＴ紙の
改良であるが、ハイブリッド化及び再使用の際のその帯
電保持とアルカリ性条件下における性能とはまだ改善の
余地がある。

［発明の要点］ 本発明は、帯電改質された疎水性基質、並びにその製造
及び使用方法に関するものである。より詳細には本発明
は、材料のイオン交換能の大部分が固定ホルマール陽帯
電基により付与されたことを特徴とする帯電改質された
疎水性微孔質膜に関するものである。これら材料は、各
種の条件下における高分子の吸着用途に極めて有効とな
るイオン性と疎水性との組合せを示す。

１具体例において、固定ホルマール陽電荷は主として第
四アンモニウム官能基から生じ、これら官能基はポリア
ミン若しくはポリアミド−ポリアミンエピクロルヒドリ
ン陽イオン樹脂を含有する溶液と疎水性材料とを接触さ
せて表面被覆を形成することにより疎水性表面上に与え
ることができる。二次的帯電改質剤を与えて被覆を安定
化させ或いは微孔質表面上の陽イオン重帯を増大させる
必要はない。

本発明の材料は、たとえば高分子プロッチング及び濾過
のような用途に適している。高分子プロッチングの場合
、疎水性及びイオン性の両件用の組合せは、高分子を効
果的に結合すると共にハイブリッド化に際しこれらを保
持し、かつ多数の反復再使用にわたり信号強度を維持し
うる材料を与える。

本発明の陽イオン帯電改質された基質は、正味の陽電荷
を有する固定ホルマール帯電基により帯電改質されてい
る疎水性微孔質膜からなっている。

これら帯電改質膜の性能は、疎水性とイオン性との両表
面作用の組合せから生ずる。

本明細書で用いる「微孔質膜」という用語は、少なくと
も０．０５ＩＪｍの平均孔径、又は水中における８、４
３６ｋ（］／Ｃｍ２　　（１２０ｒ）ｓｉ　）未満の初
期泡立点（ＩＢＰ）を有する実質的に等方性の多孔質膜
を意味する。本発明に有用な最大孔径は約１０＃である
。本明細書に用いる「等方性」若しくは「対称性」とい
う用語は、膜仝休にわたり孔構造が実質的に均一である
ことを意味する。さらに、「異方性」若しくは「非対称
性」膜も、より多孔性の構造で支持された小ざい平均孔
径を有する材料の薄層間における複合体として形成する
ことができる。

本発明に有用な膜は疎水性ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、ポリスルホン及びポリテトラフルオロエチレン（Ｐ
ＴＦＥ）からなるものを包含するが、ポリ弗化ビニリデ
ン（ＰＶＤＦ）からなる膜が好適である。ＰＶＤＦ膜は
、たとえば米国特許第４．２０３．８４８号及び第４．
２０３．８４７号（両者ともグランジン二相に係り、こ
れらの教示を参考のためにここに引用する）に記載され
たように従来公知である。ざらに、これら疎水性膜は、
たとえばイムモビロンＰ（登録商標）微孔質膜［マサチ
ューセッツ州、ベツドホード在、ミリボア・コーポレー
ション社の登録商標］として市販されている。

本発明に使用される帯電改質剤は約１０００より大きい
分子量を有する水溶性有機重合体であり、ここで重合体
は大部分がエピクロルヒドリンと反応している単量体か
らなっている。エピクロルヒドリンは、予め重合体上に
残存している第三アミン構造を第四官能性を有する構造
まで変換させるよう作用する。これは、正味の陽電荷を
阻止性基質に付与しうる第四アンモニウム固定ホルマー
ル電荷を含む安定な被覆を形成する。

帯電改質剤は、疎水性微孔質膜の接触表面上に被覆され
る。本明細書で用いる「被覆」という用語は、所定の使
用条件下で顕著に抽出されないよう充分に膜に結合した
帯電改質剤を意味する。

帯電改質剤は好ましくはポリアミンエピクロルヒドリン
陽イオン樹脂であり、たとえば米国特許第２，９２６，
１１６号、第２，９２６．１５４号、第３，２２４，９
８６号、第３，３１１，５９４号、第３．３３２．９０
１号、第３．３８２，０９６号及び第３．７６１　、３
５０号各公報に記載されたものであり、これら米国特許
の教示を参考のためここに引用する。

帯電改質剤はハロヒドリン置換基と固定ホルマール陽帯
電基とを有することが必要である。エピクロルヒドリン
置換基と第四アンモニウムイオンとを有する帯電改質剤
が最も好適である。この種の帯電改質剤の１種は、Ｒ４
３０８樹脂［プラウエア州、ウィルミントン在、バーキ
ュリース・コーポレーション社の登録商標］として市販
されているポリアミンエピクロルヒドリン樹脂である。

