JPH08508577A - 被覆毛細管カラム及びその用途としての電気泳動分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 被覆毛細管カラムと、電気泳動分離において被覆毛細管カラムを使用する方法とが記載されている。前記被覆毛細管カラムは、内面と、相互結合される高分子コーティングとを有するある長さのチューブを含む。前記相互結合される高分子コーティングは、前記内面に共有結合される疎水性の高分子官能基と、この疎水性の高分子官能基に相互結合される親水性ポリマーとを含む。典型的な毛細管カラムは、疎水性の高分子官能基を有するＳｉ−ＯＨ反応コンパウンドを毛細管カラムの内面上のＳｉ−ＯＨ官能基と反応させることによって準備される。それから、親水性モノマーを前記疎水性の高分子官能基と接触して重合させると、親水性ポリマーと疎水性ポリマーとの相互結合したコーティングを形成する。

Description

【発明の詳細な説明】 被覆毛細管カラム及びその用途としての電気泳動分離方法 発明の背景 発明の分野 本発明は、一般に、内面コーティング（被覆）を有する毛細管カラム及びその 用途のための電気泳動分離方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、内壁表面 つまり内面上に中性の親水性の架橋コーティングを有する毛細管カラムに関する 。前記中性の親水性の架橋コーティングは、毛細管カラムの内面と分析物質との 相互作用を減少させ、同時に、酸性コンパウンド及び塩基性コンパウンドの電気 泳動分離中に毛細管カラムの内面を保護する。 関連技術の説明 電気泳動分離技術は、分子の実効電荷の差異及び（又は）分子の分子径の差異 に従って、分子を分離するために長年にわたり利用されている。最近になるまで 、電気泳動分離は、ポリアクリルアミドゲル材料から典型的には作られるゲルス ラブ又はオープンゲルベッド中において実施されていた。さらに最近になって、 毛細管電気泳動技術は分光検出方法と組み合わせられ、分子の自動的な迅速定量 分析を可能とした。異なる実効電荷を有する分子の高分解能分離が、緩衝液を充 填したか又はゲルを充填した細い毛細管チューブに電気泳動原理を適用すること によって達成されている。 典型的には、毛細管電気泳動に使用される毛細管カラムは、25μｍから200μ ｍのオーグの直径と、約10cmから200cmの長さとを有する（種々の）長さのシリ カチューブで作られている。緩衝液及 びゲル分離媒体はカラム内部に直接ポンプで注入され、電気泳動技術を用いて、 ペプチド類やタンパク質類、オリゴヌクレオチド類、核酸類、その他の荷電分子 種を含む多種類の分子を分離する。電気泳動分離技術の分野は、毛細管電気泳動 操作を用いて分離でき、かつ、検出できる分子の種類及び大きさに関して絶えず 拡大している。 毛細管電気泳動と関連した利点は極めて多い。定量的情報は極めて小さい試料 サイズによって得ることができ、消費するゲル又は緩衝液の量は非常に少ない。 さらに、分離に要する時間を極めて短くでき、毛細管電気泳動技術それ自体が自 動化や、電子データ保存、データ操作に適している。毛細管電気泳動が従来のス ラブゲル電気泳動に存在しないある現象に関連していることは重要である。これ らのうちの１つは、電極の１つに向けての緩衝液のバルクフロー（bulk flow） によって特徴づけられる現在よく知られた電気浸透フロー現象である。 電気浸透フローは、シリカ毛細管チューブの表面におけるシラノール官能基類 のイオン化によって発生する。このイオン化の結果、シリカチューブの表面にお いて電気泳動緩衝液中にプロトン層を生成する。電場の存在において、プロトン 層は陰極に向かって移動する流体の陽電荷カラムに類似し、緩衝液媒体の一般的 なバルク移動を引き起こす。電気浸透フローが種々の適用において利用でき、電 気泳動分離を向上させるのは有用である。たとえば、分離されている分子の電気 泳動移動が電気浸透フローの移動とは反対方向にあるとき、正味の効果はカラム 性能の向上と、分離の改善とである。 多くの電気泳動の適用にとって電気浸透フローは好ましくなく、 バルクフローを除き又は実質的に減らすことは好ましい。一般に、電気浸透フロ ーが最小まで減らされるとき、電気泳動の試料成分は電気泳動移動によってのみ 移動し、電気泳動移動は試料成分の分析の再現性と質量回復とを向上する。 電気浸透フローを最小にするか又は制御する１つの方法は、シリカの毛細管チ ューブで作られ、高分子材料で内側を被覆された毛細管カラムを利用することで ある。前記高分子コーティングは、電気泳動カラム内のバルクフローの実質的減 少をとにかく引き起こす表面のシラノールグループのイオン化の程度を除くか、 実質的に減少する。試料成分とコーティングとの間の好ましくない疎水性相互作 用を避けるために、前記高分子コーティングは伝統的に親水性である。親水性の 高分子コーティングに関連する１つの問題は、コーティングの低い物理的保全性 （physical integrity）と、毛細管カラムの表面からの除去ないし移動傾向と、 その結果生ずる短い寿命とである。毛細管チューブの表面に親水性ポリマーを共 有結合することは、コーティングの移動傾向を減らすが、コーティングの物理的 保全性は依然として問題である。 加えて、シリカ毛細管の表面にＳｉ−Ｏ−Ｓｉによって共有結合されるときで も、親水性コーティングは、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ官能基と水性相互作用を促進する。 この結果、好ましくない水解と、前記Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合と、短い寿命とを生ず る。 