JP3811188B2

JP3811188B2 - 電気泳動及びクロマトグラフィー技術でのポリアクリルアミドマトリックスのための、新規アクリルアミド誘導体及び新規な配合物

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Publication number: JP3811188B2
Application number: JP51701897A
Authority: JP
Inventors: リゲッティ，ピエール・ジオルジオ
Original assignee: リゲッティ，ピエール・ジオルジオ
Priority date: 1995-10-18
Filing date: 1996-10-14
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2016-10-14
Also published as: AU7292296A; ITMI952144A0; WO1997016462A2; DE856015T1; EP0856015B1; DE69605569T2; CA2235274C; EP0856015A2; DE69605569D1; ITMI952144A1; WO1997016462A3; CA2235274A1; JPH11515017A; IT1276957B1

Description

本発明は、以下のような特徴を有する新規なポリアクリルアミドマトリックスに関する：
ａ）アルカリ加水分解に対する優れた耐性；
ｂ）酸加水分解に対する良好な耐性；
ｃ）マクロ分子との疎水的相互作用を妨げる高い親水性；
ｄ）高い多孔性（高分子量のモノマーを用いるためか、又は側面集成化剤を使用するため）。
上記の特徴を示すマトリックスが、本発明の範囲である方法により、Ｎ−モノ−若しくはジ−置換アクリルアミドモノマーの重合又は共重合による本発明により得られる。同様に本発明に含まれるものは、上記のアクリルアミドモノマーのポリマー（若しくはコポリマー）の混合物、又は該ポリマー若しくはコポリマーとアガロースとの混合物から得られるマトリックスである。
更に、以下のものは、本発明の範囲内である：
ａ）非プロトン性溶媒中、０℃以下の温度で、非常に高収量（＞９８％）、非常に高い生成物純度で製造される新規モノマー類（特に、３−（Ｎ−アクリロイル）−アミノ−１−プロパノール、ＡＡＰ及び４−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−ブタノール、ＡＡＢ）；
ｂ）高い温度に対して連鎖移動剤（例えばイソプロパノール）を用いる、短鎖ポリ（ＡＡＰ）及びポリ（ＡＡＢ）の新規な製造方法；
ｃ）２官能性試薬、Bind silaneを、アクリロイルクロリド試薬（これは、キャピラリーの内壁に対してポリ（ＡＡＰ）［又は（ポリ（ＡＡＢ）］鎖の錨化剤として働く）で置き換えることからなる溶融シリカキャピラリーを被覆する方法。
ゾーン電気泳動による分離のためのポリアクリルアミドマトリックス類は、RaymondとWeintraub（Science,130,1959,711-712）により、既に１９５９年に導入され、続いてDavis（Ann.N.Y.Acad.Sci.121,1964,404-427）、Ornstein（Ann.N.Y.Acad.Sci.121,1964,321-349）及びHjerten（J.Chromatogr.11,1963,66-70）により、ディスク電気泳動のために促進された。電気泳動の支持体としてのそれらの一般性は、ａ）紫外線を含む光の透過性；ｂ）帯電基の不在による電気的中性性；ｃ）広い間隔の有孔性を有するゲル合成の可能性のようないくつかの基本的な特性に由来する。何年もの間、最も一般的であったモノマーの対は、アクリルアミドと、架橋剤であるＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドとを対にしたものであった（P.G.Righetti,J.Biochem.Biophys.Methods 19,1989,1-20）。しかしながら、長く使用されてきて、そのようなマトリックスのいくつかの欠点が注目されてきた。最も重大な欠点は、アルカリ性ｐＨ値でのその不安定性である：電気泳動を実施した後（タンパク質及び核酸のいずれについても大部分の動電的分離はアルカリ性ｐＨ値で起こる）、懸垂アミド結合が部分的に加水分解し、カルボキシル基を生成させ、このカルボキシル基がポリマーに共有結合して留まり、このようにして、このポリマーがポリアクリレートに転換される。