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Die
Erfindung bezieht sich auf die Trennung der Komponenten von Gemischen
in kleinem Maßstab,
insbesondere die Trennung von Proteinen oder Peptiden in Gemischen,
beispielsweise für
analytische Zwecke.
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Die
Erfindung besteht darin, die geladenen Moleküle der Gemischkomponenten durch
ein elektrisches Gleichfeld in Längsrichtung
durch ein geeignetes Medium, beispielsweise ein Gel, zu ziehen,
die so migrierenden Moleküle
aber gleichzeitig in Querrichtung einer Wechselspannung mit stark
asymmetrischem Profil auszusetzen. Durch das nichtlineare Verhalten
der elektrisch erzeugten Migration werden viele Gemischkomponenten
in Querrichtung aus dem Medium wandern, während nur wenige Komponenten
die gegenüber
liegende Stirnfläche
des Mediums erreichen. Durch eine überlagerte Gleichspannung in Querrichtung
kann eingestellt werden, welche der Gemischkomponenten das Medium
vollständig
in Längsrichtung
durchwandern. Die getrennten Komponenten können aber nicht nur der gegenüberliegenden
Stirnfläche,
sondern auch Stellen der Oberseite oder Unterseite des Mediums entnommen
werden.
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Stand der Technik
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Eine
Trennung der Komponenten eines Substanzgemisches für analytische
Zwecke kann durch Gaschromatographie (GC), Flüssigkeitschromatographie (HPLC),
Dünnschichtchromatographie
(DC), Kapillarelektrophorese (CE) Polyacryl-Gelelektrophorese (PAGE),
Ionenmobilitätsspektrometrie
(IMS) und weitere, ähnliche
Verfahren vorgenommen werden. Allen diesen Verfahren ist eigen,
dass jeweils nur eine geringe Menge des Substanzgemisches eingebracht
wird, und dass sich für
die verschiedenen Komponenten des Gemisches verschiedene Wanderungsgeschwindigkeiten
einstellen, die zu einer zeitlichen Trennung der Komponenten führen. Die
einzelnen Komponenten verlassen das jeweilige System jeweils in
Form von kleinen Substanzschüben („Peaks") oder sind bei Beendigung
des Trennvorgangs in Form von kleinen Ansammlungen („Spots" oder „Banden") zugänglich.
Es handelt sich also in keinem Fall um eine stationäre Trennung
mit einer ständigen
Eingabe von Gemisch an einer Stelle und einer ständigen Entnahme einer Gemischkomponente
an einer anderen Stelle. Alle diese Verfahren sind daher grundsätzlich nicht
durch Variation der Zeitdauer an die Probenmenge anpassbar und können Komponenten
geringer Konzentration nicht anreichernd sammeln.
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Es
gibt nur sehr wenige stationär
arbeitende Trennsysteme für
Gemische, die meisten davon in der Großindustrie, wie beispielsweise
die Kolonnen-Destillation. Für
analytische Mikropräparationen sind
fast keine stationär
arbeitenden Trennsysteme bekannt.
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Lediglich
auf dem Gebiet der Ionenmobilität ist
ein Trennsystem bekannt geworden, das stationär arbeitet. Es handelt sich
um das „High-Field
Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometer" (FAIMS). Wird zwischen zwei konzentrischen
Rohren eine hohe Wechselspannung geschaltet, so ergibt sich ein
asymmetrisches Wechselfeld. Eingebrachte Ionen wandern in diesem
Feld durch die nichtlinearen Anteile ihrer Mobilität zu einer
der beiden rohrförmigen
Elektroden. Durch eine überlagerte
Gleichspannung kann nun für
genau eine Ionensorte ein Gleichgewicht so eingestellt werden, dass
genau diese Ionensorte im Zwischen raum zwischen den beiden Rohren
gespeichert wird. Die Ionen können
dabei an einer Stelle als Gemisch in das System eingeführt und
an einer anderen Stelle als separierte Ionensorte entnommen werden.
Nachteilig ist hier, dass es sich dabei um ein Trennsystem handelt,
das nur als Ionenfilter betrieben werden kann: eine Ionensorte kommt
durch, alle anderen Ionensorten werden an den Elektroden vernichtet.
Nachteilig ist hier ferner, dass es keinen aktiven Transport der
ausgewählten Ionensorte
von der Eingabestelle zur Entnahmestelle gibt.
