DE60031287T2

DE60031287T2 - Verfahren und kit zur herstellung von trenngelen

Info

Publication number: DE60031287T2
Application number: DE60031287T
Authority: DE
Inventors: Lena Stigh; Ronnie Palmgren
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 2000-10-12
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2020-10-13
Also published as: WO2001029098A2; SE9903748D0; ATE342289T1; AU7664700A; WO2001029098A3; DE60031287D1; EP1230282B1; US7052590B1; EP1230282A2; JP2003512608A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Trenngels. Diese Art von Gels kann verwendet werden zur Trennung verschiedener Arten von Molekülen, wie Biomolekülen, z.B. durch chromatographische Verfahren oder Elektrophorese, insbesondere Gelelektrophorese und Kapillarelektrophorese (CE).
In der Gelelektrophorese, findet der Massentransport in einem Gel statt, während in der Kapillarelektrophorese (CE) der Massentransport im zentralen Kanal einer Kapillare erfolgt, die mit einem hydrophilen Material beschichtet ist.
Gelelektrophorese ist ein weit verbreitet verwendetes Verfahren zum Trennen von Biomolekülen, wie Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren etc. Gelelektrophorese beinhaltet die Wanderung von elektrisch geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld. Eine Lösung, die Biomoleküle enthält, wird in Kontakt mit einem Trägergel angeordnet, ein elektrisches Feld wird angelegt und man lässt die Moleküle auf oder durch das Elektrophoresegel wandern. Eine elektrophoretische Trennung der Moleküle basiert auf dem Unterschied in der Ladungsdichte der Moleküle, wie auch dem Siebeffekt der porösen Gelmedien. Das Ausmaß des Siebens hängt davon ab, wie gut die Porengröße des Gels mit der Größe der wandernden Moleküle übereinstimmt.
Trenngels wurden oft hergestellt durch Polymerisieren von Monomeren, die eine oder mehrere polymerisierbare ungesättigte Strukturen (vorwiegend Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen), im besonderen Vinylgruppen, umfassen. Wenn Monomere mit zwei oder mehr polymerisierbaren ungesättigten Strukturen in der Polymerisationsmischung vorhanden sind, werden vernetzte Polymere gebildet werden. Typischerweise waren die Monomere Acrylate, Methacrylate, Acrylamide, Methacryl amide, Acrylonitrile, Methacrylonitrile, falls anwendbar, Bis-Formen davon, etc. In bestimmten Fällen war das Monomer ein Polymer (Vorpolymer), das eine Mehrzahl von ungesättigten Strukturen trug. Typische Vorpolymere wurden ausgewählt unter Polyhydroxypolymeren, wie Dextran, Agarose und andere Polysaccharide. Siehe US 4,094,832 ; US 4,094,833 , EP 87995 ; WO 9731026, WO 9726071.
Vorherige Polymerisationssysteme nutzen verschiedene Arten von Initiatoren. Typische Initiatoren sind chemisch und thermisch. Thermische Initiatoren werden oft bevorzugt. Sie haben ihre beste Effizienz im Bereich von 50–90°C. Gut bekannte chemische/thermische Initiatoren sind Azo-Verbindungen (z.B. 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril), Azoisonitrile, Peroxide (z.B. Benzoylperoxid), Persulfate. Eine wichtige Art von chemischen Initiatoren erfordert eine Bestrahlung, z.B. UV, um eine Polymerisation zu beginnen. Redox-Systeme sind auch verwendet worden, z.B. Fentons Reagenz (Wasserstoffperoxid +Fe²⁺).
Es gab Probleme verbunden mit der Produktion von Trenngels. Acrylamide z.B. sind oft toxisch. Dies ist von besonderer Wichtigkeit für Elektrophoresegels, weil der Kunde selbst sie oft gießt. Ferner sind Acrylate und Acrylamide empfindlich gegenüber Hydrolyse. Noch ferner besitzen Elektrophoresegels spezifische Erfordernisse in Bezug auf Homogenität und physikalische Stabilität, die manchmal problematisch zu erreichen sein können. Die Menge von restlichem Monomer im Polymer unmittelbar nach der Polymerisation hat oft nachfolgende Waschschritte und dergleichen stark erfordert.
Demzufolge gibt es eine Notwendigkeit für neue Trenngels, z.B. Elektrophoresegels, und/oder verbesserte Verfahren für deren Produktion.
Akashi M et al. (Kuromatogurafi 15(2) (1994) 108–109) testeten ein Gel, das durch Strahlungs-initiierte Polymerisation von N-Vinylacetamid und einer Bis-Form eines Acrylats erhalten wurde, in Kapillarelektrophorese (CE).
