JP3113036B2 - ゲル収容毛管カラム、毛管に満たされるゲルの形成方法、試料の分離方法および毛管電気泳動機構 - Google Patents
ゲル収容毛管カラム、毛管に満たされるゲルの形成方法、試料の分離方法および毛管電気泳動機構Info
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Description
に、重合されたゲルを使用しての毛管の充填に関する。
おいて最も広く用いられている技術の一つである。ペプ
チド、タンパク質およびオリゴヌクレオチド(アナライ
ト)のような分子種がこれらを電場の影響下で分離媒質
において異なる速度で泳動させることにより分離され
る。前記分離媒質は緩衝液、または、低い適度の濃度の
アガロースもしくはポリアクリルアミドのような適当な
ゲル化剤とすることができる。ゲル分離媒質が用いられ
る場合、前記アナライトの分離は、該アナライトがゲル
マトリックスによりふるい分けられるように、ある程度
は前記アナライトの分子の大きさに基礎をおく。ある程
度はゲル中のポリマーの濃度に依存する所与の細孔寸法
のゲルを通って小さい分子が大きい分子より迅速に移動
する。
号明細書に毛管電気泳動に好適なゲル構造の記載があ
る。約75μm の内径を有する石英ガラス製毛管がまず
アクリルアミド単量体および他の成分の混合物で満たさ
れ、次いで、前記毛管内での重合が完了する。重合の完
了に要する時間は最少限1時間である。重合されたゲル
の貯蔵期間は限られている。また、使用期間後、ゲルの
性能は低下する。これは、繰り返しの走行の後にゲルマ
トリックス中の高分子が次第に蓄積することによる。適
用された電場は、繰り返し使用した後のポリマー材料を
崩壊させる。従来、ゲル充填の毛管カラムは、その使用
期間後、廃棄されなければならない。
で、数多くの手作業の過程例えばゲルカラム等の端部に
関する緩衝液容器の設置を含む実験室の装備において用
いられてきた。また、使用されたゲルカラムは手作業に
より新しいゲルカラムと交換されなければならない。電
気泳動を行なう際の自動化の利用を図るため、自動化さ
れた電気泳動機構の設計においてできる限り多くの手作
業過程を除去することが考慮されるべきである。
ゲルを使用する内部被覆毛管の充填に向けられている。
毛管壁の内部被覆は毛管壁へのゲルの付着を防ぐ。ゲル
は、該ゲルに損傷を与えることなしにその重合状態で前
記毛管を満たすことができ、かつ、前記ゲルの有用期間
の経過の後に前記毛管から除去され得る混合物である。
毛管は、次いで、新しいゲルで再び満たされる。これ
は、自動毛管電気泳動機構により自動的に取り扱われ
る。
のアクリルアミドおよび緩衝液を含む。さらに、所望の
細孔寸法、分離効率およびゲルの寿命を調整するため、
任意の量の架橋剤(crosslinker )、触媒、開始剤、尿
素、および他の添加剤が加えられる。前記混合物は、ゲ
ルを損傷することなしに内部被覆の毛管に強制的に入れ
られまた毛管から出されるコンシステンシーのゲルに帰
する。
インコーポレーテッドにより導入されたP/ACE (商標)
2000電気泳動機構のような自動毛管電気泳動機構と共に
有利に用いることができる。前記機構は図1に概略的に
示されている。この機構の詳細は米国特許出願第07/61
4,059、07/542,673および07/187,760に記載されてい
る。この機構では、毛管カラム10がカートリッジ12
に入れられ、カートリッジ12は電解質または試料溶液
のバイアル14,16への前記毛管の両端部のアクセス
を許すように支持されている。ここに言う毛管とは、典
型的には1000μm以下、より典型的には 300μm 以下の
内径を有する管を意味する。分離された種を検出するた
めに検出器13が設けられている。前記バイアルは、モ
ータ22,24により前記毛管の両端の位置選択バイア
ルまで回転される円形コンベヤ18,20に保持されて
いる。選択された溶液は、前記毛管の一端を前記バイア
ルに入れかつ図示しない手段による前記バイアルの加圧
により、前記毛管に入れることができる。本発明によれ