この樹脂において、帯電した窒素原子は複素環式基の１
部を形成すると共に、メチレン基を介し修飾クロルヒド
リン基に結合する。バーキュリースＲ４３０８の各モノ
マー基は次の一般式により示され他の好適な帯電改質剤
はポリカップ１８８４　［プラウエア州、ウィルミント
ン在、バーキュリース・コーポレーション社の登録商標
コであり、その個々の七ツマ−は次の一般式により示さ
れる：しかしながら、アンモニウムイオン以外のイオン
、たとえば固定ホルマール陽帯電基を形成するスルホニ
ウム、ホスホニウムなどのイオンも本発明の実施に使用
しうろことを指摘せねばならない。

広義において本発明の方法は、材料のイオン交換能の大
部分が固定ホルマール陽帯電基により付与されるよう、
たとえば微孔質膜のような疎水性有機高分子材料を陽イ
オン帯電改質することに向けられる。この方法は、膜構
造を被覆すると共に樹脂中のハロヒドリン置換基及び残
留第三アミンを介し架橋される帯電改質量の陽イオン帯
電改質剤を膜に施すことからなっている。最も広い範囲
においで、本発明の方法は （ａ＞疎水性Ｈ料塁貿を形成し、 （ｂ）前記基質を帯電改質溶液と接触させ、首記溶液は
約１０００より大きい分子旦を有する有機重合体からな
る帯電改質剤を含み、前記重合体は固定ホルマール陽帯
電基とハロヒドリン置換基とを持った重合体連鎖を有し
、前記帯電改質剤をアルカリ性の水混和性有機溶剤溶液
に溶解させ、かつ（ｃ）陽イオン帯電改質された疎水性
基質を硬化させる 工程からなっている。

上記したように、疎水性材料基質は多数の疎水性膜、た
とえばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン、
ＰＴＦＥなど任意のものとすることができる。疎水性Ｐ
ＶＤＦが好適である。帯電改質剤は好ましくはポリアミ
ンエピクロルヒドリン樹脂であり、かつ水混和性有機溶
剤の水溶液中に約０．５〜５重量％固形分として存在さ
せるが、約１〜３重Ｍ％固形分の溶液が好適である。有
機溶剤は、一般に工業処理で使用される任意の低級アル
コールとすることができる。メタノール、エタノール、
イソプロパツール及びその混合物が好適である。このア
ルコール／水混合物は、曲型的には溶剤に応じて１０〜
５０重足％混合物である。この混合物は、たとえばＮａ
ＯＨのような物質の添加により弱アルカリ性にされる。

好ましくは、溶液は約９．０〜１２．０のｐＨである。

当業界で知られた他の帯電改質疎水性膜と異なり、本発
明の方法により製造される帯電改質疎水性膜は、たとえ
ばテトラエチレンペンタミンのような二次的帯電改質剤
で処理されない。従来、二次的帯電改質剤は一次的帯電
改質剤の陽イオン電荷を増加させる手段として、並びに
−次的帯電改質剤を架橋させると共に膜表面に対するそ
の結合を向上させる手段として示唆されている。

本発明に用いる固定ホルマール陽帯電基は、高分子を結
合させる優秀な性能を基質に付与する意味で望ましい。

疎水性膜と組合せて使用すれば、固定ホルマール陽帯電
基のイオン交換能と膜の疎水性とが組合されて、高分子
の結合を生ぜしめることが望ましい用途にて優秀な性能
を与える。この種の用途は高分子プロツチング並びに濾
過を包含する。

プロッチング用途において、本発明の陽イオン帯電改質
された疎水性膜は、ニトロセルロース、ＤＢＭ紙、ＤＰ
Ｔ紙及び帯電改質親水性膜が従来使用されているのと同
じ方法で使用される。しかしながら、疎水性と固定ホル
マール陽電荷との組合せは、現在使用されているプロッ
トマトリックスよりも向上した性能を本発明の膜に付与
する。

ざらに本発明の材料は、たとえばナイロンのようなプロ
ツチング材が満足しえないと判明している条件下（すな
わち高いイオン強度を有する環境）で使用した際に、効
果的でおることが判明した。

さらに本発明の材料は、たとえばニトロセルロースのよ
うな従来のマトリックス材料よりも多くの利点を有する
。たとえば、ＤＮＡプロッチングの材料として使用する
場合、ニトロセルロース固定化マトリックスは充分機能
するには緩衝溶液中の高塩濃度の条件を必要とする。高
塩濃度の条件は、しかしながら、高い電流要求（すなわ
ち約５アンペアまで）を必要とする。これらの高電流は
熱を発生して、試験されているＤＮＡに悪影響を与える
。高塩濃度の条件は本発明の材料を用いれば必要でなく
なるので、電流をミリアンペア範囲に維持することがで
き、したがって熱破損を最小化させ又は完全に防止する
ことができる。

他の固定化マトリックス材料を用いて従来行なわれてい
ると同様に、本発明の材料を用いてプロット若しくは移
動電気泳動グラムの積層を行なうことができる。さらに
、本発明による材料の結合能力は従来の材料よりも優秀
でおるため、本発明による材料はハイブリッド化の際に
結合高分子を保持する能力の向上、並びに反復再使用す
る段階で強い信号を維持する能力を示す。本発明の材料
はクロマトグラフグル基質からの高分子の移動に関し特
に有用であると判明しているが、移動を対流若しくは拡
散により生ぜしめるような特定技術を含む実質的に伯の
全ての高分子プロツヂング技術につき使用することもで
きる。