Akashi M et al. (JP-Anmeldung 96-43050 (1996)) testeten ein Trennmedium, erhalten durch thermisch initiierte Polymerisation von Vinylamin oder N-Vinylacetamid (Azobis-Initiator). Koshiji J. (JP-Anmeldung 94-167484 (1994)) schlug Hydrogels, die z.B. durch Ammoniumpersulfat initiierte Polymerisation von N-Vinylacetamid oder N-Vinylformamid zusammen mit einem Vernetzer, wie N,N'-Methylenbisacrylamid, erhalten wurde, in Gelelektrophorese vor.
Akashi M et al. (Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, 31, (1993) 1153–1160) beschrieben Hydrogels basierend auf N-Vinylacetamid.
Hashimoto et al. (JP-Anmeldung 95-209781 (1995) beschrieben flüssige Adsorbenzien und Haftvermittler, hergestellt durch UV-initiierte Polymerisation von N-Vinylformamid oder N-Vinylacetamid zusammen mit N,N'-Butylenbis(N-vinylacetamid) als Vernetzer.
Nach unserer Kenntnis wird das Problem mit dem Minimieren der restlichen Monomermenge nach der Polymerisation in keiner dieser Veröffentlichungen diskutiert. Ebensowenig scheint UV-initiierte Polymerisation für die Herstellung von Trenngels wie oben definiert zuvor beschrieben worden zu sein.
Wir haben vernetzte Trenngels gegossen, vorwiegend für Gelelektrophorese, aus N-Vinylcarboxamiden und fanden, dass es schwierig ist, Trenngels zu erhalten, die ausreichend niedrige Mengen eines restlichen Monomers enthalten. Dies betont weiter die Notwendigkeit für Verbesserungen. Wir haben gefunden, dass dieser Nachteil zumindest teilweise neutralisiert werden kann durch

(a) Auswählen von Monomeren, die bei vergleichbaren Geschwindigkeiten polymerisieren, und
(b) Einbauen eines UV-Photoinitiators in der Polymerisationsmischung und Initiieren der Polymerisation durch Bestrahlen der Mischung bei der geeigneten Wellenlänge.

Ein erster Aspekt der Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren für die Herstellung eines Trenngels der oben diskutierten Art. Das Verfahren umfasst die Schritte (i) Bereitstellen einer Polymerisationsmischung, enthaltend ein erstes Monomer (I) mit einer polymerisierbaren ungesättigten Struktur und ein zweites Monomer (II), umfassend zwei oder mehr polymerisierbare ungesättigte Strukturen, und einen Initiator und (ii) Polymerisieren der Mischung. Die charakteristischen Eigenschaften sind, dass das Monomer I ein N-Vinylcarboxamid ist; und dass

(a) das initiierende System für die Polymerisation einen UV-Photoinitiator umfasst und die Polymerisation durch UV-Bestrahlen der Mischung bei einer für den Initiator geeigneten Wellenlänge initiiert wird.

Mit einem N-Vinylcarboxamid ist eine Verbindung gemeint, die die strukturelle Einheit CH₂=CH-NH-COH umfasst, in der einer oder mehrere der Wasserstoffe ersetzt sein kann durch eine organische Einheit/Gruppe, die einen sp³-hybridisierten Kohlenstoff direkt gebunden an den Rest der N-Vinylcarboxamid-Verbindung bereitstellt.
N-Vinylcarboxamide, die als das Monomer I verwendet werden sollen, besitzen ein niedriges Molekulargewicht, z.B. unter 5000 Dalton, z.B. unter 2000 Dalton. Alkylgruppen und/oder Wasserstoffe sind an die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung oder einen Amidstickstoff oder einen Carbonylkohlenstoff gebunden. Andere Alkylgruppen als Methyl enthalten bevorzugt nicht-geladene oder nicht-ladbare hydrophile Substituenten, wie Hydroxy- oder -(CH₂CH₂O)_nH.
In einem bevorzugten Modus der Erfindung besitzt das Monomer I die Formel CH₂=CR³-NR²-CO-R¹ in der R¹, R² und R³ unabhängig stehen für Wasserstoff oder ein niederes Alkyl, wie C_1-10-Alkyl, z.B. Methyl. Im Falle, dass irgendeiner von R¹, R² und R³ für C_1-10-Alkyl steht, enthält er einen oder mehrere der oben diskutierten hydrophilen Substituenten. Im bevorzugten Monomer I dieser Art steht die Alkylgruppe für Methyl und mindestens ein R² und R³ steht für Wasserstoff. Die Monomere mit der Formel I umfassen die folgenden Verbindungen:
Monomere der Formel I können synthetisiert werden gemäß in der Technik bekannter Verfahren, z.B. wie beschrieben für N-Vinylacetamid durch M. Akashi et al. (1993) Journal of Polymer Science: Part A: Polymer Chemistry, Band 31, Seiten 1153–1160.