この現象が、強い電気浸透を生じさせ、マトリックスを膨潤させ、かなりなひずみをもたらす。実際には、電気泳動を１回実施しただけで、ポリアクリルアミドマトリックスは再利用できなくなる。このことは、再利用性マトリックスが利用できれば分析時間が大幅に短縮され、世界中でそのようなプロジェクトの迅速な進展が可能になるであろうヒトゲノムの配列決定(sequencing)のような大規模プロジェクトにおいての使用を厳しく制限している。安定なマトリックスは、またキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）（そこでは、部分的に加水分解されるか、十分に働かない場合、ゲルをキャピラリーから押し出すことができない）において有用である。
もう一つの一般的な問題は、ポリアクリルアミドによって効率的にふるい分けることができる分子寸法の範囲が限られることである。このような有孔度（porosity）の範囲は、数nm（２〜３nm）から希釈度の高いマトリックスでの約２０〜３０nmまでの孔の大きさを包含する。このことが、タンパク質分離へのポリアクリルアミドの利用を制限しているが、これに対してアガロースゲルは、今日、核酸断片の分離にほぼ独占的に使用されている。したがって、高い有孔度のポリアクリルアミドマトリックスは、核酸の、いくつかの長さ間隔での分画をも可能にするであろう。
第三の問題は、現在使用しているモノマー類（アクリルアミド／Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドの対）の制限された親水性であり：高い親水性を有するモノマーの生成物は、特に、疎水性相互作用がそのようなマクロ分子の避けられない吸着をもたらすタンパク質分離において、そのようなマトリックスを最適に使用させている。
最近において、いくつかのグループが、それらの問題のいくつかを取り除くことができる新規なモノマー類を提案している。このようにして、Boschetti（Dean P.D.G.,Johnson,W.S.e Middle,F.A.,eds.,Affinity Chromato-graphy,IRL Press,Oxford 1985,pp.11-15）は、クロマトグラフィーのマトリックス、中性又はイオン交換類（例えば、カルボキシメチルジエチルアミノエチルトリスアクリル）を製造するために、新規なモノマーを有するトリスアクリル：（Ｎ−アクリロイル−２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）の使用を提案している。このモノマーは、二つの明瞭な利点を提供する：トリスアクリルの高い分子量のために、より多孔なゲルと結びついた優れた親水性。これらの利点にもかかわらず、トリスアクリルは、基本的な欠点を有すると考えられている：アルカリｐＨの値で、それはゼロ次反応で崩壊し（C.Gelfi,P.De Besi,A.Alloni e P.G.Righetti,J.Chromatogr.608,1992,333-341）、電気泳動マトリックスとしてのその使用を妨げている。このモノマーとは別に、Kozulic（European Patent No.88,10717.4,1988）は、アクリルアミド糖（例えば、Ｎ−アクリロイル（又はメタクリロイル）−１−アミノ−１−デオキシ−Ｄ−グルチトール又はＤ−キシリトールとの類似の誘導体）を提案している。しかしながら、アクリルアミド糖は、トリスアクリルと同様の利点と欠点を持っている：優れた親水性及びポリマー性マトリックスとしての高い有孔性、しかしアルカリ性のｐＨでモノマーのゼロ次崩壊動力学。事実、この化合物のこのクラスのものは、電気泳動及びクロマトグラフィーに用いられていない。