前述のように、毛細管電気泳動技術に関連する別の問題は、試料成分が毛細管 チューブの壁に、特にシリカチューブの壁に付着する傾向である。これは、反応 性シリカ官能基に容易に吸引される荷電小分子の場合に特に当てはまる。電気泳 動分離媒体中に小ペプチド類及び小アミン類が存在するとき、それらは毛細管壁 と静電的に、 かつ、疎水的に相互作用する。その結果、分離効率の低下となり、誤った分離デ ータを与える好ましくないバンド拡大となる。 電気浸透フローと同様に、試料成分と壁との相互作用の程度を最小にすること ができる電気泳動毛細管を提供することは、全く成功していない。これまで、動 的の二重層コーティングを用いる試みがされていた。これらの二重層コーティン グは安定ではなく、電気泳動過程で使用される運転緩衝液に添加剤を必要とする 。疎水性のコーティングはシリカカラムの前記Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ表面を保護するの に有効であるが、毛細管壁と分析物質との間の好ましくない疎水性相互作用を生 ずる。前述のように、親水性のコーティングは前記Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ表面を保護す るのに有効ではない。 したがって、本発明の目的は、電気泳動分離に有用であり、電気浸透フローを 最少にする新規の被覆毛細管カラムを提供することである。 本発明の別の目的は、試料成分と内部の毛細管壁との間の相互作用を減らすか 、または除く毛細管カラムを提供することである。 本発明のさらに別の目的は、物理的に安定なコーティングを有する毛細管カラ ムを提供することである。 本発明の付加的な目的は、種々の荷電分子の電気泳動分離に有用である毛細管 カラムを提供することである。 発明の概要 本発明は、内面コーティングを有する毛細管カラムを提供することによって先 に確認した目的を満たす。前記内面コーティングは、試料成分と毛細管カラムの 内面との間の相互作用の程度の削除または実質的減少に寄与する。本発明の被覆 毛細管カラムは、電気泳動 分離中の電気浸透フローの程度を最小にするのに付加的に寄与し、これによって バルクフローを除き、電気泳動移動への試料の移動を制限する。本発明の毛細管 カラノ、を都合よく使用すると、アミン類やアミノ酸類、ベプチド類、タンパク 質類を含む、多くの酸性コンパウンド及び塩基性コンパウンドのための向上した 分離が得られる。さらに、ここに記載した高分子コーティングは、かなりの物理 的保全性を有し、高い安定性があり、毛細管カラムの寿命を従来の毛細管カラム よりも実質的に向上させる。 特に、本発明の毛細管カラムは、内面を有するある長さのチューブを含む。前 記内面は高分子の架橋コーティングを有する。この架橋コーティングは、毛細管 チューブの前記内面に共有結合された疎水性の高分子官能基と、この疎水性の高 分子官能基に共重合された親水性ポリマーとを含む。前記毛細管カラムを準備す るのに使用される毛細管チューブはシリカで作られることが好ましく、前記疎水 性の高分子官能基は、前記毛細管の内面のＳｉ−ＯＨ官能基を適当な反応物と反 応させて形成されるＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合によって前記内面に共有結合されること が好ましい。好ましい実施例では、前記疎水性の高分子官能基はポリブタジエン であり、前記親水性ポリマーはポリアクリルアミドである。 本発明の被覆毛細管カラムは、内面と、この内面上のＳｉ−ＯＨ官能基とを有 するある長さのシリカチューブを供給し、Ｓｉ−ＯＨ反応コンパウンドを前記Ｓ ｉ−ＯＨ官能基と反応させることによって準備することができる。適当なＳｉ− ＯＨ反応コンパウンドは、少なくとも１つの中性の疎水性官能基であってこの疎 水性官能基が高分子であり、重合できるモノマーとさらに反応できることが好ま しい疎水性官能基を有するシランコンパウンド及びシロキサンコン パウンドを含む。それから、親水性モノマーを単独重合させ、前記疎水性官能基 と反応させると、親水性ポリマーと疎水性ポリマーとの相互結合された高分子コ ーティングを生ずる。好ましい方法では、前記反応コンパウンドは高分子のポリ ブタジエニルトリエソキシシラン（polybutadienenyl triethoxy silane）であ り、前記親水性モノマーはアクリルアミドである。 さらにここに記載されているのは、本発明の被覆毛細管カラムを準備する方法 及び使用する方法である。さらに詳しくは、本発明に従うと、被覆毛細管カラム を準備する方法は、内面と、この内面上のＳｉ−ＯＨ官能基とを有するある長さ のシリカチューブを供給すること、高分子の疎水性官能基を有するＳｉ−ＯＨ反 応コンパウンドを前記Ｓｉ−ＯＨ官能基と反応させることを含む。それから、親 水性モノマーを前記疎水性の高分子官能基と接触して重合させると、親水性ポリ マーと疎水性ポリマーとの相互結合された高分子網目（polymeric network）を 生ずる。この相互結合された高分子網目は高い物理的保全性と、延長された寿命 とを有する。 本発明に関連する前記の及び他の利点は、次の図面を参照しての発明の詳細な 説明に記載された発明を理解するとき、当業者に明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 図１は本発明の毛細管電気泳動カラムの断面図で、シリカ毛細管カラムの内面 上の疎水性の架橋ポリマー及び親水性ポリマーのコーティングを示している。 図２は毛細管電気泳動カラムの部分断面図で、本発明の好ましい実施例を示し ている。 