Monomer II besitzt zwei oder mehr polymerisierbare ungesättigte Strukturen, wie Vinylgruppen, und kann als Vernetzer wirken. Diese Art von Struktur kann veranschaulicht werden durch von Acrylsäure abgeleiteten Gruppen (Acrylamido- oder Methacrylamido- oder Acrylat- oder Methacrylat- etc. Gruppen). Diese Art von Vernetzern kann gefunden werden unter Verbindungen, die zwei oder mehr N-Vinylcarboxamido-Gruppen (mit Bevorzugung für derartige Formamido- oder Acetamido-Gruppen) oder zwei oder mehr Acrylat- oder Methacrylat-Gruppen tragen. Zwei oder mehr polymerisierbare ungesättigte Strukturen, wie Acrylatgruppen, oder Methacrylatgruppen können verbunden werden über einen veresterten Alkohol, der zwei oder mehr Hydroxygruppen enthält, z.B. Ethylenglykol und oligomerisierte und polymerisierte Formen davon, verschiedene Formen von Zuckeralkoholen, Propylendiolen, Butylendiolen, etc.
In bevorzugten Modi der Erfindung enthält die Polymerisationsmischung mindestens eine vernetzende Verbindung, die ein MonomerI/MonomerII-Reaktivitätsverhältnis wie unten diskutiert bereitstellt.
Vorpolymere, z.B. ein Polyhydroxypolymer, der oben erwähnten Art, die eine Mehrzahl von N-Vinylcarboxamidgruppen tragen, bilden eine Gruppe von Monomeren, die möglicherweise sowohl als Monomer I als auch als Monomer II fungieren werden. Wenn sie in der Polymerisation vorhanden sind, benötigt diese Art von Vorpolymeren deshalb nicht notwendigerweise, dass zusätzliche Monomere, die eine oder zwei polymerisierbare ungesättigte Strukturen tragen, vorhanden sind. Diese Art von N-Vinylcarboxamiden besitzt typischerweise Molekulargewichte über 2.000 Dalton, wie über 5.000 Dalton. Die Anzahl von monomeren Einheiten in einem Vorpolymer kann ausgewählt werden gemäß derselben Regeln, wie sie für andere Vorpolymere bekannt sind, die ungesättigte Strukturen tragen. Siehe U.S. 4,094,832; U.S. 4,094,833; EP 87995 ; WO 9731026, WO 9726071. Daher kann es von 5 bis zu 100 oder sogar mehr, wie bis zu 1.000, 10.000 oder 100.000 monomere Einheiten in einem Vorpolymer geben. In den bevorzugten Varianten sind im wesentlichen all die N-Vinylcarboxamid-Gruppen in einem Vorpolymer identisch. Der Substitutionsgrad in Bezug auf N-Vinylcarboxamid-Gruppen kann ausgewählt werden gemäß derselben Regeln, wie sie für andere Vorpolymere bekannt sind, die polymerisierbare ungesättigte Strukturen tragen. Siehe z.B. U.S. 4,094,832; U.S. 4,094,833; EP 87995 ; WO 9731026; und WO 9726071.
Um die relative Reaktivität zweier Monomere zu bestimmen, studiert man oft, wie die Monomere in die wachsende Polymerkette während der Polymerisation eingebaut worden sind. Die relative Reaktivität kann ausgedrückt werden in Form eines Monomer-Reaktivitätsverhältnis (MonomerI/MonomerII). Im Falle, dass die Monomere willkürlich über die Kette aufgefunden werden, zeigt sich dies in einem Monomer-Rreaktivitätsverhältnis, das um 1 beträgt. Im Falle, dass das Monomer I überwiegt, wird das Monomer I eine höhere Reaktivität besitzen, und das Monomer-Reaktivitätsverhältnis wird daher größer als 1 sein. In allgemeinen Begriffen umfasst die Bestimmung von Monomer-Reaktivitätsverhältnissen: Gießen der Polymerisationsmischung nach der Polymerisation in ein Lösungsmittel, z.B. Methanol und Isolieren der Polymerketten. Die Zusammensetzung der Ketten kann bestimmt werden auf verschiedene Arten, abhängig von dem verwendeten besonderen Monomer, z.B. im Falle von Amidmonomeren durch Stickstoffanalyse. Das Monomer-Reaktivitätsverhältnis kann dann berechnet werden aus den Daten, die durch ein Kurven-Fit-Verfahren erhalten werden. Siehe z.B. Lindeman et al., Macromolecules 30 (1997) 4073–4077; Otsu et al., 13 (1975) 505–510; George et al,. J. Polymer Sci.: Part A; Polymer Chemistry 28 (1990) 2585–2596).
In der vorliegenden Erfindung liegt das Monomer-Reaktivitätsverhältnis (MonomerI/MonomerII) typischerweise im Intervall von 0,2 bis 5, wie im Intervall von 0,5 bis 2, d.h. die Reaktivitäten des Monomers I und des Monomers II sind vergleichbar.
