DE69605569T2

DE69605569T2 - Neue polyacrylamid matrizen für elektrophorese und chromatographie

Info

Publication number: DE69605569T2
Application number: DE69605569T
Authority: DE
Inventors: Pier Giorgio Righetti
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-14
Publication date: 2000-04-27
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: EP0856015A2; CA2235274A1; JPH11515017A; CA2235274C; IT1276957B1; DE856015T1; ITMI952144A0; EP0856015B1; ITMI952144A1; WO1997016462A2; DE69605569D1; WO1997016462A3; AU7292296A; JP3811188B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polyacrylamid- Matrices mit den folgenden Eigenschaften:
a) extreme Beständigkeit gegen alkalische Hydrolyse;
b) gute Beständigkeit gegen saure Hydrolyse;
c) hohe Hydrophilie, die hydrophobe Wechselwirkung mit Makromolekülen verhindert;
d) größere Porosität (entweder durch Verwendung von Monomeren mit höherer Molekülmasse oder Verwendung von lateral aggregierenden Agenzien)
Matrices mit den obigen Eigenschaften werden erfindungsgemäß durch Polymerisation oder Copolymerisation von N-mono- oder N-disubstituierten Acrylamiden gemäß Verfahren, die von der vorliegeäden Erfindung umfasst werden, erhalten. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Matrices, die aus Gemischen von Polymeren (oder Copolymeren) der obigen Acrylamid-Monomere oder aus Gemischen der Polymere oder Copolymere mit Agarose erhalten werden.
Außerdem sind die folgenden Aufgaben in der vorliegenden Erfindung beschrieben:
a) die neue Herstellung von Monomeren (insbesondere 3-(N- Acryloyl)-amino-1-propanol, AAP, und 4-(N-Acryloyl) - amino-1-butanol, AAB) bei Temperaturen unter Null in aprotischen Lösungsmitteln und in sehr hohen Ausbeuten (> 98%) und gleichzeitig sehr hoher Produktreinheit (> 98%);
b) ein neues Verfahren zur Herstellung von kurzkettigem Poly(AAP) und Poly(AAB), wobei Kettenübertragungsmittel (z. B. Isopropanol) und hohe Temperaturen verwendet werden;
c) ein neues Verfahren zur Beschichtung von Quarzglaskapillaren, umfassend das Ersetzen des bifunktionellen Mittels Bindesilan durch das Reagenz Acryloylchlorid, das als Verankerungsmittel für Poly(AAP)- [oder Poly(AAB)-] Ketten an der Kapillarwand dient.
Polyacrylamid-Matrices für Trennungen mittels Zonenelektrophorese wurden bereit 1959 von Raymond und Weintraub (Science 130, 1959, 711-712) eingeführt und anschließend von Davis (Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 1964, 404-427), Ornstein (Ann. N. Y. Acad. Sci. 121, 1964, 321-349) und Hjerten (J. Chromatogr. 11, 1963, 66-70) für die Disc-Elektrophorese weiterentwickelt. Ihre Popularität als Träger bei der Elektrophorese rührt von einigen grundlegenden Eigenschaften her, wie: a) optische Transparenz, auch für Ultraviolett; b) elektrische Neutralität aufgrund des Fehlens geladener Gruppen; c) die Möglichkeit, Gele mit einem breiten Spektrum an Porengrößen zu synthetisieren. Im Lauf der Jahre war das Monomeren-Paar, das die größte Popularität erlangte, Acrylamid zusammen mit einem Vernetzungsmittel, N,N'-Methylenbisacrylamid (P. G. Righetti, J. Biochem. Biophys. Methods 19, 1989, 1-20). Bei längerer Verwendung wurden jedoch mehrere Mängel dieser Matrix festgestellt. Der schwerwiegendste Nachteil ist ihre Instabilität bei alkalischen pH-Werten: Nach einem Elektrophoreselauf (die meisten elektrokinetischen Trennungen erfolgen sowohl für Proteine als auch für Nukleinsäuren bei alkalischen pH-Werten) sind die anhängenden Amidobindungen partiell hydrolysiert und erzeugen Carboxylgruppen, die kovalent mit dem Polymer verbunden bleiben, das somit in ein Polyacrylat umgewandelt wird. Dieses Phänomen erzeugt eine starke Elektroendoosmose, wobei die Matrix quillt und sich erheblich verformt. In der Praxis kann die Polyacrylamid-Matrix nach nur einem einzigen Lauf nicht wiederverwendet werden. Dies schränkt ihre Verwendung bei Projekten im großen Maßstab, wie dem Sequenzieren des menschlichen Genoms, bei denen die Verfügbarkeit wiederverwendbarer Matrices die Analysezeit stark verkürzen und einen schnelleren Fortschritt dieses Projektes auf der ganzen Welt ermöglichen würde, stark ein. Stabile Matrices wären auch für die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) recht geeignet, bei der das Gel nicht zu einer Kapillare extrudiert werden kann, wenn es partiell hydrolysiert oder fehlerhaft ist.