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Die
Ionenmobilität
bei der elektrischen Feldstärke
E gehorcht dem einfachen Gesetz v = K × E, wobei v die Geschwindigkeit
der Ionenwanderung ist. K ist eine Konstante, die vom Reibungsquerschnitt der
Ionen abhängt
und somit spezifisch für
eine Ionensorte ist. K wird die Mobilität der Ionensorte genannt. Die
Mobilität
K ist jedoch nicht von der Feldstärke E unabhängig; die Geschwindigkeit v
ist damit nicht einfach der Feldstärke proportional.
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Es
gilt hier vielmehr die Beziehung K(E) = K0 × (1 + K1 × E2 + K2 × E4 + ...). K0 ist
dabei die Mobilität für verschwindend
kleine elektrische Felder. Diese Abhängigkeit der Mobilität von der
Feldstärke
E bewirkt, dass eine Ionensorte unter der Wirkung einer asymmetrischen
Wechselspannung in Feldrichtung wandert, obwohl das zeitliche Integral über den Spannungsverlauf
der Wechselspannung genau Null ist. Eine asymmetrische Wechselspannung
in diesem Sinne ist eine Spannung, die zu einer Seite hin, beispielsweise
zur positiven Seite hin, ein hohes Spannungsmaximum aufweist, allerdings
nur für
eine kurze Zeit, während
zur anderen Seite hin, hier zur negativen Seite, eine nur geringe
Spannung herrscht, die aber wesentlich länger anhält. Wenn die Konstanten K1 und K2 nicht Null
sind, bewirkt diese Asymmetrie eine Wanderung in eine der beiden
Feldrichtungen.
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Es
ist nicht sicher geklärt,
warum die Mobilität
K von der elektrischen Feldstärke
abhängt.
Es gibt die Hypothese, dass es sich um variable Zustände der
auch im gasförmigen
Zustand immer vorhandenen Solvathüllen um die einzelnen Ionen
handelt, die sich bei hoher Wanderungsgeschwindigkeit durch Stöße mit Umgebungsgas
oder Reibung mit der umgebenden Flüssigkeit mehr oder weniger
abstreifen lassen. Es ändert
sich dann der Querschnitt, und damit die Mobilität. Für die Ionenmobilitätsspektrometrie
ist bekannt, dass sich stets einige Wassermoleküle an den Ionen befinden, und
dass diese Wassermoleküle
einem sehr raschen und ständigen
Austausch unterliegen.
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Es
kann sich aber auch um eine andersartige Konformitätsänderung
der Ionen handeln. Besitzt das Molekül beispielsweise neben seiner
Ladung auch noch einen Dipol, so kann dieser im Feld auseinander
gezogen werden. Damit wird das Molekül bei höherer Feldstärke länger und
schlanker, sein Querschnitt ändert
sich und damit seine Mobilität
im umgebenden Medium. Es sind weitere Mechanismen für Konformitätsänderungen
vorstellbar.
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Die
Einstellung der Konformitätsänderung muss
nicht momentan erfolgen, sie kann eine Einstellzeit haben. Zur Ausnutzung
dieser Konformitätsänderungen
für die
Trennung von Substanzen ist es aber immer notwendig, die Konformitätsänderung auch
spürbar
eintreten zu lassen, oder gar die Einstellung eines Gleichgewichtes
abzuwarten. Aus dieser Notwendigkeit ergibt sich eine Obergrenze
für die Frequenz
des asymmetrischen Wechselfeldes.
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Aufgabe der Erfindung
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Es
ist die Aufgabe der Erfindung, ein stationäres Trennsystem für analytische
Proben bereitzustellen. Das Trennsystem soll möglichst auch vielkanalig arbeiten
können.
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Das
Trennsystem soll insbesondere auch für Protein- oder Peptidgemische
eingesetzt werden können.
Viele Gemische, darunter auch Peptide und Proteine, enthalten in
wässriger
Lösung überwiegend geladene
Moleküle,
wobei die über
die Moleküle
eines Peptids und die Zeit gemittelte Ladung vom pH-Wert der Lösung abhängt. Die
Anzahl der Ladungen eines Moleküls
in Lösung
ist nicht ganzzahlig, wie sie es bei gasförmigen Ionen der Fall ist,
sondern ergibt sich nur als zeitliches Mittel über einen ständig oszillierenden
Vorgang der Ionisation und Deionisation.