Nicht-vergleichbare Reaktivitäten zwischen 2 Monomeren können sich in einer vergrößerten Menge von restlichen unpolymerisierten Monomeren im Polymerisationsprodukt unmittelbar nach der Polymerisation zeigen (gemessen als eine Menge eines restlichen Monomers relativ zur zugegebenen Gesamtmenge desselben Monomers oder des erzeugten Gels).
Die Menge eines restlichen Monomers sollte so gering wie möglich sein, typischerweise unter 0,1 Mol-% der Gesamtmenge des zugegebenen bestimmten Monomers oder unter 1 % (w/w) des gebildeten Gels.
Monomer I und Monomer II sollten ausgewählt sein unter Monomeren, die bei einer Copolymerisation ein vernetztes Polymer ergeben, das in Wasser quellbar ist, d.h. das Wasser adsorbieren kann, ohne sich selbst aufzulösen. Die Absorbanz von Wasser liegt typischerweise im Intervall von 10 bis 100 g, mit einer Bevorzugung für 25 bis 50 g, Wasser pro Gramm trockenem Polymer.
Die Polymerisationsmischung kann gegebenenfalls auch polymerisierbare Monomere umfassen, die eine ungesättigte Struktur tragen, die eine andere ist, als jene, die für das Monomer I spezifiziert ist, z.B. kann sie eine Monovinylverbindung sein, wie ein Monoacryl- oder ein Monomethacrylamid oder ein Monoacrylat- oder ein Monomethacrylatester. Monomer III kann ausgewählt sein, um ein Monomer-Reaktivitätsverhältnis (Monomer I/Monomer III) um 1 im selben Sinn wie für MonomerI/MonomerII bereitzustellen.
Die Polymeristation erfordert ein initiierendes System, das typischerweise einen Initiator umfasst. Der Initiator kann ausgewählt sein gemäß zuvor bekannter Regeln. Siehe oben. Die bevorzugten Systeme werden photoinitiiert und umfassen einen UV-Photoinitiator, der aktiviert werden kann durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht (UV). Es gibt zwei typische Arten von UV-Photoinitiatoren: 1) Jene, die eine intramolekulare Bindungsspaltung durchlaufen, z.B. Acetophenonderivate mit und ohne Freisetzung von Gasen (z.B. Stickstoff für Azoinitiatoren) und 2) jene, die eine intermolekulare N-Abstraktion durchlaufen, z.B. Benzephenone, Benzile und Chinone. Typische Initiatoren sind 1-Hydroxycyclohexylphenylketon (Irgacure 184^TM), Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (Lucrin TPO^TM), Phenyl-2-hydroxy-prop-2-yl-keton (Darocur 1173^TM), 2-Hydroxyethoxyphenyl-2-hydroxy-prop-2-yl-keton (Iracure^TM 2959), Azobisisobutyronitril (AIBN), 2,2'-Azobis-{2-methyl-N-[1,1-bis(hydroxymethyl)hydroxyethyl]propionamid}, oder 2,2'-Azobis-[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamid].
Die bevorzugten Initiatoren sind UV-Initiatoren, die über intramolekulare Bindungsspaltung wirken, mit einer Bevorzugung für jene, die kein Stickstoffgas freisetzen (nicht-Azo-UV-Initiatoren). Die Nachteile von Azo-UV-Initatoren sind, dass sie zu Gasbläschen (Stickstoff) im Gel führen können. Dies kann das Lesen des Gels nach der Elektrophorese und auch sein kosmetisches Erscheinungsbild stören. Ein bevorzugter Initiator beim Einreichen der Priorität war Phenyl-2-hydroxy-prop-2-yl-keton (Darocur 1173^TM).
In der Polymerisationsmischung werden wirksame Konzentrationen des Monomers I typischerweise ausgewählt innerhalb des Intervalls 1–4 M, mit einer Bevorzugung für innerhalb des Intervalls 2–3,5 M. Die wirksamen Konzentrationen des Monomers II (vernetzende Verbindung) werden typischerweise gefunden im Intervall von 20–100 mM, mit einer Bevorzugung für 25–55 mM. Die Menge des Monomers I relativ zum Monomer II wird typischerweise gefunden im Intervall 50–140 (Molverhältnis). Die Menge des Monomers I relativ zum Monomer II kann entlang der beabsichtigten elektrophoretischen Transportrichtung variieren, und so die Herstellung von Gradientengels ermöglichen. Wirksame Initiatorkonzentrationen werden typischerweise gefunden im Intervall von 3–8 mM.
Die genauen Mengen des Monomers I, des Monomers II, des Initiators etc., die Anlass geben werden für nützliche Trenngels, wird abhängen von den ausgewählten Monomeren und dem ausgewählten Initiator und muss von Fall zu Fall bestimmt werden.