上記方法により製造される帯電改質疎水性ＩＩＩ材料は
、水溶液中に浸漬しても直ちに濡れない。寧ろ、たとえ
ば高分子プロッチング用途の場合のように使用前に材料
を濡らさねばならない用途では、水混和性有機溶剤その
もので或いは水溶液で材料を予め濡らす必要がある。上
記のように、水混和性有機溶剤は工業的に従来使用され
ている任意の低級アルコール（すなわちメタノール、エ
タノール、イソプロパツール）とすることができる。こ
れらのアルコールは、好ましくは選択するアルコールに
応じて約１０〜５０重量％の範囲で変化するアルコール
対水の比を有する水溶液として使用される。

水性アルコールによる予備濡らし工程の代案として、予
備濡らしを必要とする用途に使用される膜材料は、マト
リックス中に表面活性剤若しくは湿潤剤を混入して製造
することもできる。この場合、疎水性膜を帯電改質性被
覆を施す際、或いは硬化工程の後に表面活性剤若しくは
湿潤剤の水溶液と接触させる。適する表面活性剤溶液は
、たとえばツイーン２０［米国ＩＣＩ・インコーポレー
ション社の登録商標］又はプルロニックＦ−６８［ＢＡ
ＳＦコーポレーシジー社の登録商標］のようなイオン型
若しくは非イオン型洗剤の水溶液を包含する。適する湿
潤剤はテトラグリム［テトラエチレングリコールジメチ
ルエーテルコ、グリセリンなどを包含する。この種の処
理は本発明の材料を、水性媒体と接触させた直後に濡れ
性にする。

［実施例］ 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。以
下の実施例は、陽イオン帯電改質された疎水性膜の製造
及び使用方法を例示する。これらの膜は、高分子プロツ
チング及び濾過を含め多くの用途に有用である。

広義において、陽イオン帯電改質剤は次の手順により疎
水性有機高分子嗅に被覆される：疎水性膜を先ず最初に
水混和性有機溶剤（すなわちアルコール）中で予備的に
濡らし、次いで水と交換する。次いで、この膜を帯電改
質剤の水溶液中に入れて被覆する。或いは、この方法は
疎水性膜基質を帯電改質剤を含有する水混和性有機溶剤
（すなわちアルコール）の水溶液と接触させてることも
含む。被覆は浸漬、スロット被覆、トランスファーロー
リング、噴霧などによって施すこともできる。次いで、
被覆された膜を拘束下で乾燥させかつ硬化させる。適す
る乾燥及び硬化方法は電熱トランスファードラム、熱風
衝突、輻射加熱又はこれら方法の組合せを使用すること
を含む。

実施例　１Ａ：帯電改質された微孔質膜の製造微孔質膜
しイムモビロンＰ（登録商標）、すなわち孔径０．、ｌ
１５塵の疎水性ポリ弗化ビニリデン、及びデュラポア（
登録商標）、ずなわち孔径０．６５柳の親水性ポリ弗化
ビニリデン：これら両者はマサチューセッツ州、ベッド
フｔ−ド在、ミリボア・コーポレーション社から市販さ
れている］（７）１５．０ｘ　２５．０ｃｍのシートを
、ＮａＯＨで１）Ｈｌｏ、　５６に調整されたバーキュ
リースＲ／１３０８の３％（Ｖ／Ｖ）溶液により室温で
１時間被覆した。疎水性基質の場合は、膜を先ず最初に
メタノールで予備的に濡らし、かつ被覆溶液に入れる前
に水で交換した。親水性デュラボアは、被覆溶液中に直
接入れた。被覆後、これら膜を１晩空気乾燥させ、次い
でポリエステル薄膜のシート間に置き、かつ拘束下に１
２１℃にて３分間加熱した。

実施例　１日：帯電改質された微孔質膜の製造実施例１
Ａと同様な膜試料を、５０％（Ｗ／Ｗ）ＮａＯＨにより
ｐＨ１０に調整された２５％（Ｖ／Ｖ）イソプロパツー
ル／水におけるバーキュリースＲ４３０８の３重量％固
形分の溶液で被覆した。これら膜試料をこの溶液に０．
５〜１．０分間浸漬し、次いで被覆溶液から取出した。

過剰の樹脂溶液をワイパー棒により「絞り」作用で除去
した。次いで、膜を拘束下にポリエステル薄膜のシート
間に挟持しながら電熱トランスファードラムと接触させ
て９５℃の温度で３分間乾燥させた。膜の試料を、厚さ
と初期メタノール泡立点と流動時間とＢＦＴ表面積とイ
オン交換能（ＩＥＣ）とにつき特性化した。その結果を
下記第１表に要約する。

