DE602005000858T2

DE602005000858T2 - Saccharid-messender fluoreszierender Monomer, Saccharid-messende fluoreszierende Sensor-Substanz und implantierbarer, Saccharid-messender Sensor

Info

Publication number: DE602005000858T2
Application number: DE602005000858T
Authority: DE
Inventors: Shouji Terumo K.K. Ochiai; Tetsuro Terumo K.K. Kawanishi; Atsushi Terumo K.K. Matsumoto
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2004-07-23
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2025-07-21
Also published as: US20080021236A1; US20060020182A1; US7524985B2; EP1619229A1; DE602005000858D1; EP1619229B1; US7388110B2; ATE359339T1; US20080319288A1; US7873398B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung:
Diese Erfindung bezieht sich auf fluoreszierende Monomerverbindungen, Fluoreszenz-Sensor-Substanzen, deren Herstellungsverfahren, und implantierbare, Saccharid-messende Sensoren, die von diesen Gebrauch machen. Diese fluoreszierenden Monomerverbindungen, Fluoreszenz-Sensor-Substanzen und die implantierbaren, Saccharid-messenden Sensoren sind ausgezeichnet in der Fähigkeit, Saccharide zu detektieren.
Beschreibung des Standes der Technik:
Implantierbare Sensoren sind verwendbar für die Beobachtung des Voranschreitens krankhafter Zustände, des Überwachens therapeutischer Effekte und für die Zwecke verschiedener Krankheiten, und in den letzten Jahren war deren Entwicklung eines der aktiven Forschungsgebiete. Insbesondere in der Behandlung von Diabetes wird die Kontrolle des Blutzuckers durch kontinuierliche Blutzuckermessung als ein Beitrag zu einer Verzögerung des Voranschreitens der krankhaften Zustände und zu einer Verringerung in der Entwicklung von Komplikationen erachtet.
Für die Selbstkontrolle des Blutzuckers entnehmen viele der jeweiligen Diabetiker Blutproben durch Punktion ihrer Finger, und geben diese in Blutzuckermessgeräte ein, um die Messungsergebnisse abzulesen. Allerdings beinhaltet diese Methode die Probleme des Verursachens von Schmerzen bei den Patienten und den Mangel an Einfachheit, so dass es nicht praktisch ist, mehrere Messungen an einem Tag durchzuführen. Unter den vorliegenden Umständen ist es somit schwierig, den Trend der Schwankungen im Blutzuckerspiegel über häufige Messungen zu überprüfen. Aus diesen Gründen wird erachtet, dass implantierbare, kontinuierliche Blutzuckermessgeräte eine hohe Verwendbarkeit besitzen.
Dagegen wurden über viele Jahre Techniken hinsichtlich der kontinuierlichen Messung des in-vivo-Glucosespiegels entwickelt. Solche Techniken beinhalten beispielsweise die Messung des Glucosegrades, welche auf einer Veränderung der Fluoreszenzintensität beruht durch Verwenden einer Substanz, die reversibel mit Glucose reagiert, um eine Fluoreszenz zu emittieren. Als eine solche fluoreszierende Substanz offenbart JP 8-53467 A eine Fluoreszenz-emittierende Verbindung mit einer Molekularstruktur, die mindestens einen Phenylboronsäure-Rest und mindestens ein Amin-bereitstellendes Stickstoffatom enthält, wobei das Stickstoffatom angeordnet ist in der Nachbarschaft des Phenylboronsäure-Restes, um intramolekular mit dem Boronsäure-Rest zu interagieren. Als Fluorophor wird beispielsweise verwendet eine Naphthylgruppe oder eine Anthrylgruppe. Bei Erzeugung eines stabilen Komplexes mit einem Saccharidmolekül über den Phenylboronsäure-Rest emittiert die Verbindung eine Fluoreszenz.
Als Indikator-Makromolekül für das Detektieren der Konzentration eines Analyten in einer wässerigen Umgebung offenbart WO 02/12251 A1 ein Copolymer eines hydrophilen Monomers und eines Excimer-bildenden polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffes wie einem Anthracen-Derivat (einschließlich Borat). Da der Excimer-bildende polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoff in der Wasserlöslichkeit nicht ausreichend ist, werden hydrophile Gruppen wie Methacrylamidgruppen eingeführt, so dass die Konzentration eines Analyten sogar in einer wässerigen Umgebung detektiert werden kann.
Des weiteren offenbart das U.S. Patent 6,319,540 A1 ein Verfahren für das direkte Immobilisieren einer fluoreszierenden Substanz in einer Festphase wie einem Kunststofffilm, um einen Fluoreszenz-Sensor bereitzustellen. Angewendet im U.S. Patent 6,319,540 A1 wird eine fluoreszierende Substanz, gebildet aus einer Atomgruppe, die eine lichtemittierende Eigenschaft, eine Fluoreszenz-emittierende Eigenschaft und eine farberzeugende Eigenschaft besitzt, wobei nur ein Phenylboronsäure-Rest zu der Atomgruppe hinzugefügt ist.
Allerdings enthält die in JP 8-53467 A offenbarte Verbindung als Fluorophor einen sperrigen Kohlenwasserstoffrest wie eine Naphthylgruppe oder eine Anthrylgruppe, und daher ist deren Binden an ein wasserlösliches Saccharid nicht leicht. Demgemäß besteht ein Bedarf nach Verbesserungen der Detektionsempfindlichkeit. Des weiteren wird die in WO 02/12251 A1 offenbarte Verbindung als eine Lösung in Ethylenglykol verwendet bei dem Durchführen einer Polymerisation mit einem hydrophilen Monomer wie Methacrylsäure (G, Beispiel 6). Die Verwendung eines organischen Lösungsmittels bei der Polymerisation hat allerdings ein beträchtliches Problem darin, dass ein Gel mit unerwünschten Eigenschaften, wie dem Entwickeln von Schwankungen bei der Messung in einer wässerigen Lösung, erhalten werden kann.
Dagegen kann die direkte Immobilisierung einer fluoreszierenden Substanz auf einem Trägermaterial, um die fluoreszierende Substanz als einen Fluoreszenz-Sensor zu verwenden, zu der Erzeugung von kleineren Signalen führen, weil eine Limitierung hinsichtlich des Freiheitsgrades der fluoreszierenden Substanz besteht, die auf dem Trägermaterial immobilisiert ist. Des weiteren kann die Immobilisierung der fluoreszierenden Substanz in einer höheren Dichte zu einem Quenchen (quenching) führen. Die Fähigkeit der fluoreszierenden Substanz, eine Targetsubstanz zu detektieren, wird daher verringert, verglichen mit der der gleichen fluoreszierenden Substanz vor deren Immobilisierung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann bereitstellen eine fluoreszierende Monomerverbindung, wie in Anspruch 1 definiert, die ausgezeichnet ist in der Fähigkeit, ein Saccharid wie Glukose zu detektieren, eine Fluoreszenz-Sensor-Substanz, wie in Anspruch 6 definiert, und einen Saccharid-messenden Sensor, wie in Anspruch 18 definiert, der von der Fluoreszenz-Sensor-Substanz Gebrauch macht.
Die Erfinder untersuchten ausführlich die Zustände des Bindens von Sacchariden bei Saccharid-messenden fluoreszierenden Monomerverbindungen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Einführung einer oder mehrerer hydrophiler Gruppen oder die Einführung von nur einer hydrophilen Gruppe, wie eine, die ein Polyalkylen umfasst, bei einem hydrophoben Rest, der bei Binden mit einem Saccharid Fluoreszenz emittiert, es ermöglicht, das Binden mit dem Saccharid zu fördern, unter Beibehalten des Freiheitsgrades des hydrophoben Restes, und ebenfalls, dass die Copolymerisation der fluoreszierenden Monomerverbindung mit (Meth)acrylamid es ermöglicht, die Messung eines Saccharids durchzuführen ohne eine Verringerung der Detektionsempfindlichkeit, sogar in einer wässerigen Lösung wie Blut oder einer Körperflüssigkeit, selbst wenn das resultierende Copolymer auf einem Trägermaterial immobilisiert ist. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde die vorliegende Erfindung bewerkstelligt.
Die Saccharid-messende fluoreszierende Monomerverbindung, die Fluoreszenz-Sensorsubstanz und Detektorschichten gemäß der vorliegenden Erfindung sind ausgezeichnet in der Fähigkeit, Saccharide zu detektieren. Aufgrund von deren ausgezeichneter Fähigkeit, Saccharide in Körperflüssigkeiten zu detektieren, können diese fluoreszierende Monomerverbindung, die Fluoreszenz-Sensorsubstanz und Detektorschichten Fluoreszenzsensoren bereitstellen, die eine langfristige Implantierung überstehen können.
Die obigen und andere Kennzeichen, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen deutlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das ein Beispiel eines Syntheseschemas zeigt für 9-10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-1-(6-acrylamido-n-hexyl)amid (F-AAm).
2 ist ein Diagramm, das ein Beispiel zeigt eines Syntheseschemas für 9,10-Bis(methylen)[[N-(ortho-boronobenzyl)methylen]-N- [acryloylpolyoxyethylen)carbonylamino]-n-hexamethylen]-2-acetylanthracen (F-PEG-AAm-1).
3 ist ein Diagramm, das ein Beispiel zeigt eines Syntheseschemas für Methyl-9,10-bis(methylen)[[N-ortho-boronobenzyl)methylen]-N-[(acryloylpolyoxyethylen)carbonylamino]-n-hexamethylen]anthracen-2-carboxylat (F-PEG-AAm-2).
4 ist ein schematisches Diagramm, das ein Beispiel einer Detektorschicht mit einer fluoreszierenden Sensorsubstanz gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, immobilisiert auf einem Trägermaterial.
5 ist eine perspektivische Ansicht, die eine Außenansicht eines implantierbaren, Saccharid-messenden Sensors gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt.
6 ist eine perspektivische Ansicht, die die innere Struktur des implantierbaren, Saccharid-messenden Sensors zeigt.
7 ist eine Aufnahme, die Glucose-Ansprechen von fluoreszierenden Sensorsubstanzen der Beispiele 3–10 zeigt.
8 ist eine Aufnahme, die Glucose-Ansprechen von fluoreszierenden Sensorsubstanzen der Beispiele 3–9 zeigt.
9 ist eine Aufnahme, die Glucose-Ansprechen von Detektorschichten von Beispiel 16 und Vergleichsbeispiel 1 zeigt.
10 ist eine Aufnahme, die Glucose-Ansprechen von Detektorschichten des Beispiels 18, des Beispiels 20 und von Vergleichsbeispiel 2 zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt eine fluoreszierende Monomerverbindung, dargestellt durch die folgende Formel (1): Formel (1)
wobei: Q, Q' und D³ gleich oder verschieden sein können, miteinander zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden können, und jeweils ein Substituent sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxy-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen, und vorzugsweise Q und Q' jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Acetyl- oder Nitrogruppe sein können; und mindestens ein Substituent, gewählt von D¹, D² und D⁴ darstellt eine Substituentengruppe, die an einem Ende hiervon eine Vinylgruppe hat, wobei die Substituentengruppe, umfassend eine Vinylgruppe an einem Ende hiervon, ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist. Das Enthalten einer Vinylgruppe am Ende erleichtert die Polymerisation der fluoreszierenden Monomerverbindung, die Polymerisation mit einem weiteren polymerisierbaren Monomer, und die Immobilisierung auf einem Trägermaterial.
Der Ausdruck "ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist", der hierin verwendet wird, bedeutet, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser aufgelöst werden kann bei einer Konzentration von 1 mM oder höher, unter den Bedingungen von 25 °C und pH 7,0, ohne Vorhandensein eines organischen Lösungsmittels oder eines Löslichkeitsvermittlers. Als Substituentengruppe, die ermöglichen kann, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist, kann vorzugsweise erwähnt werden eine Substituentengruppe, dargestellt durch die unten beschriebene Formel (2) oder Formel (3). Details der Substituentengruppen, dargestellt durch Formel (2) oder Formel (3), werden nachstehend beschrieben.
Weiter bevorzugt können D¹, D², D³ und D⁴ die unter den folgenden Definitionen (i) oder (ii) erwähnten Bedeutungen haben:

(i) D¹ und D² können gleich oder verschieden sein und jeweils eine substituierte oder eine unsubstituierte Alkylgruppe sein, D³ ist ein Wasserstoffatom, und D⁴ ist eine Substituentengruppe, dargestellt durch die unten beschriebene Formel (2). Als Alkylgruppe wird bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl oder dergleichen, wobei Methyl oder Ethyl insbesondere bevorzugt werden.
(ii) D¹ und D² können gleich oder verschieden sein und jeweils sein eine Substituentengruppe, dargestellt durch die folgende Formel (3), und D³ und D⁴ können gleich oder verschieden sein, können zusammen kombiniert werden zu einem verschmolzenen Ring, und sind jeweils ein Substituent, gewählt von der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituiertem oder unsubstituiertem Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxyl-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen. Als Alkylgruppen werden diejenigen mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Spezielle Beispiele schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Beispiele der Acylgruppen schließen ein Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl und Isobutyryl. Beispiele der Oxyalkylgruppen schließen ein Methoxy und Ethoxy. Beispiele der Halogenatome schließen ein F, Cl, Br und I. Beispiele der Aminoalkylgruppen schließen ein Methylamino und Ethylamino. Eine Einführung von Nitro-, Cyano- und/oder Acylgruppen wie Q, Q', D³ und D⁴ können einen Effekt hervorrufen, der beisteuert zur Rotverschiebung der Fluoreszenz oder dem Verbreitern der Distanz zwischen einem Anregungs-Wellenlängenpeak und einem Fluoreszenz-Wellenlängenpeak, um auf diese Weise eine Analyse der Ergebnisse der Fluorometrie zu erleichtern.

Wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (ii) in der vorliegenden Erfindung haben, wird bevorzugt, dass mindestens eines von Q, Q', D³ und D⁴ eine Substituentengruppe ist, gewählt von Acetyl, Carboxylatester und Cyanogruppen, und der Restbestand Wasserstoffatome sind. Formel (2)
Formel (3)
Zunächst wird ein Fall beschrieben, in dem D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (i) in Formel (1) besitzen.
In der Definition (i) ist X eine Substituentengruppe, gewählt von der Gruppe bestehend aus -COO-, -OCO-, -CH₂NR-, -CH₂S-, -CH₂O-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-. Beispiele der Alkylgruppe schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Bevorzugte Beispiele von X schließen ein -NRCO- und -CONR-.
In der Definition (i) repräsentiert R'' ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe. Als Alkylgruppe wird bevorzugt eine mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei eine mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen besonders bevorzugt wird. Spezielle Beispiele schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl.
In der Definition (i) ist Y eine substituierte oder unsubstituierte, zweiwertige Gruppe eines organischen Restes, und ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist. Der Ausdruck "ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist", der hierin verwendet wird, bedeutet, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser aufgelöst werden kann bei einer Konzentration von 1 mM oder höher, unter den Bedingungen von 25 °C und pH 7,0, ohne Vorhandensein eines organischen Lösungsmittels oder eines Löslichkeitsvermittlers. Bevorzugte Beispiele von Y schließen diejenigen ein, die eine oder mehrere hydrophile Gruppen enthalten wie Amino-, Carboxy-, Sulfo-, Nitro-, Amino-, Phosphat- und/oder Hydroxygruppen; und diejenigen, die eine oder mehrere hydrophile Linker enthalten, wie Ether-, Amid- und/oder Esterlinker in deren Strukturen.
Des weiteren kann Y vorzugsweise enthalten, in der Gruppe des organischen Restes, eine Struktur, dargestellt durch die unten beschriebenen Formeln (4) oder (5). Y kann zusätzlich enthalten eine oder mehrere Substituentengruppen und/oder zweiwertige Gruppen eines organischen Restes. In der Formel (4) und in der Formel (5) kann n vorzugsweise 2 bis 4 sein, wobei 2 bis 3 insbesondere bevorzugt werden; j kann vorzugsweise von 1 bis 3 sein, wobei 1 insbesondere bevorzugt wird; und m kann vorzugsweise 20 bis 150 betragen, wobei 40 bis 120 insbesondere bevorzugt werden. Y' und Y'' können gleich oder verschieden sein, und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe sein. Als Alkylgruppe wird bevorzugt eine mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl werden erläuternd angeführt. Als Y' und Y'' wird insbesondere bevorzugt, dass Y' und Y'' jeweils ein Wasserstoffatom ist, oder dass Y' ein Wasserstoffatom ist und Y'' eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, insbesondere eine Methylgruppe. Formel (4)
Formel (5)
Y kann vorzugsweise eine Anzahl von Atomen von 3 bis 500 besitzen, wobei 3 bis 12 insbesondere bevorzugt werden.
Ein Fall wird beschrieben, in dem D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (ii) in der Formel (1) besitzen.
In der Definition (ii) repräsentiert X eine C_1-30-Alkylengruppe, die enthält mindestens eine Substituentengruppe gewählt von der Gruppe bestehend aus -COO, -OCO-, -CH₂NR-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-. R repräsentiert ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe. Der Ausdruck "Alkylengruppe, die enthält mindestens eine Substituentengruppe", der hierin verwendet wird, bedeutet eine Alkylengruppe, die mindestens eine Substituentengruppe enthält an deren Ende, oder eine Alkylengruppe, die mindestens eine Substituentengruppe in deren Kette enthält. Die Kohlenstoffanzahl der Alkylengruppe kann vorzugsweise von 1 bis 30, weiter bevorzugt von 3 bis 12 sein. Spezielle Beispiele schließen ein Propylen, Hexylen und Octylen. Als die mindestens eine Substituentengruppe, enthalten in der Alkylengruppe, wird bevorzugt -NRCO- oder -CONR-. Wenn R eine Alkylgruppe ist, wird eine bevorzugt mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, wobei 1 bis 5 weiter bevorzugt werden. Spezielle Beispiele schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Als R wird ein Wasserstoffatom bevorzugt.
In der Definition (ii) repräsentiert Z -O- oder -NR''-, und R'' repräsentiert ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe. Als Alkylgruppe wird eine mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bevorzugt, wobei eine mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen weiter bevorzugt wird. Spezielle Beispiele schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Als Z wird -O- bevorzugt.
In der Definition (ii) ist Y eine substituierte oder unsubstituierte, zweiwertige Gruppe eines organischen Restes, und gewährleistet, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist. Der Ausdruck "ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist", der hierin verwendet wird, bedeutet, dass die fluoreszierende Monomerverbindung aufgelöst werden kann bei einer Konzentration von 1 mM oder höher in Wasser, unter den Bedingungen von 25 °C und pH 7,0, ohne Vorhandensein von einem organischen Lösungsmittel oder einem Löslichkeitsvermittler. Bevorzugte Beispiele von Y schließen diejenigen ein, die eine oder mehrere hydrophile Gruppen enthalten, wie Amino-, Carboxy-, Sulfo-, Nitro-, Amino-, Phosphat- und/oder Hydroxygruppen; und diejenigen, die eine oder mehrere hydrophile Linker enthalten, wie Ether-, Amid- und/oder Ester-Linker in deren Strukturen.
In der Definition (ii) kann Y vorzugsweise ein Molekulargewicht von 500 bis 10000 besitzen, wobei 1000 bis 5000 weiter bevorzugt wird.
Aufgrund von der Einführung der hydrophilen Ketten Y als ein charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung kann die vorliegende Erfindung vorteilhafte Effekte hervorrufen, wie beispielsweise diejenigen, die unten unter (1), (2), (3) und (4) beschrieben sind.
(1) Weil die fluoreszierende Monomerverbindung dazu fähig ist, in Wasser löslich zu sein, ist es möglich, in effizienter Weise eine Immobilisierung und eine Polymerisationsreaktion durchzuführen bei Erzeugen einer Fluoreszenz-Sensor-Substanz. Bei Herstellung eines Acylamidgels ist beispielsweise eine Polymerisation allein unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel erreichbar, und eines mit einer hohen physikalischen Festigkeit, Stabilität und Gleichförmigkeit kann erhalten werden. Bei einer hydrophoben Monomerverbindung ist die Verwendung eines organischen Lösungsmittels erforderlich für deren Auflösung, und ein Gel mit unerwünschten Eigenschaften kann erhalten werden. (2) Die Einführung von hydrophilen Ketten kann die Umgebung und die Mobilität um die Phenylboronsäure-Reste modifizieren, die mit einem Analyten interagieren, um auf diese Weise zu Verbesserungen der Empfindlichkeit, der Genauigkeit, der Anspruchs-Geschwindigkeit und der Selektivität bei einem Saccharid als Analyten beizusteuern. (3) Die hydrophilen Ketten können die Fluoreszenz-Sensor-Substanz in seiner Ganzheit stabilisieren, beispielsweise deren polymerisierte Struktur. (4) Da die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser allein reagieren kann, ist seine Polymerisierung sogar auf einem Trägermaterial erreichbar, das empfänglich ist gegenüber Angriffen durch ein organisches Lösungsmittel, beispielsweise auf einer Platte, die aus einem Acrylharz oder dergleichen gebildet ist.
Die fluoreszierende Monomerverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Y über X in eine Verbindung für das Detektieren eines Saccharids eingeführt wird. Dies hat es ermöglicht, die fluoreszierende Monomerverbindung bereitzustellen mit verbesserten physikalischen Eigenschaften, Stabilität, Detektionsempfindlichkeit, Detektionsgenauigkeit und Selektivität gegenüber Saccharid als Analyten. Insbesondere führt die Einführung von hydrophilen Gruppen, dargestellt durch Formel (4) oder Formel (5), zu einer Verbesserung im Freiheitsgrad bei den Phenylboronsäure-Resten, die in der fluoreszierenden Monomerverbindung enthalten sind, in einer wässrigen Lösung wie Blut oder einer Körperflüssigkeit, um auf diese Weise zu ermöglichen, unmittelbar mit einem Saccharid zu interagieren. Als Konsequenz kann die Affinität bei dem Saccharid erhöht werden, um die Detektionsempfindlichkeit zu verbessern.
Insbesondere im Fall der Definition (i) in der Formel (1) wurde nur eine hydrophile Gruppe in einen hydrophoben Rest eingeführt, der an ein Saccharid bindet, um eine Fluoreszenz zu emittieren. Demgemäß kann das Binden mit dem Saccharid gefördert werden, unter Beibehalten eines Freiheitsgrades bei dem hydrophoben Rest.
Es ist bekannt, dass die fluoreszierende Monomerverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung wie obenstehend beschrieben ein Phenylboronsäure-Derivat ist mit einem Anthracen-Gerüst, das darin enthalten ist, und das Anthracen-Gerüst als ein Fluorophor agiert. Wenn die Phenylboronsäure-Reste und ein Saccharid stabile Komplexe bilden, wird eine Fluoreszenz emittiert aufgrund des Einschlusses des Fluorophors. Da die fluoreszierende Monomerverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zwei Phenylboronsäure-Reste enthält, ist sie ausgezeichnet, besonders in der Detektionsempfindlichkeit gegenüber Sacchariden. Es ist zu verstehen, dass COCHCH₂ gebunden mit Z in der Formel (3), eingeführt wurde, um die fluoreszierende Monomerverbindung an ein Trägermaterial zu binden, so dass die fluoreszierende Monomerverbindung an einer Auflösung in einer Körperflüssigkeit wie Blut gehindert wird.
Im zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt eine Saccharid-messende Fluoreszenz-Sensor-Substanz, umfassend ein Copolymer von mindestens den folgenden zwei Verbindungen (I) und (II):

(I) Eine fluoreszierende Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1), wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, und
(II) mindestens ein hydrophiles, nicht-fluoreszierendes polymerisierbares Monomer mit einer Vinylgruppe.

Um ein Saccharid zu detektieren, das enthalten ist in einer wässrigen Lösung wie Blut oder einer Körperflüssigkeit, durch Verwenden der fluoreszierenden Monomerverbindung, ist eine Immobilisierung der fluoreszierenden Monomerverbindung erforderlich, um zu verhindern, dass die fluoreszierende Monomerverbindung aufgelöst wird in, oder hinausfließt in die wässrige Lösung. Wenn die fluoreszierende Monomerverbindung in einfacher Weise auf einem Trägermaterial immobilisiert wird, wird allerdings der Kontakt und das Binden zwischen der fluoreszierenden Monomerverbindung und dem Saccharid verhindert, was zu einer Verringerung in der Detektionsempfindlichkeit führt. In der vorliegenden Erfindung werden die fluoreszierende Monomerverbindung und das mindestens eine hydrophile, nicht-fluoreszierende, polymerisierbare Monomer, enthaltend die Vinylgruppe, daher copolymerisiert, um das hydrophile polymerisierbare Monomer in der fluoreszierenden Monomerverbindung einzuführen und zu immobilisieren, so dass die fluoreszierende Sensor-Substanz erzeugt wird. Dies hat es ermöglicht, die fluoreszierende Monomerverbindung unlöslich zu machen, unter Gewährleisten einer hohen Affinität zwischen der fluoreszierenden Monomerverbindung und dem Saccharid.
Bei Herstellung der Fluoreszenz-Sensor-Substanz kann das oben erwähnte, mindestens eine hydrophile, nicht-fluoreszierende polymerisierbare Monomer mit der Vinylgruppe aufgelöst werden in Wasser, sogar bei einer Konzentration, die für die Polymerisation erforderlich ist. Wenn die Fluoreszenz-Sensor-Substanz hergestellt wird in der Form eines Gels, kann das Gel somit mit derartigen erwünschten Eigenschaften erhalten werden wie z.B. kaum spürbar entwickelnden Schwankungen in den Messungsdaten. Bei Herstellen der Fluoreszenz-Sensor-Substanz mit dem mindestens einen hydrophilen, nicht-fluoreszierenden, polymerisierbaren Monomer mit der Vinylgruppe kann die Konzentration des Monomers in einem Reaktionsgemisch vorzugsweise von 0,5 bis 50 Gew.-%, weiter bevorzugt von 3 bis 30 Gew.-% reichen.
Als das mindestens eine hydrophile, nicht-fluoreszierende, polymerisierbare Monomer mit der Vinylgruppe kann ein polymerisierbares Monomer mit einer Acrylsäure-Restgruppe oder ein polymerisierbares Monomer mit einer (Meth)acrylamid-Restgruppe vorzugsweise erwähnt werden, wobei das polymerisierbare Monomer mit der (Meth)acrylamid-Restgruppe weiter bevorzugt wird. Das polymerisierbare Monomer mit der (Meth)acrylamid-Restgruppe ist ausgezeichnet, insbesondere in der Wasserlöslichkeit und der Einfachheit der Handhabung.
Keine besondere Einschränkung existiert hinsichtlich des polymerisierbaren Monomers mit einer Acrylsäure-Restgruppe, insoweit als das resultierende Polymer Acryloylgruppen in dessen Struktur enthält. Beispiele können einschließen 4-Hydroxydibutylacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat, Hydroxypropylacrylat, Methoxyethylacrylat, Polyethylenglykolacrylat und Acrylsäure.
Keine besondere Einschränkung besteht hinsichtlich des polymerisierbaren Monomers mit (Meth)acrylamid-Restgruppe, insoweit als das resultierende Polymer Acryloylgruppen und Amid-Linker in seiner Struktur enthält. Beispiele können einschließen (Meth)acrylamid und dessen Derivate. Erläuternd angegeben werden Kondensationsprodukte zwischen (Meth)acryloylchlorid und Aminosäuren oder Verbindungen, die aktive Aminogruppen enthalten, wie Acrylamid, Methacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N-tris-Hydroxymethylacrylamid, N-Hydroxymethylacrylamid, N-(n-Butoxymethyl)acrylamid, N-Acryloyllysin und N-Acryloylhexamethylendiamin; und Verbindungen, dargestellt durch die folgende Formel (6): Formel (6)
In der Formel (6) ist A ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, und U und U' können gleich oder verschieden sein und jeweils eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sein. Beispiele der Alkylgruppe schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl.
Das Polymer, das das polymerisierbare Monomer mit der (Meth)acrylamid-Restgruppe, die darin enthalten ist, umfasst, hat eine hohe Hydrophilie, so dass, bei Anbindung mit der fluoreszierenden Monomerverbindung, die Fluorophore, die in der fluoreszierenden Monomerverbindung existieren, die die Phenylboronsäure-Reste enthalten und eine starke hydrophobe Eigenschaft besitzen, in die hochhydrophile Struktur eingefügt werden. Selbst wenn ein Saccharid, das im Blut oder einer Körperflüssigkeit enthalten ist, gemessen werden soll, kann sich das wasserlösliche Saccharid daher in einfacher Weise annähern und an die Fluorophore anbinden.
Das molare Verhältnis [(I):(II)] der fluoreszierenden Monomerverbindung (I) zu dem polymerisierbaren Monomer, das die Acrylamid-Restgruppe im Copolymer enthält, kann vorzugsweise sein von 1:10 bis 1:4000, weiter bevorzugt von 1:50 bis 1:4000, besonders bevorzugt von 1:100 bis 1:2000, wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (i) in der fluoreszierenden Monomerverbindung haben. Ein Verhältnis der fluoreszierenden Monomerverbindung (I), das größer ist als das, welches das molare Verhältnis von 1:10 ergibt, beinhaltet ein beträchtliches Problem, dass der Freiheitsgrad verloren gehen kann infolge von der Sperrigkeit der hydrophoben Reste der fluoreszierenden Monomerverbindung, und die Interaktion mit einem Saccharid kann verringert werden. Ein Verhältnis der fluoreszierenden Monomerverbindung (I), das kleiner ist als das, welches das molare Verhältnis von 1:4000 ergibt, kann andererseits nicht in der Lage sein sein, den absolut erforderlichen Grad der Fluoreszenzintensität zu ergeben.
Das molare Verhältnis [(I):(II)] der fluoreszierenden Monomerverbindung (I) zu dem polymerisierbaren Monomer, das die Acrylamid-Restgruppe im Copolymer enthält, kann vorzugsweise von 1:50 bis 1:6000 sein, weiter bevorzugt von 1:150 bis 1:3000, wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (ii) in der fluoreszierenden Monomerverbindung haben. Ein Verhältnis der fluoreszierenden Monomerverbindung (I), das größer ist als das, welches das molare Verhältnis 1:50 ergibt, beinhaltet darin ein beträchtliches Problem, dass der Freiheitsgrad verloren gehen kann infolge von der Sperrigkeit der hydrophoben Reste in der fluoreszierenden Monomerverbindung, und die Interaktion mit einem Saccharid kann verringert werden. Ein Verhältnis der fluoreszierenden Monomerverbindung (I), das kleiner ist als das, welches das molare Verhältnis 1:6000 ergibt, kann andererseits nicht den absolut erforderlichen Grad der Fluoreszenzintensität gewährleisten.
Das massegemittelte Molekulargewicht der Fluoreszenz-Sensor-Substanz, zusammengesetzt aus den oben beschriebenen beiden Komponenten, kann vorzugsweise von 50000 bis 500000, weiter bevorzugt von 100000 bis 300000 sein, bestimmt mittels GPC unter Verwendung eines Polyethylenoxid-Standards, wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (i) in der fluoreszierenden Monomerverbindung besitzen.
Das massegemittelte Molekulargewicht der Fluoreszenz-Sensor-Substanz kann vorzugsweise von 50000 bis 750000, weiter bevorzugt von 150000 bis 450000 sein, bestimmt durch GPC unter Verwendung eines Polyethylenoxid-Standards, wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (ii) in der fluoreszierenden Monomerverbindung haben.
Die Fluoreszenz-Sensor-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere andere Komponenten zusätzlich zu der fluoreszierenden Monomerverbindung und dem polymerisierbaren Monomer, enthaltend die (Meth)acrylamid-Restgruppe, verwenden. Beispiele solcher Komponenten schließen ein vernetzbare Monomere, andere vernetzbare Komponenten, kationische Monomere, die fähig sind, Kationen in Wasser bereitzustellen, anionische Monomere, die fähig sind, Anionen in Wasser bereitzustellen, und nichtionische Monomere, die keine Gruppen enthalten, die Ionen in Wasser freisetzen können.
Beispiele der vernetzbaren Monomere schließen ein eine breite Vielfalt von denjenigen, die fähig sind, eine dreidimensionale vernetzte Struktur in die Fluoreszenz-Sensor-Substanz einzuführen über polymerisierbare Doppelbindungen. Erläuternd angegeben werden Divinylverbindungen wie N,N'-Methylen-bis(meth)acrylamid, N,N'-(1,2-Dihydroxyethylen)-bis(meth)acrylamid, Diethylenglykol-di(meth)acrylat,(Poly)ethlyenglykol-di(meth)acrylat, Triethylenglykol-di(meth)acrylat, Propylenglykol-di(meth)acrylat, Trimethylolpropan-di(meth)acrylat, Trimethylolpropan-tri(meth)acrylat, Pentaerythritol-di(meth)acrylat, Pentaerythritol-tri(meth)acrylat, Pentaerythritol-tetra(meth)acrylat, (Poly)propylenglykol-di(meth)acrylat, Glycerin-tri(meth)acrylat, Glycerinacrylat-methacrylat, Ethylenoxid-modifiziertes Trimethylolpropan-tri(meth)acrylat, Pentaerythritol-tetra(meth)acrylat und Dipentaerythritolhexa(meth)acrylat, auch wenn diese sich unterscheiden in Abhängigkeit von der Substituentengruppe in der Fluoreszenz-Sensor-Substanz, die verwendet werden soll. Zwei oder mehrere dieser vernetzbaren Monomere können in der vorliegenden Erfindung in Kombination verwendet werden.
Beispiele der anderen vernetzbaren Komponenten schließen ein eine breite Vielfalt von Verbindungen, die jeweils zwei oder mehr funktionelle Gruppen enthalten. Erläuternd angegeben werden Triallylcyanurat, Triallylisocyanurat, Triallylphosphat, Triallylamin, Poly(meth)allyloxyalkane, (Poly)ethylenglykol-diglycidylether, Glycerin-diglycidylether, Ethylenglykol, Polyethylenglykol, Propylenglykol, Glycerin, Pentaerythritol, Ethylendiamin, Polyethylenimin, Glycidyl(meth)acrylat, Triallylisocyanurat, Trimethylolpropan-di(meth)allylether, Tetraallyloxyethan und Glycerolpropoxytriacrylat, auch wenn sie sich unterscheiden in Abhängigkeit von den Substituentengruppen in der zu verwendenden Fluoreszenz-Sensor-Substanz. Zwei oder mehrere dieser vernetzbaren Monomere können in Kombination in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiele der kationischen Monomere, die fähig sind, Kationen in Wasser bereitzustellen, schließen ein Dimethylaminoethyl(meth)acrylat, Diethylaminoethyl(meth)acrylat und 4-Vinylpyridin. Zwei oder mehrere dieser kationischen Monomere können in Kombination in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiele der anionischen Monomere, die fähig sind, Anionen in Wasser bereitzustellen, schließen ein (Meth)acrylsäure, Vinylpropionsäure und 4-Vinylbenzolsulfonsäure. Zwei oder mehr dieser anionischen Monomere können in Kombination in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Beispiele der nichtionischen Monomere, die keine Gruppen enthalten, die fähig sind, in Wasser Ionen freizusetzen, schließen ein 2-Hydroxyethyl(meth)acrylat, 3-Methoxypropyl(meth)acrylat, 4-Hydroxydibutyl(meth)acrylat, 2-Methoxyethylacrylat und 1,4-Cylcohexandimethanolmonoacrylat. Zwei oder mehr dieser nichtionischen Monomere können in Kombination in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Des weiteren können ebenfalls in Kombination verwendet werden zwei oder mehr dieser vernetzbaren Monomere, andere vernetzbare Komponenten, kationische Monomere, anionische Monomere und nichtionische Monomere. Das Verhältnis von einer oder mehrerer dieser anderen Komponenten kann vorzugsweise von 0,1 bis 10 Mol-%, weiter bevorzugt von 2 bis 7 Mol-%, basierend auf dem Gesamtverhältnis der fluoreszierenden Monomerverbindung und des polymerisierbaren Monomers, das darin die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, betragen. Die kombinierte Verwendung von einer oder mehrerer dieser anderen Komponenten ermöglicht es, eine dreidimensional vernetzte Struktur zu bilden, und ermöglicht auch das Bewirken einer Einstellung der Hydrophilie, der Einführung von Startpunkten für eine Reaktion. Die dreidimensional vernetzten Strukturen werden nachstehend beschrieben.
Die Fluoreszenz-Sensor-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise eine Struktur, dargestellt durch die folgende Formel (7), besitzen: Formel (7)
In der Formel (7) sind Q und Q' definiert in Verbindung mit der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1).
D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ haben die Bedeutungen der folgenden Definition (x) oder (xx):

