DE4412260C1 - Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin - Google Patents
Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem HämoglobinInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Hämo
globin aus biologischem Material.
Blut entwickelte sich im Laufe der Evolution als hochspeziali
siertes "flüssiges Organ" mit zahlreichen Transport- und
Verknüpfungsfunktionen. Um Menschen mit hohem Eigenblutver
lust, beispielsweise infolge von Verletzungen oder operativen
Eingriffen, am Leben erhalten zu können, wurden Blutkonserven
entwickelt. Zum einen setzt sich bei ihrer Verwendung der
Empfänger der Gefahr einer Übertragung von Krankheitserregern
aus, zum anderen ist ihr Einsatz aufgrund der vorherigen
Typisierung des Blutes im A-B-0- und Rhesussystem und einer
durchzuführenden Kompatibilitätsprüfung in vielen Fällen
eingeschränkt. Bei erhöhter Nachfrage nach Blutkonserven kommt
es nicht zuletzt wegen ihrer begrenzten Haltbarkeit zu Versor
gungsengpässen.
Die Medizin ist deshalb dazu übergegangen, in beschränktem
Maße auf andere Präparate in Form von sog. Plasmaexpandern
auszuweichen. Sie dienen der Volumensubstitution von Blut,
sind aber nicht in der Lage, eine der lebenswichtigen Funktio
nen des Blutes, den Gastransport von O₂ und CO₂ zu gewährlei
sten. Ihr ausschließlicher Einsatz ist bei einem Blutverlust
von über 25% des Gesamtblutvolumens nicht vertretbar. Da
natürliches Blut diese Funktion aufgrund des in den Erythrozy
ten enthaltenen Hämoglobins erfüllt, hat man bei der Suche
nach Blutersatzstoffen mit der Eigenschaft, Gasträger sein zu
können, Präparate auf der Basis von Hämoglobin entwickelt.
Vorzugsweise verwendet man hierzu Hämoglobin in hochreiner
Form.
Als Ausgangsstoff für die bekannte Hämoglobinisolierung dient
biologisches Material in Form von humanem Blut. Dazu eignet
sich nicht nur frisch entnommenes menschliches Blut, sondern
es eignen sich ebenfalls Blutkonserven oder solche, deren
Verfalldaten abgelaufen sind sowie Erythrozytensuspensionen.
Humanes Hämoglobin kann aber auch mikrobiell durch genetisch
geklonte Pilz- oder Bakterienkulturen und gentechnologisch
mittels transgener Tiere, beispielsweise transgener Schweine,
gewonnen werden. Zur Freisetzung des Hämoglobins wird die
Erythrozyten- oder Zellhülle durch Zugabe einer hypotonen
Flüssigkeit aufgeschlossen, sog. Zell-Lyse. Anschließend wird
das Hämoglobin aus diesem Lysat isoliert.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Hämoglobin ist nach dem Stand
der Technik durch die Methode nach De Venuto (1977) bekannt.
Hierbei wird dem Erythrozytenlysat Toluol beigemengt, das die
erythrozytären Hüllen auflöst. Es entstehen zwei Phasen, eine
wäßrige hämoglobinhaltige Phase und eine toluolhaltige, die
die Lipidbestandteile beinhaltet, wobei die wäßrige Phase mit
geringen Mengen von Toluol verunreinigt ist, die das herge
stellte Hämoglobin für den Einsatz für physiologische Zwecke
in Frage stellt.
Es ist ferner bekannt, Hämoglobin mittels Filtrations- und
Ultrafiltrationsverfahren zu isolieren, beispielsweise nach
dem Prinzip der Kaskadenfiltration. Dabei wird das Erythrozy
tenlysat unter Druck durch einen Filter oder ein Filtersystem
mit einer geeigneten Ausschlußgrenze (100 000 Dalton) gepreßt.