第１表 膜 厚さ、ｃｍ （ミル） 初期泡立点 ｋｇ／ｃｍ　２　　（ｐｓｉ）１ 流動時間 （ｄ／ｍｉｎ　／ｃｍ２ ＢＥＴ表面積 （ｍ　２　／（７） ＩＥＣ能力３　　　　　　０　　　　　　０．１３７５
．５ 帯電改質 ０．０１２ （４，６８） ０、７９９ （１１，３６”） ３０．０ 比較 ０．０１２ （４，６５） ０、７８７ （１１，２＞ ５１．２ ６．４７ 〉 １　：直径４７ｍｍの膜試料の円盤を、この円盤の縁部
を封止する試験ホルダーに入れた。膜の上方かつその上
面と直接接触させて、目間ステンレス鋼支持スクリーン
を載置し、このスフ−リンは空気圧力を下方から加えた
際に膜が変形し若しくは破裂するのを防止した。次いで
、膜の上にメタノールを載せた。次いで、制御された供
給源からの空気圧力を膜の下から加え、かつ最初の気泡
の流れが膜により放出されるまで増大させた。この圧力
を、ｃｍ（ｐｓｉ）における初期泡立点と呼ぶ。

２　：流動時間は、ＡＳＴＭ法Ｎｏ、　Ｆ　３１　？／
７２　ｉ、：従って上記と同様な装置で測定した。

３：全ＩＥＣ能力を測定するには、直径４７ｍｍの膜試
料の円盤を５０％（Ｖ／Ｖ）エタノールにおける０、１
Ｍ　　ＨＣｅの１００ｍ１！中に５分間入れ、次いで室
温にて１時間空気乾燥させた。次いで、こられ膜円盤を
８０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／水混合物の１００ｍ１で
濡らし、次いでこれに２−の５ＭＮａＮＯ３溶液を添加
した。塩素イオン濃度を、次いでフィッシャー・コンピ
ュータ補助滴定装置を用いて硝酸銀（０，０２８２Ｍ　
　ＡＱＮＯ３）での誘導滴定により推定した。次いで、
ＩＥＣ能力を円盤のミリ当＠／　ｇ重量として現わす。

実施例　２：帯電改質された微孔質膜に対するこの実施
例においては、実施例１Ａに記載したように帯電改質剤
で被覆された微孔質膜の試料に対するＤＮＡの結合を、
トッド−プロット・マニホールド分析法で検査した。こ
の分析法においては、膜の試料がウェルの底部を形成し
、ここに液体を入れて膜と共に培養することができる。

次いで、液体を減圧下に膜を通して吸引することができ
る。この試験において、制限酵素１−１ｉｎｄｌｌ（Ｎ
Ｅビオラプス社）で切断されたバクテリオファージＭ１
３の複製型（ＲＦ）から誘導された二本鎖ＤＮＡの試料
を用いて、帯電改質されたＰＶＤＦ表面とナイロンとの
ＤＮＡ結合効率を比較した。ＲＦ−ＤＮＡは、Ｊ、スプ
リングによりメソヅズ・イン・エンチモロジー、第１０
１巻、組換ＤＮＡ　［パートＣ］、第２０〜７８頁、Ｒ
，ウーし、グロスマン、Ｋ１モルデーブ編、アカデミツ
クブレス社、ニューヨーク（１９８３）に記載されたよ
うに単離した。ＤＮＡは、市販キット（ＮＥＮ／デュポ
ン、ＮＥＫＯＯ９）により酵素末端デオキシヌクレオチ
ジルトランスフエラーゼと標識としての［α−Ｐ３２］
　３’　−ｄＡＴＰとを用いて３′−末端標識した。標
識されたＤＮＡを未標識物質と組合せて、１０．　ＯＯ
Ｏｃｐｍ／１Ｉ９Ｄ　Ｎ　Ａの特異活性を与えた。次い
で、ＤＮＡをドツト−プロット分析マニホールドのウェ
ルに、次の試薬系の１種における０、０５０ｍの容積で
添加した：　　０．１２５ＭＮａＯＨ１０，１２５ＸＳ
ＳＣ（標準クエン酸ナトリウム、１８．７５ｍＨＮ　ａ
　ｃ　ｌ、２．１ｍＨクエン酸ナトリウム）　、１０Ｘ
ＳＳＣ（１，５Ｍ　　ＮａＣｅ、０．１７Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７，４＞　、及び２５ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，４）。後者の２種の緩衝液におい
て、ＤＮＡを１００℃まで５分間加熱した後に水中で１
０分間急冷することにより一本鎖となし、次いで試験膜
試料に施した。３０分間後、残留液を減圧下に膜を通し
て吸引した。

次いで、膜をマニホールド中で低減圧下に０．１００ｄ
の同じ試料用緩衝液にて洗浄し、次いで膜シートを取出
しかつ風乾させた。次いで、個々の膜内盤をシンチレー
ションカウンタ液に入れ、ｐ３２の組込を測定した。

