JPH08504037A

JPH08504037A - 被覆毛細管カラムおよびその用途としての電気泳動分離方法

Info

Publication number: JPH08504037A
Application number: JP7510442A
Authority: JP
Inventors: シエー、チア−ヒュイ
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1993-09-29
Filing date: 1994-09-28
Publication date: 1996-04-30
Anticipated expiration: 2020-11-09
Also published as: EP0671000A1; US5462646A; DE69422489D1; EP0671000B1; WO1995009360A1; DE69422489T2; JP3713520B2

Abstract

(57)【要約】被覆毛細管電気泳動カラムおよびその用途としての電気泳動分離の方法が開示されている。該被覆毛細管カラムは、管内面上の荷電化学官能基とイオン相互作用可能な少なくとも１つの架橋有機多価イオン化合物で被覆された内面を有する所定長さの管を含む。例示としてのカラムは、多官能性のアミン化台物をジエポキシドと架橋させ、該架橋された多官能性のアミン化合物をアルキル化して架橋４級アンモニウム化合物を形成させ、そしてその後、該毛細管の内面を該架橋４級アンモニウム化合物に接触させることによって製造される。

Description

【発明の詳細な説明】被覆毛細管カラムおよびその用途としての電気泳動分離方法発明の背景１．発明の分野本発明は、一般に、内面コーティング（被覆）を有する毛細管カラムおよびその用途のための電気泳動分離方法に関する。さらに詳細には、本発明は、それらの内壁表面上に荷電架橋コーティングを有する毛細管カラムに関する。荷電コーティングは、電気浸透フローをさらに制御できるようにし、毛細管カラムの内面との分析物質相互作用を低下させ、アミン類および関連化合物の効果的な電気泳動分離に寄与する。２．関連技術の記載電気泳動分離方法は、分子の実効電荷の差異および／または前記分子の分子径の差異に従って、分子を分離するために長年にわたり利用されてきた。最近になるまで、電気泳動分離は、通常はポリアクリルアミドゲル材料から構成されるゲルスラブまたはオーブンゲルベッド中において実施されてきた。さらに最近になって、毛細管電気泳動技術は分光検出方法と併用され、分子の自動化および迅速定量分析を可能としてきた。異なる実効電荷を有する分子の高分解能分離が、緩衝液を充填したかまたはゲルを充填した細い毛細管に電気泳動原理を適用することによって、達成されてきた。典型的には、毛細管電気泳動に使用されてきた毛細管は、２５μｍから２００ μｍのオーダーの直径と約１０から２００ｃｍの長さを有する（種々の）長さのシリカチューブから加工されている。緩衝液およびゲル分離媒体はカラム内部に直接ポンプで組み入れられ、電気泳動法を用いて、多種類のペプチド類、タンパク質類、およびオリゴヌクレオチド類、核酸類およびその他の荷電分子種を分離する。さらに、この分野は、毛細管電気泳動操作を用いて分離できかつ検出できる分子の種類および大きさに関して、絶えず拡大している。毛細管電気泳動と関連した利点は、極めて多い。定量的情報は極小試料サイズによって得ることができ、使用したゲルまたは緩衝液の量は非常に少ない。さらに、分離に要する時間を極めて短くでき、本方法自体は、自動化および電子データ保存およびデータ操作に寄与する。毛細管電気泳動が旧来のスラブゲル電気泳動に存在しないある現象に関連していることは重要である。これらのうちのひとつは、緩衝溶液の電極のひとつに向かってのバルクフローによって特徴づけられる現在よく知られている電気浸透フロー現象である。電気浸透フローは、シリカ毛細管チューブの表面におけるシラノール官能基類のイオン化によって発生する。このイオン化の結果、シリカチューブの表面において、電気泳動緩衝液中にプロトン層を生成する。電場の存在において、プロトン層は陽極に向かって移動する液体の陽電荷カラムに類似し、緩衝液媒体の全体としてのバルク移動を引き起こす。電気浸透フローが種々の適用において利用でキ、電気泳動分離を向上させるのは、有益である。