Bei diesem Verfahren nimmt aufgrund der mechanischen Belastung
der Hämoglobinmoleküle der Methämoglobingehalt stark zu und
das Hämoglobin zerfällt zunehmend in seine Monomere. Die
Qualität des so isolierten Hämoglobins genügt nicht den Anfor
derungen, die für den Einsatz in einem Blutersatzstoff ge
stellt werden.
Als weitere Isolierungsverfahren zur Gewinnung von Hämoglobin
sind säulen-chromatographische Trennmethoden bekannt. Diese
ermöglichen zwar die Isolierung von hochreinem Hämoglobin,
sind aber für ein großtechnisch anwendbares Isolierungsverfah
ren aufgrund der hierfür notwendigen, in regelmäßigen Abstän
den zu wechselnden Säulen nicht praktikabel.
Konventionelle elektrophoretische Trennverfahren eignen sich
nicht für die technische Herstellung von hochreinem Hämoglo
bin. So ist durch die DE-OS 25 59 534 ein dahingehendes iso
elektrisches Fokussierungsverfahren zur Isolierung von Hämo
globin aus Vollblut bekannt, bei dem in einer eigens dafür
entwickelten Kammer durch den Aufbau eines pH-Gradienten ein
inhomogenes abgestuftes pH-Feld entsteht. Die zu trennenden
Substanzen durchlaufen unter Stromeinwirkung die entsprechen
den pH-Bereiche, wobei sie hierdurch naturgemäß eine unter
schiedliche Mobilität entwickeln. Zonen geringster Mobilität
entsprechen dem jeweiligen isoelektrischen Punkt, indem die
einzelnen Komponenten diskrete Zonen bilden. Diese bekannte
isoelektrische Fokussierung ist auf ein ideal eingestelltes
Ampholytensystem angewiesen, was schwierig zu erzeugen ist.
Ferner erlaubt die isoelektrische Fokussierung mit ihrem
apparativen Aufbau nur eine chargenweise Isolierung, so daß
die Ausbeute an Hämoglobin gering ist. Aufgrund der Durchwan
derung des zu trennenden Materials durch mehrere pH-Bereiche
ist eine physiologische Qualität des Hämoglobins nicht sicher
gestellt, da Hämoglobin auf pH-Unterschiede empfindlich rea
giert. Dieser physiologische Qualitätsverlust des Hämoglobin-
Endproduktes ist durch den Zerfall des Hämoglobins in seine
Monomere bedingt. Ferner kann die physiologische Qualität des
Hämoglobins unter Einfluß von Ampholyten geschädigt werden, da
das II-wertige Eisen im Hämoglobin leicht in die III-wertige,
physiologisch inaktive Form überführt werden kann.
Es ist auch bekannt, die Free-Flow-Isotachophorese im kontinu
ierlichen Verfahren zur Separation von Hämoglobin einzusetzen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das bekannte Verfah
ren zur kontinuierlichen Separation von Hämoglobin zu verbes
sern und hochreines Hämoglobin bereitzustellen. Diese Aufgabe
löst ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1.
Gegenüber der Methode nach De Venuto und den Filtrationsver
fahren ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das isolierte
Hämoglobin frei von Nebenprodukten, wie Fremdproteinen, Enzy
men und Lipiden. Weiterhin gewährleistet das erfindungsgemäße
Verfahren die sichere Abtrennung von das biologische Material
begleitenden Mikroorganismen, wie Bakterien und Viren, die ein
Krankheitsrisiko bedeuten. Das erhaltene Hämoglobin ist also
hochrein. Gegenüber den säulenchromatographischen Trennmetho
den arbeitet das erfindungsgemäße Verfahren wirtschaftlicher,
da hier keine teuren Säulen zum Einsatz kommen. Das erfin
dungsgemäße Verfahren wird so betrieben, daß das Hämoglobin
ausschließlich mit Substanzen in Berührung kommt, welche in
tierischem und humanem Gewebe natürlicherweise vorkommen und
keine Veränderung der Hämoglobinstruktur bewirken, so daß das
erhaltene Hämoglobin qualitativ hochwertig ist. Außerdem ist
eine kontinuierliche Herstellung für die technische Anwendung
der diskontinuierlichen überlegen.