Ein weiteres allgemeines Problem ist der beschränkte Bereich an Molekülgrößen, der durch Polyacrylamide effektiv gesiebt werden kann. Dieser Porositätsbereich umfasst Porengrößen von wenigen (2-3 nm) bis etwa 20-30 nm in stark verdünnten Matrices. Dies beschränkt die Verwendung von Polyacrylamiden auf Proteintrennungen, wohingegen Agarosegele heute fast ausschließlich zur Trennung von Nukleinsäurefragmenten eingesetzt werden. Polyacrylamid-Matrices mit großen Poren würden somit die Fraktionierung von Nukleinsäuren in einigen Längenbereichen ermöglichen.
Ein drittes Problem ist die eingeschränkte Hydrophilie der zur Zeit verwendeten Monomere (des Paares Acrylamid/N,N'- Methylenbisacrylamid): die Herstellung von Monomeren mit größerer Hydrophilie würde die optimale Verwendung dieser Matrices, insbesondere bei Proteintrennungen, ermöglichen, bei denen hydrophobe Wechselwirkungen oft zur irreversiblen Adsorption dieser Makromoleküle führen.
Vor kurzem haben mehrere Gruppen neue Monomere vorgeschlagen, die einige dieser Probleme beseitigen können. So hat Boschetti (in: Dean, P. D. G., Johnson, W. S., und Middle, P. A., Hrsgb., Affinity Chromatography, IRL Press, Oxford 1985, S. 11-15) die Verwendung von Trisacryl (N-Acryloyl-2- amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol) als neues Monomer zur Herstellung von neutralen oder Ionenaustausch- (z. B. Carboxymethyl-, Diethylaminoethyltrisacryl) Chromatographiematrices vorgeschlagen. Dieses Monomer bietet zwei unterschiedliche Vorteile: extreme Hydrophilie, gekoppelt mit poröseren Gelen aufgrund der höheren Molekülmasse von Tris acryl. Trotz dieser Vorteile ist Trisacryl mit einem grundlegenden Fehler behaftet: bei alkalischen pH-Werten wird es mit einer Kinetik der nullten Ordnung abgebaut (C. Gelfi, P. De Besi, A. Alloni und P. G. Righetti, J. Chromatogr. 608, 1992, 333-341), was seine Verwendung als Elektrophoresematrix verhindert. Als Alternative zu diesem Monomer hat Kozulic (Europäisches Patent Nr. 88.10717.4, 1988) Acrylamidozucker (z. B. N-Acryloyl- (oder Methacryloyl-) 1-amino-1-desoxy-D-glucitol oder das analoge Derivat mit D-Xylitol vorgeschlagen. Acrylamidozucker haben jedoch die gleichen Vor- und Nachteile wie Trisacryl: extreme Hydrophilie und hohe Porosität als Polymermatrix, aber eine Abbaukinetik der Monomere bei alkalischem pH-Wert der nullten Ordnung. Auch diese Verbindungsklasse hat tatsächlich keine Anwendung bei der Elektrophorese und der Chromatographie gefunden.
In einer anderen Anmeldung (Shorr, R., und Jain, T., Europäisches Patent Nr. 89107791.9, 28. April 1989, Veröffentlichungs-Nr. 339678) ist eine große Klasse N-mono- und -disubstituierter Acrylamido-Monomere als Elektrophoreseträgermedien vorgeschlagen. Aus dieser großen Klasse potentieller Monomere haben Shorr und Jain aber nur zwei bevorzugte Gemische, wie folgt (wörtliches Zitat) herausgenommen (und kommerziell vertrieben): "Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polymere durch Vernetzungspolymerisation von N,N- Dimethylacrylamid mit Ethylenglycolmethacrylat hergestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Polymere durch Vernetzungspolymerisation von N,N-Dimethylacrylamid und Hydroxyethylmethacrylat mit N,N-Dimethylacrylamid hergestellt." Auch diese Formulierungen scheinen nicht optimal zu sein. N,N-Dimethylacrylamid und ähnliche alkylsubstituierte Acrylamide sind zu hydrophob, wohingegen verschiedene Methacrylat-Vernetzungsmittel zu empfindlich gegen Hydrolyse und ebenfalls zu hydrophob sind. Als Ergebnis muss das kom merziell vertriebene Produkt, das diese Formulierungen enthält, (Hydrolink) Detergenzien enthalten, das die Solubilisierung der Monomere zu unterstützt. Die entsprechende Emulsion flockt oft aus. Diese Probleme (hohe Hydrophobie und irreversible Adsorption von Proteinen) wurden von Chiari et al. (Electrophoresis 15, 1994, 177-186) nachgewiesen. Somit sind bisher zwei Klassen von Monomeren vorgeschlagen worden:
A) einerseits Monomere (wie Trisacryl und Acrylamidozucker) mit extremer Hydrophilie, die sehr empfindlich für alkalische Hydrolyse sind;
B) andererseits Monomere (wie N,N-Dimethylacrylamid), die sehr beständig gegenüber alkalischer Hydrolyse, aber viel zu hydrophob sind.