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Kurze Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung besteht darin, geladene Moleküle der Gemischkomponenten durch
ein elektrisches Gleichfeld in einer Richtung, der Ziehrichtung, durch
ein geeignetes Medium, beispielsweise ein Gel, zu ziehen, die so
in Ziehrichtung wandernden Moleküle
aber gleichzeitig quer zur Ziehrichtung einer Wechselspannung mit
stark asymmetrischem Profil auszusetzen. Durch das nichtlineare
Verhalten der elektrisch erzeugten Migration werden viele Gemischkomponenten
in Querrichtung aus dem Medium wandern, während nur wenige Komponenten
parallel zum elektrischen Ziehgleichfeld ohne Ablenkung in Ziehrichtung
wandern und gegenüber
der Eingabestelle entnommen werden können. Durch eine überlagerte
Gleichspannung in Querrichtung, die die Wanderung einer Komponente
in Querrichtung kompensiert, kann eingestellt werden, welche der
Gemischkomponenten das Medium vollständig in Ziehrichtung ohne Ablenkung
durchwandern. Die getrennten Komponenten können aber nicht nur am Ende
der Ziehrichtung, sondern auch anderen Stellen des Mediums entnommen
werden.
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Die
Erfindung besteht also darin, die nichtlineare Mobilität geladener
Substanzkomponenten unter der Wirkung von elektrischen Feldern in
geeigneten Medien in besonderer Weise auszunutzen. Als Medium können beispielsweise
stehende oder laminar bewegte Gase Verwendung finden, wie das in
Ionenmobilitätsspektrometern
der Fall ist. Das Gas ist dabei in irgendeiner Weise einzuhüllen. Die
Ladung der Substanzmoleküle
ist dann durch Ionisierung eigens zu erzeugen. Es können aber
auch in Lösung dissoziierte
Moleküle,
also irgendeine Form von Molekülionen,
durch eine Flüssigkeit
bewegt werden, oder, besonders günstig,
durch ein Gel. Hier braucht die ionische Form der Moleküle nicht
eigens hergestellt zu werden; der Grad der Dissoziierung und somit
der zeitlich-räumliche
Mittelwert der Ladung pro Molekül
lässt sich
in einfacher Weise durch den pH-Wert der Lösung einstellen. Das gilt insbesondere auch
für Peptide,
Proteine und die meisten anderen Biomoleküle. Selbst die Permeabilität vieler
Substanzen durch gummiartige Festkörper kann ausgenutzt werden,
wenn sich dabei ionische Formen der Moleküle herstellen lassen. Diese
Migration der Substanzen in Lösung
durch flüssige,
gelartige oder gummiartige Medien ist der Mobilität von Ionen
in Gasen sehr ähnlich;
die Migration in der Flüssigkeit
oder im Gel ist lediglich sehr viel langsamer.
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Das
Medium kann eine Vielzahl von Formen haben, beispielsweise die Form
einer länglichen, nicht
allzu dünnen
Schicht oder eines flachen Quaders. Es braucht beispielsweise die
Dicke der Schicht nicht gleichförmig
zu sein, oder es braucht die Schicht nicht eben zu sein. Eine der
Richtungen senkrecht zur Ziehrichtung werde hier als Querrichtung
angesehen, wobei eine Querrichtung senkrecht durch die Schicht oder
den flachen Quader hindurch besonders günstig für die Herstellung der elektrischen
Felder ist. Wenn Gase oder Flüssigkeiten
als Medium dienen, sollen sie durch feste Hüllen oder Gefäße zusammengehalten
und auch ortsfest ruhig oder in ruhiger, laminarer Strömung gehalten
werden. Ist das Medium ein Gel, so kann es kleinräumig seine
Form selber halten, für
die Gesamtform braucht es entsprechende Unterstützung.
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Es
werden in der Erfindung die Moleküle der Gemischkomponenten an
einer kleinen Stelle des Mediums, beispielsweise an einer Stirnseite
einer flachen Schicht, stetig in das Medium eingegeben. Die Gemischkomponenten
werden nun durch ein elektrisches Ziehfeld durch das Medium gezogen,
wie es zum Beispiel bei PAGE der Fall ist. Das Ziehfeld kann zeitlich
konstant, aber auch moduliert oder gepulst sein. Gleichzeitig aber
wird in Querrichtung eine Wechselspannung mit stark asymmetrischem
Profil an das Medium angelegt, vorzugsweise überlagert mit einem Quergleichfeld
einstellbarer Feldstärke. Durch
das nichtlineare Verhalten der elektrisch erzeugten Migration werden
viele Gemischkomponenten in Querrichtung aus dem Medium wandern,
während
nur wenige Komponenten im Gleichgewicht zwischen asymmetrischen
Wechselfeld und überlagertem
Quergleichfeld geradeaus wandern und die gegenüber liegende Oberfläche des
Mediums erreichen, beispielsweise die gegenüber liegende Stirnfläche. Durch
die gegebenenfalls überlagerte
Quergleichspannung kann eingestellt werden, welche der Gemischkomponenten
das Medium in Ziehrichtung geradeaus durchwandert. Diese Gemischkomponente
kann an der Ankunftsstelle kontinuierlich entnommen oder längere Zeit
gesammelt werden. In dieser Ausführungsform
wirkt die Einrichtung als Filter, nur die an der Ankunftsstelle
ankommenden Substanzen werden entnommen und weiter verarbeitet.