(x) D¹⁰ und D²⁰ können gleich oder verschieden sein und sind jeweils eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, D³⁰ ist ein Wasserstoffatom, und D⁴⁰ ist eine Substituentengruppe, dargestellt durch die unten beschriebene Formel (8). Als die Alkylgruppe wird bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl oder dergleichen, wobei Methyl oder Ethyl weiter bevorzugt werden.
(xx) D¹⁰ und D²⁰ können gleich oder verschieden sein und sind jeweils eine Substituentengruppe, dargestellt durch die unten beschriebene Formel (9), und D³⁰ und D⁴⁰ können gleich oder verschieden sein, können zusammen zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden, und sind jeweils ein Substituent, gewählt von der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und einem substituierten oder unsubstituierten Alkyl, Acyl, Oxyalkyl, Carboxyl, Carboxylatester, Carboxamido, Cyano, Nitro, Amino und Aminoalkylgruppen. Als die Alkylgruppe wird bevorzugt eine mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen. Spezielle Beispiele schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, und Pentyl. Beispiele der Acylgruppe schließen ein Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, und Isobutyryl. Beispiele der Oxyalkylgruppe schließen ein Methoxy und Ethoxy. Beispiele der Halogenatome schließen ein F, Cl, Br, und I. Beispiele der Aminoalkylgruppe schließen ein Methylamino und Ethylamino. Die Einführung von Nitro-, Cyano- und/oder Acylgruppen wie Q, Q', D³⁰ und D⁴⁰ kann eine Wirkung hervorrufen, die beisteuert zur Rotverschiebung der Fluoreszenz oder dem Verbreitern der Distanz zwischen einem Anregungswellenlängen-Peak und einem Fluoreszenzwellenlängen-Peak.