So ist das grundlegende Problem, eine neue Klasse von Monomeren zu finden, die sowohl hohe Hydrophilie als auch hohe Beständigkeit gegenüber Hydrolyse vereinigen, immer noch nicht gelöst worden.
1991 schlug Righetti (Italienisches Patent Nr. R191 A- 003271, 1991; Europäisches Patent PCT 92/0177) ein neues Monomer vor, das anscheinend die Lösung für die obigen Probleme bot: N-Acryloylaminoethoxyethanol (AAEE), eine neue Verbindung, die Matrices [Poly(AAEE)] herstellen kann, die stark hydrophil und extrem beständig gegen alkalische Hydrolyse sind. Bei einer Reihe von Anwendungen (z. B. Chiari et al., Electrophoresis 15, 1994, 177-186; ibid. 15, 1994, 616-622) lieferte dieses Monomer eine einzigartige Leistung sowohl bei der Elektrophorese als auch bei der Herstellung von Chromatographieperlen. Man stellte jedoch fest, dass dieses neue Monomer sogar in Abwesenheit des Vernetzungsmittels eine eigenartige Neigung zur Autopolymerisation und Autovernetzung hat. Aufgrund dieser schädlichen Eigenschaft war es nicht möglich, kurzkettige Flüssigkeitssieb-Polymere herzustellen, die bei der Kapillarzonenelektrophorese (CZE) beispielsweise zur Trennung von DNA-Fragmenten weitverbreitet eingesetzt werden. Diese Neigung zur Autopolymerisation trat aufgrund eines "1- 6-Entzugs"-Mechanimus auf, der die Bildung freier Radikale an C&sub2; und C&sub6; bewirkt. Dieser Entzug (eines Protons durch C&sub1; von C&sub6;) wird durch das Vorliegen einer Ethergruppe (O&sub7;) in der Nähe von C&sub6; gefördert. Wird eine kritische Konzentration dieser Radikale erreicht, autopolymerisiert und autovernetzt die Monomerlösung spontan.
Bei der vorliegenden Erfindung werden neue Matrices vorgeschlagen, die die obigen Probleme lösen und auf Monomeren basieren, die:
a) hohe Hydrophilie;
b) sehr hohe Beständigkeit gegen Hydrolyse;
c) Beständigkeit gegen Autopolymerisation, wie beispielsweise durch "1-6-Entzug"
besitzen
Diese Klasse von Monomeren liefert, wie unten gezeigt, eindeutig überragende Ergebnisse bei elektrokinetischen und chromatographischen Trennungen.
Diese Formulierungen werden über die Polymerisation oder Copolymerisation von Monomeren mit der folgenden Formel (I):
wobei R Wasserstoff oder CH&sub3; darstellt und R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel -[(CH&sub2;)n-O]p-H darstellen, wobei n = 3 oder > 3 und p = 1, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R&sub1; und R&sub2; von Wasserstoff verschieden ist, oder durch Copolymerisation von Monomeren des Typs (I) mit anderen (Meth)Acrylamiden erhalten. Die bevorzugten Monomere der Formel (I) sind 3-(N-Acryloyl)-amino-1-propanol (AAP) und 4-(N-Acryloyl)-amino-1-butanol (AAB) oder ihre disubstituierten Monomere 3-[-N-(3-Hydroxypropyl)-N-(acryloyl)]-amino-1-propanol und 4-[N-(4-Hydroxypropyl)-N-(acryloyl)]-amino-1-butanol. Insbesondere die Polymere (oder Copolymere), die mit AAP und AAB hergestellt werden, bieten die gewünschten Eigenschaften einer guten Hydrophlie, sehr hohen Beständigkeit gegenüber Hydrolyse und erhöhten Porosität. Die Eigenschaften können auch in Mischbettformulierungen (z. B. Agarose-Polyacrylamid-Matrices, die mit AAP- und AAB-Monomeren erhalten werden) gefunden werden.
Die Erfindung umfasst auch Syntheseverfahren, mit denen diese Monomere in hohen Ausbeuten (> 98%) und hoher Reinheit (> 98%) erhalten werden, sowie Polymerisationsverfahren, die kurzkettiges Poly(AAP) und Poly(AAB), jeweils zum Füllen von Kapillaren und zum Mischen mit Agarose und Polyacrylamid- Matrices, ergeben. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung der neuen AAP- und AAB-Monomere zur Herstellung von Plattengelen, die lange gelagert werden können, und zur Herstellung von Chromatographieperlen, die bei allen Chromatographie- und elektrokinetischen Verfahren für industrielle Anwendungen sowie für Forschungs- und Analysezwecke eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Herstellung von Matrices aus Poly(AAP) und Poly(AAB), die (mit Hilfe vorgeformter Polymere in Lösung) lateral aggregiert und somit makroporös sind, sowie Photopolymerisationsverfahren, die bereits in der vorherigen Patentanmeldung (P. G. Righetti, Italienisches Patent Nr. R191 A-003271) für Poly(AAEE)-Matrices angewendet werden.
Die Vorteile der vorliegenden Matrices verglichen mit den bisher beschriebenen sind nachstehend beschrieben.