例えば、分離される分子の電気泳動移動が電気浸透フローのそれと反対方向にある時、正味の効果は実効カラム長の増加となる。電気浸透フローがいかなる特定の分離に有効であろうがなかろうが、フローを制御できることは望ましい。電気浸透フローを最小とするかまたは制御するためのひとつの方法は、表面シラノール基のイオン化が起こる度合いを制御するために内部を高分子材料で被覆したシリカ毛細管チューブを提供することである。一般に、これらのコーティングはそれらの目的に役だっている。しかし、改良されたコーティングが今も求められている。特に、電気浸透フローの制御に役立ちかつ特定種類の試料構成成分の電気泳動分離に役立つ毛細管コーティングを提供することが望ましい。毛細管電気泳動に関連したもうひとつの問題として、試料成分が毛細管壁に、特にシリカチューブの壁に付着する傾向が挙げられる。このことは、反応性シリカ官能基に容易に誘引される荷電小分子の場合に特に当てはまる。電気泳動分離媒体中に小ペプチド類およびアミン類が存在するとき、それらは、毛細管壁と静電的にかつ疎水性の両者で相互作用する。その結果、分離効率の低下および望ましくないバンド拡大となり、分離について誤まったデータが得られる。電気浸透フローと同様に、試料成分および壁相互作用の程度を最小とするかまたは制御可能な電気泳動毛細管を提供することは、全く成功していない。これまで、動的二重層コーティングを用いようと試みられてきた。これらの二重層コーティングは安定でなく、電気泳動プロセスで使用される溶出緩衝液中に添加剤を必要とする。ペプチド類およびタンパク質類の分離のためには、荷電高分子コーティングを適用すべきであると提案されてきた。しかし、これらのカラムコーティングは、物理的強度および被覆安定性を欠如しており、こうしたコーティングを有するカラムは、コーティング寿命が短くなっており、再現性のない分離という問題を呈することがある。さらに、荷電小分子はそれ自体、有効な毛細管コーティングを形成するために十分な物理的強度を有していない。したがって、荷電表面コーティングを有する毛細管カラムを調製する操作では、入手が限定されている高分子を利用することが必要となる。したがって、本発明の目的は、電気泳動分離に有用でかつ電気浸透フローを制御できる新規な被覆毛細管カラムを提供することである。さらに、本発明の目的は、試料成分と毛細管内壁との相互作用を低減するかまたは消失させる毛細管カラムを提供することである。さらに、本発明の目的は、物理的に安定なコーティングを有する毛細管を提供することである。さらに、本発明の目的は、さまざまな荷電分子の電気泳動分離に有用な毛細管を提供することである。発明の要約本発明は、試料成分と毛細管カラムの内面との相互作用量を低減することに寄与する内面コーティングを有する毛細管カラムを提供することによって、上記で述べた目的を満足する。本発明の被覆毛細管カラムは、さらに、電気泳動分離に際して、バルク材料の電気浸透フロー程度を使用者が制御できる度合いを高めることに寄与する。本発明の毛細管カラムに利用されたコーティング材料が、容易に入手できる種々の有機化合物から容易に調製されるのは、好都合である。これらの有機化合物として、巨大高分子材料の処理要件が必要でない実質的に低分子量の化合物が挙げられる。さらに、本発明の毛細管カラムを使用することで、アミン類、ペプチド類、およびタンパク質類を含むいくつかの化合物の分離が向上することになる。さらに詳細には、本発明の毛細管カラムとして、内面が荷電化学官能基を有する所定長さのチューブが挙げられる。この内面は、内面の荷電化学官能基とイオン相互作用が可能な架橋有機多価イオン化合物のコーティングを有している。本発明の好適な態様において、前記チューブはシリカから構成されており、前記架橋有機多価イオン化合物は架橋された４級アンモニウム化合物である。架橋４級アンモニウム化合物の例として、一般式：｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＨＯＣＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＨＯＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有するものが挙げられる。