Für eine gute
Ausnutzung der nichtlinearen Mobilität sollte die Maximalfeldstärke in Querrichtung
wesentlich größer sein
als die Ziehfeldstärke.
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Statt
der asymmetrischen Wechselspannung kann ein quer anliegendes, von
Ort zu Ort in Richtung und Stärke
längs der
Ziehrichtung asymmetrisch wechselndes, aber zeitlich konstantes
Gleichfeld durchwandert werden. Die Asymmetrie besteht hier darin,
dass über
eine kurze Wanderstrecke in Längsrichtung
ein hohes Feld in einer Querrichtung, sodann über eine längere Wanderstrecke in Längsrichtung
ein niedriges Feld in der entgegen gesetzten Querrichtung durchlaufen
wird.
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Es
können
durch viele Entnahmestellen an der Oberfläche des Mediums die quer aus
dem Medium migrierenden Substanzen in vielen einzelnen Fraktionen
aufgefangen und weiter verarbeitet werden. In dieser Ausführungsform
handelt es sich um eine vielkanalige Trennung. Die Fraktionen können in vielen
kleinen Flüssigkeitsvolumen
oder auch direkt auf einem analytischen Probenträger aufgefangen werden.
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Die
elektrischen Zieh- und Querfelder können durch eine Vielzahl von
parallelen, linear ausgedehnten geraden oder auch gekrümmten Elektroden erzeugt
werden, die in zwei Schichten angeordnet sind, zwischen denen das
Medium eingeschlossen ist. Die Schichten von Elektroden können auf
Oberflächen
des Mediums oder in der Nähe
der Oberflächen
angebracht sein. Die Elektroden können auch jeweils mit Entnahmekanälchen kombiniert
werden.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen
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1 gibt
das Prinzip einer einkanaligen, stationären Trenneinrichtung mit einem
Gel (9) wieder. Durch die Eingabeeinrichtung (1)
können
mit der Elektrode (3) geladene Moleküle, die über die Zuführung (2) zugeführt werden,
in das Gel (9) hineingedrückt werden. Spannungen an den
einzelnen Elektroden der beiden Elektrodenschichten (4)
und (5) können
die gewünschten
Zieh- und Querfelder im Gel (9) erzeugen. Die geradeaus
wandernde Molekülsorte
kann über
die Entnahmeeinrichtung (6) mit Hilfe der Elektrode (8)
aus dem Gel (9) herausgezogen und durch das Röhrchen (7)
abgeführt
werden.
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2 zeigt
das Prinzip der stationären Trenneinrichtung
aus 1 in schräger
Aufsicht.
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In 3 wird
eine vielkanalige Trenneinrichtung gezeigt, in der das Gel (9)
auf Ober- und Unterseite
jeweils von einem Kunststoffteil (10) und (11) abgedeckt
wird, das benachbart zu jeder Elektrode der beiden Elektrodenschichten
(4) und (5) jeweils einen feinen Entnahmekanal
für getrennten
Komponenten enthält.
Auch an der entnahmeseitigen Stirnfläche befinden sich in einem
weiteren Kunststoffteil (13) einige Entnahmekanäle, jeweils
mit Elektroden (12) bewehrt, deren Spannungen die geladenen
Moleküle
aus dem Gel (9) in die Entnahmekanäle ziehen können.
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4 zeigt
einen Ausschnitt aus 3. Es sind hier die feinen Kanälchen oder
Riefen des Riefenmusters (14) in jeweiliger Nähe zu einer
Elektrode aus der Elektrodenschicht (4) besser sichtbar.
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In
den 5 und 6 sind die Wanderwege für die geladenen
Moleküle
verschiedener Substanzen eingezeichnet. In 5 ist der
Fall eines elektrischen Ziehfeldes konstanter Stärke wiedergegeben, wobei sich
gerade Wanderwege ergeben. In 6 hingegen
ist das elektrische Ziehfeld eingangsseitig zunächst sehr stark und wird zur
gegenüberliegenden
Stirnseite hin wesentlich schwächer. Dadurch
ergeben sich gekrümmte
Wanderwege und, je nach Gemischzusammensetzung, eine möglicherweise
bessere Verteilung der Substanzen auf die Entnahmekanäle.