Mono- und disubstituierte Polyacrylamid-Matrices

Das Beispiel der Fig. 1 zeigt die Hydrolysekinetik von Standard-Acrylamid und N-mono- und -disubstituierten Acrylamiden. Die freien Monomere, gelöst in 0,1 N NaOH, wurden bei 70ºC für die angegebenen Zeiten inkubiert, dann neutralisiert und mittels Kapillarelektrophorese mit Mandelsäure als internem Standard analysiert. Die Peakintegration wurden mittels System Gold von Beckman durchgeführt. Es ist ersichtlich, dass alle Monomere, ausgenommen Trisacryl, das mit einer Kinetik nullter Ordnung abgebaut wird, eine Abbaukinetik erster Ordnung aufweisen. Dies zeigt, dass mit diesem Typ der Struktur eine innere Stabilität einhergeht. Unter den N-substituierten Acrylamiden, die theoretisch stabiler als Acrylamid sein sollten, zeigt N-Acryloylmorpholin dagegen eine schnellere Abbaukinetik. Das hier vorgeschlagene neue Monomer, das zwar auch mit einer Kinetik erster Ordnung abgebaut wird, zeigt eine 8mal kleinere Hydrolysekonstante (K = 0,008 l mol&supmin;¹ · min&supmin;¹) als Acrylamid (K = 0,05 l · mol&supmin;¹ · min&supmin;¹).
Der Stabilitätsunterschied ist noch ausgeprägter, wenn die Monomere, anstelle frei in einer Lösung vorzuliegen, in eine Polymermatrix eingebaut werden. Beim Beispiel der Fig. 2 wird die Stabilität von Standard- und substituierten Acrylamiden verglichen, wenn diese in Polymerperlen eingebaut sind. Nach der Hydrolyse in 0,1 N NaOH für die angegebenen Zeiten wird die Hydrolyse des Polymers durch direkte Titration der freigesetzten Carboxylgruppen gemessen. Es ist ersichtlich, dass im Fall von Poly(acrylamid) 30% und im Fall von Poly(trisacryl) 15% der Amidgruppen in nur 2 Stunden Inkubation hydrolysiert werden. Dagegen zeigen die beiden Matrices, die mit N-substituierten Monomeren hergestellt sind, Poly(dimethylacrylamid) und Poly(AAP) eine extreme Beständigkeit gegen Hydrolyse: das erste wird in 48 Stunden nur zu 1,5% abgebaut, wohingegen Poly(AAP) dieses Ausmaß an Hydrolyse (1,5%) nach 60stündiger Hydrolyse erreicht. Das ausgezeichnete Verhalten von Poly(AAP) zeigt sich auch unter drastischen Hydrolysebedingungen (1 N NaOH, 100ºC): nach 8 Stunden betrug das Ausmaß der Hydrolyse nur 6,5%, verglichen mit 8% bei Poly- (AAEE) (Fig. 3). Unter diesen Bedingungen zerfiel ein Poly- (acrylamid)-Gel schnell. Die sehr hohe Beständigkeit des Poly(AAP)-Monomers zeigt sich auch unter sauren Bedingungen: in 0,1 N Rd bei 70ºC (Fig. 4) beträgt die Hydrolyse nach 12 Stunden nur 0,5%, verglichen mit 1% bei Poly(DMA) und 6% bei Poly(acrylamid). Unter drastischen Bedingungen (1 N HCl, 100ºC) sind die Unterschiede noch ausgeprägter: 40% Hydrolyse bei Poly(AAP) nach 8 Stunden, verglichen mit nur 4 Stunden für Poly(DMA) und Poly(acrylamid) (Fig. 5).
Im Beispiel der Fig. 6 wird die Beständigkeit von Poly(AAP) gegenüber Hydrolyse bei einem Isoelektrofokussierungs- (IEF-) Experiment demonstriert. Zwei Plattengele, eines aus Poly(acrylamid) und eines aus Poly(AAP), werden hergestellt und 20 min bei 70ºC in 0,1 N NaOH inkubiert. Nach dem Waschen, um einen Überschuss an NaOH zu beseitigen, werden die Gele getrocknet und in 2% Ampholin, pH-Wert 3-10, wieder gequollen. Nach der IEF wird der pH-Gradient zwischen Anode und Kathode an Gelstücken in Abständen von 5 mm gemessen. Es ist ersichtlich, dass bei Poly(AAP)-Gelen der pH- Gradient durch die NaOH-Behandlung unbeeinflusst ist, wohingegen bei Poly(acrylamid)-Gelen der pH-Gradient völlig angesäuert ist. Dieses letzte Phänomen ist auf das Vorliegen freier Carboxylgruppen (pK 4,6, verantwortlich für die Ansäuerung des pH-Gradienten und starken elektroosmotischen Fluss (P. G. Righetti, Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Ansterdam, 1983)) zurückzuführen. Poly(DMA)-Matrices zeigen zwar das gleiche Verhalten wie Poly(AAP), können aber aufgrund ihrer starken Hydrophobie (s. u.)nicht zur elektrophoretischen Trennung von Proteinen eingesetzt werden.
Es ist zwar ersichtlich, dass Poly(AAP) und Poly(DMA) hinsichtlich der Beständigkeit gegenüber Hydrolyse einzigartig stabil sind, es müssen aber noch ihre jeweiligen Hydrophilieeigenschaften, die am meisten erwünschte Eigenschaft für die Trennung von Makromolekülen, demonstriert werden. Zu diesem Zweck wurden wässrige Lösungen dieser Monomere einer Verteilung gegen n-Octanol ausgesetzt. Nach der Verteilung wird die wässrige Phase mittels Kapillarelektrophorese untersucht, und das Molverhältnis der verschiedenen Monomere in den beiden Phasen wird bestimmt. Die Fig. 7 zeigt die verschiedenen Verteilungskoeffizienten P: es ist ersichtlich, dass Trisacryl das bei weitem hydrophilste Molekül ist, wohingegen andere N-substituierten Acrylamide hydrophober sind. Der P-Wert von AAP ist jedoch ausgezeichnet, da es zweimal so hydrophil wie Acrylamid ist. Auch AAB hat eine ähnliche Hydrophilie wie Acrylamid (P = 0,24). Der Maximalwert von P, damit ein hydrophiles Gel erhalten wird, kann nicht viel größer als P = 0,3 sein. Über diesem Wert weist das Polymer hydrophobe Wechselwirkungen mit Proteinen auf, und über P = 0,5 kann das Polymer nicht mehr in protischen Lösungsmitteln quellen. Somit kann eine Poly(DMA)-Matrix, die zwar eine einzigartige Hydrolysebeständigkeit aufweist, aufgrund ihrer hohen Hydrophobie nicht zur Trennung von Makromolekülen vorgeschlagen werden.