好適な態様において、本発明の被覆毛細管カラムは、最初に、好適な２級アミン化合物を架橋し、そして次に、生成した架橋されたアミン化合物を適切なアルキル化剤によってアルキル化することによって対応する架橋４級アンモニウム化合物を形成させることによって製造される。最後に、この架橋４級アンモニウム化合物を、適切に荷電された化学官能基を有する所定長さの毛細管内壁と接触させ、荷電化合物の電気泳動分離における用途に適した被覆毛細管カラムを提供する。本発明において用途を有している適切なアミン誘導体は、少なくとも３個のアミン官能基を有しかつ少なくとも２個の適切な反応性官能基を有する架橋試薬によって架橋可能なアミン化合物である。好適な態様において、この架橋試薬は、ブタジエンジエボキシドのようなジエポキシドである。例示的なアルキル化剤は、低級アルキルハライド類のようなアミン官能基と反応可能でこのアミンの４級アンモニウム誘導体を形成する化合物である。本発明の被覆毛細管カラムは、アミノおよびアミノ誘導体官能基を有する分析物質の電気泳動分離において特別の用途を有している。例示的分析物質化合物として、アミン類、アミノ酸類、ペプチド類およびアミン塩酸塩のようなそれらの誘導体が挙げられる。本発明に関連したこれらおよびその他の利点は、下記の図面とともに本発明の詳細な説明に記載された発明を理解すれば、当業者には明らかであろう。図面の簡単な説明第１図は、シリカ毛細管カラムの内壁とイオン的に相互作用する好適な４級アンモニウム化合物を示したものである。第２図は、本発明による７種の塩基性薬物の水溶液の電気泳動分離による電気泳動図である。第３図は、本発明によるタンパク質類水溶液の電気泳動分離による電気泳動図である。発明の詳細な説明本発明は、ベックマン社（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が製造販売のＰ／ＡＣＥシリーズ毛細管電気泳動システムのような電気泳動分離システムに特に有用な被覆毛細管カラムを提供する。さらに詳細には、本発明の被覆毛細管カラムは、種々の分子種をそれらの電気泳動度に基づいて分離する適用における分離媒体として有用である。これらの分子種として、タンパク質およびポリヌクレオチドのような巨大分子および塩基性薬剤および核酸のような小化合物が挙げられる。本文に記載の被覆毛細管カラムによって、使用者が電気浸透フローをさらに制御できるようになり、電気浸透フロー増強が望ましい分析条件において利用できる。本発明の特徴として、被覆カラム形成に使用されるコーティング材料は、架橋化合物または共有結合で結合された化合物の相互作用性のネットワークである。この結果、物理的強度が増強されたコーティングが生成し、次に、使用寿命が長くしかも電気泳動分離操作における信頼性および精度が向上したカラムを提供する。この増強された物理的強度は、また、異なる分析物質の毛細管壁との相互作用を防上する能力が延長することに寄与する。さらに詳細にかつ第１図に示したカラムの代表的断面図を参照して述べると、本発明の被覆毛細管カラム１０は、その内面１４上に荷電化学官能基を有する所定長さの毛細管１２から製造される。この内面は、さらに、内面の荷電化学官能基とイオン相互作用が可能な架橋有機多価イオン化合物のコーティングを有している。本発明の好適な態様において、前記毛細管は、シリカ含有ガラスから製造され、荷電化学部分は、シラノール官能基ＳｉＯ^-1であり、それらは、溶融シリカ表面を極めてわずかに塩基性の溶液に暴露させることによって形成される。毛細管分離系技術で公知であるように、毛細管は、長さおよび直径を変えることができ、このそれぞれは、特定の分析適用に依存している。典型的には、カラムは、長さが約１０ｃｍ〜２００ｃｍであり、内径が２５−２００μｍであろう。適切な有機多価イオン化合物として、毛細管内面における荷電化学官能基のそれと逆のイオン電荷を有しかつ少なくとも３のイオン価を有する有機種が挙げられる。コーティング材料の架橋性が本発明の特徴であるので、好適な有機多価イオン化合物は、多価イオン化合物に存在する官能基と反応性の少なくとも２個の官能基を有する架橋剤で架橋可能である。