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7 gibt
ein Beispiel für
die zeitliche (t) oder örtliche
(l) asymmetrische Wechselspannung wieder, die quer zur Ziehrichtung
die Trennung der Substanzkomponenten bewirkt.
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Bevorzugte Ausführungsformen
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Eine
erste günstige
Ausführungsform
ist in den 3 und 4 gezeigt.
Sie sieht eine Trennung in einem schichtförmigen, nicht zu dünnen Gel (9)
vor. Das quaderförmige
Gel (9) befindet sich zwischen zwei Schalen (10)
und (11) aus Kunststoff, die es fest umschließen und
dem Gel Halt geben. Die Kunststoffschalen (10) und (11)
haben auf der Oberseite und der Unterseite des Gels (9),
jeweils nahe an den Elektroden der beiden Elektrodenschichten (4) und
(5), viele kleine Querriefen (14), etwa je einen halben
Millimeter tief und etwa einen Millimeter breit, die während des
Betriebes mit Flüssigkeit,
vorzugsweise leicht angesäuertem
Wasser, gefüllt
sind als Entnahmekanäle
dienen können.
Die Riefen (14) verlaufen parallel zu den Stirnseiten des
Gels. Am Grunde der Riefen (14) liegen voneinander und
zu den Flüssigkeitskanälen hin
isoliert die Einzelelektroden der beiden Elektrodenschichten (4)
und (5) für die
Erzeugung sowohl der elektrischen Ziehfelder wie auch der Querfelder.
Die inneren Oberflächen
der Riefen (14) sind durch bekannte Maßnahmen stark hydrophil gemacht,
damit sich hier keine Gemischkomponenten durch hydrophob-hydrophobe
Wechselwirkungen fest ablagern können.
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An
der eingangsseitigen Stirnseite des Gels (9) befindet sich
die Eingabevorrichtung (1) für die Lösung mit dem Peptidgemisch,
das hier als Beispiel für
eine Substanzauftrennung dienen soll. Die Eingabevorrichtung (1)
presst sich mit einer runden oder länglichen Öffnung dicht an die Stirnseite
des Gels (9), so dass die Lösung mit dem Peptidgemisch
direkten Kontakt mit dem Gel hat. Die längliche Öffnung liegt parallel zur Schichtoberfläche des
Gels. Eine Elektrode (3) nahe am inneren Kanal der Eingabevorrichtung
sorgt dafür,
dass die geladenen Peptidmoleküle
durch die Wirkung des elektrischen Feldes aus der Flüssigkeit
in das Gel wandern. Die Lösung
mit dem Peptidgemisch kann durch zwei rohrförmige Kanäle (2) der Eingabevorrichtung
zugeführt werden,
auch ein Kreislauf ist möglich.
Auch hier sind die inneren Oberfläche stark hydrophil gemacht
worden, um hydrophobe Substanzen nicht durch Oberflächenadsorption
zu verlieren.
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Aus
der Kapillarelektrophorese ist bekannt, dass die überwiegende
Anzahl der Peptide in Lösung geladen
sind, wobei die Stärke
der Ladung vom pH-Wert der Lösung
abhängt.
Auch im Gel sind die Peptide geladen, wobei auch hier die Stärke der
Ladung vom pH-Wert der Flüssigkeit
im Gel abhängt. Die
Peptide (oder Proteine) können
also bereits im nativen Zustand mit Hilfe eines elektrischen Feldes durch
das Gel gezogen werden. Es können
die Peptide aber auch durch besondere Maßnahmen in bekannter Weise
mit ladungstragenden chemischen Gruppen derivatisiert werden, um
ihre Ladung in Lösung
zu erhöhen.
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Die
Elektroden der beiden Elektrodenschichten (4) und (5),
die hier in die Kunststoffschalen (10) und (11)
eingebettet sind, können
zur Kontaktierung feste Anschlussdrähte besitzen (in 3 nicht
gezeigt), die aus den Kunststoffschalen (10) und (11) hervorstehen.
Diese Anschlussdrähte
können über aufsteckbare
Flachbandkabelstecker in sehr einfacher Weise mit Flachbandkabeln
verbunden werden, die zu entsprechenden elektronischen Platinen
zur Spannungsversorgung führen.
Es ist somit zweckmäßig, für die Abstände der
einzelnen Elektroden in der Elektrodenschicht (4) voneinander
genau die Abstände
der Kontaktierungsstellen in standardisierten Flachbandkabelsteckern
(1,27 bzw. 2,0 Millimeter) zu wählen.
Das gleiche gilt für
die einzelnen Elektroden der Elektrodenschicht (5), und
auch für
die Elektroden (12) im Kunststoffteil (13).