他の出願（Shorr,R.and Jain,T.,European Patent No.89107791.9,April-28-19899）において、Ｎ−モノ−及びジ−置換アクリルアミドモノマー類の広い範囲のクラスのものは、電気泳動支持媒体として提案されている。しかしながら、Shorr及びJainは、可能性のあるモノマーのクラスの広い範囲から、わずか２種の好ましい混合物を取り出し（そして市販化している）、次のように述べている（原文のままの引用）。「ある好ましい実施態様において、ポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとエチレングリコールメタクリレートとの架橋重合によって形成される。他の好適な実施態様において、ポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びヒドロキシエチルメタクリレートとＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとの架橋重合によって形成される」。これらの配合物も最適なものとは考えられない。Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及び同様なアルキル置換アクリルアミドは、疎水性であり過ぎ、一方、種々のメタクリレート架橋剤も同様に加水分解を受けやすく、疎水性である。この結果、このような配合物を含有する市販の製品（Hydrolink）は、モノマーの可溶化を助けるための界面活性剤を含有しなければならない。相当するエマルションは、しばしば凝集する。これらの問題（高い疎水性及びタンパク質の不可逆的吸着）は、Chiari et al.により証明されている（Electrophoresis 15,1994,177-186）。したがって、モノマーの二つのクラスが、現在までに提案されている：
Ａ）一方において、非常に親水性であるが、アルカリ性加水分解への高い感受性のモノマー（トリスアクリル及びアクリルアミド糖のような）；
Ｂ）他方において、アルカリ性加水分解に対して高耐性であるが、疎水性であり過ぎるモノマー（Ｎ，Ｎ′−ジメチルアクリルアミドのような）。
したがって、高い親水性と加水分解に対する高耐性の両方を組み合わせたモノマーの新規なクラスをどのように見いだすかの基本的問題は、まだ解決から程遠い。
１９９１年に、Righetti（Italian patnet No.R191 A-003271,1991;European Patent PCT 92/0177）は、上記の問題に対する解答を提案しているように見える新規なモノマーを提案している：Ｎ−アクリロイルアミノエトキシエタノール（ＡＡＥＥ）、高い親水性かつアルカリ性加水分解に非常に抵抗性のマトリックス［ポリ（ＡＡＥＥ）］を製造し得る新規な化合物。一連の出願（例えば、Chiari et al.,Electrophoresis 15,1994,177-186;ibid.15,1994,616-622）において、この新規なモノマーは、電気泳動及びクロマトグラフィー用ビーズの製造において優れた結果を与える。しかしながら、この新規なモノマーは自己重合する異常な傾向及び架橋剤が存在しない場合でも自己架橋する傾向を有することに注意すべきである。この有害な特性のために、短鎖の液体のふるい化ポリマー（これは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、例えばＤＮＡ断片の分離において、広く使用されている）を製造することができない。自己重合の傾向は、「１−６引き抜き」の機構のために存在することが見いだされ、それはＣ₂とＣ₆の両方に遊離基の形成をもたらす。この（Ｃ₆の犠牲においてＣ₁によるプロトンの）引き抜きは、Ｃ₆の隣のエーテル基（Ｏ₇）の存在により、促進される。そのような遊離基の臨界濃度が達成されたとき、モノマー溶液は、自発的に、自己重合し、自己架橋する。
本発明において、新規な組成物が提案されており、そこでは以下の特性を有するモノマーの新規なクラスを製造することにより上記の問題を除去している：
ａ）高い親水性；
ｂ）加水分解に対する非常に高い耐性；
ｃ）「１−６引き抜き」により例示されている自己重合への耐性。
提案されているモノマー類のこの新規なクラスは、動電的及びクロマトグラフィー分離において、以下に示すように決定的に優れた結果を示す。
そのような配合物類は、以下の式（Ｉ）：