Matrices, die hydrolysebeständig und hydrophil sind, eignen sich auch sehr zur Beschichtung der Quarzglaswand von Kapillaren bei der CZE, damit der elektroosmotische Fluss (EEO) unterdrückt wird. Das Unterdrücken des EEO ist für Kapillar-IEF entscheidend, da der pH-Gradient durch Ladungen an der Wand zerstört würde, und zur Trennung von Makromolekülen, da Proteine stark an ionisierte Silanole adsorbiert würden.
Eine der populärsten Beschichtungen ist die von Hjerten (J. Chromatogr. 347, 1085, 191-198) vorgeschlagene: Die Kapillare wird mit einem bifunktionellen Mittel (z. B. Bindesilan, 3- Methacryloxypropyltrimethoxysilan) behandelt, an das Polyacrylamid-Stränge (in Abwesenheit eines Vernetzungsmittels) kovalent gebunden werden. Diese Beschichtung ist jedoch sehr empfindlich gegenüber alkalischem Milieu: Wird eine IEF durchgeführt, tritt der EEO-Fluss bereits nach 5 Läufen auf. Wird dagegen die Kapillare mit linearen Poly(AAP)-Ketten beschichtet, wird dagegen nach 30 Läufen noch kein EEO-Fluss bemerkt. Die Bindung zwischen der Quarzglaswand und Bindesilan ist vom Typ Si-O-Si, die ebenfalls unter alkalischen Bedingungen instabil ist. Eine Alternative ist die Verwendung des Verfahrens von Cobb et al. (Anal. chem. 62, 1990, 2478- 2483), das ein Grignard-Reagenz zur Bildung einer direkten Si-C=-Bindung zwischen der Siliciumdioxidwand und dem bifunktionellen Agens verwendet. Mit dem letzten Verfahren und einer Poly(acrylamid)-Beschichtung erhöht sich aufgrund der Instabilität des Acrylamid-Monomers die Stabilität der Beschichtung nur von 5 auf 10 Läufe. Wird dieses Vernetzungsmittel dagegen zusammen mit der Poly(AAP)-Beschichtung verwendet, wird auch nach 100 Läufen kein EEO-Fluss bemerkt.
Ein Teil der vorliegenden Erfindung ist auch ein neues Verfahren zur Verankerung des Polymers an der Siliciumdioxidwand, wobei Agenzien vom Typ des Bindesilans vermieden werden, die nicht nur eine instabile -Si-O-Si-Bindung bilden, sondern auch mittels Hydrolyse der Trimethoxyeinheit zusätzlich freie Silanole erzeugen, die zudem zum EEO-Fluss beitragen. Ein alternatives Verfahren ist die Bindung von Acryloylchlorid an die Wand, wobei eine Esterbindung mit dem Si der Wand gebildet wird. Diese Bindung ist stabiler als die Siloxanbrücke; außerdem erzeugt dieses monofunktionelle Reagenz beim Binden an die Wand keine freien Silanole. Werden an diesen Acryloylrest, der mit der Wand umgesetzt wird, Poly- (AAP)- [oder Poly(AAB)-] Stränge umgesetzt, ist die Beschichtung auch für > 100 Elektrophoreseläufe stabil.
Ein Teil der vorliegenden Erfindung ist auch ein neues Verfahren zum Synthetisieren von AAP (oder AAB), wobei in einem einzigen Syntheseschritt ein im Wesentlichen reines Produkt (> 98%) hergestellt werden kann. Das von uns im vorhergehenden Patent zu AAEE vorgeschlagene Syntheseverfahren bestand aus einer Standard-Schotten-Baumann-Reaktion (Acryloylchlorid, gemischt mit Aminoethoxyethanol in 2 N NaOH bei 0-5ºC in einem wässrigen Lösungsmittel). Diese Reaktion ergab sehr niedrige Ausbeuten (15%) und einen hohen Grad der Verunreinigung mit freier Acrylsäure. Bei der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Syntheseansatz beschrieben, durch den Acryloylchlorid und Aminopropanol (oder Aminobutanol) bei -30ºC bis -70ºC, vorzugsweise bei -40ºC, in absolutem Ethanol und in einem 2X molaren Überschuss an Propanol (oder Aminobutanol) anstelle von Triethylamin oder NaOH zur Neutralisierung der bei der Kondensationsreaktion erzeugten HCl umgesetzt werden. Das so erhaltene Produkt (Fig. 8) ist gemäß gaschromatographischer Analyse rein (oberes Bild). Massenspektren (Fig. 8, unteres Bild) bestätigen die Identität des Produktes, die auch durch NMR-Spektren bezeugt wird (Fig. 9).
Teil der Erfindung ist auch die Herstellung von kurzkettigem Poly(AAP) [oder Poly(AAB)] zum Sieben von Proteinen und Nukleinsäuren bei der CZE oder als Agarose- und Poly(acrylamid)-Matrices zur Modulierung der Porengröße dieser Matrices. Die Herstellung kurzkettiger Polymere eignet sich aufgrund der niedrigen Viskosität dieser Ketten außerordentlich gut zum Füllen und Entleeren von Kapillaren und auch zur starken Verbesserung des Siebens kleinerer Nukleinsäuren (z. B. von Oligonukleotiden und DNA-Fragmenten von 100 bis 500 bp). Die Synthese dieser Ketten erfolgt durch gleichzeitige Behandlung mit hohen Temperaturen (60-70ºC) und Kettenübertragungsadditiven, wie 2-Propanol. Diese Synthese war mit dem AAEE-Monomer nicht möglich, da bei diesem Verfahren Autovernetzung und Gelbildung auftrat.