Die oben angegebenen Bereiche beziehen sich auf Fälle, in denen die Monomere niedrige Molekulargewichte wie oben diskutiert besitzen, d.h. hauptsächlich eine, zwei oder drei polymerisierbare ungesättigte Strukturen pro Molekül.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Biomolekülen auf einem Elektrophoresegel, hergestellt durch das oben beschriebene Verfahren. Die Erfindung umfasst auch ein Trenngel, insbesondere ein Elektrophoresegel, erhältlich durch das Verfahren zur Herstellung von Trenngels.
In einem dritten Aspekt umfasst die Erfindung ein Kit zur Verwendung bei der Herstellung eines Elektrophoresegels, wobei das Kit umfasst

(i) ein Monomer (I), das eine N-Vinylcarboxamid-Gruppe trägt;
(ii) ein Monomer (II), das zwei oder mehr polymerisierbare ungesättigte Strukturen trägt,
(iii) eine UV-Initiator-Verbindung, und
(iv) einen Puffer und/oder ein denaturierendes Mittel;

Die Monomere (Vernetzer oder Nicht-Vernetzer), die Initiatoren einschließlich ihrer aboluten und relativen Mengen, die in dem Kit enthalten sein sollen, ergeben sich aus dem, was oben im Kontext der Polymerisationsmischung gesagt worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Trenngel wie oben definiert hergestellt, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen einer Polymerisationsmischung, umfassend die oben erwähnten Vorpolymere, die eine Mehrzahl von N-Vinylcarboxamidstrukturen wie in der Technik für zuvor bekannte Vorpolymere tragen, die andere Arten von Gruppen tragen, mit einer polymerisierbaren Nicht-Sättigung (Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, insbesondere), und
(b) Polymerisieren der Mischung durch UV-Bestrahlung bei Vorhandensein eines UV-Photoinitiators.

Bevorzugt ist das Vorpolymer ein Polyhydroxypolymer, z.B. mit einer Polysaccharidstruktur. Das Initiatorsystem ist enthalten in der Polymerisationsmischung und kann ein beliebiges der oben diskutierten Initiatorsysteme sein. Monomere niedrigen Molekulargewichts der oben diskutierten Art, wie Monomer I, Monomer II und/oder Monomer III, ohne spezifisch mit den Kriterien von vergleichbaren Reaktivitäten übereinzustimmen, können in der Polymerisationsmischung enthalten sein. Siehe ferner U.S. 4,094,832; U.S. 4,094,833; EP 87995 ; WO 9731026, WO 9726071.
Experimenteller Teil
A. Polymerisationsexperimente
A1. Photopolymerisation mit N-Vinylformamid als Monomer I.
Initiator (0,01 mmol), N-Vinylformamid (Monomer I, (20 mmol, 2 ml) und Bisacrylamid (Monomer II, 15 mg) wurden mit 2,5 ml Wasser in einer kleinen Petrischale gemischt und unter UV-Licht (350 nm) 10 min lang angeordnet. Die vier verwendeten Initiatoren waren Irgacure 184^TM (1-Hydroxycyclohexylphenylketon, Ciba-Geigy), AIBN (Azo-bis-isobutynitril, Merck), VA-080^TM (2,2'-Azo-bis{2-methyl-N[1,1-bis(hydroxymethyl)-2-(hydroxethyl]propionamid}, Wako) und VA-086^TM (2,2'-Azo-bis-[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamid], Wako).
Klare transparente elastische Gels wurden mit allen drei Azo-Initiatoren gebildet. Das Gel mit VA-086 als der Initiator enthält die geringste Anzahl von Blasen. Irgacure 184 ergab nicht so gute Gels wie es die Azo-Initiatoren taten. Die Gels waren, wenn Irgacure 184 verwendet wurde, klebriger und die mechanischen Eigenschaften waren schlechter, sogar wenn die Konzentration erhöht wurde.
A2. N-Vinylformamid. Gelbildung mit verschiedenen Initiatoren und verschiedenen Konzentrationen eines Vernetzers
Gemäss der Literatur initiiert Kaliumpersulfat nicht eine N-Vinylacetamid-Polymerisationsreaktion in wässrigen Lösungen, da das Monomer mit dem Ersteren reagiert, um Hydrolysate zu ergeben. Benzoylperoxid ist auch keine gute Wahl, da es ein nicht wirksamer Initiator der NVA-Polymerisation in protischen Lösungsmitteln ist, was zu geringen Ausbeuten führt. (Kirsh, Y. E. (1998). Radical polymerization. Water soluble poly-N-vinylamides: Synthesis and Physiochemical properties; Seiten 36–80). Persulfate und Benzoylperoxide werden aus offensichtlichen Gründen nicht getestet.