本発明によればかつ第１図に示したように、好適な被覆毛細管カラムは、一般式｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＨＣＯＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＯＨＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₂−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有する架橋４級アンモニウム化合物の内面コーティングを有するシリカ管から形成されたものである。当業者は、下記に示したようにシリカカラムの表面にいったん接触させれば、上述の架橋４級アンモニウム化合物の陽電荷は、シリカカラム表面のイオン化シラノール官能基の陰電荷と相互作用し、毛細管カラムの内面にイオン的に結合するであろうということを理解するであろう。３個（上記式におけるｎの値）しか繰り返しサブユニットを有していない２級アンモニウム化合物から調製された架橋４級アンモニウム化合物は、本発明の毛細管にとって有用なコーティングであることがわかった。高分子量化合物は物理的強度に寄与し通常毛細管表面に容易に結合するので、分子量上限値には限度がない。好適な架橋４級アンモニウム化合物は、約１，０００〜約１００，０００の分子量を有する好適な高分子性アンモニウム化合物である。架橋有機多価イオン化合物のイオン電荷密度は少なくとも部分的には値ｎによって決定され、毛細管の化学官能基と安定かつイオン的に相互作用するために十分に大きくするべきである。同様に、イオン電荷密度は十分に高く、毛細管内面の電荷をマスクするべきである。従って、値ｎは実質的に変動でき、唯一の限定的基準は、多価イオン化合物が十分な電荷を有し毛細管カラム表面に結合できるということである。好適な態様において、値ｎは、約１〜約２０である。架橋多価イオン化合物の架橋密度は、十分に大きく、物理的に安定した力学的に堅固なコーティングを提供する。第１図の例示的コーティングに関して、値ｎおよび架橋反応に使用した架橋剤の量は、架橋密度を少なくとも部分的に決定する。好適なコーティングを生成する架橋剤の量を、下記でさらに詳細に記載する。本発明によれば、被覆毛細管カラムを製造するプロセス（方法）は、荷電化学官能基の内面を有する所定長さの管を用意し（providing）、そして前記荷電化学官能基とイオン相互作用可能な架橋有機多価イオン化合物を用意する、一般的工程を含む。その後、前記有機多価イオン化合物を前記内面と接触させることによって、架橋多価化合物の層が前記内面とイオン的に相互作用し、被覆毛細管カラムを形成する。上記にも述べたように、好適な態様において、架橋有機多価イオン化合物は、一般式Ｉを有する架橋４級アンモニウム化合物である。式Ｉの化合物は、最初に、下記の一般式II [-(CH₂)_n-CH₂-NH-(CH₂)_n-CH₂-NH-(CH₂)_n-CH₂-NH-]_pII （式中、０≦ｎ≦２０；およびｐ≧１）を有する少なくとも１個の２級アミン化合物を用意することによって調製されるのが好都合である。次に、このアミン化合物を架橋し、次に、前記架橋アミン化合物をアルキル化剤と反応させることによって、架橋４級アンモニウム化合物を形成させる。前記アルキル化反応は、低級アルキルアルコールおよびエーテルを含むいくつかの揮発性有機溶媒のいずれにおいても達成可能である。従って、アルキル化反応後、前記架橋化合物を内壁表面に結合させるため、架橋４級アンモニウム化合物を毛細管内壁と接触するように、４級アンモニウム化合物および溶媒の溶液にさせる。多官能アミン化合物の架橋は、前記官能基をアミンと反応可能な少なくとも２個の官能基部分を有する化合物を反応させることによって、達成できる。アミン類は数種の異なる化学部分と容易に反応するので、広範囲の多官能化合物が入手できるかまたは合成でき架橋剤として作用させる。ジエポキシド類はアミンと開環反応において容易に反応するのでおよび種々の分子量のエポキシド類は広く入手可能であるので、本発明のプロセスに従って多官能アミン類を架橋するために好適である。下記でさらに詳細に記載するように、最も好適な架橋剤はブタジエンジエポキシドであり、上記のIIで示したアミンと下記のように反応する：（式中、０≦ｎ≦２０；およびｐ≧１）。式る官能基からなる群から選択され、およびｎは、１〜２０の整数である）を有するその他のジエポキシド類も、また、適切である。ジエポキシド類、特にブタジエンジエポキシドは、好適な架橋剤ではあるが、当業者には、種々の類似のジエポキシド類、ジアルキルハライド類、ジアシルハライド類、およびジスクシンイミド類を含むその他の多官能化合物も利用できることが明らかであろう。