他の試料を、公開された文献［モレキュラ・クローニン
グ、第３８７〜３８９頁、王、マニアチス、Ｅ、Ｆ、フ
リッチ及びＪ、サムプルツク編、コールド・スプリング
・ハーバ−・プレス社（１９８２）　］に記載されたハ
イブリッド化分析を模倣した条件下で放射能標識された
ＤＮＡの保持につき分析した。さらに、結合したＤＮＡ
をもアルカリ「ストリッピング」条件（０，４Ｍ　　Ｎ
ａＯＨ，４２℃、３０分間）にかけて、結合した放射能
標識ＤＮＡ　ｒプローブ」を除去した。これは、プロッ
トしたＤＮＡが再試験される場合に膜が受ける条件を模
倣したものである。疎水性基質と近縁の親水性基質と１
７人 下記緩衝液にて施した ＤＮＡ保持％１ アルカリ２　１０ＸＳＳＣ３燐酸塩４ 膜種類： Ｒ４３０Ｂ被覆された　　１００　　１００　　　７０
．１疎水性ＰＶＤＦ Ｒ４３０８被覆された　　９５．２　　０　　　６４．
７親水性ＰＶＤＦ ナイロン５　　　　　１００　　　９５．２　　　６１
．１１　：上記試料緩衝系の１種における１μ９のＭ１
３ＲＦ−ＤＮＡを、９．０００〜１３．　ＯＯＯＣｐｍ
／／／９ＤＮＡの比活性にて０．０５０ｍの容積で施し
た。シンチレーション計数の後、保持されたＤＮＡのμ
９を計算し、かつ初期に施した試料１μ９の％として現
わした。

２　　：　　１２５ｍＨＮ　ａＯＨ，１８，７５ｍＨＮ
　ａ　Ｃｌ　。

２．１ｍＮクエン酸すｉ〜ツリウム ３　　：　　１．５Ｍ　　ＮａＣｅ、０．１７Ｍクエン
酸ナトリウム、ＤＩ−（７，４ ４：２５ｍＮリン酸ナトリウム、ｐ）（７，４５：使用
したナイロン試料はゼネスクリーン・プラス（ＮＥＮ／
デュポン）とした。

この試験の結果は、微孔質疎水性ＰＶＤＦ膜表面の帯電
改質が、ハイブリッド化分析及び再試験を模倣する条件
下で向上したＤＮＡ結合と保持特性とを示す膜を形成し
うろことを示している。この実施例で試験した実験条件
は、同相核酸プロツチングに有用な膜で経験されるよう
な代表的範囲の条件である。主としてサウザン・プロッ
ト分析の場合に用いられる高イオン強度条件（すなわち
１０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）の下で、Ｒ４３０８被覆された親
水性ＰＶＤＦ表面に対するＤＮＡ結合は全く存在しない
ことが特に注目される。これに対し、疎水性表面は優秀
なりＮＡの結合を示す。観察された性能上の利点は、ハ
イブリッド・イオン性／疎水性の微小環境がより効率的
な高分子プロツチングを促進するという理論を裏付ける
。これは、帯電改質された疎水性表面の重要な属性であ
る。

この実施例においては、実施例１Ａに記載したように作
成した膜試料を、ハイブリッド化の５サイクルシリーズ
にてマニホールド・ドツト−プロット分析で使用した。

この実施例は、この用途につき現在入手しつるナイロン
基質と対比して、向上した帯電改質疎水性膜の性能を示
している。

この分析においては、実施例２に記載したように単離し
たＭ１３−ＲＦ　　ＤＮＡを次のように放射能標識した
： （１）Ｈｉｎｄｍ制限酵素で切断した後、試料を３′−
末端標識し、かつこれを用いて１０ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ高イ
オン強度条件により実施例２に記載したようにＤＮＡ結
合を測定し、ざらに （２）完全ＲＦ−ＤＮＡの試料を市販キット（ＮＥＮ／
デュポン、ＮＥＫＯＯ４）により［α−Ｐ３２］ｄ−Ａ
ＴＰでニック翻訳しＴ　１０７　ｃｐｍ／μｈＤＮＡの
比活性を達成し、これをハイブリッド分析用のプローブ
として用いた。次いで、この分析をドツト−プロット・
マニホールド（ビオラド社）を用いて実施例２に記載し
たように行なった。

ＨｉｎｄＩＩＩで切断した２組のＤＮＡ試料（０，０５
（７中１μ９）を次のように試験膜に吸着させた：（１
）Ｐ３２３’　−末端標識で追跡標識したり、ＮＡ（こ
れはＤＮＡの保持を決定するために用いた）。（２）標
識しなかったＤＮＡ　（これはニック翻訳プローブでの
ハイブリッド化分析を行なうために用いた）。実施例２
に記載したような１サイクルのハイブリッド化の後、１
組の試料をシンジーション計数用として保持する一方、
残余の試料をアルカリ「ストリッピング」にかけて放射
能プローブＤＮＡを除去した。次いで、後者の試料をハ
イブリッド化工程に再使用した。これを全部で５回反復
した。その結果を第４表及び第５匪土憲 １ノ゛イクルにおけるＤＮＡ結合／保持サイクル 模型　　　　　　Ｎｏ。