（式中、Ｒは、水素又はＣＨ₃を表し、Ｒ₁及びＲ₂は、独立して、水素又は式：−［（ＣＨ₂）_nＯ］_p−Ｈ（ここで、ｎ＝３又は＞３、そしてｐ＝１〜５、好適には１である）を表すが、但しＲ₁及びＲ₂の少なくとも一つは、水素以外である）で示されるモノマーの重合若しくは共重合を介してか、又は式（Ｉ）のモノマー類と他の（メタ）アクリルアミド類との共重合により得られる。式（Ｉ）の好適なモノマー類は、３−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−プロパノール（ＡＡＰ）及び４−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−ブタノール（ＡＡＢ）又はそれらのジ−置換モノマー類、３−［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（アクリロイル）］アミノ−１−プロパノール及び４−［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（アクリロイル）］アミノ−１−ブタノールである。特に、ＡＡＰ及びＡＡＢで形成されるポリマー（又はコポリマー）は、良好な親水性、加水分解に対する非常に高い耐性及び増大された有孔性の所望の特性を示している。これらの特性は、混合床の配合物類（例えば、ＡＡＰ及びＡＡＢモノマーとのアガロース／ポリアクリルアミドマトリックス）中にも見いだされている。
本発明は、高収量（＞９８％）かつ高純度（＞９８％）で、該モノマーを得るための合成方法、並びに短鎖のポリ（ＡＡＰ）及びポリ（ＡＡＢ）を製造する重合方法、及びキャピラリーを充填し、アガロースとポリアクリルアミドマトリックスへ混合する両方法を含む。本発明は、長期貯蔵のためのゲル平板の調製、並びに工業的利用、研究及び分析目的のために、すべてのクロマトグラフィー及び動電方法で用いられるクロマトグラフィー用ビーズの製造のための、新規なＡＡＰ及びＡＡＢモノマー類の使用も含む。また、本発明に含まれるものは、ポリ（ＡＡＰ）及びポリ（ＡＡＢ）側面集成化物（laterally-aggregated）（溶液中で予備形成されたポリマーの助けにより）、したがってマクロ多孔性のマトリックスを製造するための方法、並びに以前の特許出願（P.G.Righetti,Italian Patent No.R191 A-003271）でポリ（ＡＡＥＥ）マトリックスに既に適用されている光重合方法を含む。
現在まで報告されたそれらに比べた本マトリックスの利点は、以下に報告されている：
モノ−及びジ−Ｎ−置換ポリアクリルアミドマトリックス類。
図１の実施例は、標準のアクリルアミド並びにＮ−モノ−及びジ−置換アクリルアミドの加水分解動力学を示している。０．１ＮのＮａＯＨに溶解した遊離モノマー類を、所定の時間、７０℃で温置し、次いで中和し、次いで内部標準としてマンデル酸を使用するキャピラリーゾーン電気泳動によって分析した。Beckman system Goldによって、ピーク積分を得た。ゼロ次動力学で崩壊するトリスアクリルを除いて、すべてのモノマーが１次崩壊動力学を示し、したがって、構造のこのタイプに結びつく固有の安定性を示すことが見られる。理論的にアクリルアミドより安定であるべきＮ−置換アクリルアミド類のうち、Ｎ−アクリロイルモルホリンは、これと異なり、より早い崩壊動力学を示している。ここで提案されている新規なモノマーは、また１次動力で崩壊するけれども、加水分解定数（K=0.008 L mol^-1min^-1）を示し、アクリルアミドのそれ（K=0.05 L mol^-1min^-1）より８倍小さい。
安定性での差は、溶液中で遊離であることに代えて、もしモノマー類がポリマーマトリックス中に組み込まれているならば、更に顕著である。図２の実施例において、標準及び置換アクリルアミド類の安定性を、ポリマービーズ中に組み込まれた場合と比較している。所定の時間、０．１NのＮａＯＨ中で加水分解した後、ポリマーの加水分解を、解離した遊離のカルボン酸の直接滴定により測定した。ポリ（アクリルアミド）の場合、アミド基の３０％が温置のわずか２時間で加水分解し、ポリ（トリスアクリル）の場合には１５％であった。これと異なり、Ｎ−置換モノマー類で形成された二つのマトリックス、ポリ（ジメチルアクリルアミド）及びポリ（ＡＡＰ）は、加水分解に対して優れた耐性を示した：初めのものは、４８時間でわずか１．５％分解であったが、ポリ（ＡＡＰ）は、６０時間の加水分解でこの範囲（１．５％）に達した。ポリ（ＡＡＰ）の優れた挙動は、過酷な加水分解条件（１N ＮａＯＨ、１００℃）で示されている：８時間で、加水分解の程度は、ポリ（ＡＡＥＥ）の場合の８％に対し、わずか６．５％であった（図３）。これらの条件において、ポリ（アクリルアミド）ゲルは、急速に崩壊した。このポリ（ＡＡＰ）モノマーの非常に高い抵抗性は、酸性条件下でも示されている：７０℃、０．１N ＨＣｌ（図４）中で、加水分解は１２時間でわずか０．５％であるが、ポリ（ＤＭＡ）では１％、ポリ（アクリルアミド）では６％であった。過酷な条件（１N ＨＣｌ、１００℃）下で、この差は、更に顕著になり：８時間、ポリ（ＡＡＰ）で４０％加水分解に対し、ポリ（ＤＭＡ）及びポリ（アクリルアミド）に対してわずか４時間で７０％であった（図５）。