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Die
beiden Elektrodenschichten (4) und (5) mit jeweils
voneinander isolierten Elektroden in den Kunststoffschalen (10)
und (11) auf beiden Seiten des Mediums bauen im Gel (9)
durch ihre Versorgung mit Spannungen ein elektrisches Längsziehfeld
von einigen Kilovolt Spannungsdifferenz auf, in ähnlicher Weise, wie es die
Elektrodenringe um die Driftstrecken in der Ionenmobilitätsspektrometrie
tun. In diesem elektrischen Längsziehfeld
wandern die geladenen Peptide (oder anderen Moleküle) langsam
in Richtung auf die gegenüberliegende
Stirnfläche
zu.
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Die
Elektroden der beiden Elektrodenschichten (4) und (5)
bauen aber auch durch entsprechende Spannungsüberlagerungen das asymmetrische Querwechselfeld
quer durch die Schicht des Gels (9) auf. Ein Beispiel für einen
zeitlichen (oder auch örtlichen)
Verlauf einer solchen asymmetrischen Wechselspannung ist in 7 wiedergegeben.
Das asymmetrische Querwechselfeld lässt die geladenen Peptide quer
zur Schicht auf eines der beiden Elektrodenschichten (4)
oder (5) zu wandern. Die Wanderungsgeschwindigkeit ist
spezifisch für
das jeweilige Peptid. Da die maximale Querfeldstärke ein Vielfaches der Ziehfeldstärke betragen
soll, sollte die Maximalspannung ebenfalls bei einigen Kilovolt
liegen. Beträgt
die Dicke des Gels etwa ein Zehntel der Länge, so ist bei gleichen Spannungen
die Stärke
des Querfelds etwa zehn Mal so groß wie die des Ziehfelds. Die
Frequenz sollte nicht zu hoch liegen. Für ein Gel als Medium sollte
die Frequenz bei einigen Hertz bis zu einigen Hundert Hertz liegen,
da sich für jede
veränderte
Spannung in jedem Spannungszyklus wieder ein Gleichgewicht für die Wanderungsgeschwindigkeit
einstellen sollte.
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Weiterhin
liegt an den Elektroden der beiden Elektrodenschichten (4)
und (5) eine einstellbare Gleichspannungsdifferenz, die
ein elektrisches Quergleichfeld aufbaut. Dieses Quergleichfeld dient
zur Kompensation der Wanderung einer gewünschten Komponente auf eines
der Elektrodenschichten zu; diese Komponente wandert also nicht
aus dem Gel (9) heraus, sondern läuft ungestört (aber in leichtem Zickzack)
zu einer Stelle der gegenüberliegenden Stirnfläche hin,
beispielsweise zum mittleren Entnahmekanal an den Elektroden (12).
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Das
Prinzip einer sehr einfach aufgebauten einkanaligen Ausführungsform,
das in 1 gezeigt ist, besitzt an der der Eingabevorrichtung
(1) gegenüberliegenden
Stirnfläche
nur eine einzige Entnahmestelle (6). Über rohrförmige Anschlüsse (7)
kann das Entnahmevolumen mit Flüssigkeit
gefüllt
werden. Eine Elektrode (8) zieht die geladenen Moleküle der hier
ankommenden Gemischkomponente in diese Flüssigkeit, diese Komponente
kann damit in stetiger Weise in der Flüssigkeit gelöst durch
die Anschlüsse
(7) abgeführt
werden. Die Komponente kann aber auch für längere Zeit gesammelt werden, bevor
sie abgeführt
wird. Dieses Trennsystem ist einkanalig, nur eine einzige ausgewählte Substanz
wird durchgelassen. Es kann sich beispielsweise um ein sehr niedrig
konzentriertes Peptid in einem komplexen Gemisch handeln, das ohne
eine solche Anreicherung nicht analytisch vermessen werden könnte. Die
analytische Messung kann sich auf die Struktur dieses Peptids, auf
die Identität,
oder auch nur auf die präzise
Masse beziehen. Diese einkanalige Ausführungsform hat den Nachteil,
dass die nicht verwendeten Komponenten im Gel verbleiben und eigens
ausgewaschen werden müssen,
fall das Gel mehrfach verwendet werden soll.
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Es
kann die Stirnseite aber auch mit mehreren parallelen Entnahmestellen
versehen sein, wie es in 3 zu sehen ist. Damit können mehrere Komponenten
mit nur leicht verschiedenen K1-Werten aufgefangen
werden, beispielsweise für
die vergleichende Messung mehrerer posttranslationaler Modifikationen
des gleichen Peptids.