Ｒ４３０８被覆　　　１ された疎水性ｐｖ叶 保持 縄ＤＮＡ１ ０．６５ ナイロン３ ０．２６ ０．２０ ０．２１ ０．１７ ０．２２ ０．０１８ ０．０３４ ０．０２７ ０．０１４ ％ 全体２ ６１．８ ２２．８ １７．５ １８．４ １４．９ ２２．５ １．８ ３．５ ２．７ １．９ １　　：ＨｉｎｄＩ［ｌで切断したＭ１３　　ＲＦ−Ｄ
ＮＡを１５．７８０ｃｐｍ／ｉＩｇの比活性までｐ３２
　３’　−末喘標識した。試料（、０，０５ｒｎＩ中１
μ９）を、実施例２に記載したようにドツト−プロット
・マニホールドにて上記膜試料に結合させた。次いで、
膜をマニホールドから取外し、かつハイブリッド化分析
と［アルカリストリッピング］条件とのサイクルにかけ
て、５サイクルの再試験を模倣した。保持されたＤＮＡ
の量をシンチレーション計数により推定した。

２　：ハイブリッド化分析前の膜試料に充填されたＤＮ
Ａの比較値は次の通りである： Ｒ４３０８被覆された　　　　　　　　１．１４μ９疎
水性ＰＶＤＦ ナイロン　　　　　　　　　　　０．９８μ９３　：比
較用として、ゼネスクリーンプラス型す第５表 サイクル 膜　　型　　　Ｎα　ハイブリッド化ＣＰＭ１Ｒ４３０
８被覆された　１　　　　　１１６．１０７疎水性ＰＶ
ＤＦ ２　　　　　　１１３゜ ３　　　　　１４９゜ ４　　　　　　２２１゜ ５　　　　　　１１３゜ ナイロン２　　　　　１　　　　　　３２゜２　　　　
　４０゜ ３　　　　　３２゜ ４　　　　　６９゜ ５　　　　　２２゜ １　：ドットープロットされたＭ１３　　ＲＦ−ＤＮＡ
を、確立された方法［モレキュラ・クローング、第３８
７〜３８９頁］にしたかい［ニック翻Ｕ（Ｊ７０−７を
用イＴ　１０７　Ｃｐｍ／μ９　　Ｄ　Ｎ　Ａの比活性
までハイブリッド化させた。厳密に洗浄した後、ｐ３２
プローブが結合された膜の試料（２反復）をシンチレー
ション計数にかりた。ハイブリッド化の程度は、λＤＮ
Ａの吸着された未標識ＨｉｎｄＩ［切断物に対し結合し
たＣＰＭとして現わした。

２　：比較用として、ゼネスクリーンプラス型ナイロン
を用いた。

第４表に示したデータから明らかなように、ＤＮＡはナ
イロンと比較してＲ４３０８被覆された疎水性ＰＶＤＦ
表面上に良好に保持された。しかしながら、両者の場合
、これら表面上に吸着された多量の初期ＤＮＡは第１サ
イクルの使用の際に喪失すると思われ、次いで一層レベ
ルを維持する。

第５表に示したハイブリッド化分析は、帯電改質された
疎水性ＰＶＤＦ表面による一層高いＤＮＡ保持という性
能上の利点を反映している。改善されたドットブロツ］
へ分析性能は、ハイブリッド・イオン性／疎水性膜表面
の重要な属性を示す。

析 この実施例においては、実施例１Ｂに記載した方法で作
成された帯電改質疎水性ＰＶＤＦ膜の試料をドツト−プ
ロット・マニホールド分析に用いて、ナイロンに対する
帯電改質ＰＶＤＦ表面のハイブリッド化分析性能を比較
した。制限酵素１−１ｉｎｄｌＩＩで切断されたバタテ
リオファージＭ１３　　ＲＦ−ＤＮＡを１０ｘ　Ｓ　Ｓ
　Ｃで加熱変性させ、かつこれを実施例２に記載したよ
うにドツｌ−−プロット・マニホールドにおけるＩＯＸ
　Ｓ　Ｓ　Ｃで帯電改質疎水性ＰＶＤＦ及びナイロン膜
の試料に施した。濃度範囲は次のようにした：　　０．
３２．１．６．８．０．４０；　　２００及び１０００
ｎｑ／ウエル１個。

次いで、ドツト−プロットされたＤＮＡを、実施例３に
記載したように作成されたニック翻訳ｐ３２標識プロー
ブとハイブリッド化させた。得られた放射能写真の例（
コダックＸＡＲ−５フィルム、増強スクリーンで１８時
間露出）を第１図に示ず。

第１図に示したＩｌｉ剣能可能写真明らかなように、帯
電改質疎水性ＰＶＤＦにドツト−プロットされたＤＮＡ
に関するハイブリッド化分析性能は、この実験の条件下
でナイロンにつき見られるものよりも優秀である。この
ＰＶＤＦ表面を用いて、８ｎｑ程度に少ないプロットＤ
ＮＡを放射能写真で検出することができる。これに対し
、同じ条件下でナイロン膜試料については２００ｎｇ程
度のレベルしかＤＮＡを検出することができなかった。