アミン化合物を架橋させるために多官能アミン化合物とジエポキシド類を反応させることは、アミンおよびジエポキシドの適切な溶媒または溶媒組み合わせの溶液を単に還流させることによって、達成できる。アミン濃度は、アミンの溶解度および反応性に依存している。１８００のオーダーの分子量を有する高分子アミンについて、適切な濃度は０．０１重量％〜約５０重量％の範囲である。同様に、ジエポキシドの濃度は、最大数のアミン官能基と反応し高架橋密度を達成するために十分に高くなければならない。当業者は、所望の結果を達成するために、種々の濃度および反応条件を付与されている。多官能アミン類とジエポキシドの架橋反応は高温を必要とせず、エーテルおよび低級アルキルアルコールを含む実質的に揮発性の溶媒を使用できる。これらの溶媒は、架橋アミンをアルキル化する前に容易に除去でき、最終架橋生成物を形成する。前記架橋多官能アミン化合物の架橋４級アンモニウム化合物への変換は、数種の適切なアルキル化剤のいずれかを用いて好適には達成され。本文に記載した方法は通常のアルキルハライドアルキル化剤を用いている一方で、その他の物質も同様に適している。１級、２級、または３級アミン類からアルキルハライドを用いて４級アンモニウム化合物を形成することは周知であり、当業者は、これらの反応の知識を付与されている。典型的なアルキル化反応は、選択したアルキルハライドおよび架橋アミンを塩基性溶液中で単に混合しかつ適切な時間還流するとを必要としているだけである。この反応の産物は、４級アミン塩の形態の多価イオン化合物である。アルキル化反応が完了した後、生成した溶液は調製した長さの毛細管の内面に直接適用できる。毛細管が溶融シリカである場合、シリカ毛細管の内面に存在する陰性シラノール官能基が陽電荷架橋４級アンモニウム化合物とイオン的に相互作用するかまたは結合し、改良された物理的強度および電気泳動分離特徴を有するコーティングを形成する。本発明の被覆毛細管カラムは容易に形成され、いかなる毛細管電気泳動システムにおける用途にも適応される。さらに、それらの用途は、特殊な取扱い操作を全く必要とせず、典型的な電気泳動技術がそれらの用途に適用される。従って、いったん標準的毛細管電気泳動機器に設置されると、本発明のカラムを、毛細管電気泳動による試料成分のための試料組成物の分析プロセスにおいて使用できる。本発明によれば、これらのプロセスは、通常、被覆された毛細管カラムの第１の端部を陽極貯留槽に浸積し、そして前記被覆カラムの第２の端部を陰極貯留槽に浸積する、工程を含んでいる。次に、試料組成物を被覆カラムの内部にその一端において導入し、貯留槽全体にわたり電場を適用することで、この毛細管カラム内部における試料成分の移動が異なってくるであろう。適切な検出器、例えば、ＵＶ可視検出器または蛍光検出器が被覆カラムの少なくとも一端に適切に配置された時に、分離された試料成分が検出され、電気泳動図が作成される。下記の例は、本発明の例示的態様を例示するものとして示されている。これらの例は限定的ではなく、例示のためのみに示されている。例１下記の例は、架橋高分子性アルキルアミンまたは一般式 [-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-]_p を有するポリエミン（ＰＥＩ）の調製を示したものである。約１６０から約１，０００，０００の種々の異なる分子量のＰＥＩが入手できる。下記に説明した操作は、架橋ＰＥＩ１８００、ＰＥＩ１２００，およびＰＥＩ６００ならびに同様の分子量特性を有する種々の多価アミンの調製に適用できる。ＰＥＩ１８００の１０ｇをメタノール２０ｍＬおよびテトラヒドロフラン３００ｍＬの溶液に添加した。ＰＥＩを完全に溶解させた後、ブタジエンジエポキシドの１．０ｇを前記ＰＥＩ溶液に添加した。ＰＥＩおよびブタジエンジエポキシドの生成溶液を１６時間還流させ、次に室温まで冷却した。その後、水１００ｍＬを冷却した溶液に添加し、メタノールおよびテトラヒドロフラン溶媒をロータリエバポレータ中で減圧下で前記溶液から蒸発させた。架橋ＰＥＩの残りの水溶液は、その後のアルキル化操作における使用に適している。例２下記の例は、低分子量多価アミン類の架橋操作を例示したものである。記載の操作を用いて、それぞれアミン官能基６個および４個を有するペンタエチレンヘキサミンおよびトリエチレンテトラミンを交互に架橋した。