図３は、φＸ１７４ＤＮＡのＨａＩＩＩ温浸の電気泳動分離から生じた電気泳 動図である。 図４は、本発明に従って水溶液中のタンパク質の電気泳動分離から生じた電気 泳動図である。 図５は、本発明の模範的な毛細管カラムを使用して得られた電気泳動図の再現 性を示す図である。 図６は、にわとりの卵白中のタンパク質の電気泳動分析から得られた電気泳動 図である。 発明の詳細な説明 本発明は被覆毛細管カラムを提供する。この被覆毛細管カラムは、米国カリフ ォルニア、フラートンのベックマン社（Beckman Instruments，Inc.，Fullerton ,California）によって製作され、かつ、販売されているＰ／ＡＣＥシリーズの 毛細管電気泳動装置のような電気泳動分離装置に特に有用である。さらに詳しく は、本発明の被覆毛細管カラムは、種々の分子種がその電気泳動移動度に基づい て分離される適用における分離媒体として有用である。前記分子種は、塩基性の 薬品及び核酸のような小さいコンパウンドはもちろんのこと、タンパク質及びポ リヌクレオチドのような塩基性の目大分子及び酸性の巨大分子を含む。 ここに記載した被覆毛細管カラムは、電気泳動分離中の電気浸透フローを除く か又は実質的に最小にするのに寄与する。本発明の特長として、被覆毛細管カラ ムを形成するのに使用するコーティング材料は、互いに、かつ、毛細管カラム壁 に共有結合によって結合されるコンパウンドであり、このように相互結合する高 分子網目を形成する。その結果、強められた物理的保全性を有するコーティング を生ずる。前記物理的保全性は、次々に、カラムに長い寿命と、向上した信頼性 と、電気泳動分離操作における正確性とを与える。前記コーティングの強められ た物理的保全性と化学的特性とはまた、異なる分析物質の毛細管カラム壁との相 互作用を妨げる能力を伸ばすのに寄与する。 本発明の被覆毛細管カラムはコーティングに親水性の高分子特性を組み入れ、 試料成分と毛細管カラム壁との間の疎水性の相互作用を実質的に除く。加えて、 本発明の毛細管カラムは、毛細管カラムの内面に共有結合された疎水性官能基を 組み入れる。この疎水性特性は、電気泳動緩衝水溶液環境の毛細管カラムの内面 との相互作用を減らし、毛細管カラム壁からの共有結合されたコーティングの水 解を最少にする。 さらに詳しくは、図１に示した毛細管カラムの典型的な長手方向の部分断面図 を参照して、本発明の被覆毛細管カラム１０は、内面１４を有するある長さの毛 細管チューブ１２で作られる。内面１４は、毛細管チューブ１２の内面１４に共 有結合された疎水性の高分子官能基１６と、疎水性の高分子官能基１６に結合さ れた親水性ポリマー１８とを含む、相互結合された高分子コーティングを有する 。 本発明に使用するのに適する毛細管チューブ１２は、ポリアクリレート、ポリ ビニル、ポリメタクリレート（polymethacrylate）のような有機高分子材料又は シリカや石英を含む無機材料で作ることができる。選定された有機高分子材料又 は無機材料は化学的部分を有するか、又は化学的部分を有するように部分的に変 態されうることが好ましい。前記化学的部分は、穏やかな又は軽い（mild）ｐＨ と温度条件で疎水性官能基を有するコンパウンドと反応する。その結 果、疎水性の高分子官能基１６は毛細管チューブの内面と共有結合される。図１ に示すように、疎水性の高分子官能基１６は、さらに、親水性コンパウンド１８ と反応することができる。親水性コンパウンド１８はポリマーであるか、又は重 合でき、したがって疎水性ポリマーと親水性ポリマーとの架橋網目のコーティン グを提供できるものである。 本発明に有用である毛細管カラムを作るのに好ましい材料は、シリカである。 シリカ毛細管カラムはクロマトグラフィー操作において何十年もの間使用されて おり、最近では電気泳動操作においての有用性が判明している。したがって、前 記毛細管カラムの製造や取扱は、当業者には明らかである思われる。そのため、 ここでは詳細には説明しない。本発明に関して一層詳細に説明するように、シリ カはＳｉ−ＯＨ官能基を有することが有利である。Ｓｉ−ＯＨ官能基は、シロキ サン及び同様に反応性のあるシランのようなコンパウンドと容易に反応する。種 々の異なる化学的置換基を有するシロキサン及びシランは、商業的に広く入手可 能であるため、シリカ毛細管カラムと組み合わせてのそれらの使用は、本発明の 実施に際して特に有利である。 本発明に従うと、疎水性官能基を有し、毛細管チューブの前記内面と共有結合 できる好ましいコンパウンドは、高分子の炭化水素部分を持つシランコンパウン ド又はシロキサンコンパウンドである。そのような炭化水素を含んでいるコンパ ウンドは、選定された親水性モノマー又は親水性ポリマーと反応できることがさ らに好ましい。この付加的な能力は、毛細管カラムの内面への疎水性ポリマーと 親水性ポリマーとの相互結合する網目の形成を可能にする。したがって、好まし い疎水性の高分子炭化水素部分は、ポリブタジエン のような反応性炭化水素である。当業者は、前記炭化水素が親水性ビニルモノマ ーと反応するために反応性ビニル部分を有することを評価するであろう。さらに 、親水性ビニルモノマーは、そのようなビニルを含んでいる炭化水素の存在状態 で重合され、かつ、そのビニルを含んでいる炭化水素と反応して、疎水性の高分 子官能基に共有結合される親水性ポリマーの網目を形成する。前記疎水性の高分 子官能基は、順に、毛細管チューブの前記内面に共有結合される。 このように、本発明の好ましい実施例では、親水性官能基を有するコンパウン ドはビニルを含んでいる親水性モノマーであり、疎水性官能基を有するコンパウ ンドはシラン又はシロキサンであって親水性のビニルモノマーと反応できるポリ ブタジエン部分を保持すべく変態されたシラン又はシロキサンである。