図６の実施例において、ポリ（ＡＡＰ）の加水分解に対する耐性は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）実験で示されている。二つのゲル平板、ポリ（アクリルアミド）及びポリ（ＡＡＰ）を調製し、０．１N ＮａＯＨ中に７０℃で２時間温置した。
過剰のＮａＯＨを除くために洗浄した後、ゲルを乾燥し、２％両性電解質中ｐＨ３〜１０で再膨潤させた。ＩＥＦの後、陽極と陰極の間のｐＨ勾配を５mmごとの増加でのゲル薄片上で測定した。ポリ（ＡＡＰ）ゲルで、ｐＨ勾配は、ＮａＯＨ処理で影響されないが、ポリ（アクリルアミド）ゲル中で、ｐＨ勾配は完全に酸性化されることが見られる。この最後の現象は、ｐＨ勾配の酸性化及び強い静電流れの原因である遊離のカルボキシル類（ｐＫ４．６）の存在によるものである（P.G.Righetti,Isoelectric Focusing:Theory,Methodology and Applications,Elsevier,Amsterdam,1983）。ポリ（ＤＭＡ）マトリックス類は、ポリ（ＡＡＰ）と同じ挙動を示すが、前者は、それらの強い疎水性（以下を参照）のために、タンパク質のどのような分離にも使用できない。
我々は、加水分解に対する耐性の見地から、ポリ（ＡＡＰ）とポリ（ＤＭＡ）の両方が、優れた安定性を示すことを見ているが、我々は、それらの親水性の相対的特性、マクロ分子の分離のための最も望ましい特性を示さねばならない。その目的のために、これらのモノマーの水性溶液を、ｎ−オクタノールに対する分配に付した。分配した後、水性相をキャピラリー電気泳動により分析し、二つの相で種々なモノマー類のモル比を決定した。図７は、種々な分配係数ｐを示している：トリスアクリルは、はるかに最も親水性分子であるが、一方他のＮ−置換アクリルアミド類は、より疎水性である。しかしながら、アクリルアミドより２倍親水性であるので、ＡＰＰのｐの値は優れている。また、ＡＡＢは、アクリルアミドのそれ（ｐ＝０．２４）に非常に近い。親水性ゲルを得るためのｐの最大の値は、ｐ＝０．３より相当大きくなることはできない：この値より上で、ポリマーは、タンパク質と親水性相互作用を示し、ｐ＝０．５より上でポリマーは、非プロトン性溶媒中でもはや再膨潤することができない。したがって、ポリ（ＤＭＡ）マトリックスは、加水分解に対して優れた耐性を示すけれども、その高い疎水性のために、マクロ分子の分離のために提案することはできない。
そのようマトリックス類（加水分解に対して耐性であり、かつ親水性である）は、電気浸透の流れ（ＥＥＯ）を抑制するためにＣＺＥでのキャピラリーの溶融シリカ壁を被覆するために非常に有用である。ＥＥＯの抑制は、ｐＨ勾配が壁上の荷電により破壊されるので、キャピラリーＩＥＦでは必須であり、タンパク質がイオン化シラノール類に強く吸収されるので、マクロ分子の分離のために必須である。最もよく知られた被覆は、Hjerten（J.Chromatogr.347,1985,191-198）により提案されているものである：キャピラリーを、２官能性試薬（例えば、Bind silane、３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン）で処理し、ポリアクリルアミド糸（架橋剤の不存在で）が、共有的に結合されている。しかしながら、そのような被覆は、アルカリ環境に非常に感受性である；ＩＥＦを実施したとき、ＥＥＯの流れは、はや５回後に表れる。これと異なり、キャピラリーが、線状ポリ（ＡＡＰ）鎖で被覆されているならば、このＥＥＯの流れは、３０回後でもまだ感知できない。溶融シリカの壁とBind silaneの間の結合は、−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−の型であり、それはまたアルカリ条件には不安定である。別のものは、Cobb et al.（Anal.Chem.62,1990,2478-2483）の方法を用いることであり、これはシリカの壁と２官能性試薬の間の直接のＳｉ−Ｃ＝結合を形成させるグリニヤ試薬を用いる。この最後の方法とポリ（アクリルアミド）被覆について、被覆の安定性は、アクリルアミドモノマーの不安定性のために、５から１０回のみである。これとは異なり、この架橋結合がポリ（ＡＡＰ）被覆に結合したとき、ＥＥＯの流れは、１００回後でもまだ感知できない。