Wenn D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ die Bedeutungen der Definition (xx) in der vorliegenden Erfindung haben, wird bevorzugt, dass mindestens eines von Q, Q', D³⁰ und D⁴⁰ eine Substituentengruppe ist, gewählt von Acetyl-, Carboxylatester- und Cyanogruppen, und der Rest Wasserstoffatome sind. Formel (8)
Formel (9)
Ein Fall wird beschrieben, in dem D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ die Bedeutungen der Definition (x) in der Formel (8) besitzen.
In der Definition (x) ist X eine Substituentengruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus -COO-, -OCO-, -CH₂NR-, -CH₂S-, -CH₂O-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-. Beispiele der Alkylgruppe schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Bevorzugte Beispiele von X schließen ein -NRCO- und -CONR-.
In der Definition (x) sind Y und R'' definiert in Verbindung mit der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1), und U, U' und A sind definiert in Verbindung mit dem polymerisierbaren Monomer, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, die durch die Formel (6) dargestellt ist.
In der Definition (x) kann das molare Verhältnis (p:q) von p zu q in der Formel (8) vorzugsweise betragen von 1:10 bis 1:4000, weiter bevorzugt von 1:50 bis 1:4000, insbesondere bevorzugt von 1:100 bis 1:2000. Ein Wert p, der größer ist als derjenige, der ein molares Verhältnis von 1:10 ergibt, beinhaltet ein beträchtliches Problem darin, dass der Freiheitsgrad verloren gehen kann infolge der Sperrigkeit der hydrophoben Reste, und die Wechselwirkung mit einem Saccharid kann verringert werden. Ein Wert von p, der kleiner ist als derjenige, der ein molares Verhältnis 1:4000 ergibt, kann andererseits nicht fähig sein, den absolut erforderlichen Grad der Fluoreszenzintensität zu gewährleisten.
Als nächstes wird ein Fall beschrieben, in dem D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ die Bedeutungen der Definition (xx) in der Formel (7) besitzen.
In der Definition (xx) repräsentiert X eine C_1-30-Alkylengruppe, die enthält mindestens eine Substituentengruppe, gewählt von der Gruppe bestehend aus -COO-, -OCO-, -CH₂NR-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR, und -CO-. R stellt dar ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe. Der Ausdruck "Alkylengruppe, die enthält mindestens eine Substituentengruppe", der hierin verwendet wird, bedeutet eine Alkylengruppe, die mindestens eine Substituentengruppe an einem ihrer Enden enthält, oder eine Alkylengruppe, die mindestens eine Substituentengruppe in ihrer Kette enthält. Die Kohlenstoffanzahl der Alkylengruppe kann vorzugsweise von 1 bis 30, weiter bevorzugt von 3 bis 12 betragen. Spezielle Beispiele schließen ein Propylen, Hexylen und Octylen. Als die mindestens eine Substituentengruppe, enthalten in der Alkylengruppe, wird -NRCO- oder -CONR- bevorzugt. Wenn R eine Alkylgruppe ist, wird eine mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bevorzugt, wobei 1 bis 5 weiter bevorzugt werden. Spezielle Beispiele schließen ein Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Als R wird ein Wasserstoffatom bevorzugt.
In der Definition (xx) sind Y und Z definiert in Verbindung mit der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1), und U, U' und A sind definiert in Verbindung mit dem polymerisierbaren Monomer, das die (Meth)acrylamid-Restgruppe enthält, die durch die Formel (5) repräsentiert ist.
In der Definition (xx) kann das molare Verhältnis (p:q) von p zu q in der Formel (7) vorzugsweise betragen von 1:50 bis 1:6000, weiter bevorzugt von 1:150 bis 1:3000. Ein Wert von p, der größer ist als derjenige, der ein molares Verhältnis von 1:50 ergibt, beinhaltet ein beträchtliches Problem darin, dass der Freiheitsgrad verloren gehen kann infolge der Sperrigkeit der hydrophoben Reste, und die Wechselwirkung mit einem Saccharid kann verringert werden. Ein Wert von p, der kleiner ist als derjenige, der das molare Verhältnis 1:6000 ergibt, kann andererseits nicht fähig sein, den absolut erforderlichen Grad der Fluoreszenzintensität zu gewährleisten.
In der Fluoreszenz-Sensor-Substanz, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, kann mindestens ein Teil des Copolymers intermolekulare Vernetzungen bilden, um eine dreidimensional vernetzte Struktur darzustellen. Die Erzeugung von dreidimensionalen Vernetzungen quer durch Poly(meth)acrylamid-Ketten wird bevorzugt, weil die fluoreszierende Monomerverbindung gegenüber einem Ausfließen resistent wird. Es ist zu beachten, dass auch wenn die fluoreszierende Monomerverbindung gemäß der vorliegenden Erfindung hydrophobe Reste enthält, die fähig sind, Fluoreszenz zu emittieren bei Anbinden eines Saccharids, wie obenstehend beschrieben, die hydrophoben Reste gewährleisten, einen solchen Freiheitsgrad beizubehalten, um das Binden des Saccharids in einer wässrigen Lösung zu ermöglichen, weil die hydrophoben Reste an Poly(meth)acrylamid-Ketten über ihre Reste zweiwertiger, organischer Gruppen, dargestellt durch Y, gebunden sind. Die Detektionsempfindlichkeit für das Saccharid wird daher nicht verringert, trotz der Erzeugung der dreidimensional vernetzten Struktur.
Auch wenn keine besonderen Einschränkungen bestehen hinsichtlich der Herstellungsverfahren der fluoreszierenden Monomerverbindung und der Fluoreszenz-Sensor-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung und der Erzeugungsmethode der dreidimensional vernetzten Struktur, können sie gemäß den folgenden Verfahren hergestellt werden.
(1–1) Herstellungsverfahren einer fluoreszierenden Monomerverbindung
Gemäß einem Syntheseschema, gezeigt in 1, wird ein Beispiel eines Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1) beschrieben, in der Q und Q' jeweils ein Wasserstoffatom sind, D¹ und D² jeweils eine Methylgruppe sind, D³ ein Wasserstoffatom ist, D⁴ eine Substituentengruppe ist, dargestellt durch die Formel (2), X ist -CONH-, Y ist -C₆H₁₂- und R'' ist ein Wasserstoffatom (9,10-Bis[(N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methy1]anthracen-2-carbonsäure-1-(6-acrylamid-n-hexyl)amid).
Unter Verwendung von Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carbonsäure als Ausgangsmaterial wird N-Bromosuccinimid (NBS) zur Reaktion gebracht, um Methyl-9,10-bis(bromomethyl)anthracen-2-carboxylat zu ergeben. Darauf folgende Addition von Methylamin überführt die Bromomethylgruppe in eine Aminomethylgruppe. 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan wird reagiert mit dem resultierenden Methyl-9,10-bis(aminomethyl)anthracen-2-carboxylat, um Methyl-9,10-bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carboxylat zu erhalten. Bei dem Reaktionsprodukt wird danach ein Alkali dazu gebracht, eine De-Esterifizierung zu induzieren, wodurch 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzy1)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure erhalten wird. Das Binden von 1-Acrylamido-6-aminohexan an die Carbonsäure kann die Zielverbindung ergeben.
Genauer gesagt wird eine Lösung aus Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carbonsäure vorbereitet, vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 bis 20 g/l, wobei 10 bis 15 g/l weiter bevorzugt werden. NBS wird hinzugefügt zu der Lösung, so dass das molare Verhältnis von NBS zu Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carbonsäure von 2 bis 2,5 mal reicht, weiter bevorzugt von 2,1 bis 2,2 mal. In jeder der oben beschriebenen Synthesereaktionen für die Zielverbindung ist es möglich, ein Lösungsmittel zu verwenden, das geeignet ist für das korrespondierende Reaktionsprodukt. Beispiele eines solchen Lösungsmittels schließen ein Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, n-Hexan, Acetonitril, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid. Diese Lösungsmittel können verwendet werden entweder einzeln oder in Kombination. Um beispielsweise Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carbonsäure aufzulösen, können in geeigneter Weise verwendet werden Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff oder Acetonitril. Zwei oder mehrere dieser Lösungsmittel können in Kombination verwendet werden, d.h. als eine gemischte Lösung. Bei Verwenden zweier oder mehrerer dieser Lösungsmittel in Kombination können die Verhältnisse dieser zwei oder mehrerer Lösungsmittel wie gewünscht eingestellt werden. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise von 60 bis 120 °C, weiter bevorzugt von 80 bis 100 °C, und die Reaktionsdauer beträgt vorzugsweise 0,5 bis 6 h, weiter bevorzugt von 2 bis 4 h.
Zu dem Methyl-9,10-bis(bromomethyl)anthracen-2-carboxylat, das in einem Lösungsmittel aufgelöst worden ist, vorzugsweise bei einer Konzentration von 1 bis 30 g/l, weiter bevorzugt bei einer Konzentration von 2 bis 10 g/l, wird als nächstes Methylamin zugemischt in einem Verhältnis von vorzugsweise 2 bis 30 molarer Mengen, weiter bevorzugt von 6 bis 20 molarer Mengen, um diese miteinander zur Reaktion zu bringen. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise von 0 bis 60 °C, weiter bevorzugt von 20 bis 30 °C, und die Reaktionsdauer ist vorzugsweise von 1 bis 10 h, weiter bevorzugt von 2 bis 5 h.
Die Reaktion zwischen dem somit erhaltenen Methyl-9,10-bis(aminomethyl)anthracen-2-carboxylat und 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan wird durchgeführt durch Mischen dieser, so dass das Verhältnis von 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan vorzugsweise 2 bis 8 mal, weiter bevorzugt 3 bis 5 mal relativ zu Methyl-9,10-bis(aminomethyl)anthracen-2-carboxylat wird. Die Konzentration von Methyl-9,10-bis(aminomethyl)anthracen-2-carboxylat ist vorzugsweise 10 bis 200 g/l, weiter bevorzugt von 50 bis 100 g/l. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise von 0 bis 80 °C, weiter bevorzugt von 20 bis 40 °C, und die Reaktionsdauer ist vorzugsweise 1 bis 48 h, weiter bevorzugt von 2 bis 24 h.
Methyl-9,10-bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carboxylat wird danach mit einem Alkali hydrolysiert. Als das Alkali kann jedes alkalische Mittel wie Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid verwendet werden. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise 0 bis 100 °C, weiter bevorzugt 20 bis 60 °C, und die Reaktionsdauer ist vorzugsweise 1 bis 24 h, weiter bevorzugt 2 bis 6 h.
Zu der 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure (1 mol) werden zugemischt 1-Acrylamido-6-aminohexan (vorzugsweise 1,05 bis 3,0 mol, weiter bevorzugt 1,2 bis 1,4 mol) und ein kondensierender Stoff (vorzugsweise 1,0 bis 3,0 mol, weiter bevorzugt 1,1 bis 2,0 mol). Als der kondensierende Stoff kann verwendet werden Dicyclohexylcarbodiimid, 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid. Die Reaktionstemperatur ist vorzugsweise 0 bis 60 °C, weiter bevorzugt 20 bis 30 °C, und die Reaktionszeit ist vorzugsweise 1 bis 24 h, weiter bevorzugt 2 bis 15 h.
Es sollte verstanden werden, dass wenn eine Ausgangsverbindung verwendet wird als das Anthracen-Gerüst, mit Substituenten, die durch Q und Q' in der Formel (1) dargestellt sind, Gruppen, anders als die korrespondierenden Gruppen in der oben beschriebenen Verbindung, eine entsprechende Verbindung hergestellt werden kann durch ein geeignetes Auswählen des Lösungsmittels, der Additive, der Reaktionstemperatur, der Reaktionsdauer und des Isolationsverfahrens. Des weiteren ermöglicht die Verwendung einer Verbindung mit einer Sulfonylgruppe, enthalten bei einem Anthracen-Gerüst anstelle von Methylcarboxylat, das Einführen von -SO₂NHals X. Des weiteren ermöglicht die Addition von Amino- (C₂H₄O)_m-acrylamid anstelle von 1-Acrylamido-6-aminohexan das Einführen von -(C₂H₄O)_m- als Y.
Es sollte verstanden werden, dass 9,10-Bis[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure auch hergestellt werden kann durch Verwenden von Anthryldiamin-2-carbonsäure anstelle von Anthryldiamin in Beispiel 3 des offengelegten japanischen Patents Hei 8-53467.
(1–2) Herstellungsverfahren einer weiteren fluoreszierenden Monomerverbindung
Gemäß einem Syntheseschema, gezeigt in 2, wird beschrieben ein Beispiel eines Verfahrens für die Herstellung einer Verbindung der Formel (1), in der Q, Q' und D³ jeweils ein Wasserstoffatom sind, D⁴ -COCH₃- ist, D¹ und D² jeweils eine Substituentengruppe sind, dargestellt durch die Formel (3), D¹ und D² gleich sind, X ist -C₆H₁₂-NHCO-, Y eine Gruppe eines PEG-Restes ist, und Z ist -O-{9,10-Bis(methylen)[[N-ortho-boronobenzyl)methylen]-N-[(acryloylpolyoxyethylen)carbonylamino]-n-hexamethylen]-2-acetylanthracen (F-PEG-AAm-1)}.
Unter Verwendung von 2-Acetyl-9,10-dimethylanthracen als Ausgangsmaterial wird es erwärmt in Tetrachlorkohlenstoff/Chloroform-Lösungsmittel, und wird reagiert mit N-Bromosuccinimid (NBS) und Benzoylperoxid (BPO), um 2-Acetyl-9,10-bis(bromomethylen)anthracen zu ergeben. Es wird danach zur Reaktion gebracht mit N-(t-Butoxycarbonyl)-hexyldiamin im Vorhandensein einer Base wie Diisopropylethylamin (DIEA) in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid (DMF). Als Ergebnis wird die Bromomethylen-Gruppe überführt in eine [(t-Butoxycarbonylamino)hexylamino]methylen-Gruppe. 2-(2- Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan wird bei dem Reaktionsprodukt zur Reaktion gebracht im Vorhandensein einer Base wie DIEA in einem Lösungsmittel wie DMF, um 9,10-Bis[[N-6'-(t-butoxycarbonylamino)hexyl-N-[2-(5,5-dimethylborinan-2-yl)benzyl]amino]methylen]2-acetylanthracen zu ergeben. Eine Säure wie Salzsäure wird bei dem Reaktionsprodukt zur Reaktion gebracht, um dieses zu entschützen, um 9,10-Bis(methylen)[[N-(ortho-boronobenzyl)methylen]-N-(aminohexyl)]-2-acetylanthracen zu erhalten. Es wird danach zur Reaktion gebracht mit Acryloyl-(polyethylenglykol)-N-hydroxysuccinimidester, um die Zielverbindung zu erhalten.
Es sollte verstanden werden, dass wenn eine Ausgangsverbindung, deren Substituent durch D⁴ in der Formel (1) dargestellt ist, eine Gruppe, anders als die korrespondierende Gruppe in der oben beschriebenen Verbindung als das Anthracen-Gerüst verwendet wird, eine korrespondierende Verbindung mit einer Gruppe, anders als eine Acetyl-Gruppe, enthalten als D⁴, hergestellt werden kann durch geeignetes Auswählen des Lösungsmittels, der Additive, der Reaktionstemperatur, der Reaktionsdauer und des Isolationsverfahrens.
(1–3) Herstellungsverfahren einer weiteren fluoreszierenden Monomerverbindung
Gemäß einem Syntheseschema, gezeigt in 3, wird beschrieben ein Beispiel eines Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel (1), in der Q, Q' und D³ jeweils ein Wasserstoffatom sind, D⁴ -COOCH₃- ist, D¹ und D² jeweils eine Substituentengruppe sind, dargestellt durch die Formel (3), D¹ und D² gleich sind, X ist -C₆H₁₂-NHCO-, Y ist eine Gruppe eines PEG-Restes, und Z ist -O-{Methyl-9,10-bis(methylen)[[N-ortho-boronobenzyl)methylen]-N- [(acryloylpolyoxyethylen)carbonylamino]-n-hexamethylen]anthracen-2-carboxylat (F-PEG-AAm-2)}.
Unter Verwendung von 9,10-Dimethyl-2-acetylanthracen als Ausgangsmaterial wird dies hinzugefügt zu einer Dioxan/Wasser-Lösung von Natriumperchlorat. Einem Rühren unter Wärme nachfolgend wird eine Säure hinzugefügt, um eine Fällung von 9,10-Dimethylaceton-2-carbonsäure zu erhalten. Die Fällung wird danach aufgelöst in einem Salzsäure/Methanol-Lösungsmittel, und die resultierende Lösung wird erwärmt unter Rückfluss, um Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carboxylat zu ergeben. Der Methylester wird aufgelöst in einem Tetrachlorkohlenstoff/Chloroform-Lösungsmittel. Einem Erwärmen nachfolgend wird der Methylester reagiert mit N-Bromosuccinimid (NBS) und Benzoylperoxid (BPO), um den Methylester in ein Methyl-9,10-bis(bromomethylen)anthracen-2-carboxylat zu überführen. Der so erhaltene Methylester wird danach reagiert mit N-(t-Butoxycarbonyl)-hexyldiamin im Vorhandensein einer Base wie Diisopropylethylamin (DIEA) in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid (DMF). Als Ergebnis wird die Bromomethylen-Gruppe überführt in eine [(t-Butoxycarbonylamino)hexylamino]methylen-Gruppe. 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan wird bei dem Reaktionsprodukt zur Reaktion gebracht im Vorhandensein einer Base wie DIEA in einem Lösungsmittel wie DMF, um Methyl-9,10-bis[[N-6'-(t-butoxycarbonylamino)hexyl-N-[2-(5,5-dimethylborinan-2-yl)benzyl]amino]methyl]anthracen-2-carboxylat zu ergeben. Bei Entschützung unter der Wirkung einer Säure wie Salzsäure wird bereitgestellt Methyl-9,10-bis(methylen)[[N-(ortho-boronobenzyl)methylen]-N-(aminohexyl)]anthracen-2-carboxylat. Es wird danach zur Reaktion gebracht mit Acryloyl-(polyethylenglykol)-N-hydroxysuccinimidester in einem basischen Puffer, um die Zielverbindung zu bilden.
Es sollte verstanden werden, dass wenn eine Ausgangsverbindung, deren Substituent durch D⁴ in der Formel (1) dargestellt ist, eine Gruppe, anders als die korrespondierenden Gruppen in den oben beschriebenen Verbindungen, verwendet wird als das Anthracen-Gerüst, eine korrespondierende Verbindung mit einer Gruppe, anders als eine Methylcarboxylat-Gruppe, enthalten als D⁴, hergestellt werden kann durch ein geeignetes Auswählen des Lösungsmittels, der Additive, der Reaktionstemperatur, der Reaktionsdauer und des Isolationsverfahrens.
(2) Herstellungsverfahren einer Fluoreszenz-Sensor-Substanz
Die Copolymerisation zwischen der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1) und dem polymerisierbaren Monomer, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, kann durchgeführt werden unter Verwendung eines Polymerisationsbeschleunigers oder Polymerisationsstarters in einem Lösungsmittel. Wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (i) in der chemischen Formel (1) besitzen, kann ein Lösungsmittel vorzugsweise zusammengesetzt sein aus einem oder mehreren Lösungsmitteln, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethylenglykol und Diethylenglykol. Das Lösungsmittel kann verwendet werden als Gemisch mit Wasser. Insbesondere kann die Verwendung eines gemischten Lösungsmittels, zusammengesetzt aus Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid und Wasser das Voranschreiten der Polymerisation fördern. Bei Vermischung mit Wasser wird bevorzugt, Dimethylsulfoxid und/oder Dimethylformamid zu verwenden bei einer Konzentration von 40 bis 80 Gew.-%, wobei 50 bis 70 Gew.-% weiter bevorzugt werden. In diesem Konzentrationsbereich kann das gemischte Lösungsmittel das Voranschreiten der Polymerisation fördern und kann die Target-Fluoreszenz-Sensor-Substanz mit einer höheren Ausbeute erhalten. Es sollte verstanden werden, dass eine Lösungsmittelkonzentration, die geringer ist als 40 Gew.-%, zu einem Fällungsbeginn der fluoreszierenden Monomerverbindung führen kann vor dem Beginn der Polymerisation. Wenn D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen der Definition (ii) in der chemischen Formel (1) besitzen, kann Wasser als Lösungsmittel verwendet werden. Die Einführung von Y, welches eine Hydrophilie besitzt, in einem Ausmaß, das ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist, hat es ermöglicht, eine Polymerisation auch dann durchzuführen, wenn Wasser allein als Lösungsmittel verwendet wird. Es ist auch möglich, Wasser in der Form eines Gemisches zu verwenden mit einem oder mehreren von Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethylenglykol und Diethylenglykol. Wenn ein organisches Lösungsmittel in der vorliegenden Erfindung vermischt wird, ist dessen Anteil vorzugsweise 10 bis 50 Gew.-%, weiter bevorzugt 20 bis 30 Gew.-%.
Bei Copolymerisieren der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1) und des polymerisierbaren Monomers, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, können eine oder mehrere andere Komponenten hinzugefügt werden. Wenn eine oder mehrere andere Komponenten hinzugefügt werden, ist deren Anteil vorzugsweise 0,1 bis 10 Mol-%, weiter bevorzugt 2 bis 7 Mol-%, basierend auf dem gesamten Anteil der fluoreszierenden Monomerverbindung und dem polymerisierbaren Monomer, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält. Wenn eine oder mehrere andere Komponenten hinzugefügt werden, wird bevorzugt, gleichzeitig einen Polymerisationsstarter und einen Polymerisationsförderer hinzuzufügen bei Durchführen der Polymerisation.
Beispiele des Polymerisationsstarters schließen ein Persulfate wie Natriumpersulfat, Kaliumpersulfat und Ammoniumpersulfat; Wasserstoffperoxid; Azo-Verbindungen wie Azobis-2-methylpropionamidinhydrochlorid und Azoisobutyronitril; und Peroxide wie Lauroylperoxid, Cumolhydroperoxid und Benzoylperoxid. Diese Polymerisationsstarter können verwendet werden entweder einzeln oder in Kombination. In Kombination mit einem solchen Polymerisationsstarter ist es auch möglich, als Polymerisationsförderer zu verwenden ein oder mehrere reduzierende Mittel wie Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfat, Mohr's-Salz, Natriumpyrobisulfit, Natriumformaldehydsulfoxylat und Ascorbinsäure; und Amin-Verbindungen wie Ethylendiamin, Natriumethylendiamintetraacetat, Glycin und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin. Die Polymerisationstemperatur ist vorzugsweise 15 bis 75 °C, weiter bevorzugt 20 bis 60 °C, während die Polymerisationszeit vorzugsweise 1 bis 20 h ist, weiter bevorzugt 2 bis 8 h. Kombinierte Verwendung eines Persulfats als Polymerisationsstarter mit N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin als Polymerisationsförderer wird besonders bevorzugt, weil die Polymerisation bei Raumtemperatur durchgeführt werden kann.
Die Verbindung, dargestellt durch die Formel (7), kann andererseits auch hergestellt werden ohne Zurückgreifen auf die Copolymerisation der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1), mit dem polymerisierbaren Monomer, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält. Da die fluoreszierende Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1), über mehrere Schritte synthetisiert wird, kann die Fluoreszenz-Sensor-Substanz, dargestellt durch die Formel (7), auch hergestellt werden, selbst wenn anstelle des Verwendens der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1) als Ausgangsmaterial, eine weitere Verbindung dazu gebracht wird, auf ein Zwischenprodukt für die fluoreszierende Monomerverbindung zu wirken. Beispielsweise kann die Fluoreszenz-Sensor-Substanz, dargestellt durch die Formel (7), auch hergestellt werden, selbst wenn 9,10-Bis[[N-(6'-aminohexyl)-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]-2-acetylanthracen, gezeigt im Schema von 2, oder Methyl-9,10-bis[[N-(6'-aminohexyl)-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carboxylat, gezeigt im Schema von 3, und eines, erhalten durch Einführen von Carboxyl-Gruppen in einem Polymer des polymerisierbaren Monomers, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, zur Reaktion gebracht werden im Vorhandensein eines Kupplungsmittels. Als weiteres Beispiel kann die Fluoreszenz-Sensor-Substanz, dargestellt durch die Formel (7), auch hergestellt werden, wenn nachfolgend zu der vorherigen Polymerisation des polymerisierbaren Monomers, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, das resultierende Polymer copolymerisiert wird mit der fluoreszierenden Monomerverbindung im Vorhandensein eines Polymerisationsstarters und Polymerisationsförderers.
(3) Verfahren der Erzeugung einer dreidimensional vernetzten Struktur
Es wird bevorzugt, dass mindestens ein Teil der Fluoreszenz-Sensor-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung intermolekulare Verbindungen bildet und eine dreidimensional vernetzte Struktur hat. Wie obenstehend erwähnt, macht die Erzeugung einer dreidimensional vernetzten Struktur quer durch Poly(meth)acrylamid-Ketten die fluoreszierende Monomerverbindung resistent gegenüber einem Ausfließen, und ermöglicht daher das Detektieren eines Saccharids mit Leichtigkeit.
Keine Beschränkung existiert beim Verfahren für das Einführen einer derartigen dreidimensional vernetzten Struktur. Beispielsweise können intermolekulare Vernetzungen erzeugt werden zwischen mindestens einigen Molekülen der Fluoreszenz-Sensor-Substanz durch Bewirken, dass eine vernetzende Komponente auf die Fluoreszenz-Sensor-Substanz wirkt.
Als Alternative kann eine solche dreidimensional vernetzte Struktur auch erzeugt werden durch Copolymerisieren der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch Formel (1), und des polymerisierbaren Monomers, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes wie obenstehend beschrieben enthält.
Bei Verwendung der Fluoreszenz-Sensor-Substanz als einen implantierbaren Saccharid-messenden Sensor befindet sich die Fluoreszenz-Sensor-Substanz im Allgemeinen auf einem Trägermaterial, um ein Ausfließen zu verhindern. Die Immobilisierung auf dem Trägermaterial und die Erzeugung von dreidimensionalen Vernetzungen kann zur gleichen Zeit bewirkt werden durch Verwenden als ein solches Trägermaterial das polymerisierbare Monomer, das die Gruppe des (Meth)acrylamid-Restes enthält, oder sein Polymer und Polymerisieren von diesem mit der fluoreszierenden Monomerverbindung, dargestellt durch die Formel (1), bei Bedarf unter Verwenden einer vernetzenden Komponente.
Verwendbare Beispiele der vernetzbaren Komponente schließen die vernetzbaren Monomere ein, andere vernetzbare Komponenten, kationische Monomere, anionische Monomere und obenstehend beschriebene nichtionische Monomere als andere Komponenten, die zu der Fluoreszenz-Sensor-Substanz hinzugefügt werden können. Die vernetzbaren Monomere und andere vernetzbare Komponenten können weiter bevorzugt verwendet werden. Diese vernetzenden Komponenten können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden entweder einzeln oder in Kombination.
Im dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch bereitgestellt eine Detektorschicht mit der oben beschriebenen Fluoreszenz-Sensor-Substanz, immobilisiert auf einem Trägermaterial. Im vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch bereitgestellt ein implantierbarer Saccharid-messender Sensor, umfassend die oben beschriebene Fluoreszenz-Sensor-Substanz oder Detektorschicht.
Der implantierbare Saccharid-messende Sensor kann auf einem immobilisierenden Material wie einem Trägermaterial vorzugsweise immobilisiert sein über kovalente Bindungen oder hydrophobe Bindungen oder durch elektrische oder andere Wechselwirkungen, so dass die Fluoreszenz-Sensor-Substanz an einem Ausfließen gehindert wird. Ein Umriss eines Saccharid-Detektionsverfahrens unter Gebrauch der Fluoreszenz-Sensor-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung wird mit Bezug auf 4 beschrieben. 4 ist eine schematische Ansicht, die ein Beispiel veranschaulicht einer Detektorschicht mit der Fluoreszenz-Sensor-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung, immobilisiert auf einem Trägermaterial.
Der Sensor schließt ein eine Detektorschicht 10, in der eine Fluoreszenz-Sensor-Substanz 30 immobilisiert ist auf einem Trägermaterial 40. Die Fluoreszenz-Sensor-Substanz 30 ist ein Copolymer, das mindestens einschließt fluoreszierende Monomerverbindungs-Reste 33, angegeben durch ovale Punkte, und polymerisierbare Monomer-Reste 35 mit einer Gruppe eines (Meth)acrylamid-Restes und angegeben durch ovale Kreise. Fluoreszenz wird emittiert, wenn ein Saccharid 70 in einer wässrigen Lösung wechselwirkt mit der fluoreszierenden Monomerverbindung 33. Die Detektorschicht 10 kann eine optische Isolationsschicht 20 besitzen. Licht von 350 bis 420 nm wird eingestrahlt aus einer Lichtquelle 50 auf die Detektorschicht 10, und eine Veränderung in der Intensität der reflektierten Fluoreszenz oder eine Wellenlänge wird detektiert durch einen Detektor 60. Als Ergebnis kann die Konzentration des Saccharids bestimmt werden ausgehend von der Fluoreszenzintensität. Beispiele des Trägermaterials, angewandt in der Detektorschicht gemäß der vorliegenden Erfindung, schließen eine breite Vielfalt von Materialien ein, beispielsweise anorganische Materialien wie Glas und Metall, und organische Materialien wie Kunststofffilme. Bevorzugt als Trägermaterial für die Detektorschicht zur Verwendung in einem Saccharid-messenden Sensor wird ein Material, das ausgezeichnet ist in Transparenz, und das sich selbst in Körperflüssigkeiten nicht auflöst oder ausfließt. Glas und Kunststofffilme, Poly(meth)acrylamidfilme und Poly(meth)acrylatfilme können vorzugsweise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Verwendung eines Poly(meth)acrylamids als Trägermaterial ist darin vorteilhaft, dass die Immobilisierung der Fluoreszenz-Sensor-Substanz auf dem Trägermaterial und die Erzeugung einer dreidimensional vernetzten Struktur zur gleichen Zeit bewirkt werden kann, wie obenstehend beschrieben. Vernetzte Strukturen, erhältlich aus der Verwendung eines vernetzbaren Polymers, werden gebildet, wie veranschaulicht in 4, zwischen polymerisierbaren Monomer-Resten 35, die (Meth)acrylamid-Reste enthalten, zwischen fluoreszierenden Monomer-Resten 33 und polymerisierbaren Monomer-Resten 35, die (Meth)acrylamid-Reste enthalten, und zwischen polymerisierbaren Monomer-Resten 35, die (Meth)acrylamid-Reste enthalten, und dem Trägermaterial 40.
Bei Immobilisieren der Fluoreszenz-Sensor-Substanz auf einer Oberfläche eines Trägermaterials, hergestellt aus einem anorganischen Material oder organischen Material, kann das Trägermaterial und die Fluoreszenz-Sensor-Substanz chemisch mit einem vernetzenden Mittel miteinander verbunden werden. Beispiele eines solchen vernetzenden Mittels schließen Silan-Kupplungsmittel, dargestellt durch die folgende Formel (10), ein:
Formel (10)