当業者は 、ひとたび重合されると、その結果が単独重合され、かつ、共重合された、疎水 性の高分子官能基と親水性の高分子官能基との網目となることを評価するであろ う。その結果生ずる被覆電気泳動毛細管カラムは、毛細管チューブの前記内面に 実質的に減少した量のＳｉ−ＯＨ官能基を有する。このようにして、電界の影響 下にある前記毛細管カラム内の電気浸透フロー又はバルクフローは実質的に除か れる。さらに、前記毛細管カラムの前記内面に結合された疎水性の高分子官能基 は、前記コーティングを共有結合するために形成される共有結合との電気泳動緩 衝液の水性相互作用を減少する。この減少した相互作用は、典型的にはＳｉ−Ｏ −Ｓｉ結合である前記共有結合の水解を除き、毛細管カラムの寿命を増加させる 。最後に、前記コーティングの親水性の高分子部分は、電気泳動分析物質を前記 コーティングの疎水性部分からさえぎり、これによって分析物質の試料成分と 前記コーティング又は毛細管カラムの内面との間の好ましくない疎水性相互作用 を除く。 当業者は、疎水性の炭化水素官能基を有する種々のコンパウンドと、種々の親 水性モノマーコンパウンドとは、本発明を実施するに際して適当であることを評 価するであろう。ポリブタジエン変態されたシラン又はシロキサン（ポリシラン 及びポリシロキサンを含む）に加えて、事実上、ビニルを含む炭化水素変態され たどのようなシラン又はシロキサンも使用できる。特に、広い範囲の分子重量を 有する反応性ポリシロキサン又はポリシランに与えられるポリブタジエン官能基 は有用である。前記分子重量は、200から2,000,000以上にわたっている。分子重 量における制限因子は、ポリブタジエン連鎖の長さである。ポリブタジエン連鎖 は立体障害を引き起こしうるし、シラン又はシロキサンを毛細管カラムの前記内 面に結合することを妨げるかもしれない。前記コンパウンドが反応性ビニル官能 基を有するために、前記コンパウンドは親水性ビニルモノマーと共重合すること ができる。親水性ビニルモノマーは、ヒドロキシチルメタクリレート（hydroxye thylmethacrylate）、ビニルピロリドン（vinylpyrrolidone）、アクリルアミド 、その他のコーティング網目を形成するものを含む。コーティング網目は、疎水 性の炭化水素高分子層と、親水性高分子層の第２の網目とを含む。同様に、アク リル毛細管チューブの内面とエステル交換反応することができ、ビニルの炭化水 素官能基を有するエステルは、同様の網目を形成するために親水性モノマーと共 重合することができる。 再び図１を参照して、本発明の好ましい実施例では、毛細管チューブ１２はシ リカで作られ、特別の分析適用に応じて、長さと直 径とを変更できる。典型的には、前記カラムは約10cmから200cmの長さと、25μ ｍから200μｍの内径との間にある。シリカ毛細管チューブの前記内面は、Ｓｉ ＯＨ部分を有することが有利である。ＳｉＯＨ部分は多くの有機化学官能基及び 無機化学官能基と反応し、共有的に取り付けられるコンパウンドのための反応サ イトを提供する。この反応サイトは毛細管チューブ１２の内面１４にとって好ま しい化学的特性を有する。さらに、本発明の好ましい実施例に従うと、疎水性の 化学的官能基１６はポリブタジエン官能基であり、ポリブタジエン官能基は、シ ロキサンとＳｉＯＨ官能基との反応によって発生したＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合によっ て内面１４に取り付けられている。この好ましい実施例では、親水性ポリマー１ ８はポリアクリルアミドである。ポリアクリルアミドは、適当な開始剤の存在に おいてアクリルアミドモノマーを重合することによって形成されるとき、ポリブ タジエンの残留している自由のビニルグループとさらに共重合し、高分子の架橋 コーティングの形成に寄与する。 毛細管カラムの１つの壁を図式的に示している図２の長手方向の部分断面図は 、好ましい被覆毛細管カラムを示す。さらに詳しくは、本発明の好ましい毛細管 カラム３０のコーティングは、毛細管チューブ３４の内面３８にＳｉ−Ｏ−Ｓｉ 結合３２によって共有結合された高分子の架橋網目である。ポリブタジエンは毛 細管チューブの内面３８に隣接する疎水性コーティング層３６を形成し、ポリア クリルアミドは親水性の外側層４０を形成する。外側層４０は、試料成分と電気 泳動分離に使用される緩衝水溶液との相互作用に利用できる。さらに、前記ポリ アクリルアミドはポリアクリルアミドの種々の長さの間のブリッジとして作用し 、これによってポリマー の架橋網目を形成する。当業者は、前述のコーティングの疎水性特性が緩衝水溶 液と毛細管カラムの内面との相互作用を最小にすることを評価するであろう。さ らに詳しくは、疎水性−親水性の反発が水性媒体と毛細管の内面のコーティング との間の相互作用を排除し、これによってＳｉＯＨ結合の水解を除く。このよう に、高分子のコーティング網目は毛細管チューブの内面に共有的に結合されたま まであり、毛細管カラムの寿命を実質的に伸ばすのに寄与する。 本発明の好ましい被覆毛細管カラムの別の特長は、前記コーティングの親水性 特性である。図１及び図２に示すように、コーティングの親水性部分は電気泳動 分離中に使用される緩衝媒体との相互作用に利用できる。加えて、親水性の高分 子部分はコーティングの疎水性部分と緩衝媒体との間のバッファゾーンとして作 用する。この親水性の高分子バッファはコーティングと電気泳動試料成分との間 の疎水性相互作用を妨げ、毛細管カラムの内面への試料吸収を最少にする。 