本発明の一部は、ポリマーをシリカの壁に錨化する新しい方法でもあり、Bind silaneタイプの試薬を避けるけれども、不安定な−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−結合を形成するばかりでなく、トリ−メトキシ部分の加水分解により、更なる遊離のシラノール（これは、ＥＥＯの流れに更に寄与する）を生成させる。別の方法は、壁にアクリロイルクロリドを結合させることである：この結合は、シロキサン橋より安定であり；更に、この試薬は、モノ−官能性であり、壁に結合して遊離のシラノール類を生成させない。もし壁と反応してこのアクリロイル残基に対して、ポリ（ＡＡＰ）［又はポリ（ＡＡＢ）］糸が結合するならば、被覆は、１００回以上の電気泳動でも安定である。
単一合成工程で、実質的に純粋な生成物（＞９８％）を同様な収率（＞９８％）で製造しうるＡＡＰ（又はＡＡＢ）を合成するための新規な方法は、本発明の一部である。ＡＡＥＥでの以前の特許において我々により提案された合成方法は、標準のSchotten-Baumann反応（水性溶媒中の２N ＮａＯＨ中、０〜５℃でのアミノエポキシエタノールと混合されたアクリロイルクロリド）である。この反応は、非常に低い収率（１５％）であり、遊離のアクリル酸からの混合物の程度が高い。本発明において、アクリロイルクロリドとアミノプロパノール（又はアミノブタノール）が、無水エタノール及び縮合反応中に生成するＨＣｌを中和するために、トリエチルアミン又はＮａＯＨの代わりに、アミノプロパノール（又はアミノブタノール）の２倍モル当量中、−３０℃〜−７０℃、好適には−４０℃で、反応させることによる新規な合成方法が記載されている。このようにして得た生成物（図８）は、ガスクロマトグラフィーの分析（上のパネル）により純粋であった。質量スペクトルは、生成物の同一性を確認し、同様にＮＭＲスペクトル（図９）によっても確証された。
ＣＺＥ中でのタンパク質及び核酸をふるうため、又は該マトリックスの有孔性を調節するためにアガロースとポリ（アクリルアミド）中での添加剤として、短鎖のポリ（ＡＡＰ）［又はポリ（ＡＡＢ）」の製造も本発明の一部である。短鎖ポリマー類の生成物は、そのような鎖の低い粘度のために、キャピラリーを充填及び空にするために非常に有用であり、またより小さい寸法の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド及び１００〜５００ｂｐのＤＮＡ断片）のふるいを大きく改善するに有用である。そのような鎖の合成は、高温（６０〜７０℃）及び２−プロパノールのような連鎖移動剤との同時処理により行われる。この合成は、この工程の間に自己網目形成及びゲル形成が起こるので、ＡＡＥＥモノマーでは可能ではない。
実施例No.1
３−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−プロパノール
温度計、ロート及びアルゴン導入口を備えた３口フラスコに、アクリロイルクロリド０．１Mを導入した。−４０℃に冷却した後、無水エタノール１５０mLを加え、−４０℃に維持し、次いで温度を−４５〜−４０℃に維持しながら、エタノールに溶解した３−アミノ−１−プロパノール０．２Mを滴下により加えた。最後の添加が終了した後、−４０℃で２時間攪拌を続け、次いで５℃で更に５時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をアセトンに溶解した。濾過によりプロパノールアミン塩酸塩を除いた後、モノマー溶液をシリカカラム（生成物／シリカ１：３０比、展開溶媒：アセトン）を通した。溶出液を、０℃で機械ポンプを用いて濃縮した。純粋な生成物（９８％収率）を水に溶解（容量／容量：１：１比）し、ガスクロマトグラフィー、質量分析（図８）及びＮＭＲ（図９）で分析した。この合成において、他の溶媒類（例えば、メタノール、アセトン、クロロホルム）、及び他のアミン類（例えば、トリエチルアミン）を用いると、収率が低くなり、多くの異なる不純物を含む生成物となった。
実施例No.2
短鎖−ポリ（ＡＡＰ）の合成