ば、重合されたゲルが前記円形コンベヤ上のバイアルに
収容され、溶液で処理されると同様の方法で内部被覆の
石英ガラス製毛管に入れられる。前記毛管の壁は該壁に
前記ゲルが結合することを阻止するために或る物質(例
えば、50%のフェニル基および50%のメチル基を含
む、または、サイノプロピル(cynopropyl))で覆われ
ている。前記した装置は、すすぎ溶液(典型的には緩衝
液または電解質溶液)を前記毛管に通して該毛管をきれ
いにする組込みのリンスモードを有するため、すすぎ溶
液は使用されたゲルを除くために使用することができ
る。カラムすなわち毛管10は次に新しいゲルで再び満
たされる。選択的に、すすぎ溶液を使用することに代え
て、使用ゲルを移動させるために新しいゲルの供給を利
用することができ、これにより、単一の工程で前記毛管
を洗い、再充填する。前記した工程は、ユーザーにより
プログラムを組まれたマイクロプロセッサ30の制御下
で自動的に進めることができる。前記機構からカートリ
ッジ12を取り除きかつ該カートリッジから前記カラム
を取り除くことを含む前記ゲルを入れ代えるために完全
なゲル毛管カラム10を入れ替えることは必要でない。
動または圧力注入によってバイアルから前記毛管の一端
に試料を注入する試料注入モードを有する。電気泳動注
入および電気泳動の実行のために電圧供給源29から所
要の高電圧(毛管の単位cm当りほぼ数百ボルト)を印加
するために電極26,28が設けられている。電気泳動
は、電解質収容バイアルに入れられた毛管の2つの端部
で行なわれる。前記電解質は、前記ゲルが形成されたま
たはゲル(すなわち、ゲル緩衝液機構)の形態にある緩
衝液に似た緩衝溶液の形態にある。後者の場合、前記毛
管内のゲルは他のバイアルにおくことなしに取り代える
ことができる。
な緩衝溶液(通常は、約8.5 のpHの100mM TRISホウ酸
塩)に溶ける6%までのアクリルアミド単量体である。
前記アクリルアミドは、0ないし5%のメチレンビスア
クリルアミド(BIS )で架橋される。7M尿素、親水性
ポリマー添加剤(例えばポリエチレングリコール(PE
G))、適量の触媒(例えば、テトラメチレンエチレン
ジアミン(TEMED ))および開始剤(例えば、過硫酸ア
ンモニウム)、および、他の添加剤が加えられ、所望の
細孔寸法、分離効率および予想寿命を有するゲルを得
る。前記緩衝液およびゲルの準備のための工程は従来通
りであり、当業者に周知である。一般に、前記混合物は
一晩で重合可能であり、重合されたゲルは、必要があれ
ば残留する過硫酸アンモニウム、TEMED 、および、非重
合のアクリルアミドおよびBIS 単量体を除去するために
前記ゲル緩衝液に対して透析または電気透析することが
できる。前記石英ガラス製毛管の被覆内面は前記ゲルの
最初の充填の前に処理することができる。前記表面は、
50℃で1時間、メタクリロキシプロピルトリメトキシ
シランの100%溶液を使用することにより処理するこ
とができる。希釈溶液(メタノールで希釈された)もま
た使用することができる。前記シランは、被膜内のわず
かな欠陥のために露出シリカの結果として毛管壁に残る
すべての水酸化物イオンを中和するためにある。水酸化
物イオンの存在は、これが電気浸透を増大させるとき、
ある適用について好ましくないことがある。
かれたあと直ちに前記毛管を同一または異なる混合物の
新しいゲルで再び満たすことができる。毛管内で重合が
生じる従来のゲルカラムと異なり、一旦前記毛管が重合
ゲルで満たされると、本発明においては重合が生じるこ
とを待つ必要がない。これは、自動電気泳動機構の自動
化の特徴を補足し、また、ゲルカラムの変化時間を待つ
ことを除去する。
アクリルアミドまたは2%までのアクリルアミド+5%
の架橋剤、1%までの濃度における35,000までの分子量
のPEG が添加剤である。高濃度のポリアクリルアミドお
よび架橋剤を有するゲルは脆すぎるため、重合状態で前
記ゲルに損傷を与えることなしに前記毛管を満たすこと
はできない。しかし、6%以上のアクリルアミドを有す
るゲルは特別な注入条件下でその完全な状態を維持する
と考えられる。従来のゲル充填毛管カラムは、前記毛管