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Es
ist schließlich
aber auch möglich,
alle oder einen Teil der mit den Elektroden der beiden Elektrodenschichten
(4) und (5) verbundenen Riefen für die Entnahme
der dort jeweils ankommenden Komponenten zu verwenden. So entsteht
ein Vielkanal-Trennsystem. Die Entnahme aus diesen vielen Kanälen kann
beispielsweise mit einem mikrofluidischen Schaltsystem geregelt
werden. Die Flüssigkeiten
in diesen Kanälen
kann auch über
längere
Zeit befüllt
werden, wobei auch nur jeweils die Länge des Kanals über die
Breite des Gels hinweg mit Flüssigkeit
gefüllt
zu sein braucht. Dazu sind je nach Riefenform und Gelbreite nur
10 bis 50 Mikroliter Flüssigkeit notwendig.
Die Flüssigkeiten
können
schließlich
beispielsweise aus den Kanälen über ein
einfaches Verteilungssystem in den Kunststoffteilen (10),
(11) und (13) in eine Mikrotiterplatte gedrückt werden,
die 96 oder 384 Proben mit Flüssigkeiten
aufnehmen kann.
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Da
alle Elektroden der beiden Elektrodenschichten (4) und
(5) unabhängig
voneinander ansteuerbar sind, können
auf elektronischem Wege viele Besonderheiten geschaltet werden.
So braucht beispielsweise das elektrische Ziehfeld nicht konstant
sein; es kann das Ziehfeld beispielsweise am Substanzeingang stärker sein,
um hier eine höhere Wanderungsgeschwindigkeit
in Ziehrichtung zu erzeugen, wie es in 5 dargestellt
ist. Die 4 zeigt dagegen die geraden
Wanderwege von Substanzen in einem konstanten Ziehfeld. Ein nicht
konstantes Ziehfeld ist dann vorteilhaft, wenn es viele Komponenten
gibt, die bereits nach kurzer Wanderung quer aus dem Gel herauswandern.
Diese Komponenten können
so über
mehr Entnahmekanäle verteilt
werden.
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Es
müssen
aber auch die asymmetrischen Wechselspannungen nicht überall gleich
stark oder gleich asymmetrisch sein. Auch hiermit lassen sich Komponenten
besser und gleichmäßiger über die Entnahmekanäle verteilen.
Es sind dann aber auch die kompensierenden Quergleichfelder entsprechend
anzupassen.
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Insbesondere
lassen sich durch die Elektroden der beiden Elektrodenschichten
(4) und (5) auch statische, aber örtlich wechselnde
asymmetrische Querfelder erzeugen. Ein Beispiel des Spannungsverlaufs
für diese örtliche
Variation der Felder ist in 7 als wiedergegeben,
wobei jetzt statt der Zeitachse t eine Ortsachse l zu lesen ist.
Die Moleküle, die
mit dem Ziehfeld durch diese wechselnden Querfelder gezogen werden,
werden wie bei einem asymmetrischen Wechselfeld quer zur Ziehrichtung
wandern, wobei wieder ein Gleichspannungsanteil des Querfeldes so
eingestellt werden kann, dass eine gewünschte Komponente geradeaus
wandert. Dieses Verfahren, dass keine Wechselspannungen verwendet,
ist durch den Wegfall aller dielektrischen Verluste besonders ökonomisch.
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Lässt man
in der beschriebenen Ausführungsform
das Gel (9) zwischen den Kunststoffschalen (10)
und (11) weg und dichtet den Raum zwischen den Kunststoffschalen
ab, so hat man eine Einrichtung, in der gasförmige Mischungen von Ionen im
gasförmigen
Medium getrennt werden können.
Es ist hier allerdings schwierig, die Entnahmekanäle zu entleeren,
ohne das Gas als Medium zu Turbulenzen oder unkontrollierten Bewegungen
anzuregen. Etwas einfacher ist es, eine Flüssigkeit zu verwenden, insbesondere,
wenn man eine etwas zähe
(hochviskose) Flüssigkeit
hoher Oberflächenspannung
verwendet, die nicht in die Entnahmekanälchen eindringt. In den Entnahmekanälchen kann
sich eine zweite Flüssigkeit
einer anderen Flüssigkeitsphase
befinden, in die die geladenen Moleküle der getrennten Komponenten
durch elektrische Felder hineingezogen werden.
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Etwas
einfacher ist es, die Gase und Flüssigkeiten durch permeable
Membranen von den Entnahmekanälen
zu trennen. Diese Membranen lassen sich elektrophoretisch oder auch
durch einfache Diffusion durchdringen. Für diese Zwecke eignen sich beispielsweise
dünne Membranen
aus Silikongummi.