Der erfindungsgemäß verwendete Spacer sorgt dabei zusätzlich
für eine klare Abgrenzung und diskrete Konzentrierung der
Hämoglobinmoleküle.
Gegenüber dem bekannten Verfahren nach der DE-0S 25 59 534
erfolgt die Auftrennung durch die erfindungsgemäße Isotacho
phorese nach der Gesetzmäßigkeit von Kohlrausch, wobei die
Trennung in einem einzigen homogenen pH-Feld erfolgt. Die
einzelnen Bestandteile sammeln sich hier anhand ihrer Beweg
lichkeit, wobei der Erfolg der Auftrennung von der Wahl und
Konzentration der L- und/oder F-Elektrolyten abhängt. Mit dem
erfindungsgemäßen Isotachophoreseverfahren ist ein Pufferge
misch ohne jegliche Ampholyte verwendbar mit einem konstanten
pH- und ein auf das Gesamtsystem abgestimmtes L- und E-Elek
trolytenpaar.
Bei dem erfindungsgemäßen Isotachophoreseverfahren ist eine
kontinuierliche Arbeitsweise gewährleistet sowohl bei der
Beschickung der Trennkammer mit dem Puffer und mit dem Lysat
als auch bei der Gewinnung des isolierten Hämoglobins. Durch
das abgestimmte Puffersystem ist eine sehr hohe physiologische
Qualität des Hämoglobin-Endproduktes gemäß der Erfindung
sichergestellt.
Vorzugsweise findet die "Free Flow Elektrophorese" (FFE)
Verwendung, worunter die zweidimensionale trägerfreie vertika
le Ablenkungselektrophorese zu verstehen ist. Weitere Isolie
rungsmethoden sind die Zonenelektrophorese und die Feldsprung
elektrophorese, mit denen allerdings nur eine Auftrennung von
Zellgemischen, Zellorganellen, Proteinen, Peptiden, DNA und
von Aminosäuren möglich ist. Bei einer bevorzugten Ausfüh
rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses unter
Anwendung der sog. Isotachophorese im freien Fluß mit der
FFE-Apparatur durchgeführt. Hierdurch ergibt sich ein Free-
Flow-Isotachophorese-Verfahren (FFI).
Die in der Natur des Hämoglobins liegende Sensibilität bezüg
lich der Handhabung eines Präparationsverfahrens ließ bisher
die Umsetzung analytischer Verfahren in präparative Maßstäbe
scheitern. Zwar ist die Isolierung von Hämoglobinmolekülen mit
den Standardmethoden der analytischen Chemie jederzeit möglich
und jedem Fachmann geläufig; eine industrielle Anwendung
scheiterte aber bisher, wenn die physiologische Aktivität des
Hämoglobins gepaart mit einer relativ hohen Ausbeute und der
Kontinuität der Isolierung gefordert wird. Faktoren wie pH,
Leitfähigkeit, Konzentration, Viskosität, Temperatur, Strom
stärke, Durchflußgeschwindigkeit, Pufferzusammensetzung,
Zusammensetzung von L- bzw. E-Ionen beeinflussen die Free-
Flow-Isotachophorese. Die molekulare Beschaffenheit von Hämo
globin, die Tetramerstruktur, die Proteinbestandteile und das
Chromatin mit dem Fe2+ als Zentralatom bilden ein sensibles
Mikrosystem, welches durch ungünstige Handhabung ihre physio
logische Aktivität verliert. Die native Präparation gilt bei
einem physiologisch nicht leistungsfähigen Hämoglobinanteil
von 9% als ungeeignet.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz der FFE-Ap
paratur hat sich jedoch herausgestellt, daß eine erfolgreiche
Präparation von Hämoglobin in technischem Maßstab möglich ist.