ペンタエチレンヘキサミンおよびトリエチレンテトラミンのいずれか１０をテトラヒドロフラン２００ｍＬに添加した。アミンを完全に溶解させた後、ブタジエンジエポキシド１ｇを前記テトラヒドロフラン溶液に添加し、生成したジエポキシドおよびアミン溶液を１６時間還流させた。還流溶液を室温まで冷却させ、その後、水１００ｍＬを冷却した溶液に添加した。前記溶媒のテトラヒドロフラン部分を減圧下でロータリエバポレータ中で蒸発させ生成した架橋アミンの水溶液は、アルキル化反応における用途に適していた。例３下記の例は、架橋ＰＥＩ類および上述の架橋ペンタエチレンヘキサミンおよびトリエチレンテトラミンを含む架橋高分子性アミン類およびより小さい架橋アミン化合物のアルキル化に適した典型的方法を例示している。ヨードメタンがこの例において使用したアルキル化剤であるが、クロロおよびブロモアルキル化合物を含む多数のアルキル化剤がヨードメタンと交換可能である。メタノール２００ｍＬ容量、炭酸ナトリウム３０ｇ、水１００ｍＬ、およびヨードメタン５０ｍＬを、例１または例２において記載したように架橋させた多価アミン化合物１０グラムを含む水溶液に添加した。反応混合物を１６時間還流させ、メタノールを減圧下でロータリエバポレータを用い除去した。生成した４級アンモニウム化合物水溶液を総量１０００ｍＬに希釈し、その後、０．４５μｍ孔サイズフィルターによってろ過した。このろ過溶液は、イオン性相互作用コーティングの形成のために毛細管内面に適用するのに適している。例４下記の例は、毛細管調製に適した方法および最終被覆毛細管カラムを提供するために管内面にコーティングを形成するための方法を例示したものである。ＰｏｌｙｍｉｃｒｏｏｆＰｈｏｅｎｉｘ、Ａｒｉｚｏｎａから購入した所定長さの直径５０μｍの毛細管の内面を、ＩＮＨＣｌ溶液で１５分間、洗浄した。このＨＣｌ溶液を除去し、管内面をＮａＯＨＩＮ溶液で１５分間洗浄し、その後、清浄水で１５分間洗浄した。その後、調製した長さの毛細管カラムを約１重量％の架橋４級アンモニウム化合物を含有する水溶液によって１５分間、洗浄した。この洗浄工程の後、被覆された毛細管カラムは、標準的毛細管電気泳動操作における使用に適していた。例５下記は、本発明の被覆毛細管カラムの例示的適用を示している。特に、下記にも記載したようにかつ第２図にも示したように、本発明の被覆カラムは塩基性薬物のような荷電小粒子および大きいタンパク質類の分離において有用である。７種の塩基性薬物を含有する水性試料を、それぞれ、デシプラミン、イミプラミン、ノルドキセピン、ドキセピン、ノルトリプチリン、アミトリプチリン、およびプロトリプチリン１．０ｍｇを水１．０ｍＬに添加し、調製した。架橋かつアルキル化ＰＥＩ１８００（例１および例２に記載のように架橋しアルキル化した）を被覆させた３７ｃｍ×５０μｍの毛細管カラムを、Ｐ／ＡＣＥ毛細管電気泳動機器（ベックマン社（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）製）中に配置した。カラムにｐＨ６．５に調整した５０ｍＭビス−トリスプロパン緩衝液を満たした。塩基性薬物溶液の試料を、１０秒加圧注入を用いて前記カラムの一端に注入し、４００Ｖ／ｃｍまたは１４．８ｋＶを２５゜Ｃの温度で電気泳動貯留槽全体にわたり適用した。分離した塩基性アミンを、ＵＶ検出器で２１４ｎｍにおいて検出した。第２図は、移動８分未満で得られた電気泳動図を示している。塩基性アミンのそれぞれは、基準線分離によって他のアミン類から分離した。電気泳動図の左から右へ、移動の順序は、ドキセピン、ノルドキセピン、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、およびプロトリプチリンである。例６下記は、本発明の被覆毛細管カラムの例示的適用を例示している。特に、下記にも示したようにかつ第３図に示したように、本発明の被覆カラムは、タンパク質分離において有用である。５種のタンパク質を含有する水性試料は、それぞれ、カルボニックアンヒドラーゼ、ミオグロビン、α・キモトリプシノーゲンＡ、チトクロームＣ，およびリゾチーム１．０ｍｇを水１．０ｍＬに添加し、調製した。