本発明に従うと、被覆毛細管カラムを準備する方法は、内面を有し、この内面 にＳｉ−ＯＨ官能基を付けたある長さのシリカチューブを供給すること、その後 、シロキサンコンパウンドを前記Ｓｉ−ＯＨ官能基と反応させることを含む。前 記シロキサンコンパウンドは、さらに、中性の重合できる官能基を有するとして 特徴づけられる。前記中性の重合できる官能基は、この重合できる官能基と反応 するモノマーと架橋をつくり又は共重合するための反応サイトを提供する。親水 性モノマーが前記重合できる官能基と共重合するのに利用されるとき、親水性ポ リマーと疎水性ポリマーとの架橋コーティングを生ずる。 前記シロキサンを前記ＳｉＯＨ官能基と反応させるに先立ち、毛細管チューブ の内面を無機酸、無機塩基で順次洗浄し、最後に揮発性の低い有機アルコールで 洗浄することによって、毛細管の内面をまず準備することが好ましい。前記シラ ンを前記ＳｉＯＨ官能基と反応させることは、典型的には、毛細管チューブの前 記内面をポリブタジエニルトリエソキシシラン（polybutadieneyl triethoxy si lane）のような適当なシランコンパウンドと単に接触させることを含む。約10ps iのヘリウムのような圧力下の不活性ガスの使用は、効力を高め、シランが毛細 管チューブの内面と接触するのに必要な時間を短くする。この技術分野で公知の ように、シラン官能基はＳｉＯＨ部分と容易に反応し、Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を形 成する。ひとたびシランコンパウンドが毛細管チューブの内面に固着されると、 親水性のモノマーコンパウンドは共有結合されたシランコンパウンドと接触状態 になる。既に述べたように、親水性のモノマーコンパウンドはその親水性と、共 有結合されたシランコンパウンド上の疎水性官能基と反応する能力とによって特 徴づけられる。好ましい実施例では、前記親水性モノマーはアクリルアミドであ る。アクリルアミドは、ポリブタジエンのビニル官能基と容易に単独重合し、か つ、共重合する。当業者は、アクリルアミドをポリブタジエンで利用できるビニ ル官能基と反応させる条件では、アクリルアミドを重合するために、この技術分 野で公知の標準の重合化学技術を適用することと思われる。 本発明の最も好ましい実施例では、前記重合過程中に形成された前記ポリアク リルアミドは、さらに、前記コーティング材料の物理的保全性を強めるために架 橋される。前記重合過程中にＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドのよう なジビニルモノマーの使用 を含む標準の架橋方法論が利用できる。別の架橋方法は、後重合の架橋過程にお いてホルムアルデヒドを利用することを含む。ホルムアルデヒドの２つのアルデ ヒドプロトンがアクリルアミドプロトンと反応するのに利用できる。反応したア クリルアミドプロトンがポリアクリルアミドの異なるストランドに置かれるとき 、それらは架橋される。当業者はアクリルアミドを架橋するための技術を適用す ると思われる。加えて、架橋のための条件の例は実施例の形態で以下に与えられ ている。 親水性モノマーの単独重合と、親水性モノマーの疎水性の高分子官能基との共 反応に続いて、過剰のポリアクリルアミドとアクリルアミドとを毛細管カラムの 内部から圧力下の水洗を使用して除去する。その後、被覆毛細管カラムは種々の 電気泳動分離に使用される。 本発明の被覆毛細管カラムは容易に形成でき、どのような毛細管電気泳動装置 の使用にも適合できる。さらに、その使用には特別の取扱操作は必要ではなく、 典型的な電気泳動技術がその使用に適用される。したがって、標準の毛細管電気 泳動装置にひとたび配置されると、本発明の毛細管カラムは、毛細管電気泳動に よって試料成分のための試料組成を分析する方法に使用できる。本発明に従うと 、前記方法は、典型的には、被覆毛細管カラムの第１の端部を陽極リザーバにつ けること、被覆毛細管カラムの第２の端部を陰極リザーバにつけることを含む。 それから、被覆毛細管カラムの一方の端部でその内部に試料成分を導き、前記リ ザーバを横切って電界を加えると、毛細管カラム内で試料成分が特異的に移動す る。適当な検出器、たとえば紫外線可視の検出器又はけい光検出器を被覆毛細管 カラムの少なくとも一方の端部に適当に配置するとき、分離され た試料成分が検出され、電気泳動図が発生する。 本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、説明のために提供するもので、 発明を制限することを意図しない次の例を参照して一層容易に理解できるであろ う。 例１ 次に説明するのは、電気泳動操作に使用ための本発明の被覆毛細管カラムの準 備のための典型的な（複数の）第１過程である。これら第１過程は、毛細管カラ ムの内面を準備すること、この準備された内面に変態された疎水性のポリブタジ エン官能基を共有的に結合することを含む。 ６５ｃｍの長さと５０μｍの直径とを有する（アリゾナ、フェニックスのポリ ミクロン社（Polymicron of Phoenix，AZ）から入手できる）融解石英の毛細管 チューブを、１ＮのＨＣｌ溶液で１５分間内面を洗浄することによって準備した 。洗浄作用はＨＣｌ溶液を毛細管チューブにポンプで供給することによって行わ れた。次に、ＨＣｌ溶液を毛細管チューブから除去し、同様の方法で内面を１Ｎ のＮａＯＨ溶液で１５分間洗浄した。最後に、ＮａＯＨ溶液を除去した後、毛細 管チューブの内部をメタノールで１５分間洗浄した。 残留メタノール溶液を毛細管チューブから除去した後、前記準備した毛細管チ ューブを、トリエソキシジリル（triethoxysilyl）で変態されたポリブタジエン （トルエン中の５０％のポリブタジエニルトリエソキシシランをニュージャージ ー、ピスカタウェイのハルスアメリカ社（HulsAmerica，Inc．