サウザン・プロット法では、アガロースゲルにおける電
気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、次いでこれを毛細管
作用により膜支持体に移した。この方法には次の工程が
含まれる：（１）大型ＤＮＡ分子の移動向上のための酸
デプリネーション、（２＞ＤＮＡを移動用として一本鎖
にするためのアルカリ変性、及び（３）中和及び高イオ
ン強度の移動用緩衝液（１０ＸＳＳＣ）との平衡化。

より詳細には、モレキュラ・クローニング、第３８７〜
３８９頁を参照することができる。

膜に毛細管移動させた後、プロットされたＤＮＡをハイ
ブリッド化分析にかけた。ハイブリッド化法においては
、次の工程を行なった：（１）予備ハイブリッド化を先
ず最初に行なって、膜表面に対するＤＮＡの比特異性結
合を減少させ、（２）膜を同質ｐ３２標識ＤＮＡプロー
ブ（膜に結合したＤＮＡに対し相補的である一本鎖ＤＮ
Ａ）に対し、膜上にてプローブとその標的ＤＮＡ配列と
の間にハイブリッド化を生ぜしめる条件下で露出させ、
かつ（３）過剰の比特異的に保持されたプローブを、厳
密度を増大させる条件下で洗浄して除去した［詳細には
モレキュラ・クローニング、第３８７〜３８９頁参照］
。

この実施例では、２つの実験につき説明する：（１）λ
ＤＮＡのＨｉ　ｎｄｌｌｌ切断物から得られたＤＮＡ断
片を１）３２ｄＣ丁Ｐ（デュポン／ＮＥＮからのキット
）で５′−末端標識した。得られたＤＮＡプローブの比
活性は１０６　ｃｐｍ　／μａＤ　Ｎ　Ａ　Ｔ：あると
決定され、全部で１μ９をこの実験に用いた。

保持されたＤＮＡプローブを、Ｘ線フィルムに１８時間
露出させて可視化させた（第２図）。

（２）上記に示したと同様な実験において、ＤＮＡポリ
メラーゼ用のプライマ（ファルマシアキット）として多
数の小型ランダムオリゴヌクレオチドを用いることによ
りＤＮＡプローブを１０９　ｃｐｍ／ｕ９Ｄ　Ｎ　Ａの
比活性まで標識し、ソノ０．２１Ｉ９を実験に用いた。

保持されたＤＮＡプローブを、Ｘ線フィルムに１０分間
露出させて可視可した（第３図）。　第２図はナイロン
膜と帯電改質された疎水性表面とのＤＮＡ結合能力を比
較する。

データ（典型的でないナイロンに関するレーン２を除く
）から明らかなように、帯電改質された疎水性膜はこの
実験の条件下でより良好な信号検出を与えた。第３図に
は、より高い比活性を有する異なるプローブを用いて、
はぼ同じ結果が見られる。帯電改質線された水性表面の
向上したザウザン・プロット性能は、許容されているサ
ウザン・プロット技術を用いるナイロンと比較して、こ
の材料の重要な特性である。

以上、好適実施例につき本発明を説明したが、本発明の
思想及び範囲内において多くの改変をなしうろことが当
業者には了解されよう。

【図面の簡単な説明】

第１図はドツト−プロット・ハイブリッド化分析に関す
るナイロン膜と帯電改質された微孔質膜とを比較した放
射能写真図であり、 第２図は第１のｐ３２標識ＤＮＡプローブを用いたサウ
ザン・プロット分析において第１図の各材料を比較した
放射能写真図であり、 第３図は第２のｐ３２標識ＤＮＡプローブを用いた第２
図と同様な放射能写真図である。 図面の浄書（内容に変更なし） 第１図 第２図 すでワニ 岸゛警改質 ＶＤＦ ＤＮＡ充填 一一一一・　０，５６ Ｏ１３２ ＤＮＡ充填； ４０、Ｏ０５ｕｇ 第３図 手続補正書 （方式） ％式％ 事件の表示 平成１年特許願第１５５９８６号 発明の名称 帯電改質された疎水性膜材料及びその製造方法補正をす
る者 事件との関係　　　　　　　　　特許出願人名　称　　
ミリボア・コーポレイション代 理 人 −−０，５６ 住 所 〒１０３ 東京都中央区日本橋３丁目１３番１１号補正命令通知の
日付 平成１年９月２６日 ４丁 補正の対象 図 面 補正の内容 別紙の通り 図面の浄書（内容に変更なし） １通