架橋かつアルキル化ＰＥＩ１８００（例１および例２に記載のように架橋しアルキル化した）を被覆させた３７ｃｍ×５０μｍの毛細管カラムを、Ｐ／ＡＣＥ毛細管電気泳動機器（ベックマン社（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）製）中に配置した。カラムにｐＨ７．０に調整したＨＥＰＥＳ緩衝液を満たした。塩基性薬物溶液の試料を、１０秒加圧注入を用いて前記カラムの一端に注入し、３００Ｖ／ｃｍまたは１１．１ｋＶを２５゜Ｃの温度で電気泳動貯留槽全体にわたり適用した。分離した塩基性タンパク質を、ＵＶ検出器で２１４ｎｍにおいて検出した。第３図は、移動８分未満で得られた電気泳動図を示している。前記タンパク質のそれぞれは、基準線分離によって他のアミン類から分離し、電気泳動図の左から右へ、移動の順序は、カルボニックアンヒドラーゼ、ミオグロビン、α・キモトリプシノーゲンＡ、チトクロームＣおよびリゾチームである。

Claims

【特許請求の範囲】１．試料成分の電気泳動分離用毛細管カラムであって、荷電化学官能基を有する内面を有する所定長さの管、および前記内面の前記荷電化学官能基とのイオン相互作用が可能な少なくとも１種の架橋有機多価イオン化合物を含んでなる、前記内面上のコーティングを有してなることを特徴とする毛細管カラム。２．前記管がシリカから製造され、かつ、前記荷電化学官能基がイオン化シラノール官能基を含むことを特徴とする請求項１記載の毛細管カラム。３．前記架橋有機多価イオン化合物が架橋４級アンモニウム化合物を含むことを特徴とする請求項１記載の毛細管カラム。４．前記４級アンモニウム化合物が少なくとも３個の４級アンモニウム官能基を有する化合物を含むことを特徴とする請求項３記載の毛細管カラム。５．前記架橋４級アンモニウム化合物が式｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０；ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＨＣＯＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＨＯＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有する化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項３記載の毛細管カラム。６．試料成分の電気泳動分離用毛細管カラムであって、荷電解離シラノール官能基を有する内面を有する所定長さのシリカ管、および前記解離シラノール官能基とのイオン相互作用が可能な架橋４級アンモニウム化合物を含んでなる、前記内面上のコーティングを有してなることを特徴とする毛細管カラム。７．前記架橋４級アンモニウム化合物が、ジエポキシド化合物で架橋された少なくとも３個の４級アンモニウム官能基を有する化合物を含むことを特徴とする請求項８記載の毛細管カラム。８．前記架橋４級アンモニウム化合物が、式｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０；ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＯＨＣＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＯＨＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有する化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の毛細管カラム。９．毛細管カラムの製造方法であって、荷電化学官能基を有する内面を有する所定長さの管を用意し；前記荷電化学官能基とのイオン相互作用が可能な架橋有機多価イオン化合物を用意し；前記架橋多価イオン化合物を前記内面と接触させ、それによって、前記内面とイオン的に相互作用する架橋多価化合物層を形成する各工程を含んでなることを特徴とする方法。１０．架橋多価イオン化合物を用意することが、架橋４級アンモニウム化合物を用意することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。１１．架橋４級アンモニウム化合物を用意することが、１分子当たり少なくとも３個のアミン官能基を有する少なくとも１個のアミン化合物を用意し；前記アミン化合物を架橋させて、架橋アミン化合物を用意し；そして前記架橋アミン化合物をアルキル化剤と反応させて、架橋４級アンモニウム化合物を形成させることによって達成されることを特徴とする請求項１０記載の方法。