への前記ゲルの結合を阻止する内部被覆を有しないた
め、使用されたゲルは、該ゲルが前記毛管の壁に結合す
るとき、前記毛管から効果的に押し出すことができな
い。架橋剤のないアクリルアミドの約6%を越える濃度
では、前記ゲルの再充填可能性すなわち粘度を維持する
ためにPEG 濃度および分子量の適当な増大が必要であ
る。同様に、5%のBIS 単量体および2%以上のアクリ
ルアミド単量体を有する混合物において、前記PEG 濃度
および分子量が増大することが見出された。
得るものであることが見出された本発明に従う再充填可
能のゲルの特定の混合物の例が以下に示されている。次
の実施例は説明を目的としてのみ示され、本発明を定義
または制限するものではない。実施例1 100 mM TRIS 100 mM 硼酸 3% T 0.5% C 2 mM EDTA (ポリヌクレオチドの分離のため) 8.35 pH実施例2 100 mM TRIS 100 mM 硼酸 1% T 5% C 2 mM EDTA (ポリヌクレオチドの分離のため) 8.35 pH
ける前記アクリルアミドおよび架橋剤の濃度は%Tおよび
%Cで示されている。%Tおよび%Cの定義は次のとおりであ
る。 %T=(mg アクリルアミド+mg 架橋剤)×100 /(ml
緩衝液の体積) %C=(mg 架橋剤)×100 /(mg アクリルアミド+mg
架橋剤)
は、ポリアクリルアミドゲルの細孔寸法および細孔分布
を決定する。既定の実施例において、実施例1では2.98
5%のアクリルアミドおよび0.015%の架橋剤(BIS )が存
在し、また、実施例2では0.95% のアクリルアミドおよ
び0.05% の架橋剤が存在する。所望であれば、実施例1
において前記架橋剤を除くことができる。
は図2のエレクトロフェログラム(electropherogram)
により示されている。電気泳動を受ける試料はφ-X 174
RFDNA-Hae III Digest混合物である。前記毛管カラム
は、前記毛管壁へのゲルの結合を阻止するための内部被
覆(例えばOV-17 )を有する。前記毛管の寸法は、100
μm の内径で、40cmの有効長さを有する全長47cmであ
る。前記ゲルは重合され、次に、前記P/ACE (商標)20
00機構の洗浄モードを使用することにより前記毛管に注
入される。前記試料は1 mg/ml の濃度であって5 KVを2
秒間印加することにより前記ゲルカラムへ電気泳動によ
り注入される。電気泳動は12KVおよび33μA下で行なわ
れる。
ゲルを有する同じ混合物を有するゲルカラム内で分離さ
れた同じ試料のエレクトロフェログラムを表わす図3に
示す結果と比較することができる。試料の注入および走
行パラメータは同一である。2つのエレクトロフェログ
ラムのピークの変化は極めて類似している。前記2つの
結果の間の大きさにわずかな違いはあるが、それは定量
分析ではないのでゲル電気泳動分析の目的のためのピー
ク分析能ほどには重要ではない。
たゲルカラムが、毛管内で重合された同様のゲルと比較
して、実質的に同じ分離効率、パワーおよび分析能を与
えることは明らかである。前記ゲルは、これがその重合
状態で前記被覆された毛管に強制的に入れられるときに
損傷を受けず、これにより、その分離性能を維持する。
再び満たすことが可能である前記ゲルは、新しいゲルの
入れ代え作業を自動的に行なうことができる自動電気泳
動機構において有利に用いることができる。走行の間の
ゲルの変化を含む一連の走行は、ユーザーの介在なしに
自動的に行なわれるようにプラグラムに組むことができ
る。
ルを使用する電気泳動の結果を示すエレクトロフェログ
ラムである。
の結果を示すエレクトロフェログラムである。
Claims (24)
- 【請求項1】 電気泳動に有用なゲル収容毛管カラムで
あって、ゲルの結合を阻止する性質を有する物質で覆わ
れた内腔を有する毛管と、前記内腔を満たす重合のゲル
であってゲル構造に実質的な損傷を与えることなしに前
記内腔を強制的に満たすことが可能である混合物を有す
るゲルとを含む、毛管カラム。 - 【請求項2】 前記ゲルは6%までのアクリルアミド