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）被覆基質のイオン交換能の大部分が固定ホルマー
   ル陽帯電基により付与され、これによりイオン性及び疎
   水性の両表面作用を有する被覆基質を形成することを特
   徴とする架橋された陽イオン帯電改質性材料で被覆され
   た疎水性基質。
2. （２）疎水性微孔質膜からなる請求項１記載の疎水性基
   質。
3. （３）ポリ弗化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリエチ
   レン、ポリスルホン又はポリテトラフルオロエチレンか
   らなる請求項２記載の疎水性微孔質膜。
4. （４）固定ホルマール陽帯電基が１０００より大きい分
   子量を有する水溶性有機重合体により形成され、前記重
   合体が固定ホルマール陽帯電基とハロヒドリン基とを持
   った重合体連鎖を有する請求項１記載の膜。
5. （５）ハロヒドリン基がエピクロルヒドリン基からなる
   請求項４記載の膜。
6. （６）固定ホルマール陽帯電基が第四アンモニウム、第
   四ホスホニウム及び第四スルホニウムよりなる群から選
   択される請求項４記載の膜。
7. （７）固定ホルマール陽電荷がポリアミノエピクロルヒ
   ドリン表面被覆により付与される請求項３記載の膜。
8. （８）さらに表面活性剤もしくは湿潤剤を材料中に混入
   してなる請求項１記載の膜。
9. （９）ゲルマトリックス上にクロマトグラフ高分子パタ
   ーンを生ぜしめ、前記高分子パターンを固定化マトリッ
   クス上に溶出させ、かつ溶出物質をハイブリッド化して
   高分子パターンを検出する工程からなる高分子の分析方
   法において、被覆基質のイオン交換能の大部分を固定ホ
   ルマール陽帯電基により付与し、これによりイオン性及
   び疎水性の両表面作用を有する固定化マトリックスを形
   成するよう架橋陽イオン帯電改質性材料で被覆された疎
   水性基質を固定化マトリックスとして用いることを特徴
   とする巨大分子の分析方法。
10. （１０）疎水性基質が疎水性微孔質膜からなる請求項９
    記載の方法。
11. （１１）疎水性基質がポリ弗化ビニリデン、ポリプロピ
    レン、ポリエチレン、ポリスルホン若しくはポリテトラ
    フルオロエチレンからなる請求項１０記載の方法。
12. （１２）固定ホルマール陽帯電基が１０００より大きい
    分子量を有する水溶性有機重合体により形成され、前記
    重合体が固定ホルマール陽帯電基とハロヒドリン基とを
    持った重合体連鎖を有する請求項９記載の方法。
13. （１３）ハロヒドリン基がエピクロルヒドリン基からな
    る請求項１２記載の方法。
14. （１４）固定ホルマール陽帯電基を付与する被覆を備え
    た疎水性材料を製造するに際し、 （ａ）疎水性材料基質を形成し、 （ｂ）前記基質を帯電改質性溶液と接触させ、前記溶液
    は１０００より大きい分子量を有する有機重合体からな
    る帯電改質剤を含み、 前記重合体は固定ホルマール陽帯電基と ハロヒドリン基とを持った重合体連鎖を 有し、前記帯電改質剤をアルカリ性有機 溶剤水溶液に溶解させ、かつ （ｃ）被覆された疎水性基質を硬化させる ことを特徴とする疎水性材料の製造方法。
15. （１５）疎水性基質が疎水性微孔質膜からなる請求項１
    ４記載の方法。
16. （１６）疎水性微孔質膜がポリ弗化ビニリデン、ポリプ
    ロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン及びポリテトラ
    フルオロエチレンよりなる群から選択される材料からな
    る請求項１５記載の方法。
17. （１７）帯電改質性溶液を９．０〜１２．０のｐＨに維
    持する請求項１４記載の方法。
18. （１８）硬化が、被覆された疎水性基質を加熱により乾
    燥することからなる請求項１４記載の方法。
19. （１９）固定ホルマール陽帯電基が第四アンモニウム、
    第四ホスホニウム及び第四スルホニウムよりなる群から
    選択される請求項１４記載の方法。
20. （２０）ハロヒドリン基がエピクロルヒドリン基からな
    る請求項１４記載の方法。
21. （２１）被覆された疎水性基質を、硬化工程の後に湿潤
    剤若しくは表面活性剤の水溶液と接触させる工程をさら
    に含む請求項１４記載の方法。
22. （２２）固定ホルマール陽帯電基を付与する被覆を備え
    た疎水性材料を製造するに際し、 （ａ）疎水性微孔質ポリ弗化ビニリデン基質を形成し、 （ｂ）水中２５容量％のアルコール溶液を形成し、前記
    溶液は０．５〜５重量％固形分のポリアミンエピクロル
    ヒドリン樹脂を含有し、前 記溶液をさらに９．０〜１２．０のｐＨに調整し、（ｃ
    ）前記基質を０．５〜１．０分間にわたり溶液中に浸漬
    し、 （ｄ）基質を溶液から取出し、かつ （ｅ）基質を９５℃の温度にて３分間乾燥させることを
    特徴とする疎水性材料の製造方法。
23. （２３）被覆膜のイオン交換能の大部分が固定ホルマー
    ル陽帯電基により付与され、これによりイオン性及び疎
    水性の両表面作用を有する濾過材を形成するよう架橋陽
    イオン帯電改質性材料で被覆された疎水性微孔質膜から
    なることを特徴とする濾過材。