Beispiel Nr. 1

Synthese von 3-(N-Acryloyl)-amino-1-propanol

In einen 3-Hals-Kolben, der mit einem Thermometer, einem Trichter und einem Argon-Spülrohr ausgerüstet war, wurde 0,1 M Acryloylchlorid gegeben. Nach Kühlen bei -40ºC wurden 150 ml Ethanol, die ebenfalls bei -40ºC gehalten wurden, zugegeben. 0,2 M 3-Amino-1-propanol, gelöst in Ethanol, wurde dann tropfenweise zugegeben, wobei die Temperatur bei -45 bis -40ºC gehalten wurde. Das Rühren wurde nach der letzten Zugabe zwei Stunden bei -40ºC und dann weitere 5 Stunden bei 5ºC fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand in Aceton gelöst. Nach Entfernen von Propanolaminchlorhydrat durch Filtration wurde die Monomerlösung auf eine Silicasäule, die mit Aceton entwickelt wurde, geleitet (Verhältnis Produkt/Silica 1 : 30). Das Elutionsmittel wurde bei 0ºC mit einer mechanischen Pumpe verdampft. Das reine Produkt (98%ige Ausbeute) wurde in Wasser gelöst (Verhältnis 1 : 1 Vol./Vol.) und mittels Gaschromatographie-Massenspektren (Fig. 8) und NMR (Fig. 9) analysiert. Die Verwendung von anderen Lösungsmitteln bei dieser Synthese (z. B. Methanol, Aceton, Chloroform) sowie anderen Aminen (z. B. Triethylamin) ergibt niedrigere Ausbeuten und eine Reihe verschiedener verunreinigender Produkte.

Beispiel Nr. 2

Synthese von kurzkettigem Poly(AAP)

Kurzkettiges Poly(AAP) wurde in Anwesenheit von 2-Propanol bei hoher Temperatur synthetisiert, um die Molekülmasse des Produktes zu regulieren. Zehnprozentiges AAP wurde in Wasser hergestellt, das 3% 2-Propanol enthielt. Die Lösung wurde entgast und dann unter Argon äquilibriert. Nach der Zugabe der Katalysatoren (10 ul 10% Ammoniumpersulfat und 1 ul reines TEMED pro ml der gelierenden Lösung) ließ man die Polymerisation 2 Std. bei 70ºC in einem Thermostatbad ablaufen. Das Polymer wurde mit Ethanol gefällt, gewaschen und lyophilisiert. Für die Verwendung bei der CZE zur Trennung von DNA- Fragmenten wurden 6% bis 10% Polymer in Standard-TBE-Puffer (89 mM Tris, 89 mM Borat und 2 mM EDTA, pH-Wert 8,3) gelöst. Die Analyse auf Molekularsieben ergab einen Mw-Wert von etwa 200000 Da im Gegensatz zu > 2 Millionen Da für das gleiche Polymer, das unter Standardbedingungen hergestellt worden war. Die Fig. 10 zeigt die Trennung des Markers V (DNA-Fragmente von 18 bis 500 bp) in TBE-Puffer in Anwesenheit von 8% kurzkettigem Poly(AAP): man erkennt die Trennung zwischen dem 123 und dem 124 bp-Fragment, die mit anderen Siebsystemen nicht erreichbar ist.

Beispiel Nr. 3

Beschichtung der Kapillarwand

Quarzglaskapillaren wurden zuerst 1 Std. unter kontinuierlichem Durchfluss mit warmem methanolischem KOH behandelt, um die Silanole zu aktivieren. Nach der Behandlung mit 1 N HCl für 10 min und mehreren Waschschritten mit Wasser, dann mit Aceton, wurde die Kapillare in einem Ofen bei 170ºC getrocknet, wobei mit Stickstoff gespült wurde. Die Kapillare wurde dann für zehn Zyklen zuerst mit wasserfreiem Triethylamin (5 min. unter Spülen), dann mit Acryloylchlorid (5 min. unter Spülen) behandelt. Nach diesen Behandlungen wurde die Kapillare mit einer Lösung aus 5% AAP-Monomer (ohne Vernetzungsmittel) gefüllt, die zuvor entgast und mit TEMED und Persulfat, wie oben beschrieben, versetzt worden war. Die Po lymerisation erfolgte über Nacht bei niedrigen Temperaturen (10ºC, um das Wachstum langkettiger Polymere zu fördern) und bei kontrolliertem pH-Wert (pH-Wert 7, um Hydrolyseprozesse bei der Beschichtung zu vermeiden). Die Kapillare wurde mit Druck geleert, mit Wasser gespült und dann für elektrophoretische Trennungen eingesetzt. Die Fig. 11 gibt die EEO einer Kontrollkapillare, einer mit Poly(AAP) in Anwesenheit von Bindesilan beschichteten Kapillare und einer mit Poly(AAP) und Acryloylchlorid als bifunktionellem Mittel beschichteten Kapillare an. Bei diesen beiden letzten Kapillaren wurde nach 60 Elektrophoreseläufen eine EEO gemessen.

Legenden

Fig. 1

Kinetik der Hydrolyse verschiedener mono- und disubstituierter Monomere, verglichen mit unsubstituiertem Acrylamid. Erzwungener Abbau unter milden (0,1 N NaOH) alkalischen Bedingungen. Die Hydrolyse wurde mittels Quantifizieren der restlichen Menge an intaktem Monomer durch Kapillarzonenelektrophorese in Anwesenheit eines internen Standards gemessen. Man beachte die ausgezeichnete Leistung von AAP. Abkürzungen: AAP = 3-(N-Acryloyl)-amino-1-propanol; AAB = 4-(N-Acryloyl)- amino-1-butanol, AAEE = 2-[2-(N-Acryloyl)-amiho]-ethoxyethanol; 2-AAB = 3-(N-Acryloyl)-amino-3-methyl-1-propanol; Acr = Acrylamid; 3-AAHP = N-Acryloyl-3-hydroxypiperidin, 4-AAHP = N- Acryloyl-4-hydroxypiperidin.