Die Gelbildung mit N-Vinylformamid als Monomer (I) unter Verwenden verschiedener Initiatoren und verschiedener Konzentrationen des Vernetzers Bisacrylamid (Monomer II), wurde studiert. Die studierten Initiatoren waren dieselben wie jene, die oben in Beispiel 1(b) erwähnt sind.
Die Gels wurden hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1(b) und untersucht auf Qualität, Anzahl von Blasen, Grad der Klarheit und restliche Monomere.
Die Ergebnisse zeigten, dass der Azo-Initiator VA-086^TM (2,2'-Azo-bis-[2-methyl-N-(2-hydroxyethyl)propionamid] besonders gute Ergebnisse ergab, wenn er bei einer Konzentration zwischen 0,5 und 2,5 mM verwendet wurde. Die optimale Initiatorkonzentration scheint 1 mM und darunter zu sein. Eine Bisacrylamidkonzentration zwischen 10 und 40 mm, bevorzugt um 25 mM, wurde als geeignet befunden.
A3. N-Vinylacetamid. Gelbildung mit verschiedenen Initiatoren
Die ausgewählten Initiatoren waren Irgacure 651 (Ciba Geigy), Irgacure 2959, (Ciba Geigy), Darocur 1173 (Ciba Geigy), Benzoinethylether (Aldrich) Quantacure QTX (Ward Blenkeninsop & Co Ltd), Methylenblau, Lucirin TPO (BASIS Kemi) zusammen mit TEMED (Amersham Pharmacia Biotech) und Darocur 1173 gemischt mit TEMED plus Lucirin TPO.
Beim anfänglichen Testen der verschiedenen Initiatoren wurden die Polymerisationen in Glaspetrischalen ausgeführt. Monomer I war N-Vinylacetamid und Monomer II war Bisacrylamid. Die Konzentration der Initiatoren wurde variiert. Die Gels wurden auf restliche Monomere, Quellgrad und ungefähre mechanische Eigenschaften getestet.
Quantacure war vielversprechend gemäß der mechanischen Eigenschaften und Monomerreste, ergab aber gelbe Gels. Die niedrigste Menge von Monomerresten wurde in Gels gefunden, die durch Darocur 1173 initiiert waren. Siehe Beispiel 4.
A4. N-Vinylacetamid. Polymerisation, angepasst, um eine niedrige Menge von restlichem Monomer zu ergeben.
N-Vinylacetamid (Monomer I, NVA) (Showa Denko, 1,55 ml von 9 M), Darocur 1173 (280 μl von 100 mM in Ethylenglykol), Bisacrylamid (Monomer II) (1,0 ml von 120 mM) und Milli-Q-Wasser werden in einer Petrischale gemischt. Die Gels werden dann durch UV-Licht 20 min lang polymerisiert. Die Platten werden annähernd 10 cm unter den Solariumröhren angeordnet. Die UV-Quelle bestrahlt mit einer Wellenlänge von annähernd 350 nm.
Dies führt zu einem Gelrezept mit der Konzentration von 3,5 M N-Vinylacetamid, 30 mM Bisacrylamid und 7 mM Darocur 1173.
Das erzeugte Gel wurde auf restliche Monomere, Quellgrad und mechanische Eigenschaften getestet.
Das Gel ergab weniger als 0,1 Mol-% Reste pro Mol NVA, was weniger ist als 1 Gew.-% des Gelgewichts. Siehe Teil B des experimentellen Teils. Ein getrocknetes Gel des oben angegebenen Rezepts quoll 38 mal in Bezug auf sein Gewicht nach 3 Tagen in überschüssigem Wasser.
A5. Gelbildung mit verschiedenen Arten von Monomer II (Vernetzer)
Die folgenden Vernetzer wurden als Monomer II getestet:
Poly(ethylenglycol)dimethacrylat Mw ≈ 330 (Aldrich)
Poly(ethylenglycol)dimethacrylat Mw ≈ 400 (Röhm)
Poly(ethylenglycol)dimethacrylat Mw ≈ 550 (Aldrich)
Poly(ethylenglycol)dimethacrylat Mw ≈ 875 (Aldrich)
Poly(ethylenglycol)diacrylat Mw ≈ 575 (Aldrich)
Poly(ethylenglycol)dimethacrylat Mw ≈ 330 (Aldrich)
1,4-Bis(acryloyl)piperazin (Fluka)
Pentaerythritoltriallylether (Aldrich)
Divinylglycol (Polysciences Inc.)
Glyceroldimethacrylat (Aldrich)
Eine Polymerisation ist ausgeführt worden auf eine ähnliche Weise wie in A3 und A4.
Variierte Parameter waren die Konzentration des Vernetzers, die Konzentration von N-Vinylacetamid und die Konzentration des Initiators Darocur 1173. Die Gels wurden durch HPLC und Elektrophorese analysiert. Das am meisten versprechende Gel wird erhalten mit Poly(ethylenglycol)dimethacrylat und Poly(ethylenglycol)diacrylat als Monomer II. Die anderen Vernetzer ergaben höhere Gehalte von Monomerresten oder niedrigerer mechanischer Stärke in ausgeführten Experimenten.