Bei der Anwendung der Free-Flow-Isotachophorese durchquert
vorzugsweise der Puffer das elektrische Feld im sog. freien
Fluß, was eine hohe Ausbeute an hochreinem Hämoglobin ermög
licht.
Das biologische Material und/oder der Puffer werden kontinu
ierlich zugeführt; das Hämoglobin, die sonstigen Bestandteile
(Debris) sowie der Puffer kontinuierlich entfernt. Hierdurch
läßt sich das Verfahren im Dauerbetrieb durchführen.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, das Verfahren bei konstanter
Temperatur unterhalb von 10°C, vorzugsweise bei 8°C, insbeson
dere jedoch bei 4°C durchzuführen, was das erhaltene Hämoglo
bin schont und seine benötigten Eigenschaften erhält.
Dadurch, daß der Puffer vorzugsweise aus Pufferlösungen unter
schiedlicher Zusammensetzung und/oder Konzentration besteht,
wird die Trennung in das Hämoglobin einerseits und die sonsti
gen Bestandteile andererseits wirksam unterstützt. Hierbei
führt die unterschiedliche Mobilität der Komponenten zur
Auftrennung mittels der Isotachophorese.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist im folgenden anhand der
Zeichnung im einzelnen beschrieben.
Es zeigen:
Fig. 1 eine Prinzipdarstellung einer Free-Flow-Iso
tachophorese-Anlage zur Durchführung des erfin
dungsgemäßen Verfahrens;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Trennein
heit zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Anwendung der sog.
Isotachophorese durchgeführt. Die Isotachophorese ist ein
Trennungsverfahren, bei der die Auftrennung der Probenbestand
teile aufgrund ihrer unterschiedlichen Beweglichkeit im elek
trischen Feld in Abhängigkeit der Leit-(L) und End-(E)Ionen
erfolgt. Die L-Ionen müssen eine höhere, die E-Ionen eine
niedrigere Beweglichkeit als die Probenbestandteile aufweisen.
Nach dem Gesetz von Kohlrausch trennen sich dann bei konstan
tem Strom sich gleichschnell bewegende Teilchen und konzen
trieren sich in scharf abgegrenzten Zonen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Hämoglo
bin wird biologisches Material in Form von menschlichem oder
tierischem Blut eingesetzt. Bei der Verwendung von tierischem
Blut kommt Schweine- oder Rinderblut in Frage. Die Entnahme
von tierischem Blut verlangt jedoch eine ganz spezielle Hand
habung. Die Blutentnahme muß entsprechend der humanen Blutent
nahmemethode durch direkte Entnahme aus den Blutgefäßen erfol
gen. Für das Aufbewahren des Blutes müssen sterile Behälter
verwendet und mit Antikoagulanzien versehen werden. Eine
Gerinnung des Blutes wirkt sich nachteilig auf den Hämoglobin
gehalt aus. Die Aufbewahrung des Blutes erfolgt bei einer
Temperatur von 4°C. Das Blut wird steril entnommen. Eine
Überprüfung der Sterilität ist vor allem im Endprodukt notwen
dig; Kontaminationen werden durch eine aseptische Verfahrens
weise unterbunden.
Das derart gewonnene Blut, ebenso wie humanes Frischblut oder
Blut aus Blutkonserven, wird zur Gewinnung der Erythrozyten
15 min. mit 2000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand aus
Blutplasma wird abgetrennt. Es folgen vier Waschschritte
(15 min. bei 2000 g und 4°C) mit physiologischer Kochsalzlö
sung, wobei jeweils ein Teil Erythrozytensuspensat mit drei
Teilen physiologischer Kochsalzlösung vermengt werden (Ver
hältnis 1 : 4). Das Suspensat wird bei jedem Waschvorgang
aufgewirbelt, um eine möglichst hohe Reinigung zu gewährlei
sten. Nach dem vierten Reinigungsschritt ist der Überstand
dann klar.