Piscataway，New Jersey）から購入した）の５０％トルエン溶液で洗浄した。前記ポリブタジエニ ルトリエソキシシランは高分子コンパウンドであり、高分子ポリブタジ エンに結合された多反応性のトリエソキシシラン官能基を有する。この技術分野 において公知のように、ポリブタジエン官能基は、ビニル重合条件下で反応する ペンダント（pendant）ビニル基を有する。前記ポリブタジエニルトリエソキシ シラン溶液は、分子重量の指標である２５−５０センチストークスの粘度を有し ていた。 前記洗浄過程を３０分間実施した。その後、毛細管チューブの２つの開口端部 はシリコンのプラグでふたをした。ふたをした毛細管チューブを２４時間待機し た。 例２ 次の例は本発明の被覆毛細管カラムを準備する最後の過程を示している。一般 に、この被覆毛細管カラムを準備することは、例１に記載したように、準備した 毛細管カラムの内面に結合された前記ポリブタジエンを利用すること、結合され たポリブタジエンの存在において線状ポリアクリルアミドを合成することを含む 。その結果、結合された疎水性ポリブタジエンのコーティングを取り囲む親水性 の線状ポリアクリルアミドの層を生ずる。 例１に記載した毛細管カラムに結合された前記ポリブタジエンを準備した。そ れから、２４時間の熟成期間に続いて、前記ポリブタジエンを結合した毛細管チ ューブをトルエンで３０分間洗浄した。３０分後、残留トルエンを除去し、毛細 管チューブをメタノールで１５分間洗浄した。次に、アクリルアミドの５％水溶 液（カリフォルニア、アーバインのアイシ−エヌバイオメディカル社（ICN Biom edical，Inc.，Irvine，CA）から入手できる）を準備した。前記水溶液は、この 水溶液中の酸素含量を減らすために１００ｍｂａｒの真空下で３０分間ガス抜き した。前記５重量％のアクリ ルアミド溶液のガス抜きと同時に、関連のない１００Ｍｌの水をこの水中にヘリ ウムを泡立てることによって脱酸素し、酸素含量を最初の酸素含量の１０％以下 に減らした。前記５重量％のアクリルアミドの水溶液を真空から除去する３分前 に、１０重量％のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ） （アイシーエヌバイオメディカル社から購入）の溶液と、１０重量％の過硫酸ア ンモニウム（ＡＰＳ）（アイシーエヌバイオメディカラ社から購入）の溶液とを 準備するために前記脱酸素した水を利用した。 その後ただちに、前記１０重量％のＴＥＭＥＤ溶液の１０μＬと、前記１０重 量％のＡＰＳ溶液の１０μＬとを前記ガス抜きしたアクリルアミド溶液の２Ｍｌ に加えて重合混合物を形成した。この重合混合物を、前記ポリブタジエンを結合 した毛細管チューブに１０ｐｓｉのヘリウム圧力を使用して注入した。３分の反 応時間の次に、前記１０ｐｓｉのヘリウム圧力を除去し、その２分後、前記毛細 管チューブの２つの端部にキャップを被せ、毛細管チューブを２４時間の待機と した。次に、端部のキャップを外し、前記ポリブタジエンと反応しない残留ポリ アクリルアミドと、残留アクリルアミドとを１００ｐｓｉの水圧を使用して前記 毛細管カラムの内部から排出した。その結果、前記結合されたポリブタジエン上 に残留ビニル基と共反応した線状のポリアクリルアミドの薄い層が生じた。前述 の手順によって準備された被覆毛細管カラムは、毛細管電気泳動分離にただちに 使用できた。 例３ 次の例は、本発明の変更した被覆毛細管カラムを準備する手順を示している。 以下に記載する被覆毛細管カラムは、例２に記載した 被覆毛細管カラムとは、前記コーティングの親水性部分が架橋ポリアクリルアミ ドである点で異なる。前記架橋ポリアクリルアミドは、強められた物理的保全性 とその結果のより長い寿命とを備えるコーティングを提供する。 この変更したコーティングを準備するために、例１に記載した前記ポリブタジ エンを結合した毛細管カラムを準備した。それから、前記２４時間の熟成期間の 次に、前記ポリブタジエンを結合した毛細管チューブをトルエンで３０分間洗浄 した。３０分後、残留トルエンを除去し、毛細管チューブをメタノールで１５分 間洗浄した。その後、５重量％のアクリルアミドの水溶液を準備し、例２に記載 したようにガス抜きした。十分のＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを 前記ガス抜きした５重量％のアクリルアミド溶液に加えて１重量％のＮ，Ｎ’− メチレン−ビス−アクリルアミドの溶液を作った。その後、１０重量％のＴＥＭ ＥＤ水溶液と１０重量％のＡＰＳ水溶液とを例２に記載したように準備した。前 記ＴＥＭＥＤ溶液の１０μＬ及び前記ＡＰＳ溶液の１０μＬを、前記アクリルア ミド及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミド溶液の２ｍＬに加えて重合 溶液を準備した。この重合溶液を、ヘリウムの１０ｐｓｉの圧力で２分間加圧し 、続いてヘリウムの圧力をＯｐｓｉに減らし、例１に記載したように準備した毛 細管カラムに接触させた。４分経過してから、前記重合溶液を同じ条件で同じ時 間２回目の加圧をした。この操作を付加的に４回繰り返し、毛細管カラムを、次 のサイクルの次に２回蒸留し、かつ、イオン化した水で洗浄した。その結果、毛 細管カラムの内面にＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合によって共有結合されたポリブタジエン の層と、前記ポリブタジエンの残留ビニル基と付加的に反応された架橋ポリアク リルアミドの網目と を含むコーティングが毛細管カラムに生じた。