Die mechanischen Eigenschaften sind so gut wie ein Polyacrylamidgel und die Gels sind transparent.
Bevorzugte Konzentrationen in den Polymerisationsmischungen sind 2–3,5 M N-Vinylacetamid (Monomer I), 25–55 mM Vernetzer und 3–7 mM Initiator.
Dies ergibt Gels, die 25–50 mal in Bezug auf ihr Gewicht in überschüssigem Wasser für 3 bis 5 Tage quellen.
A6. Polymerisation von Gels für Elektrophorese
Wenn eine Polymerisation eines Gels für Elektrophorese ausgeführt wird, enthält die Polymerisationmischung typischerweise einen Puffer. In diesem Beispiel wird ein Tris-Puffer gewählt.
Die Qualität der Glasplatten ist wichtig. Sie sollte nicht zuviel der erforderlichen Wellenlänge absorbieren. Für eine vertikale Gelelektrophorese werden die Glasplatten mit Spacern in einem Dual-Gel-Caster montiert.
N-Vinylacetamid (2666 μl 9 M), Darocur 1173 (84 μl 1 M in Ethylenglycol), Bisacrylamid (1666 μl 120 mM), Tris-Puffer (2000 μl 1,5 M) und Milli-Q-Wasser (1584 μl) werden gemischt. Die Kassette wird mit der Gellösung von oben gefüllt. Der Kamm wird dann oben angeordnet und das Gel wird durch UV-Bestrahlung 20 min lang polymerisiert.
Neben der Elektrophorese wurde das Gel auf Hydrolyse und restliche Monomere getestet.
B. Funktionale Testprotokolle und analytische Protokolle zum Testen von restlichen Monomeren und der Stabilität gegen Hydrolyse.
B1. Elektrophorese in einem Poly-N-vinylformamid-Gel
Ein Poly-N-vinylformamid-Gel wurde hergestellt durch Mischen von 375 μl VA-086^TM (50 mM in Wasser); 2,3 ml Bisacrylamid (20 mg/ml); 4,5 ml konz. N-Vinylformamid; 3,1 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,6); und 2,1 ml Wasser. Ein Standard-Polyacrylamidgel wurde hergestellt zum Vergleich. Beide Gels wurden in Plastikkassetten durch Initiation mit UV-Licht (35 nm) 10 min lang polymerisiert. Das Poly-N-vinylformamid-Gel war gleichermassen klar und transparent wie das Polyacrylamidgel.
Die Gels wurden mit vorgefärbtem Molekulargewichtsmarker-Proteinen (4–250 kDa) beladen und man ließ sie bei konstantem Strom (20 mA pro Gel) und Standard-Denaturierungsbedingungen 52 min laufen. Die Gels wurden unmittelbar nach der Elektrophorese gescannt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Trenneigenschaften des Poly-N-vinylformamids gleich dem Standard-Polyacrylamidgel waren. Es gab eine Trennung von Proteinbändern entsprechend Markerproteinen von 16–105 kDa.
B2. Elektrophorese in einem Poly-N-vinylacetamid-Gel.
Ein Poly-N-vinylacetamid-Gel wurde hergestellt durch Mischen von 270 μl VA-050^TM (50 mM in Wasser); 2,1 ml Bisacrylamid (120 mM); 3,5 ml N-Vinylacetamid (9 M); 2,25 ml Tris-HCl (1,5 M, pH 8,6); und 0,88 ml Wasser. Die Gels wurden polymerisiert zwischen Glasplatten durch Inititation mit UV-Licht (350 mM) 10 min lang. Das Poly-N-vinylacetamid-Gel war gleichermassen klar und transparent wie das Polyacrylamid-Gel. Die Gels wurden mit vorgefärbtem Molekulargewichtsmarker-Proteinen (4–250 kDa) beladen und man ließ sie bei konstantem Strom (20 mA pro Gel) 72 min und Standard-Denaturierungsbedingungen laufen. Die Gels wurden unmittelbar nach der Elektrophorese gescannt.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Trenneigenschaften des Poly-N-Vinylacetamids gut waren. Es gab eine Trennung von Proteinbändern entsprechend Markerproteinen von 6–260 kDa.
B3. Analyse von Monomerresten durch HPLC
Ein polymerisiertes Gel wird ausgewogen und in einem Becher mit 120 g Milli-Q-Wasser angeordnet. Der Becher wird mit Parafilm bedeckt und zum Rühren 3 bis 5 Tage stehen gelassen. Eine Wasserprobe wird aus dem Becher entnommen und verdünnt auf eine geeignete Konzentration. Vor der Injektion der Probe wird eine Verdünnungsreihe des Monomers erzeugt und beim HPLC injiziert.