Fig. 2

Hydrolysekinetiken verschiedener Monomere nach dem Einbau in eine Gelmatrix. Bedingungen: 0,1 N NaOH, 70ºC, bis zu 60 Std. Das Ausmaß der Hydrolyse wurde durch Messen der Äquivalente an Acrylsäure, die in den Polymerperlen erzeugt worden waren, mittels Frontalanalyse bestimmt. Diese Äquivalente wurden dann in einen %-Wert der im Polymer insgesamt hydrolysierten Amidgruppen umgewandelt. Man beachte, dass sich die Reaktivität von Poly(acrylamid) einerseits und Poly(AAP) und Poly(DMA) (DMA = N,N-Dimethylacrylamid) andererseits um das 500fache unterscheiden.

Fig. 3

Hydrolysekinetiken von Poly(AAEE) und Poly(AAP) unter stark alkalischen Bedingungen (1 N NaOH, 100ºC). Alle anderen Bedingungen waren wie bei Fig. 2.

Fig. 4

Hydrolysekinetiken von Poly(acrylamid), Poly(DMA) und Poly(AAP) unter milden sauren Bedingungen (0,1 N HCl, 70ºC). Alle anderen Bedingungen waren wie bei Fig. 2.

Fig. 5

Hydrolysekinetiken von Poly(acrylamid), Poly(DMA) und Poly(AAP) unter stark sauren Bedingungen (1 N HCl, 100ºC). Alle anderen Bedingungen waren wie bei Fig. 2.

Fig. 6

Elektrophoretische Analyse der Hydrolyse von Poly(acrylamid)- und Poly(AAP)-Gelen. Beide Gele wurde auf eine Glasplatte gegossen und 20 min bei 70ºC in 0,1 N NaOH einer Hydrolyse unterzogen. Nach Waschen und Trocknen wurden die Gele wieder in 2% Trägerampholyten, pH-Wert 3-10, gequollen und 2 Std, bei 1500 V, 4ºC einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen. Die Gele wurden dann entlang des Laufweges in 17 Stücke mit 5 mm Breite unterteilt. Nach der Elution in 300 ul 10 mM NaCl wurde der pH-Wert jedes Stückes gemessen.

Fig. 7

Hydrophobieskala von Acrylamid und N-substituierten Derivaten. Die Monomere wurden jeweils in einer Konzentration von 2 mM in wässriger Lösung (3,5 ml) gelöst und 2 min mit einem gleichen Volumen an n-Octanol gemischt. Nach der Phasentrennung wurde die wässrige Lösung 75 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Alle Arbeitsgänge erfolgten bei 25ºC. Die Lösung wurde nach Verdünnen mit einem internen Standard (2,5 mM Immobiline, pk 9,3) versetzt und mittels CZE analysiert. Abkürzungen s. Fig. 1. Andere Abkürzungen: MMA: N-(Monomethyl)- acrylamid; ACM: N-Acryloylmorpholin; TrisA: Trisacryl; DD- Tris: Didesoxytrisacryl.

Fig. 8

Identifikation der Reaktionsprodukte bei der Synthese der neuen N-substituierten Acrylamide mittels Gaschromatographie-Massenspektren. Reaktionsbedingungen: -40ºC, Ethanol als Lösungsmittel und ein zweifacher molarer Überschuss an Propanolamin. Oberes Bild: GC-Profile; unteres Bild: Massenspektrum von AAP. Man beachte, dass nur unter diesen Reaktionsbedingungen ein im Wesentlichen reines Produkt erhalten wird.

Fig. 9

¹H-NMR-Spektren zur Identifikation des gewünschten AAP- Reaktionsproduktes. Die Spektren wurden mit einem Bruker-AC- 200-Gerät unter Verwendung von CDCl&sub3; als Lösungsmittel aufgezeichnet. Die Zahlen 1-6 betreffen die Identifikation der verschiedenen Gruppen im Molekül, dessen Formel über dem Spektrum angegeben ist. Die -OH-Gruppe ergibt das verschmierte Signal rechts neben Peak 4.

Fig. 10

Kapillarelektrophorese von DNA-Fragmenten (Marker V). Kapillaren: 75 um I. D. (linkes Bild) und 50 um I. D. (rechtes Bild), 37 cm lang, beschichtet mit Poly(AAP). Pufferelektrolyt: 89 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA, pH-Wert 8,3, mit 8% linearem kurzkettigem Poly(AAP) als Flüssigkeitssieb-Polymer und 2,5 uM Ethidiumbromid. Probeneinspritzung: 15-20 s bei 100 V/cm. Laufbedingungen: 100 V/cm bei Raumtemperatur. Der Einsatz zeigt die Trennung von Fragmenten mit 123 und 124 bp, die gewöhnlich in herkömmlichem Poly(acrylamid) nicht auflösbar sind.

Fig. 11

Werte für den elektroosmotischen Fluss (EEO) in Quarzglaskapillaren mit verschiedenen Beschichtungen. Die obere Kurve ist der EEO in unbeschichteten Kapillaren. Die anderen beiden Kurven stehen für Kapillaren, die mit Poly(AAP), das mit Bindesilan (2) oder Acryloylchlorid (3) an die Wand gebunden worden war, beschichtet waren. Der EEO-Fluss wird gemessen, indem ein neutraler Marker (Acrylamid) eingespritzt und seine Wanderungszeit bei 10000 V und verschiedenen Hintergrundelektrolyt-pH-Werten gemessen wurde.