１２．前記アミン化合物が、式 -[(CH₂)_n-CH₂-NH-(CH₂)_n-CH₂-NH-(CH₂)_n-CH₂-NH-]_p- （式中、０≦ｎ≦２０；ｐ≧１である。）を有するアミン類の群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。１３．前記アミン化合物の架橋が、前記アミンのアミン官能基をジエポキシド類、ジアルキルハライド類、ジアシルハライド類およびジスクシンイミド類からなる群から選択された架橋剤と反応させることによって達成されることを特徴とする請求項９記載の方法。１４．前記ジエポキシドが、式官能基からなる群から選択され、およびｎは、１〜２０の整数である）を有する化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。１５．前記架橋４級アンモニウム化合物が、式｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０；ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＨＣＯＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＨＯＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有する化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１記載の方法。１６．前記架橋アミン化合物をアルキル化剤と反応させて架橋４級アンモニウム化合物を形成させることが、前記架橋アミン化合物をアルキルハライドアルキル化剤と反応させることによって達成されることを特徴とする請求項１０記載の方法。１７．毛細管電気泳動によって試料成分の試料組成物を分析するための方法であって、内面、第１の端部及び第２の端部を有してなり前記内面が荷電化学官能基を有する所定長さの毛細管、並びに前記内面上のコーティングであって前記内面の前記荷電化学官能基とのイオン相互作用が可能な架橋有機多価イオン化合物を含んでなるコーティング、を有してなる毛細管電気泳動カラムを用意し；前記第１の端部を陽極貯留槽に浸積し、かつ前記第２の端部を陰極貯留槽に浸積し；前記試料組成物を前記長さの毛細管中に、前記第１の端部又は第２の端部において導入し；そして前記毛細管カラム内部で各試料成分に関して異なる速度で前記試料成分を移動させることができる電場を前記貯留槽にわたり適用する各工程を含んでなることを特徴とする方法。１８．前記試料成分が、ペプチド類、タンパク質類およびアミン類からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７記載の方法。１９．架橋有機多価イオン化合物の前記コーティングが、式｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０；ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＨＣＯＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＨＯＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有する化合物からなる群から選択された架橋４級アンモニウム化合物のコーティングであることを特徴とする請求項１７記載の方法。２０．一般式｛式中、０≦ｎ≦２０；０≦ｙ≦２０；ｐ≧１；Ｘは、式Ｃ１，ＢｒおよびＩを有する官能基からなる群から選択される；Ｚは、式Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキル、−Ｃ⁼⁰−Ｒ₁−Ｃ⁼⁰−および −ＨＣＯＨ−Ｒ₂−Ｏ−Ｒ₃−ＨＯＣＨ（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃はそれぞれ独立に、Ｃ₁−Ｃ₂₀アルキルである）を有する官能基からなる群から選択された有機ラジカルである｝を有する架橋４級アンモニウム化合物を含むことを特徴とする組成物。