Die HPLC-Bedingungen sind isokratisches 7%-iges Acetonitril mit einem Fluss von 1 ml/min und einer Wellenlänge von 225 nm. Die Säule ist eine HP-Hypersil 5 μm 125*2 mm, 79926 18-562.
Der Prozentsatz des Monomers wird gegen die obere Fläche der Standardproben aufgetragen. Die Gleichung der Linearkorrelation wird dann verwendet, um die Konzentration der Probe zu bestimmen. Der Verdünnungsfaktor, das Gewicht des übertragenen Gels und das Gewicht von zugegebenem Wasser wird dann berücksichtigt, um den Gewichtsprozentsatz von Monomerresten des Gels zu bestimmen.
B4. Stabilitätstests von N-Vinylacetamidgels.
Sechs Gels wurden gemäß Beispiel A4 gegossen. Die Gels wurden mit Wasser gewaschen für mehrere Tage, bis keine Monomerreste gemäß HPLC zurückgelassen werden. Die Gels wurden in einen Becher jeweils mit 50 ml von entweder 0,1 M NaOH, 0,1 M HCl oder Wasser gegeben und für einen und drei Tage stehengelassen. Acrylamidgels waren auf dieselbe Weise früher behandelt worden.
Die Gels wurden in Viertel unterteilt. Ein Viertel der Gels wurde ausgewogen und homogenisiert durch einen Handmischer. 50 ml Milli-Q-Wasser wurde zugegeben und die Mischung wurde titriert mit entweder 0,1 M NaOH oder 0,1 M HCl, abhängig vom Ausgangs-pH. Wasserproben wurden entnommen und man ließ sie auf einem LC-MS laufen.
Keine Hydrolyse erfolgte in den Wasserproben, Säureproben und nicht nach einem Tag in Base.
Nach drei Tagen einer basischen Hydrolyse trat eine 2-Schritt-Titrationskurve auf, die ein Hydrolyseprodukt anzeigte. Mögliche Hydrolyseprodukte sind Essigsäure und vielleicht Polyvinylamin. LC-MS zeigte eine Molekulargewichtsspitze bei 60,2, die stützt, dass Essigsäure das detektierte Hydrolyseprodukt ist.
Verglichen mit den Polyacrylamidgels ist das N-Vinylacetamidgel viel widerstandsfähiger gegenüber Hydrolyse.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Trenngels, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen einer Polymerisationsmischung, enthaltend ein erstes Monomer (I) mit einer polymerisierbaren ungesättigten Struktur und ein zweites Monomer (II), umfassend zwei oder mehr polymerisierbare ungesättigte Strukturen, und einen Initiator, und (ii) Polymerisieren der Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomer I ein N-Vinylcarboxamid ist; und dass (a) das initiierende System für die Polymerisation einen UV-Photoinitiator umfasst und die Polymerisation durch UV-Bestrahlen der Mischung bei einer für den Initiator geeigneten Wellenlänge initiiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend (b) Vorauswählen des Monomers I und des Monomers II, damit sie vergleichbare Reaktivitäten besitzen, die in das wachsende Polymer eingebaut werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das N-Vinylcarboxamid ausgewählt ist unter N-Vinylformamid, N-Methylvinylformamid, N-Methyl-N-vinylformamid, N-Vinylacetamid und N-Methyl-N-vinylacetamid.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Initiator durch intramolekulare Bindungsspaltung aktiviert wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Initiator ein Nicht-Azo-Initiator ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Initiator ein Phenylketon mit einem Hydroxy-Substituenten an der Postion 2 in bezug auf die Carbonylgruppe (α-Substituent) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomer II N-N'-Methylenbisacrylamid ist und der Initiator ein UV-Photoinitiator ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomer II ein Bismethylacrylat oder Bisacrylat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomer I dem Monomer II gleich ist und ein Polyhydroxypolymer ist, das eine Mehrzahl von M-Vinylcarboxamid-Strukturen trägt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Monomer I und das Monomer II vergleichbare Reaktivitäten besitzen.
Verfahren für die Trennung von Biomolekülen auf einem Elektrophoresegel, wobei das Elektrophoresegel ein Trenngel ist, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 hergestellt ist.
Trenngel, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Kit zur Verwendung bei der Herstellung eines Elektrophoresegels, wobei das Kit umfasst (a) ein Monomer (I), das eine N-Vinylcarboxamid-Gruppe trägt; (b) ein Monomer (II), das zwei oder mehr polymerisierbare ungesättigte Strukturen trägt, und (c) eine UV-Initiator-Verbindung, (d) einen Puffer und/oder ein denaturierendes Mittel; wobei die Monomere (I und II) ausgewählt sind, um vergleichbare Reaktivitäten bereitzustellen.