と、0−5%の架橋剤とを含む、請求項(1)に記載の
毛管カラム。 - 【請求項3】 前記架橋剤はメチレンビスアクリルアミ
ドを含む、請求項(2)に記載の毛管カラム。 - 【請求項4】 前記被覆物質はフェニル基およびメチル
基、または、サイノプロピルを含む、請求項(3)に記
載の毛管カラム。 - 【請求項5】 毛管に満たされるゲルの形成方法であっ
て、毛管を用意すること、重合可能の単量体を用意する
こと、前記単量体を重合してゲルにすること、および、
前記毛管を前記ゲルで満たすことを含む、ゲルの形成方
法。 - 【請求項6】 さらに、前記ゲルの結合を阻止する性質
を有する物質で前記毛管の内面を覆うことを含む、請求
項(5)に記載の方法。 - 【請求項7】 前記単量体はアクリルアミドであり、ま
た、前記ゲルは6%までのアクリルアミドと0−5%の
架橋剤とを含む混合物を有する、請求項(6)に記載の
方法。 - 【請求項8】 前記架橋剤はメチレンビスアクリルアミ
ドを含む、請求項(7)に記載の方法。 - 【請求項9】 試料をその分子種に分離する方法であっ
て、毛管を用意すること、重合可能の単量体を用意する
こと、前記単量体を重合して電気泳動に有用なゲルにす
ること、前記ゲルで前記毛管を満たし、満たされた毛管
に試料を導入すること、および、前記試料に電気泳動を
実行し、前記試料を分離してその分子種にすることを含
む、試料の分離方法。 - 【請求項10】 さらに、電気泳動後に前記毛管から前
記ゲルを除去すること、および、重合されたゲルで前記
毛管を再び満たすことを含む、請求項(9)に記載の方
法。 - 【請求項11】 前記除去および再充填工程が、前記毛
管内の初めのゲルにとって代わる重合ゲルを用いること
により、同時に行なわれる、請求項(10)に記載の方
法。 - 【請求項12】 さらに、前記ゲルの結合を阻止する性
質を有する物質で前記毛管の内面を被覆することを含
む、請求項(9)に記載の方法。 - 【請求項13】 前記ゲルは6%までのアクリルアミド
と、0−5%の架橋剤とを含む、請求項(12)に記載
の方法。 - 【請求項14】 毛管と、前記毛管の端部に連絡するよ
うに配置された、重合されたゲルの供給源と、試料の供
給源と、前記ゲルを前記毛管に満たしかつ試料を前記毛
管に導入するための手段と、電気泳動を実行するための
手段とを含む、毛管電気泳動機構。 - 【請求項15】 さらに、前記毛管をゲルで再び満たす
ことができるように前記毛管から前記ゲルを除去するた
めの手段を含む、請求項(14)に記載の機構。 - 【請求項16】 さらに、前記機構の操作の自動制御手
段を含む、請求項(15)に記載の機構。 - 【請求項17】 前記ゲルおよび試料はそれぞれ容器に
収容され、また、前記機構は、さらに、前記容器を支持
するための円形コンベヤと、各容器を前記毛管と連通す
る位置まで回転させるための手段とを含む、請求項(1
4)に記載の機構。 - 【請求項18】 前記毛管を満たしかつ前記試料を導入
するための手段は、ゲルの充填および試料の導入を行な
うために前記容器を加圧するための手段を含む、請求項
(17)に記載の機構。 - 【請求項19】 さらに、前記機構の操作の自動制御手
段を含む、請求項(18)に記載の機構。 - 【請求項20】 前記自動制御手段は、前記容器から前
記毛管にゲルを満たすことにより前記毛管に初めにあっ
たゲルを移動させるようにプログラムが組まれている、
請求項(19)に記載の機構。 - 【請求項21】 さらに、前記試料の電気泳動で分離さ
れた成分を分析するための手段を含む、請求項(20)
に記載の機構。 - 【請求項22】 さらに、前記毛管を支持するためのカ
ートリッジを含む、請求項(21)に記載の機構。 - 【請求項23】 前記毛管は、その内壁に前記ゲルが結
合することを防ぐ物質で被覆された内壁を有する、請求
項(14)に記載の機構。 - 【請求項24】 前記ゲルは6%までのアクリルアミド
と、0−5%の架橋剤とを含む、請求項(23)に記載
の機構。
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