(R'''O)₃-Si-E

In der Formel (10) repräsentiert R'''O eine C_1-5-Alkoxygruppe wie Methoxy, Ethoxy oder Propoxy, wobei Methoxy oder Ethoxy bevorzugt sind. Ein anorganisches Material kann chemisch gebunden werden mit solchen Alkoxygruppen. E ist eine funktionelle Gruppe, die fähig ist, chemisch gebunden zu werden mit einem organischen Material wie Vinyl, Epoxy, Amino, Mercapto, Acryl, Methacryl, (Meth)acryloyl, oder einem Derivat hiervon. Erläuternd angegeben werden Silankupplungsmittel, die geeignet sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, einschließlich Vinylmethoxysilan, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, N-2-(Aminoethyl)-3-aminopropylethoxysilan, 3-Mercaptopropyltrimethoxysilan, 3-Acryloxypropyltrimethoxysilan, 3-Methacryloxypropyltrimethoxysilan und 3-Methacryloxypropyltriethoxysilan.
Unter den obenstehend beschriebenen Silankupplungsmitteln sind diejenigen, die als E eine Substituentengruppe enthalten, die eine polymerisierbare Doppelbindung wie Acryl, Methacryl oder (Meth)acryloyl enthält, ebenfalls geeignet, aus den Gründen, die unten erwähnt sind. Wenn ein solches Silankupplungsmittel vorher angewendet wird bei der Oberfläche eines anorganischen Materials wie Glas oder Metall, können die fluoreszierende Monomerverbindung, die Phenylboronsäure-Rest-Gruppen und Acrylamid-Rest-Gruppen enthält, und das polymerisierbare Monomer, das eine (Meth)acrylamid-Rest-Gruppe enthält, in direkter Weise immobilisiert werden, während sie miteinander copolymerisiert werden.
Um die Fluoreszenz-Sensor-Substanz auf einer Oberfläche eines organischen Materials wie einem Kunststofffilm zu immobilisieren, können andererseits die Substituentengruppen, die reaktive Gruppen enthalten, in den Kunststofffilm eingeführt werden, um sie mit der Fluoreszenz-Sensor-Substanz zu binden. Als Verfahren für das Einführen solcher reaktiver Gruppen existiert beispielsweise ein Pfropf-Polymerisationsverfahren von Glycidyl(meth)acrylat durch Plasma, Elektronenstrahlen oder Bestrahlungen, wie offenbart im offengelegten japanischen Patent Hei 5-245198 .
Um weiter das Binden der Fluoreszenz-Sensor-Substanz an ein anorganisches Materials oder organisches Material, behandelt mit einem solchen Silankupplungsmittel, oder an einen Kunststofffilm, in den reaktive Gruppen eingeführt worden sind, zu erleichtern, kann ein Monomer mit einer oder mehreren reaktiven Substituentengruppen, die darin enthalten sind, vorher verwendet werden bei der Synthese der Fluoreszenz-Sensor-Substanz, oder reaktive Gruppen können der Synthese der Fluoreszenz-Sensor-Substanz nachfolgend eingeführt werden. Als ein solches Monomer sind diejenigen, die oben in Verbindung mit der Fluoreszenz-Sensor-Substanz beschrieben wurden, jeweils verwendbar. Beispiele solcher reaktiver Gruppen schließen ein Amino, Carboxyl, Hydroxyl, halogeniertes Carboxyl, Sulfonyl, Thiol, Isocyanat, Isothiocyanat, und Epoxygruppen. Es ist zu beachten, dass das Binden zwischen den reaktiven Gruppen und der Fluoreszenz-Sensor-Substanz auf dem anorganischen oder organischen Material, behandelt mit dem Silankupplungsmittel, bewerkstelligt werden kann im Vorhandensein oder in der Abwesenheit eines geeigneten Lösungsmittels, Katalysators und kondensierenden Stoffes.
Es wird bevorzugt, einen Fluoreszenzdetektor in den implantierbaren Saccharid-messenden Sensor gemäß der vorliegenden Erfindung einzuschließen. Weiter bevorzugt können ein solcher Sensor und Fluoreszenzdetektor zusammen mit einer Lichtquelle innerhalb eines adäquaten Gehäuses angeordnet werden.
Bei Verwendung der Fluoreszenz-Sensor-Substanz und der Detektorschicht gemäß der vorliegenden Erfindung in dem implantierbaren Saccharid-messenden Sensor wird bevorzugt, die optische Isolierungsschicht 20 auf der Detektorschicht 10, wie in 4 veranschaulicht, zu laminieren. Wenn die optische Isolierungsschicht 20 auf der Seite einer äußeren Oberfläche des Sensors angeordnet ist, kann die optische Isolierungsschicht 20 einen Kontakt der Fluoreszenz-Sensor-Substanz vermeiden, die enthalten ist in der Detektorschicht 10, mit Radikalen, oxidierenden Substanzen oder reduzierenden Substanzen als Komponenten einer Körperflüssigkeit, und kann die Fluoreszenz-Sensor-Substanz von Verschlechterungen durch solche Körperflüssigkeits-Komponenten schützen. Des weiteren ermöglicht die Laminierung der optischen Isolierungsschicht 20 die Vermeidung einer Verringerung in der Detektionsfähigkeit, die sich sonst ereignen würde infolge von Reflexion und Streuung von Anregungslicht, emittiert von der Lichtquelle 50. Des weiteren, selbst wenn eine Biosubstanz, die anders als das Saccharid ist, durch Anregungslicht aus der Lichtquelle angeregt wird, kann die Anordnung der optischen Isolierungsschicht 20 Licht abschirmen, das von der Außenseite stammt, das anders als das Anregungslicht aus der Lichtquelle 50 ist, und kann auch Effekte von Farbsubstanzen oder fluoreszierenden Substanzen im Körper eliminieren.
Die optische Isolationsschicht 20, die mit solchen Funktionen, wie obenstehend beschrieben, versehen ist, wird erzeugt aus einem Trägermaterial für die optische Isolationsschicht und einem lichtundurchlässigen Material. Als das Trägermaterial für die optische Isolierungsschicht ist es möglich, ein makromolekulares Material auszuwählen, das vernetzt oder chemisch modifiziert sein kann. Beispiele des makromolekularen Materials schließen ein Dextran, Poly(meth)acrylamide, Poly(meth)acrylate, Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyamide, Polyurethane, deren Gemische und deren Copolymere. Das Trägermaterial für die optische Isolierungsschicht kann modifiziert werden mit Vitamin E, einem Polyphenol oder einem Metallchelat, oder kann eine solche Verbindung darauf tragen. Verwendbare Beispiele des lichtundurchlässigen Materials schließen ein Carbon Black, Fullerene, Kohlenstoff-Nanoröhren und Eisenoxid.
Die Detektorschicht 10 und die optische Isolierungsschicht 20 können zusammen laminiert werden über chemische Bindungen wie kovalente Bindungen, ionische Bindungen oder hydrophobe Bindungen. Wenn die optische Isolierungsschicht Dextran als sein Trägermaterial und Carbon Black als sein lichtundurchlässiges Material verwendet, wird beispielsweise Dextran aufgelöst in einem Lösungsmittel, gefolgt von Addition von Carbon Black. Das resultierende Gemisch wird einheitlich gemacht durch Ultraschallbehandlung, bei der eine wässerige Lösung eines Alkalis und Ethylenglykoldiglycidylether weiter hinzugefügt werden. Die so hergestellte Lösung wird dann gleichmäßig durch eine Sprühvorrichtung auf die Detektorschicht aufgesprüht, und die Detektorschicht mit der darauf aufgesprühten Lösung wird danach erwärmt und getrocknet, um eine optische Isolierungsschicht auf der Detektorschicht zu laminieren.
Eine äußere Ansicht eines implantierbaren, Saccharid-messenden Sensors gemäß der vorliegenden Erfindung ist gezeigt als eine perspektivische Ansicht in 5. Der implantierbare Saccharid-messende Sensor hat ein Gehäuse 110 für das flüssigkeitsdichte Beibehalten des Inneren des Sensors, ein Fenster 120 für das Belichten von allein der optischen Isolierungsschicht oder der Detektorschicht, und einen Antennenteil 130 für das Durchführen einer Kommunikation mit einem System, das außerhalb des Körpers angeordnet ist.
Die innere Struktur des implantierbaren, Saccharid-messenden Sensors ist in 6 gezeigt. Die optische Isolierungsschicht 20 oder die Detektorschicht 10 ist so angeordnet, dass das Fenster 120 geschlossen ist, um das Innere flüssigkeitsdicht beizubehalten. Ebenfalls angeordnet sind die Lichtquelle 50 für das Emittieren von Anregungslicht, ein optischer Wellenleiter-Weg 170 für das Führen von Licht aus der Lichtquelle 50 bis zur Detektorschicht 10, der Fluoreszenzdetektor 60 für das Detektieren von Fluoreszenz aus der Detektorschicht 10, eine integrierte Schaltung 140 für das Verarbeiten von Signaldaten aus der Fluoreszenzdetektorschicht 60, und eine Batterie 150 als eine innere Energieversorgung. Auf dem Antennenteil 130 ist eine Antennenspule 160 angeordnet. Allerdings ist zu beachten, dass 5 und 6 begriffliche Ansichten sind, und Implementierungen der vorliegenden Erfindung sollten nicht auf diese Figuren eingeschränkt sein. Die Größe, Gestalt und Anordnung jedes Bestandteils kann frei nach Bedarf bestimmt werden.
Die Verwendung des implantierbaren Saccharid-messenden Sensors ermöglicht, eine Schwerfälligkeit und das Auftreten von zeitlichen Verschiebungen in einer kontinuierlichen Blutzuckermessung zu vermeiden, wenn ein Diabetiker seinen oder ihren Blutzuckerspiegel selbst kontrolliert. Zusätzlich ermöglicht die Verwendung des implantierbaren Saccharid-messenden Sensors auch einem Nicht-Diabetiker, in einfacher Weise Blutzucker-Messungen durchzuführen.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich anhand von Beispielen beschrieben. Es sollte allerdings verstanden werden, dass die folgenden Beispiele keineswegs die vorliegende Erfindung einschränken.
Beispiel 1: Synthese von 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-1-(6-acrylamido-n-hexyl)amid (nachstehend bezeichnet als "F-AAm")
A) Synthese von Methyl-9,10-bis(bromomethyl)anthracen-2-carboxylat
Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carboxylat (360 mg), N-Bromosuccinimid (540 mg) und Benzoylperoxid (5 mg) wurden hinzugefügt zu einem Gemisch von Chloroform (4 ml) und Tetrachlorkohlenstoff (10 ml), gefolgt von Erwärmen unter Rückfluss für 2 h. Dem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde der Rest mit Methanol extrahiert, um die Zielverbindung zu ergeben (430 mg).
B) Synthese von Methyl-9,10-bis(aminomethyl)anthracen-2-carboxylat
Methyl-9,10-bis(bromomethyl)anthracen-2-carboxylat (400 mg), erhalten in der obigen Prozedur A), wurde aufgelöst in Chloroform (60 ml), eine 2 M Lösung von Methylamin in Methanol (8 ml) wurde hinzugefügt, und das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt für 4 h. Dem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde das Reaktionsprodukt über einer Silicagelsäule mit Methanol/Chloroform als Laufmittel gereinigt, um die Zielverbindung zu ergeben (235 mg).
C) Synthese von 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure
Methyl-9,10-bis(aminomethyl)anthracen-2-carboxylat (200 mg), erhalten in der obigen Prozedur (B), 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan (700 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (0,35 ml) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (3 ml), gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 16 h. Einem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde das Reaktionsprodukt über eine Silicagelsäule mit Methanol/Chloroform als Laufmittel gereinigt, um den Methylester (194 mg) der Zielverbindung zu ergeben. Der Methylester wurde in Methanol (5 ml) aufgelöst, und 4 N Natriumhydroxid (1 ml) wurden danach hinzugefügt, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 10 h. Das Reaktionsgemisch wurde neutralisiert mit Salzsäure, und das anorganische Salz wurde entfernt durch Gelfiltration, um die Zielverbindung zu ergeben (180 mg). Der Schmelzpunkt des Reaktionsproduktes war 121 °C, und in DMSO-d₆ wurden die folgenden ¹H-NMR-Daten (δ, ppm) erhalten: 2,15 ppm(d,6H,N-CH₃), 4,10 ppm(m,4H,N-CH₂- Benzol), 4,45 ppm(m,4H,N-CH₂-Anthracen), 7,55-8,90 ppm(m,15H, aromatisch).
D) Synthese von F-AAm
In Dimethylformamid (5 ml), in dem N,N-Diisopropylethylamin (50 mg) enthalten sind, wurden aufgelöst 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure (70 mg), erhalten in der obigen Prozedur C), 1-Acrylamido-6-aminohexan (22 mg) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid (50 mg) wurden aufgelöst, gefolgt von Rühren bei 60 °C für 18 h. Das Reaktionsgemisch wurde aufgelöst in Chloroform (50 ml). Die so hergestellte Lösung wurde dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Chloroformschicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und wurde danach bis zur Trockenheit unter verringertem Druck destilliert, um die Zielverbindung zu ergeben (85 mg).
Beispiel 2: Synthese von 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-(terminal Acrylamido-PEG3400)amid
9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure (10 mg), erhalten in der obigen Prozedur C) von Beispiel 1, Amino-PEG3400-acrylamid (Produkt von Nektar Corp.; 50 mg) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid (22 mg) wurden aufgelöst in 100 mM Phosphatpuffer (pH 6,0; 3 ml), gefolgt von Rühren bei 60 °C für 24 h. Das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration ausgesetzt, und eine fluoreszierende Polymerfraktion wurde gesammelt, um die Zielverbindung zu ergeben (36 mg).
Beispiele 3 bis 9