前記コーティングは前記毛細管チ ューブの内面にしっかり付着し、前記架橋網目によって物理的保全性をさらに強 めた。 例４ 次の例は、本発明の第２の変更した被覆毛細管カラムを準備する手順を示して いる。以下に説明する被覆毛細管カラムは、例２に記載した被覆毛細管カラムと は、前記コーティングの親水性部分が架橋ポリアクリルアミドである点で異なる 。さらに、例３に記載した被覆毛細管カラムとは、前記架橋ポリアクリルアミド が異なる架橋試薬及び手順を利用して形成されている点で異なる。前記架橋ポリ アクリルアミドは、強められた物理的保全性とその結果のより長い寿命とを備え る前記コーティングを提供する。 この変更したコーティングを準備するために、例１に記載した前記ポリブタジ エンを結合した毛細管カラムを準備した。それから、前記２４時間の熟成期間の 次に、前記ポリブタジエンを結合した毛細管チューブをトルエンで３０分間洗浄 した。３０分後、残留トルエンを除去し、毛細管チューブをメタノールで１５分 間洗浄した。その後、５重量％のアクリルアミドの水溶液を準備し、例２に記載 したようにガス抜きした。前記ＴＥＭＥＤ及びＡＰＳの溶液と、前記重合溶液と を例２に記載したように準備した。これら溶液を準備した後、前記重合溶液を、 例１に記載したように準備した毛細管カラムに、例２に記載したのと同じ条件で 注入した。線状ポリマーを形成するために重合された前記アクリルアミドと、ポ リブタジエンと反応しない残留ポリアクリルアミドと、過剰のアクリルアミドと を前記毛細管カラムから除去した後、被覆毛細管カラムを、 ２％１ＮのＮａＯＨを有する３７％ホルムアルデヒド溶液に満たした。このホル ムアルデヒド溶液は２４時間毛細管カラム内で待機した。その後、毛細管カラム を２回蒸留した水で洗浄した。その結果生じた被覆毛細管カラムは、多くの異な るタイプのコンパウンドの電気泳動分離に適していた。 例５ 次の例は、本発明の被覆毛細管カラムの典型的な適用を示す。特に、以下に述 べるように、本発明の被覆毛細管カラムは、核酸のように荷電小粒子の分離に有 用である。 ３０／３７ｃｍ（３７ｃｍの全体長さと３０ｃｍのｕｖウインド）の例２に記 載したように準備した被覆毛細管カラムを、前記Ｐ／ＡＣＥ毛細管電気泳動装置 （前記ベックマン社製）に配置した。前記毛細管カラムを、５０ｍＭのトリ−Ｈ Ｃｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡ中に３％のアクリルアミドを含んだ緩衝液で満たした 。ＨａＩＩＩで温浸されたφＸ１７４ＤＮＡ（２００μｇ／ｍＬＤＮＡ）溶液で あってオレンジＧの内標準を含んでいるＤＮＡ溶液の試料を、１０秒間０．５ｐ ｓｉの圧力注入を使用して毛細管カラムの一方の端部に注入し、２００Ｖ／ｃｍ または７．４ｋＶを２０℃の温度で電気泳動装置のリザーバを横切って印加した 。分離した塩基性ＤＮＡフラグメントをｕｖ検出器によって２５４ｎｍにおいて 検出した。図３は２０分未満の移動の後得られた電気泳動図を示している。ＤＮ Ａフラグメントのそれぞれを、基準線分離によって他のＤＮＡフラグメントから 次の移動順序で分離した。第１ピーク：内標準オレンジＧ；第２ピーク：７２塩 基対ＤＮＡフラグメント；第３ピーク：１８８塩基対；第４ピーク：１９４塩 基対；第５ピーク：２３４塩基対；第６ピーク：２７１塩基対；第７ピーク：２ ８１塩基対；第８ピーク：３１０塩基対；第９ピーク：６０３塩基対；第１０ピ ーク：８７２塩基対；第１１ピーク：１０７８塩基対；第１２ピーク：１３５３ 塩基対。 例６ 次の例は、本発明の被覆毛細管カラムのための典型的な適用である。特に、以 下に述べ、かつ、図４に示すように、本発明の被覆毛細管カラムはタンパク質の 分離に有用である。内標準（ヒスタミン）、リゾチーム、シトクロムＣ、リボヌ クレアーゼＡのそれぞれ１ｍｇ／ｍＬを含む水溶液を準備し、例４に記載した手 順にしたがって準備した２０／２７ｃｍの被覆毛細管カラムを前記Ｐ／ＡＣＥ毛 細管電気泳動装置に配置した。毛細管カラムを２０ｍＭのＭＥＳ（ミズーリ、セ ントルイスのシグマケミカル社（Sigma Chemica1，St．Louis，MO）から購入し た緩衝液）と、ｐＨ６．０に調節された２０ｍＭのシトラート緩衝液とで充填し た。タンパク質の水溶液の試料を２秒間０．５ｐｓｉの圧力注入を使用して前記 毛細管カラムの一方の端部に注入し、５００Ｖ／ｃｍを２５℃の温度で電気泳動 リザーバを横切って印加した。分離したタンパク質をｕｂ検出器によって２１４ ｎｍにおいて検出した。図４は１２分未満の移動の後得られた電気泳動図を示し ている。タンパク質のそれぞれを基準線分離によって他のタンパク質から分離し た。この場合の移動順序は電気泳動図の左から右へ内標準（ヒスチジン）、リゾ チーム、シトクロームＣ、リボヌクレアーゼである。 例７ 本発明の被覆毛細管カラムを使用する検定の多様性や長期使用の安定性、再現 性を証明するために、例５で実行されたタンパク質検定を２１０回繰り返した。 繰り返しの検定のそれぞれのために各タンパク質の電気泳動移動時間を検出した 。この再現性の結果を図５に示してある。内標準（ヒスタミン）の移動時間の再 現性をライン１（移動時間１．９９分）で示してあり、リゾチームの移動時間の 再現性をライン２（移動時間４．６分）で示してあり、シトクロムＣの移動時間 の再現性をライン３（移動時間５．７７分）で示してあり、リボヌクレアーゼの 移動時間の再現性をライン４（移動時間９．７３分）で示してある。 繰り返しのヒスタミン検定、リゾチーム検定、シトクロムＣ検定、及びリボヌ クレアーゼ検定のための相対標準偏差はそれぞれ０．