Eine Kontaminierung des Suspensates wird durch sterile Handha
bung ausgeschlossen. Die Reinigungsschritte werden deshalb in
speziell gefertigten Beutelsystemen durchgeführt. Luftkontakt
muß dabei vermieden werden, um die Methämoglobinbildung mög
lichst gering zu halten. Jedes Gefäß wird daher mit O₂-freiem
Stickstoff geflutet. Alle Verfahrensschritte werden möglichst
schonend durchgeführt, d. h. Erschütterungen, Scherkräfte,
Quetschungen und hohe Drücke, die zumindest teilweise eine
beträchtliche Schädigung des Hämoglobinmoleküls durch Zerfall
in seine Monomere mit sich bringen, werden vermieden. Der
pH-Wert der Lösung liegt stets im physiologischen Bereich
zwischen pH 7,0 bis 7,4.
Um das gewonnene Erythrozytensuspensat aufzuschließen, werden
die intakten Erythrozyten mit pyrogenfreiem Aquadest im Ver
hältnis 1 : 4 vermischt. Durch Wirkung des osmotischen Druckes
in hypotonischer Lösung platzen die Erythrozyten auf und ihr
Inhalt wird freigesetzt. Das derart gewonnene Hämolysat wird
nun mittels der Isotachophorese im freien Fluß erfindungsgemäß
aufgetrennt.
Die Auftrennung erfolgt unter Einsatz der in Fig. 1 im Prinzip
dargestellten Free-Flow-Isotachophorese-Anlage. Diese Anlage
besteht im wesentlichen aus einer Trennkammer 1, geeigneten
Pumpen 2 und 3, die ein kontinuierliches Zuführen sowohl der
Pufferlösung als auch des Hämolysates zur Kammer 1 gewährlei
sten, einer elektrischen Einheit 4 und einem Scann-System 5
zum Abtasten der mittels der Isotachophorese erfolgten Auf
trennung in das reine Hämoglobin 9 und die sonstigen Bestand
teile wie die Hüllenfragmente 6 des Hämolysates. Eine
Schlauchpumpe 8 sorgt für das kontinuierliche getrennte Abfüh
ren des Hämoglobins 9, der Pufferlösung 11 und den sonstigen
Bestandteilen des Lysats, wie den Hüllenfragmenten 6. Zur
Einstellung der gewünschten Betriebstemperatur ist ein Kühl
system 12 vorgesehen und mittels einer an das Scann-System
angeschlossenen Datenverarbeitung 7 läßt sich der Prozeß
überwachen.
In Fig. 2 ist die Trennkammer gemäß der Fig. 1 detaillierter
dargestellt. Die flache, vertikal angeordnete Trennkammer 1
hat eine hintere Kammerhälfte 13, die temperierbar ist. Die
vordere Kammerhälfte 15 besteht aus durchsichtigem Polyacryl.