Claims

1. Verwendung von aus Poly(N-substituierten)acrylamiden hergestellten Matrices bei elektrophoretischen und chromatographischen Methoden, wobei diese Matrices erhältlich sind durch (Co)polymerisation von Monomeren der Formel (I):

wobei R Wasserstoff oder CH&sub3; darstellt, während R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel -(CH&sub2;)n OH darstellen, wobei n = 3 oder > 3, unter der Voraussetzung, daß mindestens einer von R&sub1; und R&sub2; von Wasserstoff verschieden ist, oder durch Copolymerisation dieser Monomere mit weiteren (Meth)acrylamiden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Matrices erhältlich sind durch Polymerisation von 3-(N-Acryloyl)amino-1-propanol und 4-(N-Acryloyl)amino-1-butanol, oder von deren disubstituierten Derivaten, 3-[N-(3-Hydroxypropyl)-N-(acryloyl)]amino-1- propanol und 4-[N-(4-Hydroxypropyl)-N-(acryloyl)]amino-1-butanol, oder durch Copolymerisation dieser Monomere mit geeigneten hydrophilen Verbindungen.

3. Verwendung nach Ansprüchen 1 und 2, wobei die Methoden alle elektrokinetischen Trennungen, einschließlich der Kapillarzonenelektrophorese umfassen.

4. Verwendung von Monomeren mit der Formel (1) wie in Anspruch 1 beschrieben zur Beschichtung der Innenwand einer Kapillare bei der Kapillarzonenalektropherese, entweder durch Verwendung üblicher eine -Si-O-Si-Brücke bildender bifunktioneller Mittel(z. B. 3-Methacyloxypropyltrimethoxysilan), oder durch Verwendung von eine direkte -Si-C-Bindung bildenden bifunktionellen Mitteln, oder durch Verwendung von Acryloylchlorid, entweder zum Füllen einer Kapillare, oder als vernetzte Matrix, oder als viskose Lösung in Abwesenheit von Vernetzer.

5. Verwendung nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die Methoden alle elektrokinetischen Methodologien umfassen, einschließlich DNA-Sequenzierung, Kapillarzonenelektrophorese, entweder in Platten oder Geizylindern, und zur Bestimmung von Protein-Mr durch Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat und für alle isoelektrischen Fokussierungsmethodologien, einschließlich immobilisierten pH- Gradienten.

6. Verwendung nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die Matrices erhältlich sind durch (Co)polymerisation in Gegenwart von verschiedenen Typen von hydrophilen Polymeren, die laterale Aggregation induzieren und so makroporöse Struktwen bilden können.

7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Matrices charakterisiert sind durch Verwendung von Polymeren der Polyethylenglykolfamilie, insbesondere der Größen 10 und 20 kDa, als laterale Aggregierungsmittel.

8. Verwendung von Matrices nach den Ansprüchen 6 und 7, wobei diese Methoden alle Typen der Elektrophorese auf makroporösen Trägern umfassen, einschließlich üblichem isoelektrischem Fokussieren und inimobilisierten pH-Gradienten.

9. Verwendung nach den Ansprüchen 6 und 7, wobei die Matrices als Membranen für chromatographische und Filtrations-Prozesse verwendet werden, entweder allein oder auf anderen Trägermembranen aufgebracht.

10. Verwendung nach den Ansprüchen 6 und 7, wobei die Matrices als isoelektrische und puffernde Membranen verwendet werden, die in Multikompartment-Elektrolysatoren zur Proteinreinigung, zur Entfernung von Pyrogenen, Nukleinsäurefragmenten und viralen Partikeln aus diesen Proteinen verwendet werden sollen, wobei die Membranen im allgemeinen auf reißfesten Trägern aufgebracht sind.

11. Verwendung nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die Matrices aus Monomeren mit der Formel (I) erhältlich sind, entweder durch chemische oder durch Photo(co)polymerisation (z. B. mit Riboflavin, oder mit Methylenblau in Gegenwart des Red-Ox-Paars Na-Toluolsulfinat und Diphenyliodoniumchlorid).

12. Verwendung von Acrylamiden mit der Formel (I) wie in Anspruch 1 beschrieben zur Herstellung von vorgefertigtem Gel für die Langzeitlagerung, das verwendet werden soll in allen elektrokinetischen Methodologien (einschließlich üblichem IEF und inxnobilisierten pH-Gradienten), wobei die Gel-Matrices entweder in Gegenwart von Lösungsmittel oder getrocknet gelagert werden.

13. Verwendung von Acrylamiden der Formel (I) wie in Anspruch 1 beschrieben zur Herstellung von chromatographischen Perlen, entweder allein oder als Beschichtung von Kunststoff oder Glasperlen, oder gemischt mit Agarose oder weiteren Polymeren.

14. Aus Poly(N-substituierten)acrylamiden hergestellte Matrices zur Verwendung in elektrophoretischen und chromatographischen Methoden, erhältlich durch (Co)polymerisation von Monomeren der Formel (I):

wobei R Wasserstoff oder CH&sub3; darstellt, während R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Gruppe der Formel -(CH&sub2;)n-OH darstellen, wobei n = 3 oder > 3, unter der Voraussetzung, daß mindestens einer von R&sub1; und R&sub2; von Wasserstoff verschieden ist, oder durch Copolymerisation dieser Monomere mit weiteren (Meth)acrylamiden und mit der weiteren Voraussetzung, daß die Monomere der Formel (I) von 3-(N-Acryloyl)amino-1-propanol und 4-(N-Acryloyl)amino-1-butanol verschieden sind.

15. Verfahren zur Herstellung von Acrylamiden der Formel (1) nach Anspruch 14, dadurch charakterisiert, daß (Meth)acryloylchlorid und mindestens zwei Mol eines Aminoalkohols der Formel

wobei R&sub1; und R&sub2; die obigen Bedeutungen haben, in absolutem Ethanol bei -30ºC bis -70ºC umgesetzt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Reaktionstemperatur -40ºC ist.