７４％、１．０８％、１． １２％、１．６３％である。これらデータは、本発明の典型的な毛細管カラムの すぐれた物理的安定性と長期の使用特性とを証明している。 例８ 次の例は、本発明の典型的な毛細管カラムのさらに別の適用を示している。特 に、例４に記載した手順にしたがって準備した毛細管カラムをにわとりの卵白内 のタンパク質を分離するのに使用した。検定条件と試料濃度とは例５に記載した ものと同じである。検定の結果は図６に示してある。移動時間５．４６における ピークはリゾチーム、５．８９におけるピークはコンアルブミン、７．１８にお けるピークはオボアルブミンである。 本発明は特別の実施例に関連して説明したけれども、さらに別の 変更も可能である。この出願は、一般に、本発明の原理に従うどのような修正、 使用又は適用をも含むことを意図している。さらに、発明が属する技術分野内の 公知の又は通例の実施となり、かつ、先に説明し、請求の範囲に記載した本質的 特徴に付加されるような本発明の出発を含むどのような修正、使用又は適用をも 含むことを意図している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料成分の電気泳動分離のための毛細管カラムであって、 内面を有するある長さのチューブを備え、前記内面は相互結合される高分 子コーティングを有し、この相互結合される高分子コーティングは、前記内面に 共有結合される疎水性の高分子官能基と、この疎水性の高分子官能基と共重合さ れる親水性ポリマーとを備える、毛細管カラム。 ２ 前記チューブはシリカで作られ、前記疎水性の高分子官能基はＳｉ−Ｏ− Ｓｉ結合によって前記内面に共有結合されている、請求項１に記載の毛細管カラ ム。 ３ 前記疎水性の高分子官能基はポリブタジエンである、請求項１に記載の毛 細管カラム。 ４ 前記親水性ポリマーはポリアクリルアミドである、請求項１に記載の毛細 管カラム。 ５ 前記ポリアクリルアミドは架橋されている、請求項４に記載の毛細管カラ ム。 ６ 試料成分の電気泳動分離のための毛細管カラムであって、 内面を有するある長さのチューブを備え、前記内面は相互結合される高分 子コーティングを有し、この相互結合される高分子コーティングは、前記内面に 共有結合されるポリブタジエン官能基 と、このポリブタジエン官能基と共重合されるポリアクリルアミドとを備える、 毛細管カラム。 ７ 前記チューブはシリカで作られ、前記ポリブタジエン官能基はＳｉ−Ｏ− Ｓｉ結合によって前記内面に共有結合されている、請求項６に記載の毛細管カラ ム。 ８ 前記ポリブタジエン官能基は、ポリブタジエニルトリエソキシシランを前 記シリカのＳｉ−ＯＨと反応させることによって前記内面に共有結合されている 、請求項７に記載の毛細管カラム。 ９ 前記ポリアクリルアミドは架橋されている、請求項６に記載の毛細管カラ ム。 １０ 毛細管カラムを準備する方法であって、 内面とこの内面上のＳｉ−ＯＨ官能基とを有するある長さのシリカチュー ブを供給すること、 疎水性の高分子官能基を有するＳｉ−ＯＨ反応コンパウンドを前記Ｓｉ− ＯＨ官能基と反応させること、 親水性モノマーを前記疎水性の高分子官能基と接触させて重合させ、これ によって親水性ポリマーと疎水性ポリマーとの相互結合する高分子網目を形成す ることを含む、毛細管カラムを準備する方法。 １１ 前記Ｓｉ−ＯＨ反応コンパウンドはポリブタジエニルトリエソキシシラン である、請求項１０に記載の毛細管カラムを準備する 方法。 １２ 前記親水性モノマーはアクリルアミドである、請求項１０に記載の毛細管 カラムを準備する方法。 １３ 前記親水性ポリマーを架橋することを含む、請求項１０に記載の毛細管カ ラムを準備する方法。 １４ Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドの存在において前記アクリル アミドを重合し、これによって架橋ポリアクリルアミドを形成ることを含む、請 求項１２に記載の毛細管カラムを準備する方法。 １５ 前記重合されたアクリルアミドをホルムアルデヒドと接触させ、これによ って架橋ポリアクリルアミドを形成することを含む、請求項１２に記載の毛細管 カラムを準備する方法。 １６ 毛細管電気泳動によって試料成分の試料組成を分析する方法であって、 毛細管電気泳動カラムを供給することであって、内面を有するある長さの チューブを備え、前記内面は相互結合される高分子コーティングを有し、この相 互結合される高分子コーティングは、前記内面に共有結合される疎水性の高分子 官能基と、この疎水性の高分子官能基と共重合される親水性ポリマーとを備える 毛細管電気泳動カラムを供給すること、 第１の端部を陽極リザーバに浸し、かつ、第２の端部を陰極 リザーバに浸すこと、 前記試料成分を前記第１の端部または第２の端部で前記毛細管カラム内に 導くこと、 前記リザーバを横切って電界を印加することを含み、前記電界は、前記毛 細管カラム内の各試料成分に関して異なる速度で前記試料成分を移動させること ができる、試料成分の試料組成を分析する方法。 １７ 前記試料成分は塩基性コンパウンド及び酸性コンパウンドからなるグルー プから選定される、請求項１６に記載の試料成分の試料組成を分析する方法。 １８ 前記チューブはシリカで作られ、前記疎水性の高分子官能基はＳｉ−Ｏ− Ｓｉ結合によって前記内面に共有結合されている、請求項１７に記載の試料成分 の試料組成を分析する方法。 １９ 前記疎水性の高分子官能基はポリブタジエンである、請求項１６に記載の 試料成分の試料組成を分析する方法。 ２０ 前記親水性ポリマーはポリアクリルアミドである、請求項１６に記載の試 料成分の試料組成を分析する方法。