Durch mehrere Einlässe 17, 18 und 19 ist es möglich, mittels
der Pumpen 2 und 3 von oben die Puffer- oder Elektrolytlö
sung(en) bzw. das aus dem Blut durch Zell-Lyse gewonnene
Hämolysat in die Kammer 1 hineinzupumpen. Die Auftrennung
durch die Free-Flow-Isotachophorese erfolgt entsprechend der
Mobilität der einzelnen Probenbestandteile, wobei die Isolie
rung unterhalb 8°C, insbesondere bei 4°C durchgeführt wird;
Temperaturbereiche, die mittels des Kühlsystems 12 einstellbar
sind.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die
Trennkammer 1 mit einem Kammerpuffer 20, bestehend aus einer
Lösung aus 14 mmol Na₂HPO₄-dihydrat/17 mmol KH₂PO₄-monohy
drat-Puffer über den Einlaß 17 geflutet, wobei der Kammerpuf
fer 20 die Kammer 1 von oben nach unten im freien Fluß durch
fließt. Die entlang der Kammer 1 links und rechts eingelasse
nen Elektroden 21 werden mit einem stabilisierten Strom von
170 mA belastet und leiten den angelegten elektrischen Strom
in die Kammerflüssigkeit 20 hinein. Die Elektroden 21 werden
von einem Elektrodenpuffer 22, bestehend aus 440 mmol
Na₂HPO₄/560 mmol KH₂PO₄-Lösungen umspült und sind von der
übrigen Kammer 1 durch Ionenaustauschmembranen 23 derart
getrennt, daß eine Vermischung von Elektrodenpuffer 22 und
Kammerpuffer 20 verhindert ist. Der Elektrodenpuffer 22 wird
im oberen Bereich zugeführt und im unteren Bereich der Kammer
1 über Auslässe 28 aus der Kammer entnommen.
Das Lysat, vermischt mit den Spacern L-Methionin (5 mmol) und
L-Histidin (5 mmol), wird mit einer Durchflußrate von 0,6 ml/h
aufgebracht. Die Durchflußrate während der Isolierung beträgt
12 ml/min und wird mittels der 90-fach Schlauchpumpe 8 auf
rechterhalten. Die Auftrennung in das hochreine Hämoglobin
einerseits und die sonstigen Bestandteile des Hämolysates
andererseits erfolgt dadurch, daß Hämoglobin im Gegensatz zu
allen anderen Bestandteilen des Lysates keine Mobilität unter
den vorliegenden Bedingungen zeigt. Während die erythrozytären
Hüllen in Richtung Anode wandern, wandern die Mikroorganismen,
Viren, Endo- und Exotoxine entsprechend ihrer Oberflächenla
dung in Richtung Kathode oder Anode. Das unter den gegebenen
Umständen positiv geladene L-Methionin und negativ geladene
L-Histidin sorgen durch ihre Mobilität für die klare Abgren
zung und die diskrete Konzentrierung der Hämoglobinmoleküle.
Die negativ geladenen erythrozytären Hüllen zeigen eine höhere
Mobilität als L-Histidin und konzentrieren sich vor den
L-Ionen in Richtung der Anode.
Das hochreine Hämoglobin wird durch vorzugsweise zwei der 90
Schläuche der Schlauchpumpe 8 aufgefangen. Auf diese Weise
kann ein Volumen von 15 ml/h aufgefangen werden. Die Isolie
rung ist mit einer 30-fachen Verdünnung verbunden, d. h. die
Ausbeute an Protein beträgt 0,5 ml/h 15%-iges Hämoglobin.
Anschließend kann die derart gewonnene Hämoglobinlösung nach
folgendem Verfahren aufkonzentriert werden. Mittels Platten
dialyse durch eine Dialysemembran mit der Ausschlußgrenze von
10 000 Dalton wird die aufgefangene Hämoglobinlösung gegen
eine 30%-ige Polyethylenglycollösung (PEG) im Gegenstromver
fahren dialysiert, als Lösungsmittel dient hierbei pyrogen
freies destilliertes Wasser. Das Durchflußvolumen für die
Dialyseflüssigkeit beträgt 2 ml/min, für die Hämoglobinlösung
0,25 ml/min. Die Hämoglobinlösung kann innerhalb von 30 min
auf einen Hämoglobingehalt von 15 vol% aufkonzentriert werden.
Die erhaltene Hämoglobinlösung läßt sich bei dem erfindungsge
mäßen Verfahren dann wie folgt charakterisieren:
Hämoglobin 15%, Oxyhämoglobin 92,5%, Carboxyhämoglobin 3,4%, Methämoglobin 4,1%, pH 7,2, Molekulargewicht (Dalton) 64 500, Phospholipidgehalt "keine Phospholipide vorhanden", Gelchromatographie "keine Fremdproteine vorhanden", p50-Wert 15,4 mmHg, Sauerstoffdissoziationskurve "sigmoidal".