Hergestellt wurde eine Dimethylsulfoxid-Lösung (nachstehend bezeichnet als "DMSO") mit einer F-AAm Konzentration von 10 Gew.-%, einer gemischten DMSO-Wasser-Lösung von 80 Gew.-% mit einer Acrylamid-Konzentration (nachstehend bezeichnet als "AAm") von 30 Gew.-%, einer gemischten DMSO-Wasser-Lösung von 50 Gew.-% mit einer Natriumpersulfat-Konzentration (nachstehend bezeichnet als "SPS") von 3 Gew.-% und einer DMSO-Lösung mit einer N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin-Konzentration (nachstehend abgekürzt als "TEMED") von 2 Gew.-%. Unter Verwendung dieser Reagenslösungen, DMSO und Wasser, wurden Reaktionslösungen hergestellt, um finale Konzentrationen und Zusammensetzungen, wie in Tabelle 1 gezeigt, zu ergeben. Die so hergestellten Reaktionslösungen wurden einer Polymerisation bei Raumtemperatur für 2 h ausgesetzt, um Copolymere F-AAm und AAm zu erhalten. Sie werden nachstehend jeweils als Beispiele 3–9 bezeichnet. Die resultierenden Copolymere wurden separat aus Aceton gefällt, aufgelöst in Wasser, und wieder aus Aceton gefällt. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt, um eine Reinigung durchzuführen. Der Reinigung nachfolgend wurden die resultierenden Fluoreszenz-Sensor-Substanzen im Vakuum getrocknet. Tabelle 1

	F-AAm (Gew.-%)	AAm (Gew.-%)	SPS (Gew.-%)	TEMED (Gew.-%)	DMSO (Gew.-%)	Gesamt-Menge (ml)	F-AAm/AAm beladenes molares Verhältnis
Bsp. 3	1,46						1/14
Bsp. 4	0,43						1/50
Bsp. 5	0,15						1/144
Bsp. 6	0,10	2,1	0,15	0,04	80	2,0	1/215
Bsp. 7	0,050						1/430
Bsp. 8	0,015						1/1435
Bsp. 9	0,0075						1/2870

Beispiel 10: Herstellung von 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-(terminal Acrylamido-PET3400)amid/AAm Copolymer
Hergestellt wurde eine wässerige Lösung mit 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-(terminal Acrylamido-PET3400)amid, enthalten zu 10 Gew.-%, einer wässerigen Lösung mit AAm, enthalten zu 30 Gew.-%, eine gemischte wässerige Lösung, die SPS zu 3 Gew.-% enthält, und eine wässerige Lösung, die TEMED zu 2 Gew.-% enthält. Mit diesen Reagenslösungen und Wasser wurde eine Reaktionslösung hergestellt, die eine fluoreszierende Monomerverbindung enthält, die die gleiche war wie die, die in Beispiel 2 synthetisiert wurde, bei 0,6 Gew.-%, AAm bei 4,5 Gew.-%, SPS bei 0,3 Gew.-% und TEMED bei 0,08 Gew.-%, allesamt als finale Konzentrationen (1/427 bezüglich des beladenen molaren Verhältnisses der fluoreszierenden Monomerverbindung zu AAm). Die Reaktionslösung wurde einer Polymerisation bei Raumtemperatur für 8 h ausgesetzt, um ein Copolymer zu ergeben. Das Copolymer wurde dazu gebracht, separat aus Aceton auszufallen, aufgelöst in Wasser, und wiederholt ausgefällt aus Aceton. Diese Prozedur wurde zehnmal wiederholt, um eine Reinigung durchzuführen. Der Reinigung nachfolgend wurde die resultierende Fluoreszenz-Sensor-Substanz im Vakuum getrocknet.
Beispiel 11
Die Copolymere, erhalten in Beispielen 3 bis 10, wurden jeweils aufgelöst in einer 1/2 (v/v) Lösung von Methanol und Phosphatpuffer, um eine Konzentration von 0,05 mg/ml zu ergeben. Unter Verwendung eines Spektrophotometers wurde die Absorption bei 265 nm gemessen. Bezüglich eines Acrylamid-Homopolymers (Molekulargewicht: 150000) wurde die Absorption genauso gemessen. Diese Absorption wurde als ein BLANK-Wert von den Absorptionswerten der Copolymere der entsprechenden Beispiele subtrahiert.
Basierend auf den Kalibrierungskurven, die vorher erstellt wurden für die jeweiligen fluoreszierenden Monomerverbindungen, wurden die Verhältnisse der fluoreszierenden Monomerverbindung zu AAm der einzelnen Fluoreszenz-Sensor-Substanzen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Es ist aus Tabelle 2 ersichtlich, dass in Beispielen 3 bis 9 die Absorption verhältnismäßig zum Anteil des beladenen F-AAm anstieg, und somit wurde F-AAm als ein Bestandteil bei einer fixierten Rate als die jeweilige Fluoreszenz-Sensor-Substanz eingefügt. Tabelle 2

	Beladenes molares Verhältnis fluoreszierende Monomerverbindung/ AAm	Absorption	Blankkorrigierte Absorption	Gemessenes molares Verhältnis fluoreszierende Monomerverbindung/ AAm
Beispiel 3	1/14	0,725	0,698	1/10
Beispiel 4	1/50	0,231	0,204	1/59
Beispiel 5	1/144	0,113	0,086	1/185
Beispiel 6	1/215	0,076	0,049	1/282
Beispiel 7	1/430	0,052	0,025	1/572
Beispiel 8	1/1435	0,035	0,008	1/1932
Beispiel 9	1/2870	0,031	0,004	1/3874

Kalibrierungskurven-Formel für die fluoreszierenden Monomerverbindungen: y = 20,158x (r = 1, x: F-AAm Konzentration [μmol/ml])

Beispiel 12
Um das Ansprechen der fluoreszierenden Monomerverbindungen in den Copolymeren zu untersuchen, die in Beispielen 3 bis 10 synthetisiert worden sind, in der Fluoreszenzintensität gegenüber einer Glukosekonzentration, durch Abgleichen der Konzentrationen der Copolymere, wurden die Copolymere jeweils aufgelöst in Phosphatpuffer pH 7,0, um eine Konzentration zu ergeben, so dass die Absorption bei 265 nm 0,05 wurde. Wie in 7 gezeigt, war unter den relativen Fluoreszenzintensitäten (Ex = 405 nm, Ein = 442 nm) der einzelnen Fluoreszenz-Sensor-Substanz-Lösungen bei einer Glucosekonzentration von 500 mg/dl die relative Fluoreszenzintensität der Fluoreszenz-Sensor-Substanz (F-AAm/AAm = 1/14) von Beispiel 3 niedriger, verglichen mit denjenigen der Fluoreszenz-Sensor-Substanzen des gleichen F-AAm/AAm-Copolymersystems. Andererseits zeigte die Fluoreszenz-Sensor-Substanz von Beispiel 10, die synthetisiert worden ist unter Verwendung der Fluoreszenz-Monomer-Verbindung mit dem darin enthaltenen ausgedehnten "Y" Rest, eine sehr hohe relative Fluoreszenzintensität.
Beispiel 13
Das Ansprechen in der Fluoreszenzintensität gegenüber der Glucosekonzentration von 500 mg/dl wurde untersucht in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 12, mit der Ausnahme, dass die Konzentrationen der in Beispielen 3 bis 9 synthetisierten Copolymere in gleicher Weise bei 10 μg/ml eingestellt wurden. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
Beispiel 14
Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen und Mischen von AAm, N,N'-Methylenbisacrylamid (nachstehend bezeichnet als "BIS"), SPS, TEMED und F-AAm-Reagenslösungen in einer 80 Gew.-% DMSO-Wasser-Lösung, um die folgenden finalen Konzentrationen zu ergeben: AAm: 15 Gew.-%, BIS: 0,15 Gew.-%, SPS: 0,3 Gew.-%, TEMED: 0,08 Gew.-% und F-AAm: 0,50 Gew.-% (F-AAm/AAm = 1/300 bezüglich des beladenen molaren Verhältnisses).
Eine Glasplatte, die vorher einer Oberflächenbehandlung mit einem Silankupplungsmittel unterzogen worden ist, und eine unbehandelte Glasplatte wurden angeordnet, wobei dazwischen ein Raum gelassen wurde. Die Lösung wurde in den Raum eingefüllt, gefolgt von Polymerisation bei Raumtemperatur für 2 h unter einer Stickstoffatmosphäre. Dem Vollenden der Polymerisation nachfolgend wurden die Glasplatten in reines Wasser eingetaucht und nur die unbehandelte Glasplatte wurde abgetrennt, um eine Gelschicht zu erhalten, erzeugt aus einem F-AAm/AAm-Copolymer, immobilisiert auf dem aus Glas hergestellten Trägermaterial. Die somit hergestellte Gelschicht wurde abwechselnd eingetaucht in Methanol und 50 mM Phosphatpuffer (pH = 7,0), jeweils 5 min pro Eintauchen, und wurde danach für 10 h oder länger in einen Phosphatpuffer eingetaucht und gewaschen, um eine Detektor-Schicht zu erhalten.
Beispiel 15
In Dimethylformamid (30 ml), in dem N,N-Diisopropylethylamin (0,2 ml) enthalten sind, wurden 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure (350 mg), synthetisiert in der Prozedur C) von Beispiel 1, Methyl-6-aminohexanoat (200 mg) und 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid (220 mg) aufgelöst, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 4 h. Das Reaktionsgemisch wurde aufgelöst in Chloroform (100 ml). Die so hergestellte Lösung wurde dreimal mit destilliertem Wasser und einmal mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Chloroformschicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und wurde danach zur Trockenheit unter verringertem Druck destilliert, um den Methylester (360 mg) als Zwischenprodukt zu ergeben. Das Zwischenprodukt wurde in Methanol (10 ml) aufgelöst und nach dem Hinzufügen einer 4 N wässrigen Lösung von Natriumhydroxid (1 ml) wurde es bei Raumtemperatur für 15 h zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Ionenaustauschersäule geladen, um das Alkali zu entfernen, und wurde danach zur Trockenheit konzentriert, um 9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-1-(6'-carbonsäure-n-hexyl)amid (310 mg) zu ergeben.
Beispiel 16
Eine wässrige Lösung von Perchlorsäure (effektive Chlorkonzentration: 5 Gew.-%, 8 g) und eine 6 N wässrige Lösung von Natriumhydroxid (30 ml) wurden in einen flachen rechteckigen Edelstahlbehälter von 10 cm × 10 cm gegeben, und danach abgekühlt auf 0 °C. Eine Polyacrylamidmembran, die geschnitten worden ist zu einem Rechteck von 10 cm × 10 cm, wurde sanft in den Container gegeben und wurde bei 0 °C für 2 h zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde entfernt, und die resultierende Membran wurde leicht viermal mit destilliertem Wasser (jeweils 40 ml) und zweimal mit Dimethylformamid (jeweils 20 ml) gewaschen, um eine aktivierte Polyacrylamidmembran zu erhalten.
9,10-Bis[[N-methyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen-2-carbonsäure-1-(6'-carbonsäure-n-hexyl)amid (20 mg), die fluoreszierende Monomerverbindung, synthetisiert in Beispiel 15, 1-[3-(Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid (12 mg) und 1-Hydroxybenzotriazol (8 mg) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (10 ml). Die resultierende Lösung wurde gefüllt in einen flachen rechteckigen Edelstahlbehälter von 10 cm × 10 cm, und die aktivierte Polyacrylamidmembran, hergestellt in der oben beschriebenen Reaktion, wurde eingeweicht. Nachdem die Membran bei Raumtemperatur über 17 h zur Reaktion gebracht worden war, wurde sie dreimal mit Dimethylformamid gewaschen (jeweils 20 ml), zweimal mit 0,01 N Salzsäure (jeweils 40 ml) und dreimal mit destilliertem Wasser (jeweils 40 ml), und wurde des weiteren eingetaucht und gewaschen für 10 h oder länger in 50 mM Phosphatpuffer (pH = 7,0), um eine Detektorschicht zu erhalten mit der auf der Polyacrylamidmembran immobilisierten fluoreszierenden Monomerverbindung.
Dextran (7 g) wurde bei 50 °C unter Rühren in destilliertem Wasser (175 ml) aufgelöst, und dem Hinzufügen von Carbon Black (5 g) nachfolgend wurde das resultierende Gemisch einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, bis das Carbon Black gleichmäßig dispergiert war. Zu dem Gemisch wurden eine 50 Gew.-% wässrige Lösung von Natriumhydroxid (3,5 ml) und Ethylenglykoldiglycidylether (6,5 g) hinzugefügt, gefolgt von Rühren bei 45 °C für 30 min. Destilliertes Wasser (230 ml) wurden danach hinzugefügt, und die resultierende gemischte Lösung wurde in eine Sprühvorrichtung gegeben. Die Detektorschicht, vorbereitet im vorhergehenden Schritt, wurde an einer Stelle auf einer flachen Glasplatte gehalten, die gemischte Lösung wurde gleichmäßig aufgesprüht, und danach wurde ein Trocknen für 30 min in einem Ofen durchgeführt, kontrolliert bei 45 °C, um die Detektorschicht zu erhalten mit einer darauf laminierten optischen Isolationsschicht.
Vergleichsbeispiel 1, Synthese und Polymerisation von 9,10-Bis(methylen)[N-(acryloylaminohexyl)-N-(ortho-boronobenzyl)methylen]anthracen (nachstehend bezeichnet als "F-AAm-2")
A') Synthese von 9,10-Bis[6'-(t-butoxycarbonylamino)hexylaminomethyl]anthracen
9,10-Bis(chloromethyl)anthracen (500 mg), N-BOC-Hexyldiamin (1,3 g) und Diisopropylethylamin (1,25 ml) wurden aufgelöst in Dimethylsulfoxid (10 ml), gefolgt von einer Reaktion unter Rühren bei 60 °C für 6 h. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform verdünnt (60 ml) und dreimal mit Wasser gewaschen (jeweils 100 ml) und einmal mit gesättigter Salzlösung (100 ml). Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Trockenmittel filtriert worden war, wurde die organische Schicht konzentriert, und das Konzentrat wurde gereinigt durch Chromatographie über einer Silicagelsäule mit Chloroform/Methanol als Laufmittel, um die Zielverbindung zu ergeben (56 mg).
B') Synthese von 9,10-Bis[[N-6'–(t-butoxycarbonylamino)hexyl-N-[2-(5,5-dimethylborinan-2-yl)benzyl]amino]methyl]anthracen
Das Produkt (50 mg), erhalten in der obigen Prozedur A'), 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan (170 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (0,1 ml) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (1 ml), gefolgt von Rühren bei 25 °C für 5 h. Dem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde das Reaktionsprodukt gereinigt über eine Silicagelsäule mit Methanol/Chloroform als Laufmittel, um die Zielverbindung zu ergeben (35 mg).
C') Synthese von 9,10-Bis[[N-6'-aminohexyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]anthracen
Das Produkt (35 mg), erhalten in der obigen Prozedur B'), wurde aufgelöst in Methanol (1 ml). 4 N Salzsäure (0,5 ml) wurden hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wurde bei 25 °C für 10 h gerührt. Dem Verdampfen bis zur Trockenheit nachfolgend wurde das anorganische Salz durch Gelfiltration entfernt, um die Zielverbindung zu ergeben (26 mg).
D') Synthese von F-AAm-2
Das Produkt (25 mg), erhalten in der obigen Prozedur C'), wurde aufgelöst in DMF (0,5 ml). Unter einer Stickstoffatmosphäre wurden N,N-Diisopropylethylamin (20 mg) und Acryloylchlorid (12 mg) hinzugefügt bei –10 °C, gefolgt von Reaktion unter Rühren für 30 min. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegeben, mit Chloroform extrahiert und mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Chloroformschicht wurde getrocknet und wurde danach bis zur Trockenheit verdampft, um die Zielverbindung zu ergeben, dargestellt durch die unten beschriebene Formel (11) (26 mg) als Vergleichsverbindung.
E') Polymerisation
Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen und Vermischen von AAm-Monomer, BIS, SPS, TEMED und F-AAm-2, dargestellt durch die Formel (11), in einer 80 Gew.-% DMSO-Wasser-Lösung, um die folgenden finalen Konzentrationen zu ergeben: AAm-Monomer: 15 Gew.-%, BIS: 0,15 Gew.-%, SPS: 0,3 Gew.-%, TEMED: 0,08 Gew.-% und F-AAm-2: 0,50 Gew.-% (F-AAm-2/AAm = 1/300 bezüglich des beladenen molaren Verhältnisses).
Eine Glasplatte, die vorher einer Oberflächenbehandlung mit einem Silankupplungsmittel unterzogen worden war, und eine unbehandelte Glasplatte wurden angeordnet, wobei dazwischen ein Raum freigelassen wurde. Die Lösung wurde in den Raum eingefüllt, gefolgt von Polymerisation bei Raumtemperatur für 2 h unter einer Stickstoffatmosphäre. Dem Vollenden der Polymerisation nachfolgend wurden die Glasplatten in reines Wasser eingetaucht und nur die unbehandelte Glasplatte wurde abgetrennt, um eine Gelschicht zu erhalten, erzeugt aus einem F-AAm-2/AAm-Copolymer, immobilisiert auf dem aus Glas hergestellten Trägermaterial. Die so erhaltene Gelschicht wurde abwechselnd eingetaucht in Methanol und 50 mM Phosphatpuffer (pH = 7,0), dreimal für 5 min pro Eintauchen, und wurde danach für 10 h oder länger in Phosphatpuffer eingetaucht und gewaschen, um eine Detektorschicht-Vorform zu erhalten. Eine optische Isolierungsschicht wurde auf der Detektorschicht-Vorform in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 16 laminiert, um eine Detektorschicht zu erhalten. Formel (11)
Beispiel 17: Synthese von 9,10-Bis(methylen)[[N-(ortho-boronobenzyl)methylen]-N-[(acryloylpolyoxyethylen)carbonylamino]-n-hexamethylen]-2-acetylanthracen (nachstehend bezeichnet als "F-PEG-AAm-1")
A) Synthese von 9,10-Bis(bromomethyl)-2-acetylanthracen
9,10-Dimethyl-2-acetylanthracen (600 mg), N-Bromosuccinimid (800 mg) und Benzoylperoxid (5 mg) wurden hinzugefügt zu einem Gemisch aus Chloroform (6 ml) und Tetrachlorkohlenstoff (20 ml), gefolgt von einem Erwärmen unter Rückfluss bei 80 °C für 2 h. Nachdem das Lösungsmittel entfernt worden war, wurde der Rest mit Methanol extrahiert, um die Zielverbindung zu ergeben (780 mg).
B) Synthese von 9, 10-Bis[6'-(t-butoxycarbonylamino)hexylaminomethyl]-2-acetylanthracen
Das Produkt (500 mg), erhalten in der obigen Prozedur A), N-BOC-Hexyldiamin (1,125 g) und Diisopropylethylamin (1,25 ml) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (10 ml), gefolgt von einer Reaktion unter Rühren bei 45 °C für 1 h. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chloroform verdünnt (60 ml), und danach dreimal mit Wasser gewaschen (jeweils 100 ml) und einmal mit gesättigter Salzlösung (100 ml). Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Trockenmittel abfiltriert worden war, wurde die organische Schicht konzentriert, und das Konzentrat wurde gereinigt durch Chromatographie über einer Silicagelsäule mit Chloroform/Methanol als Laufmittel, um die Zielverbindung zu ergeben (367 mg).
C) Synthese von 9,10-Bis[[N-6'-(t-Butoxycarbonylamino)hexyl-N-[2-(5,5-dimethylborinan-2-yl)benzyl]amino]methyl]-2-acetylanthracen
Das Produkt (200 mg), erhalten in der obigen Prozedur B), 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan (700 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (0,35 ml) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (3 ml), gefolgt von Rühren bei 25 °C für 16 h. Dem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde das Reaktionsprodukt über eine Silicagelsäule mit Methanol/Chloroform als Laufmittel gereinigt, um die Zielverbindung zu ergeben (194 mg).
D) Synthese von 9,10-Bis[[N-6'-aminohexyl-N-(ortho-boronobenzyl)amino]methyl]-2-acetylanthracen
Das Produkt (100 mg), erhalten in der obigen Prozedur C), wurde aufgelöst in Methanol (2 ml). 4 N Salzsäure (2 ml) wurden hinzugefügt, und das so erhaltene Gemisch wurde bei 25 °C für 10 h gerührt. Dem Verdampfen bis zur Trockenheit nachfolgend wurde das anorganische Salz durch Gelfiltration entfernt, um die Zielverbindung zu ergeben (95 mg).
E) Synthese von F-PEG-AAm-1
Das Produkt (160 mg), erhalten in der obigen Prozedur D), wurde aufgelöst in Dimethylformamid (0,5 ml). Die Lösung wurde hinzugefügt zu einer Lösung von Acryloyl-(polyethylenglykol)-N-hydroxysuccinimidester (PEG Molekulargewicht: 3400; 1,22 g) in 100 mM Phosphatpuffer (pH = 8,0; 10 ml), gefolgt von Rühren bei 25 °C für 20 h. Das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration ausgesetzt, um eine fluoreszierende Makromolekülfraktion aufzusammeln. Der Lyophilisierung nachfolgend wurde die Zielverbindung erhalten (1,2 g). Die obigen Prozeduren A) bis E) sind im Syntheseschema von 1 gezeigt. F-PEG-AAm-1 wurde aufgelöst in einer 100 mM Konzentration in Wasser, unter den Bedingungen von 25 °C und pH 7,0, ohne Vorhandensein eines organischen Lösungsmittels oder eines Löslichkeitsvermittlers. Die ¹H-NMR-Daten der Zielverbindung in Deuterochloroform waren wie folgt (δ, ppm): 1,30-1,65(m,C-CH₂-C), 2,90(s,Ac), 2,78(m,-C(-C)N-CH₂-C), 3,25(m, CH₂-NH-COO), 3,50-3,80(s,PEG), 5,80(d,COCH=C), 6,17(m,C=CH₂), 7,20-8,20(m, aromatisch). Es wurde bestätigt, dass kein Wasserstoff-Signal mit einem Peak überlappte, der PEG-Rest-Gruppen zugeschrieben wird.
Beispiel 18
Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen und Vermischen von Acrylamid, F-PEG-AAM-1, synthetisiert in Beispiel 17, Methylen-bisacrylamid, Natriumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin in reinem Wasser, um die folgenden finalen Konzentrationen zu ergeben: Acrylamid: 15 Gew.-%, F-PEG-AAm-1: 10 Gew.-%, Methylen-bisacrylamid: 0,3 Gew.-%, Natriumpersulfat: 0,18 Gew.-%, und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin: 0,36 Gew.-%. Eine Glasplatte, die vorher einer Oberflächenbehandlung mit einem Silankupplungsmittel unterzogen worden war, und eine unbehandelte Glasplatte wurden angeordnet, wobei dazwischen ein Raum gelassen wurde. Die Lösung wurde in den Raum eingefüllt, gefolgt von einer Polymerisation bei 25 °C für 8 h unter einer Stickstoffatmosphäre. Dem Vollenden der Polymerisation nachfolgend wurden die Glasplatten eingetaucht in reines Wasser, und nur die unbehandelte Glasplatte wurde abgetrennt, um eine Gelschicht zu erhalten, erzeugt aus einem Acrylamid/F-PEG-AAm-1 Copolymer (molares Verhältnis: 160/1), immobilisiert auf dem aus Glas hergestellten Trägermaterial.
Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen oder Vermischen von Acrylamid, Methylen-bisacrylamid, Natriumpersulfat, N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin und Carbon Black in reinem Wasser, um die folgenden finalen Konzentrationen zu ergeben: Acrylamid: 20 Gew.-%, Methylen-bisacrylamid: 1 Gew.-%, Natriumpersulfat: 0,18 Gew.-%, N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin: 0,36 Gew.-%, und Carbon Black: 5 Gew.-%. Die Lösung wurde aufgebracht auf eine Oberfläche der Gelschicht, gefolgt von Polymerisation bei 25 °C für 24 h unter einer Stickstoffatmosphäre. Die resultierende Gelschicht wurde insgesamt zehnmal für 30 min pro Eintauchen eingetaucht und gewaschen mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), mit einer Glukosekonzentration von 500 mg/dl. Nachfolgend wurde die Gelschicht eingetaucht und insgesamt viermal für 30 min pro Eintauchen in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen, so dass Glucose abgewaschen wurde, um eine Detektorschicht zu erhalten.
Beispiel 19: Synthese von Methyl-9,10-bis(methylen)[N-(ortho-boronobenzyl)]-N-[(acryloylpolyoxyethylen(carbonylamino]-n-hexamethylen]-anthracen-2-carboxylat (nachstehend bezeichnet als "F-PEG-AAm-2")
a) Synthese von 9,10-Dimethylanthracen-2-carbonsäure
9,10-Dimethyl-2-acetylanthracen (1,2 g) wurden aufgelöst in Dioxan (24 ml). Eine wässrige Lösung von Natriumperchlorat (10 ml; effektive Chlorkonzentration: 10 Gew.-%) wurden danach hinzugefügt, gefolgt von einer Reaktion unter Rühren bei 85 °C für 8 h. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und danach sauer gestellt mit verdünnter Salzsäure. Die resultierende Fällung wurde mittels Filtration aufgelesen, mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und danach im Vakuum getrocknet, um die Zielverbindung zu ergeben (1,16 g).
b) Synthese von Methyl-9,10-dimethylanthracen-2-carboxylat
Das Produkt (1 g), erhalten in der obigen Prozedur a), wurde aufgelöst in 5 Gew.-% Salzsäure-Methanol, gefolgt von Erwärmen unter Rückfluss für 20 h. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, und Wasser (30 ml) wurde hinzugefügt. Das resultierende Gemisch wurde extrahiert mit Chloroform (100 ml). Die Chloroformschicht wurde gewaschen mit einer wässerigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und gesättigter Salzlösung, und wurde danach getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat. Die Chloroformschicht wurde bis zur Trockenheit verdampft, um die Zielverbindung zu ergeben (915 mg).
c) Synthese von Methyl-9,10-bis(bromomethylen)anthracen-2-carboxylat
Das Produkt (600 mg), erhalten in der obigen Prozedur b), N-Bromosuccinimid (800 mg) und Benzoylperoxid (5 mg) wurden hinzugefügt zu einem Gemisch von Chloroform (6 ml) und Tetrachlorkohlenstoff (20 ml), gefolgt von Erwärmen unter Rückfluss für 2 h. Dem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde der Rest extrahiert mit Methanol, um die Zielverbindung zu ergeben (767 mg).
d) Synthese von Methyl-9,10-bis[6'-(t-butoxycarbonylamino)hexylaminomethyl]anthracen-2-carboxylat
Das Produkt (500 mg), erhalten in der obigen Prozedur c), N-BOC-Hexyldiamin (1,125 g) und Diisopropylethylamin (1,25 ml) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (10 ml), gefolgt von Reaktion unter Rühren bei 45 °C für 2 h. Das Reaktionsgemisch wurde verdünnt mit Chloroform (60 ml), und danach dreimal mit Wasser gewaschen (jeweils 100 ml) und einmal mit gesättigter Salzlösung (100 ml). Die organische Schicht wurde getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat. Nachdem das Trockenmittel abfiltriert worden war, wurde die organische Schicht konzentriert, und das Konzentrat wurde gereinigt durch Chromatographie über einer Silicagelsäule mit Chloroform/Methanol als Laufmittel, um die Zielverbindung zu ergeben (307 mg).
e) Synthese von Methyl-9,10-bis[[N-6'-(t-butoxycarbonylamino)hexyl-N-[2-(5,5-dimethylborinan-2-yl)benzyl]amino]methyl]anthracen-2-carboxylat
Das Produkt (200 mg), erhalten in der obigen Prozedur d), 2-(2-Bromomethylphenyl)-1,3-dioxaborinan (700 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (0,35 ml) wurden aufgelöst in Dimethylformamid (3 ml), gefolgt von Rühren bei 25 °C für 16 h. Dem Entfernen des Lösungsmittels nachfolgend wurde das Reaktionsprodukt gereinigt über einer Silicagelsäule mit Methanol/Chloroform als Laufmittel, um die Zielverbindung zu ergeben (203 mg).
f) Synthese von Methyl-9,10-bis(methylen)[[N-(ortho-boronobenzyl)methylen]-N-(aminohexyl)]anthracen-2-carboxylat
Das Produkt (100 mg), erhalten in der obigen Prozedur e), wurde aufgelöst in Methanol (3 ml). 8 N Salzsäure (0,5 ml) wurden hinzugefügt, und die so erhaltene Mischung wurde gerührt bei 25 °C für 2 Tage. Dem Verdampfen zur Trockenheit nachfolgend wurde das anorganische Salz durch Gelfiltration entfernt, um die Zielverbindung zu ergeben (82 mg).
g) Synthese von F-PEG-AAm-2
Das Produkt (160 mg), erhalten in der obigen Prozedur f), wurde aufgelöst in Dimethylformamid (0,5 ml). Die Lösung wurde hinzugefügt zu einer Lösung von Acryloyl-(polyethylenglykol)-N-hydroxysuccinimidester (PEG Molekulargewicht: 3400; 1,22 g) in 100 mM Phosphatpuffer (pH = 8,0; 10 ml), gefolgt von Rühren bei 25 °C für 20 h. Das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration ausgesetzt, um eine fluoreszierende Makromolekülfraktion aufzulesen. Der Lyophilisierung nachfolgend wurde die Zielverbindung erhalten (1,1 g). Die obigen Prozeduren a) bis e) sind gezeigt im Syntheseschema von 3. F-PEG-AAm-2 wurde aufgelöst bei einer 100 mM Konzentration in Wasser unter den Bedingungen von 25 °C und pH 7,0, ohne Vorhandensein eines organischen Lösungsmittels oder eines Löslichkeitsvermittlers. Die 1H-NMR-Daten der Zielverbindung in Deuterochloroform waren wie folgt (δ, ppm): 1,30-1,65 (m,C-CH₂-C), 2,78 (m,-C(-C)N-CH₂-C), 3,25(m,CH2-NH-COO), 3,50-3,80(s,PEG), 4,10(s,COOCH₃), 5,80(d,COCH=C), 6,17(m,C=CH₂), 7,20-8,20(m, aromatisch). Es wurde bestätigt, dass kein Wasserstoffsignal überlappte mit einem Peak, der PEG-Rest-Gruppen zugeschrieben wird.
Beispiel 20
Unter Verwendung von F-PEG-AAm-2, synthetisiert in Beispiel 19, wurde eine Gelschicht erzeugt aus Acrylamid/F-PEG-AAm-2 (molares Verhältnis: 160/1), immobilisiert auf einem aus Glas hergestellten Trägermaterial, erhalten in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 18. Des weiteren wurde eine Detektorschicht erhalten in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 18.
Vergleichsbeispiel 2: Synthese und Polymerisation von AAm-2
F-AAm-2, dargestellt durch die Formel (11) wurde synthetisiert in einer ähnlichen Weise wie in den Prozeduren A') bis D') von Vergleichsbeispiel 1.
E'') Polymerisation
Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen und Vermischen von Acrylamid, Methylen-bisacrylamid, F-AAm-2, Natriumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin in einer 80 v/v-% wässerigen Lösung von Dimethylsulfoxid, um die folgenden finalen Konzentrationen zu ergeben: Acrylamid: 15 Gew.-%, Methylen-bisacrylamid: 0,3 Gew.-%, F-AAm-2: 1,2 Gew.-%, Natriumpersulfat: 0,18 Gew.-%, und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin: 0,36 Gew.-%.
Eine Glasplatte, die vorher einer Oberflächenbehandlung mit einem Silankupplungsmittel ausgesetzt worden war, und eine unbehandelte Glasplatte wurden angeordnet, wobei dazwischen ein Raum freigelassen wurde. Die Lösung wurde in den Raum eingefüllt, gefolgt von einer Polymerisation bei 25 °C für 8 h unter einer Stickstoffatmosphäre. Dem Vollenden der Polymerisation nachfolgend wurden die Glasplatten in reines Wasser eingetaucht, und nur die unbehandelte Glasplatte wurde abgetrennt, um eine Gelschicht zu erhalten, erzeugt aus einem Acrylamid/F-AAm-2-Copolymer (molares Verhältnis: 150/1), immobilisiert auf dem aus Glas hergestellten Trägermaterial.
Eine Lösung wurde hergestellt durch Auflösen oder Vermischen von Acrylamid, Methylen-bisacrylamid, Natriumpersulfat, N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin und Carbon Black in reinem Wasser, um die folgenden finalen Konzentrationen zu ergeben: Acrylamid: 20 Gew.-%, Methylen-bisacrylamid: 1 Gew.-%, Natriumpersulfat: 0,18 Gew.-%, N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin: 0,36 Gew.-%, und Carbon Black: 5 Gew.-%. Die Lösung wurde aufgebracht auf eine Oberfläche der Gelschicht, gefolgt von einer Polymerisation bei 25 °C für 24 h unter einer Stickstoffatmosphäre. Die resultierende Gelschicht wurde in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einer Glucosekonzentration von 500 mg/dl eingetaucht und insgesamt zehnmal gewaschen für 30 min pro Eintauchen. Nachfolgend wurde die Gelschicht in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eingetaucht und insgesamt viermal für 30 min pro Eintauchen gewaschen, so dass Glucose abgewaschen wurde, um eine Detektorschicht zu erhalten.
Beispiel 21
Die Detektorschichten, erhalten in Beispiel 16 und Vergleichsbeispiel 1, wurden jeweils an einer Stelle auf Bewertungsvorrichtungen gehalten. Unter Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurden deren Ansprechen gegenüber Glucose bei veränderten Konzentrationen in der Fluoreszenzintensität bewertet. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Jede Bewertungsvorrichtung wurde versehen mit einer Zelle, einem Bündel von optischen Fasern und einem Fluorospektrometer. Die Zelle kann in fixierter Weise die Detektorschicht beherbergen, und ermöglicht die Zirkulation einer Flüssigkeit durch deren Inneres. Das Bündel optischer Fasern ist in fixierter Weise an einem Ende hiervon auf einer hinteren Seite der Zelle gesichert, und ist an einem gegenüberliegenden Ende hiervon mit dem Fluorospektrometer verbunden. Ein Teil der gebündelten optischen Fasern wird verwendet, um Anregungslicht der Zelle hinzuzuführen, und der verbleibende Teil der gebündelten optischen Fasern wird verwendet, um die aus der Zelle fluoreszierende Strahlung zurückzuführen.
Wie deutlich aus 9 hervorgeht, ist die Detektorschicht von Beispiel 16 im Ansprechen auf Glucose der Detektorschicht von Vergleichsbeispiel 1 überlegen.
Beispiel 22
Die Detektorschichten, erhalten in Beispiel 18, Beispiel 20 und Vergleichsbeispiel 2, wurden jeweils an einer Stelle auf Bewertungsvorrichtungen gehalten. Unter Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurde deren Ansprechen auf Glucose bei veränderten Konzentrationen in der Fluoreszenzintensität bewertet. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Die verwendeten Bewertungsvorrichtungen waren denjenigen ähnlich, die in Beispiel 21 angewendet wurden.
Wie aus 10 deutlich hervorgeht, ist erwiesen, dass die Detektorschichten der Beispiele 18 und 20, die unter Verwendung des wasserlöslichen Monomers hergestellt worden waren, im Ansprechen auf Glucose verbessert waren, verglichen mit der Detektorschicht von Vergleichsbeispiel 2, hergestellt unter Verwendung des konventionellen hydrophoben Monomers.
Beispiel 23
Die Detektorschichten, erhalten in Beispielen 16, 18 und 20 und Vergleichsbeispiel 2, wurden jeweils an einer Stelle auf Bewertungsvorrichtungen gehalten. Unter Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurden Fluoreszenzspektren gemessen.
Die Detektorschicht von Vergleichsbeispiel 2 zeigte maximale Fluoreszenzwellenlängen bei 403 nm und 430 nm, wenn bei 377 nm angeregt. Andererseits zeigte die Detektorschicht von Beispiel 16 eine maximale Fluoreszenzwellenlänge bei 450 nm, wenn bei 400 nm angeregt, die Detektorschicht von Beispiel 18 zeigte eine maximale Fluoreszenzwellenlänge bei 480 nm, wenn angeregt bei 400 nm, und die Detektorschicht von Beispiel 20 zeigte eine maximale Fluoreszenzwellenlänge bei 455 nm, wenn angeregt bei 400 nm. Jede Detektorschicht gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine Fluoreszenzwellenlänge, die zur längeren Seite verschoben ist, hat eine große Differenz zwischen seiner Anregungswellenlänge und der Fluoreszenzwellenlänge, ist vorteilhaft unter dem Gesichtspunkt der Fluoreszenzeigenschaften, und stellt eine hohe Messungsgenauigkeit bereit.