生成物の分子量を制御するために、高温、２−プロパノールの存在下に短鎖−ポリ（ＡＡＰ）を合成した。１０％のＡＡＰは、２−プロパノールを３％含む水中で調製した。この溶液を脱ガスし、次いでアルゴン下で平衡させた。触媒（ゲル化溶液mL当たり１０％過硫酸アンモニウム１０μL及び純ＴＥＭＥＤの１μL）を加えた後、定温浴中７０℃で２時間重合させた。エタノールでポリマーを沈殿させ、洗浄し、凍結乾燥した。ＤＮＡ断片の分離のために、ＣＺＥでそれを用いるために、標準ＴＢＥ緩衝液（トリス８９mM、ホウ酸塩８９mM及びＥＤＴＡ２mM、ｐＨ８．３）にポリマー６〜８％を溶解した。モレキュラーシーブでの分析は、Ｍｗ約２０００００Ｄａであり、標準条件で調製した同じポリマーは、＞２００００００Ｄａであった。図１０は、８％短鎖−ポリ（ＡＡＰ）の存在下、ＴＢＥ緩衝液でのマーカーＶ（１８〜５００ｂｐからのＤＮＡ断片）の分離を示している：１２３ｂｐと１２４ｂｐの分離を観察することができ、これは典型的に他のふるいシステムでは見られないものである。
実施例No.3
キャピラリー壁の被覆
シラノールを活性化するために、溶融シリカのキャピラリーを、先ず連続還流下に１時間、熱メタノール性ＫＯＨで処理した。１０分間、１N ＨＣｌで処理した後、水で数回洗浄し、次いでアセトンで洗浄し、キャピラリーを、窒素を流しながら、１７０℃でオーブン中で乾燥した。続いて、キャピラリーを、初めに無水トリエチルアミン（流しながら５分）で、次いでアクリロイルクロリド（流しながら５分）での処理を１０回繰り返した。それらの処理の後、キャピラリーに、上記したように予め脱ガスし、ＴＥＭＥＤ及び過硫酸塩を加えた５％ＡＡＰモノマー（架橋剤なしに）溶液を充填した。低温（長鎖ポリマーの成長を促進するために、１０℃）、制御されたｐＨ（被覆の間の加水分解を避けるふために、ｐＨ７）で、重合を１夜行った。キャピラリーを圧力により空にし、水を流し、次いで電気泳動分離に用いた。図１１は、対照のキャピラリー、Bind silaneの存在下でのポリ（ＡＡＰ）で被覆されたキャピラリー、及び２官能性試薬としてのアクリロイルクロリドでポリ（ＡＡＰ）により被覆されたキャピラリーのＥＥＯを示している。これらの最後の二つのキャピラリーのために、ＥＥＯは、６０回の電気泳動の後に測定した。
解説
図１
非置換アクリルアミドと比較した、異なるモノ−及びジ−置換モノマの加水分解の動力学
温和なアルカリ条件（０．１N ＮａＯＨ）での強制された分解。加水分解は、内部標準の存在下でのキャピラリーゾーン電気泳動により、損傷を受けていないモノマーの残留量を定量して評価した。ＡＡＰの優れた効果に注目されたい。略号：ＡＡＰ＝３−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−プロパノール；ＡＡＢ＝４−（Ｎ−アクリロイル）アミン−１−ブタノール；ＡＡＥＥ＝２−［２−（Ｎ−アクリロイル）アミノ］エトキシ−エタノール；２−ＡＡＢ＝３−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−３−メチル−１−プロパノール；Ａｃｒ＝アクリルアミド；３−ＡＡＨＰ＝Ｎ−アクリロイル−３−ヒドロキシ−ピペリジン；４−ＡＡＨＰ＝Ｎ−アクリロイル−４−ヒドロキシ−ピペリジン。
図２
ゲルマトリックス中へ組込み後での、異なるモノマーの加水分解動力学
条件：０．１N ＮａＯＨ、７０℃、６０時間まで。加水分解の程度は、先端分析によりポリマービーズ中の遊離したアクリル酸の等価物を測定することにより評価した。これらの等価物は、ポリマーの加水分解した全アミド基の値％に変換される。一方において、ポリ（アクリルアミド）と他方においてポリ（ＤＭＡ）の反応性の差は５００倍であることに注目されたい（ＤＭＡ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）。
図３
過酷なアルカリ条件（１N ＮａＯＨ、１００℃）でのポリ（ＡＡＥＥ）とポリ（ＡＡＰ）の加水分解動力学
他のすべての条件は、図２と同じ。
図４
温和な条件（０．１N ＨＣｌ、７０℃）での、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ＤＭＡ）及びポリ（ＡＡＰ）の加水分解の動力学
図５
過酷な条件（１N ＨＣｌ、１００℃）での、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ＤＭＡ）及びポリ（ＡＡＰ）の加水分解の動力学
図６
ポリ（アクリルアミド）及びポリ（ＡＡＰ）ゲルの加水分解の電気泳動分析