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Ein
Gel ist ein offenporiges dreidimensionales Molekülgitter, das recht stabil und
mit Flüssigkeit, vorwiegend
mit Wasser, gefüllt
ist. Der pH-Wert des Wassers lässt
sich durch Lösen
von Säuren
oder Basen (oder entsprechenden Salzen) einstellen. Moleküle in Lösung können diese
offenporige Struktur durchwandern, wenn sie entsprechend angetrieben werden.
Die Moleküle,
vor allem geladene Moleküle, sind
in der Regel mit einer Solvathülle
aus Flüssigkeitsmolekülen umgeben.
Das Abstreifen von Teilen der Solvathülle ist möglicherweise für die Abhängigkeit
der Mobilität
von der elektrischen Feldstärke
verantwortlich.
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Organische
Moleküle
können
aber auch durch bestimmte Arten von Festkörpern permeieren (so genannte
permeable Festkörper),
vor allem durch gummiartige Festkörper. So ist bekannt, dass
organische Moleküle
von einigen Hundert atomaren Masseneinheiten sehr schnell durch
Silikongummimembranen hindurch permeieren können. Eine Membran von einem
Millimeter Dicke ist in Sekunden durchdrungen, wenn nicht gar bereits
nach einigen Zehnteln einer Sekunde. Diese Permeation ohne elektrische
Felder beruht nur auf Diffusion, es ist jedoch anzunehmen, dass
geladene Moleküle
auch durch elektrische Felder bewegt werden können. Durch Lösen von
organischen Säuren
oder Basen lässt
sich der pH-Wert innerhalb des Gummis einstellen, so dass sich die
Ladung bio-organischer Moleküle
einstellen lässt.
Es ist nicht bekannt, ob diese elektrisch unterstützte Permeation
einen nicht-linearen Anteil hat, ob also die Proportionalität der Permeationsgeschwindigkeit
zur elektrischen Feldstärke
gestört
ist. Wenn die Permeationsgeschwindigkeit nicht streng proportional
zur Feldstärke
ist, so lässt
sich auch hiermit ein Trennsystem nach dieser Erfindung aufbauen.
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Die
Substanzen wandern im Medium längs einer
Bahn, die je nach der Form der elektrischen Felder gerade oder gekrümmt sein
kann. Die Bahn beginnt bei der Einrichtung zur Eingabe des Substanzgemisches.
Bei einer punktförmigen
Eingabe der Substanzen des Gemisches sind die Bahnen zunächst sehr
fein, sie verbreitern sich aber mit zunehmender Entfernung von der
Eingabestelle durch Diffusion. Die Verbreiterung findet in beiden
räumlichen Richtungen
quer zur Wanderungsrichtung statt. Diese Diffusion ist im Grunde
unvermeidbar. Man kann jedoch die Bahn in einer der beiden Querrichtungen fokussiert
halten, wenn man dem elektrischen Querfeld einen Gradienten gibt.
Ein solches fokussierendes Querfeld lässt sich durch zwei konzentrische Elektrodenschichten,
die jeweils die Form von Zylinderausschnitten haben, erreichen.
Es findet zwischen diesen gekrümmten
Elektrodenschichten eine Fokussierung in radialer Richtung statt.
Diesen Effekt kann man zur Erhöhung
der räumlichen
Auflösung der
Komponenten benutzen.
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Es
lassen sich durch Kombination von mehreren Trenneinrichtungen nach
dieser Erfindung auch sehr komplexe Trennsystem aufbauen. So ist es
beispielsweise möglich,
mehrere einkanalige Trennsysteme parallel zu betreiben, wobei jede
Trenneinrichtung auf eine andere Komponente ausgerichtet ist. Man
kann dann die nicht zu den Entnahmestellen wandernden Substanzen
auffangen und zu den Eingabeeinrichtungen zurückführen. Dieser Vorgang kann fortgesetzt
werden, bis jede gewünschte
Komponente aus dem Gemisch genügend
gut extrahiert ist.
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Man
kann bei diesem System aber auch so vorgehen, dass die nicht zu
der Entnahmestelle der ersten Trenneinrichtung wandernden Substanzen
einer zweiten Trenneinrichtung für
die Abtrennung einer zweiten Komponente zugeführt werden. In weiteren Stufen
werden weitere Komponenten entfernt. Auf diese Weise können nacheinander
eine Reihe von Komponenten abgetrennt werden.
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Dem
Fachmann ist es nach Kenntnis dieser Erfindung relativ einfach möglich, für seine
speziellen Trennaufgaben geeignete Trennverfahren und Trennapparate
zu entwickeln.