Claims

Fluoreszierende Monomerverbindung, dargestellt durch die folgende Formel (1), Formel (1)
wobei: Q, Q' und D³ gleich oder verschieden sein können, miteinander zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden können, und jeweils ein Substituent sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxy-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen; und D¹, D² und D⁴ jeweils darstellen einen Substituenten, wobei mindestens eines von D¹, D² und D⁴ eine Substituentengruppe ist, die an einem Ende eine Vinylgruppe hat, wobei der Substituent, der an einem Ende eine Vinylgruppe hat, ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist.
Fluoreszierende Monomerverbindung, dargestellt durch die folgende Formel (1) Formel (1)
wobei: Q und Q' gleich oder verschieden sein können, miteinander zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden können, und jeweils ein Substituent sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxy-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen; und in D¹, D², D³ und D⁴ (i) D¹ und D² gleich oder verschieden sein können und jeweils eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sind, D³ ein Wasserstoffatom ist, und D⁴ eine Substituentengruppe, dargestellt durch die folgende Formel (2) ist, oder (ii) D¹ und D² gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Substituentengruppe sind, die durch die folgende Formel (3) dargestellt ist, und D³ und D⁴ gleich oder verschieden sein können, miteinander zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden können, und jeweils ein Substituent sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxy-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen: Formel (2)
Formel (3)
wobei: X, in einem Fall der Definition (i), eine Substituentengruppe ist, gewählt aus der Gruppe bestehend aus -COO-, -OCO-, -CH₂NR-, -CH₂S-, -CH₂O-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-, und, in einem Fall der Definition (ii), darstellt eine C₁- bis C₃₀-Alkylengruppe, umfassend mindestens eine Substituentengruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus -COO-, -OOO-, -CH₂NR-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-, in der R darstellt ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, Y eine substituierte oder unsubstituierte, zweiwertige Gruppe eines organischen Rests ist, Z darstellt -O- oder -NR''-, und R'' darstellt ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe.
Fluoreszierende Monomerverbindung nach Anspruch 2, wobei die Substituentengruppe, die durch die Formel (2) dargestellt ist, oder die Substituentengruppe, die durch die Formel (3) dargestellt ist, ermöglicht, dass die fluoreszierende Monomerverbindung in Wasser löslich ist.
Fluoreszierende Monomerverbindung nach Anspruch 2, wobei Y enthält eine Struktur, dargestellt durch die folgende Formel (4) oder (5): Formel (4)
Formel (5)
wobei n von 2 bis 5 ist, j von 1 bis 5 ist, m von 1 bis 200 ist, und Y' und Y'' gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe sind.
Fluoreszierende Monomerverbindung nach Anspruch 2, wobei D¹, D², D³ und D⁴ die Bedeutungen haben, wie unter der Definition (i) definiert, und Y eine substituierte oder unsubstituierte, lineare, zweiwertige Gruppe eines organischen Rests mit einer Anzahl von Atomen von 3 bis 500 ist.
Saccharid-messende Fluoreszenz-Sensor-Substanz mit einem Copolymer aus mindestens den folgenden beiden Verbindungen (I) und (II): (I) der fluoreszierenden Monomerverbindung, wie in Anspruch 1 oder 2 definiert, und (II) mindestens einem hydrophilen, polymerisierbaren Monomer mit einer Vinylgruppe.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 6, wobei das polymerisierbare Monomer (II) ein polymerisierbares Monomer mit einer Gruppe eines (Meth)acrylamid-Restes ist.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 6, wobei D¹, D², D³ und D⁴ in der in Anspruch 2 definierten Formel (1) die gleichen Bedeutungen haben, wie in der Definition (i) definiert, und ein molares Verhältnis ((I):(II)) der fluoreszierenden Monomerverbindung (I) zu dem polymerisierbaren Monomer (II) in dem Copolymer von 1:10 bis 1:4000 ist.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 6, wobei D¹, D², D³ und D⁴ in der in Anspruch 2 definierten Formel (1) die gleichen Bedeutungen haben, wie in der Definition (ii) definiert, und ein molares Verhältnis ((I):(II)) der fluoreszierenden Monomerverbindung (I) zu dem polymerisierbaren Monomer (II) in dem Copolymer von 1:50 bis 1:6000 ist.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 6, wobei das polymerisierbare Monomer (II) eine Verbindung, dargestellt durch die folgende Formel (6), ist: Formel (6)
wobei A ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, und U und U' gleich oder verschieden sein können und jeweils eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sind.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 6, wobei mindestens ein Teil des Copolymers darin erzeugte intermolekulare Vernetzungen hat, und eine dreidimensionale vernetzte Struktur hat.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 6, dargestellt durch die folgende Formel (7): Formel (7)
wobei: Q und Q' gleich oder verschieden sein können, miteinander zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden können, und jeweils ein Substituent sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxy-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen; und in D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰, (x) D¹⁰ und D²⁰ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sind, D³⁰ ein Wasserstoffatom ist, und D⁴⁰ eine Substituentengruppe, dargestellt durch die folgende Formel (8), ist, oder (xx) D¹⁰ und D²⁰ gleich oder verschieden sein können und jeweils eine Substituentengruppe sind, die durch die folgende Formel (9) dargestellt ist, und D³⁰ und D⁴⁰ gleich oder verschieden sein können, miteinander zu einem verschmolzenen Ring kombiniert werden können, und jeweils ein Substituent sind, gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Wasserstoffatom, einem Halogenatom, einer Hydroxygruppe und substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Acyl-, Oxyalkyl-, Carboxy-, Carboxylatester-, Carboxamido-, Cyano-, Nitro-, Amino- und Aminoalkylgruppen: Formel (8)
Formel (9)
wobei: X, in einem Fall der Definition (x), eine Substituentengruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus -OOO-, -OOO-, CH₂NR-, -CH₂S-, -CH₂O-, -NR-, -NRCO-, -CONR, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-, und, in einem Fall der Definition (xx), darstellt eine C₁- bis C₃₀-Alkylengruppe, enthaltend mindestens eine Substituentengruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus -OOO-, -OOO-, -CH₂NR-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -O-, -S-, -SS-, -NRCOO-, -OCONR- und -CO-, in der R darstellt ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, Y eine substituierte oder unsubstituierte, zweiwertige Gruppe eines organischen Rests ist, Z darstellt -O- oder -NR''-, R'' darstellt ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, A ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe ist, und U und U' gleich oder verschieden sein können und jeweils eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe sind.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 12, wobei Y umfasst eine Struktur, dargestellt durch die folgende Formel (4) oder (5): Formel (4)
Formel (5)
wobei n von 2 bis 5 ist, j von 1 bis 5 ist, m von 1 bis 200 ist, und Y' und Y'' gleich oder verschieden sein können und jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe sind.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 12, wobei D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ die Bedeutungen haben, wie unter der Definition (x) definiert, und Y eine substituierte oder unsubstituierte, lineare, zweiwertige Gruppe eines organischen Rests mit einer Anzahl von Atomen von 3 bis 500 ist.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 12, wobei D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ die gleichen Bedeutungen haben, wie unter der Definition (x) definiert, und ein molares Verhältnis (p:q) von p zu q von 1:10 bis 1:4000 ist.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 12, wobei D¹⁰, D²⁰, D³⁰ und D⁴⁰ die gleichen Bedeutungen haben, wie unter der Definition (xx) definiert, und ein molares Verhältnis (p:q) von p zu q von 1:50 bis 1:6000 ist.
Fluoreszenz-Sensor-Substanz nach Anspruch 12, wobei mindestens ein Teil des Copolymers darin erzeugte intermolekulare Vernetzungen umfasst, und eine dreidimensionale vernetzte Struktur hat.
Ein implantierbarer, Saccharid-messender Sensor, umfassend eine Fluoreszenz-Sensor-Substanz, wie in Anspruch 6 oder Anspruch 12 definiert.