両方のゲルは、平板上に流延し、０．１N ＮａＯＨ、７０℃、２０分間加水分解に付した。洗浄し、乾燥した後、ゲルをｐＨ３〜１０で２％両性電解質担体中で再膨潤させ、４℃、１５００Ｖで２時間、等電点電気泳動に付した。ゲルを、移動経路に沿って、５mm幅の１７個の片に分割した。１０mMＮａＣｌの３００μLで溶出した後、それぞれの片のｐＨを測定した。
図７
アクリルアミドとＮ−置換誘導体の疎水性の尺度
それぞれのモノマーは、２mM濃度で水性溶液（３．５mL）に溶解し、ｎ−オクタノールの同量と２分間混合した。相分離の後、水性相を２０００rpmで７５分遠心分離した。すべて２５℃で操作した。溶液は、希釈した後、内部標準（ｐＫ９．３Immobiline２．５mM）を加え、ＣＺＥで分析した。略語は図１を参照。他の略号：ＭＭＡ：Ｎ−（モノ−メチル）アクリルアミド；ＡＣＭ：Ｎ−アクリオキシモルホリン；ＴｒｉｓＡ：トリスアクリル；ＤＤ−Ｔｒｉｓ：ジデオキシトリスアクリル。
図８
新規なＮ−置換アクリルアミド類の合成におけるガスクロマトグラフィー質量分析による反応生成物の固定
反応条件：−４０℃、溶媒としてエタノール及びプロパノールアミンの２倍過剰モル当量。上のパネル：ＧＣの様子；下のパネル：ＡＰＰのマススペクトル。これらの反応条件でのみ、実質的に純粋な生成物が得られることに注目されたい。
図９
所望のＡＡＰ反応生成物の同定のための¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル
スペクトルは、Bruker AC-200装置で、溶媒としてＣＤＣｌ₃を用いて記録した。数字１〜６は、分子中の種々の基の同定を示し、それらの式は、スペクトルの上に示されている。ＯＨ−基は、丁度ピーク４の右側の不鮮明なシグナルである。
図１０
ＤＮＡ断片（マーカーＶ）キャピラリー電気泳動
キャピラリー類：７５μm Ｉ．Ｄ．（左のパネル）及び５０μm Ｉ．Ｄ．（右のパネル）、３７cm長さ、ポリ（ＡＡＰ）で被覆。緩衝電解質：トリス−ホウ酸塩８９mM、ＥＤＴＡ２mM、ｐＨ８．３、ふるいの液体ポリマーとして綿状、短鎖ポリ（ＡＡＰ）８％及びエジウムブロミド２．５μMを含む。試料注入：１００V/cmで１５〜２０ｓ。挿入物は、断片１２３ｂｐと１２４ｂｐの分離を示し、典型的には通常のポリ（アクリルアミド）では分離し得ない。
図１１
異なる被覆の溶融シリカキャピラリーでの電気浸透の流れ（ＥＥＯ）
上のカーブは、未処理キャピラリーでのＥＥＯを表している。他の二つのカーブは、Bind Silane（２）又はアクリロイル（３）を介して壁にグラフトされたポリ（ＡＡＰ）で被覆されたキャピラリーでのＥＥＯを示している。ＥＥＯの流れは、中性マーカー（アクリルアミド）を注入して測定し、その移動時間を１０００Ｖ及び異なる背景電解質ｐＨの値で測定した。

Claims

式（Ｉ）：

（式中、Ｒは、水素又はＣＨ₃を表し、Ｒ₁及びＲ₂は、独立して、水素又は式：−（ＣＨ₂）_nＯＨ（ここで、ｎ＝３又は４である）を表すが、但しＲ₁及びＲ₂の少なくとも一つは、水素以外である）で示されるアクリルアミドの（共）重合により、又は該アクリルアミドと他の（メタ）アクリルアミドとの共重合により得られるポリ（Ｎ−置換）アクリルアミドから製造される、電気泳動及びクロマトグラフィー用マトリックス。
３−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−プロパノール及び４−（Ｎ−アクリロイル）アミノ−１−ブタノール、又はそれらのジ−置換誘導体類、３−［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（アクリロイル）］アミノ−１−プロパノール及び４−［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｎ−（アクリロイル）］アミノ−１−ブタノールの重合により、又は該モノマーと適切な親水性化合物類との共重合により得ることができる、請求項１記載のマトリックス。
キャピラリーゾーン電気泳動を含む、すべての動電的分離のための、請求項１又は２記載のマトリックスの使用。
ＤＮＡ配列の決定、平板又はゲル円筒でのキャピラリーゾーン電気泳動を含み、かつドデシル硫酸ナトリウム中での電気泳動によるタンパク質のＭｒの測定のためのすべての動電的方法論、及び固定されたｐＨ勾配を含むすべての等電点電気泳動方法論のための、請求項１又は２記載のマトリックスの使用。