Hämoglobin 15%, Oxyhämoglobin 92,5%, Carboxyhämoglobin 3,4%, Methämoglobin 4,1%, pH 7,2, Molekulargewicht (Dalton) 64 500, Phospholipidgehalt "keine Phospholipide vorhanden", Gelchromatographie "keine Fremdproteine vorhanden", p50-Wert 15,4 mmHg, Sauerstoffdissoziationskurve "sigmoidal".
Diese Werte erhält man durch eine nachgeschaltete Analyse des
gewonnenen hochreinen Hämoglobins, bei der die Oxy-, Desoxy-
und Methämoglobingehalte photometrisch nach Benesch und Be
nesch erfaßt werden. Der pH-Wert wird nach standardisierter
Methode mit einer Glaselektrode gemessen. Fremdproteine werden
durch Elektrophorese mit einem Phast Gel-Gradienten von 8-25
(Phast-System Pharmacia) nachgewiesen. Gleichzeitig kann das
Molekulargewicht der isolierten Hämoglobinlösung bestimmt
werden. Der Phospholipidgehalt wird mit einem Laserdensitome
ter (LKB Pharmacia) erfaßt. Die Struktur und die Funktionsfä
higkeit des Hämoglobins wird durch Aufnahme der Sauerstoffdis
soziationskurve ermittelt. Daraus ist auch der p50-Wert be
rechenbar.
Mit der Erfindung ist ein isotachophoretisches System zur
kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin im
freien Fluß gegeben, wobei das aus biologischem Material
stammende Hämoglobin von seinen sonstigen Bestandteilen ver
läßlich getrennt wird.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin aus biologischem
Material, wobei dem biologischen Material ein Spacer in
Form von L-Methionin und/oder L-Histidin beigemengt wird
und Hämoglobin kontinuierlich und im freien Fluß hochrein
von den sonstigen Bestandteilen abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es
eine Isotachophorese ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Puffer eine Free-Flow-Isotachophorese-Apparatur im
freien Fluß durchquert.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
biologische Material und/oder der Puffer kontinuierlich
zugeführt und das Hämoglobin, die sonstigen Bestandteile
sowie der Puffer kontinuierlich abgeführt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge
kennzeichnet, daß es bei konstanter Temperatur unterhalb
von 10°C, vorzugsweise bei 8°C, insbesondere bei 4°C
durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge
kennzeichnet, daß das biologische Material freies Hämoglo
bin enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge
kennzeichnet, daß das biologische Material Zellen auf
weist, die an ihrer Oberfläche chemisch modifiziert sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge
kennzeichnet, daß der Puffer aus Pufferlösungen unter
schiedlicher Zusammensetzung und/oder Konzentration be
steht.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge
kennzeichnet, daß ein Puffer aus Na₂HPO₄-dihy
drat/KH₂PO₄-Monohydrat eingesetzt wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944412260 DE4412260C1 (de) | 1994-04-09 | 1994-04-09 | Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944412260 DE4412260C1 (de) | 1994-04-09 | 1994-04-09 | Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4412260C1 true DE4412260C1 (de) | 1995-03-09 |
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ID=6514994
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19944412260 Expired - Fee Related DE4412260C1 (de) | 1994-04-09 | 1994-04-09 | Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4412260C1 (de) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2559534A1 (de) * | 1974-07-10 | 1977-02-24 | Hoffmann La Roche | Isoelektrische fokussierung |
-
1994
- 1994-04-09 DE DE19944412260 patent/DE4412260C1/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE2559534A1 (de) * | 1974-07-10 | 1977-02-24 | Hoffmann La Roche | Isoelektrische fokussierung |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |