DE4412260C1 - Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Hämo­ globin aus biologischem Material.

Blut entwickelte sich im Laufe der Evolution als hochspeziali­ siertes "flüssiges Organ" mit zahlreichen Transport- und Verknüpfungsfunktionen. Um Menschen mit hohem Eigenblutver­ lust, beispielsweise infolge von Verletzungen oder operativen Eingriffen, am Leben erhalten zu können, wurden Blutkonserven entwickelt. Zum einen setzt sich bei ihrer Verwendung der Empfänger der Gefahr einer Übertragung von Krankheitserregern aus, zum anderen ist ihr Einsatz aufgrund der vorherigen Typisierung des Blutes im A-B-0- und Rhesussystem und einer durchzuführenden Kompatibilitätsprüfung in vielen Fällen eingeschränkt. Bei erhöhter Nachfrage nach Blutkonserven kommt es nicht zuletzt wegen ihrer begrenzten Haltbarkeit zu Versor­ gungsengpässen.

Die Medizin ist deshalb dazu übergegangen, in beschränktem Maße auf andere Präparate in Form von sog. Plasmaexpandern auszuweichen. Sie dienen der Volumensubstitution von Blut, sind aber nicht in der Lage, eine der lebenswichtigen Funktio­ nen des Blutes, den Gastransport von O₂ und CO₂ zu gewährlei­ sten. Ihr ausschließlicher Einsatz ist bei einem Blutverlust von über 25% des Gesamtblutvolumens nicht vertretbar. Da natürliches Blut diese Funktion aufgrund des in den Erythrozy­ ten enthaltenen Hämoglobins erfüllt, hat man bei der Suche nach Blutersatzstoffen mit der Eigenschaft, Gasträger sein zu können, Präparate auf der Basis von Hämoglobin entwickelt. Vorzugsweise verwendet man hierzu Hämoglobin in hochreiner Form.

Als Ausgangsstoff für die bekannte Hämoglobinisolierung dient biologisches Material in Form von humanem Blut. Dazu eignet sich nicht nur frisch entnommenes menschliches Blut, sondern es eignen sich ebenfalls Blutkonserven oder solche, deren Verfalldaten abgelaufen sind sowie Erythrozytensuspensionen. Humanes Hämoglobin kann aber auch mikrobiell durch genetisch geklonte Pilz- oder Bakterienkulturen und gentechnologisch mittels transgener Tiere, beispielsweise transgener Schweine, gewonnen werden. Zur Freisetzung des Hämoglobins wird die Erythrozyten- oder Zellhülle durch Zugabe einer hypotonen Flüssigkeit aufgeschlossen, sog. Zell-Lyse. Anschließend wird das Hämoglobin aus diesem Lysat isoliert.

Ein Verfahren zur Gewinnung von Hämoglobin ist nach dem Stand der Technik durch die Methode nach De Venuto (1977) bekannt. Hierbei wird dem Erythrozytenlysat Toluol beigemengt, das die erythrozytären Hüllen auflöst. Es entstehen zwei Phasen, eine wäßrige hämoglobinhaltige Phase und eine toluolhaltige, die die Lipidbestandteile beinhaltet, wobei die wäßrige Phase mit geringen Mengen von Toluol verunreinigt ist, die das herge­ stellte Hämoglobin für den Einsatz für physiologische Zwecke in Frage stellt.

Es ist ferner bekannt, Hämoglobin mittels Filtrations- und Ultrafiltrationsverfahren zu isolieren, beispielsweise nach dem Prinzip der Kaskadenfiltration. Dabei wird das Erythrozy­ tenlysat unter Druck durch einen Filter oder ein Filtersystem mit einer geeigneten Ausschlußgrenze (100 000 Dalton) gepreßt. Bei diesem Verfahren nimmt aufgrund der mechanischen Belastung der Hämoglobinmoleküle der Methämoglobingehalt stark zu und das Hämoglobin zerfällt zunehmend in seine Monomere. Die Qualität des so isolierten Hämoglobins genügt nicht den Anfor­ derungen, die für den Einsatz in einem Blutersatzstoff ge­ stellt werden.

Als weitere Isolierungsverfahren zur Gewinnung von Hämoglobin sind säulen-chromatographische Trennmethoden bekannt. Diese ermöglichen zwar die Isolierung von hochreinem Hämoglobin, sind aber für ein großtechnisch anwendbares Isolierungsverfah­ ren aufgrund der hierfür notwendigen, in regelmäßigen Abstän­ den zu wechselnden Säulen nicht praktikabel.

Konventionelle elektrophoretische Trennverfahren eignen sich nicht für die technische Herstellung von hochreinem Hämoglo­ bin. So ist durch die DE-OS 25 59 534 ein dahingehendes iso­ elektrisches Fokussierungsverfahren zur Isolierung von Hämo­ globin aus Vollblut bekannt, bei dem in einer eigens dafür entwickelten Kammer durch den Aufbau eines pH-Gradienten ein inhomogenes abgestuftes pH-Feld entsteht. Die zu trennenden Substanzen durchlaufen unter Stromeinwirkung die entsprechen­ den pH-Bereiche, wobei sie hierdurch naturgemäß eine unter­ schiedliche Mobilität entwickeln. Zonen geringster Mobilität entsprechen dem jeweiligen isoelektrischen Punkt, indem die einzelnen Komponenten diskrete Zonen bilden. Diese bekannte isoelektrische Fokussierung ist auf ein ideal eingestelltes Ampholytensystem angewiesen, was schwierig zu erzeugen ist. Ferner erlaubt die isoelektrische Fokussierung mit ihrem apparativen Aufbau nur eine chargenweise Isolierung, so daß die Ausbeute an Hämoglobin gering ist. Aufgrund der Durchwan­ derung des zu trennenden Materials durch mehrere pH-Bereiche ist eine physiologische Qualität des Hämoglobins nicht sicher­ gestellt, da Hämoglobin auf pH-Unterschiede empfindlich rea­ giert. Dieser physiologische Qualitätsverlust des Hämoglobin- Endproduktes ist durch den Zerfall des Hämoglobins in seine Monomere bedingt. Ferner kann die physiologische Qualität des Hämoglobins unter Einfluß von Ampholyten geschädigt werden, da das II-wertige Eisen im Hämoglobin leicht in die III-wertige, physiologisch inaktive Form überführt werden kann.

Es ist auch bekannt, die Free-Flow-Isotachophorese im kontinu­ ierlichen Verfahren zur Separation von Hämoglobin einzusetzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das bekannte Verfah­ ren zur kontinuierlichen Separation von Hämoglobin zu verbes­ sern und hochreines Hämoglobin bereitzustellen. Diese Aufgabe löst ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruches 1.

Gegenüber der Methode nach De Venuto und den Filtrationsver­ fahren ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das isolierte Hämoglobin frei von Nebenprodukten, wie Fremdproteinen, Enzy­ men und Lipiden. Weiterhin gewährleistet das erfindungsgemäße Verfahren die sichere Abtrennung von das biologische Material begleitenden Mikroorganismen, wie Bakterien und Viren, die ein Krankheitsrisiko bedeuten. Das erhaltene Hämoglobin ist also hochrein. Gegenüber den säulenchromatographischen Trennmetho­ den arbeitet das erfindungsgemäße Verfahren wirtschaftlicher, da hier keine teuren Säulen zum Einsatz kommen. Das erfin­ dungsgemäße Verfahren wird so betrieben, daß das Hämoglobin ausschließlich mit Substanzen in Berührung kommt, welche in tierischem und humanem Gewebe natürlicherweise vorkommen und keine Veränderung der Hämoglobinstruktur bewirken, so daß das erhaltene Hämoglobin qualitativ hochwertig ist. Außerdem ist eine kontinuierliche Herstellung für die technische Anwendung der diskontinuierlichen überlegen.

Der erfindungsgemäß verwendete Spacer sorgt dabei zusätzlich für eine klare Abgrenzung und diskrete Konzentrierung der Hämoglobinmoleküle.

Gegenüber dem bekannten Verfahren nach der DE-0S 25 59 534 erfolgt die Auftrennung durch die erfindungsgemäße Isotacho­ phorese nach der Gesetzmäßigkeit von Kohlrausch, wobei die Trennung in einem einzigen homogenen pH-Feld erfolgt. Die einzelnen Bestandteile sammeln sich hier anhand ihrer Beweg­ lichkeit, wobei der Erfolg der Auftrennung von der Wahl und Konzentration der L- und/oder F-Elektrolyten abhängt. Mit dem erfindungsgemäßen Isotachophoreseverfahren ist ein Pufferge­ misch ohne jegliche Ampholyte verwendbar mit einem konstanten pH- und ein auf das Gesamtsystem abgestimmtes L- und E-Elek­ trolytenpaar.

Bei dem erfindungsgemäßen Isotachophoreseverfahren ist eine kontinuierliche Arbeitsweise gewährleistet sowohl bei der Beschickung der Trennkammer mit dem Puffer und mit dem Lysat als auch bei der Gewinnung des isolierten Hämoglobins. Durch das abgestimmte Puffersystem ist eine sehr hohe physiologische Qualität des Hämoglobin-Endproduktes gemäß der Erfindung sichergestellt.

Vorzugsweise findet die "Free Flow Elektrophorese" (FFE) Verwendung, worunter die zweidimensionale trägerfreie vertika­ le Ablenkungselektrophorese zu verstehen ist. Weitere Isolie­ rungsmethoden sind die Zonenelektrophorese und die Feldsprung­ elektrophorese, mit denen allerdings nur eine Auftrennung von Zellgemischen, Zellorganellen, Proteinen, Peptiden, DNA und von Aminosäuren möglich ist. Bei einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dieses unter Anwendung der sog. Isotachophorese im freien Fluß mit der FFE-Apparatur durchgeführt. Hierdurch ergibt sich ein Free- Flow-Isotachophorese-Verfahren (FFI).

Die in der Natur des Hämoglobins liegende Sensibilität bezüg­ lich der Handhabung eines Präparationsverfahrens ließ bisher die Umsetzung analytischer Verfahren in präparative Maßstäbe scheitern. Zwar ist die Isolierung von Hämoglobinmolekülen mit den Standardmethoden der analytischen Chemie jederzeit möglich und jedem Fachmann geläufig; eine industrielle Anwendung scheiterte aber bisher, wenn die physiologische Aktivität des Hämoglobins gepaart mit einer relativ hohen Ausbeute und der Kontinuität der Isolierung gefordert wird. Faktoren wie pH, Leitfähigkeit, Konzentration, Viskosität, Temperatur, Strom­ stärke, Durchflußgeschwindigkeit, Pufferzusammensetzung, Zusammensetzung von L- bzw. E-Ionen beeinflussen die Free- Flow-Isotachophorese. Die molekulare Beschaffenheit von Hämo­ globin, die Tetramerstruktur, die Proteinbestandteile und das Chromatin mit dem Fe²⁺ als Zentralatom bilden ein sensibles Mikrosystem, welches durch ungünstige Handhabung ihre physio­ logische Aktivität verliert. Die native Präparation gilt bei einem physiologisch nicht leistungsfähigen Hämoglobinanteil von 9% als ungeeignet.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz der FFE-Ap­ paratur hat sich jedoch herausgestellt, daß eine erfolgreiche Präparation von Hämoglobin in technischem Maßstab möglich ist.

Bei der Anwendung der Free-Flow-Isotachophorese durchquert vorzugsweise der Puffer das elektrische Feld im sog. freien Fluß, was eine hohe Ausbeute an hochreinem Hämoglobin ermög­ licht.

Das biologische Material und/oder der Puffer werden kontinu­ ierlich zugeführt; das Hämoglobin, die sonstigen Bestandteile (Debris) sowie der Puffer kontinuierlich entfernt. Hierdurch läßt sich das Verfahren im Dauerbetrieb durchführen.

Erfindungsgemäß ist vorgesehen, das Verfahren bei konstanter Temperatur unterhalb von 10°C, vorzugsweise bei 8°C, insbeson­ dere jedoch bei 4°C durchzuführen, was das erhaltene Hämoglo­ bin schont und seine benötigten Eigenschaften erhält.

Dadurch, daß der Puffer vorzugsweise aus Pufferlösungen unter­ schiedlicher Zusammensetzung und/oder Konzentration besteht, wird die Trennung in das Hämoglobin einerseits und die sonsti­ gen Bestandteile andererseits wirksam unterstützt. Hierbei führt die unterschiedliche Mobilität der Komponenten zur Auftrennung mittels der Isotachophorese.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist im folgenden anhand der Zeichnung im einzelnen beschrieben.

Es zeigen:

Fig. 1 eine Prinzipdarstellung einer Free-Flow-Iso­ tachophorese-Anlage zur Durchführung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Trennein­ heit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Anwendung der sog. Isotachophorese durchgeführt. Die Isotachophorese ist ein Trennungsverfahren, bei der die Auftrennung der Probenbestand­ teile aufgrund ihrer unterschiedlichen Beweglichkeit im elek­ trischen Feld in Abhängigkeit der Leit-(L) und End-(E)Ionen erfolgt. Die L-Ionen müssen eine höhere, die E-Ionen eine niedrigere Beweglichkeit als die Probenbestandteile aufweisen. Nach dem Gesetz von Kohlrausch trennen sich dann bei konstan­ tem Strom sich gleichschnell bewegende Teilchen und konzen­ trieren sich in scharf abgegrenzten Zonen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Hämoglo­ bin wird biologisches Material in Form von menschlichem oder tierischem Blut eingesetzt. Bei der Verwendung von tierischem Blut kommt Schweine- oder Rinderblut in Frage. Die Entnahme von tierischem Blut verlangt jedoch eine ganz spezielle Hand­ habung. Die Blutentnahme muß entsprechend der humanen Blutent­ nahmemethode durch direkte Entnahme aus den Blutgefäßen erfol­ gen. Für das Aufbewahren des Blutes müssen sterile Behälter verwendet und mit Antikoagulanzien versehen werden. Eine Gerinnung des Blutes wirkt sich nachteilig auf den Hämoglobin­ gehalt aus. Die Aufbewahrung des Blutes erfolgt bei einer Temperatur von 4°C. Das Blut wird steril entnommen. Eine Überprüfung der Sterilität ist vor allem im Endprodukt notwen­ dig; Kontaminationen werden durch eine aseptische Verfahrens­ weise unterbunden.

Das derart gewonnene Blut, ebenso wie humanes Frischblut oder Blut aus Blutkonserven, wird zur Gewinnung der Erythrozyten 15 min. mit 2000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand aus Blutplasma wird abgetrennt. Es folgen vier Waschschritte (15 min. bei 2000 g und 4°C) mit physiologischer Kochsalzlö­ sung, wobei jeweils ein Teil Erythrozytensuspensat mit drei Teilen physiologischer Kochsalzlösung vermengt werden (Ver­ hältnis 1 : 4). Das Suspensat wird bei jedem Waschvorgang aufgewirbelt, um eine möglichst hohe Reinigung zu gewährlei­ sten. Nach dem vierten Reinigungsschritt ist der Überstand dann klar.

Eine Kontaminierung des Suspensates wird durch sterile Handha­ bung ausgeschlossen. Die Reinigungsschritte werden deshalb in speziell gefertigten Beutelsystemen durchgeführt. Luftkontakt muß dabei vermieden werden, um die Methämoglobinbildung mög­ lichst gering zu halten. Jedes Gefäß wird daher mit O₂-freiem Stickstoff geflutet. Alle Verfahrensschritte werden möglichst schonend durchgeführt, d. h. Erschütterungen, Scherkräfte, Quetschungen und hohe Drücke, die zumindest teilweise eine beträchtliche Schädigung des Hämoglobinmoleküls durch Zerfall in seine Monomere mit sich bringen, werden vermieden. Der pH-Wert der Lösung liegt stets im physiologischen Bereich zwischen pH 7,0 bis 7,4.

Um das gewonnene Erythrozytensuspensat aufzuschließen, werden die intakten Erythrozyten mit pyrogenfreiem Aquadest im Ver­ hältnis 1 : 4 vermischt. Durch Wirkung des osmotischen Druckes in hypotonischer Lösung platzen die Erythrozyten auf und ihr Inhalt wird freigesetzt. Das derart gewonnene Hämolysat wird nun mittels der Isotachophorese im freien Fluß erfindungsgemäß aufgetrennt.

Die Auftrennung erfolgt unter Einsatz der in Fig. 1 im Prinzip dargestellten Free-Flow-Isotachophorese-Anlage. Diese Anlage besteht im wesentlichen aus einer Trennkammer 1, geeigneten Pumpen 2 und 3, die ein kontinuierliches Zuführen sowohl der Pufferlösung als auch des Hämolysates zur Kammer 1 gewährlei­ sten, einer elektrischen Einheit 4 und einem Scann-System 5 zum Abtasten der mittels der Isotachophorese erfolgten Auf­ trennung in das reine Hämoglobin 9 und die sonstigen Bestand­ teile wie die Hüllenfragmente 6 des Hämolysates. Eine Schlauchpumpe 8 sorgt für das kontinuierliche getrennte Abfüh­ ren des Hämoglobins 9, der Pufferlösung 11 und den sonstigen Bestandteilen des Lysats, wie den Hüllenfragmenten 6. Zur Einstellung der gewünschten Betriebstemperatur ist ein Kühl­ system 12 vorgesehen und mittels einer an das Scann-System angeschlossenen Datenverarbeitung 7 läßt sich der Prozeß überwachen.

In Fig. 2 ist die Trennkammer gemäß der Fig. 1 detaillierter dargestellt. Die flache, vertikal angeordnete Trennkammer 1 hat eine hintere Kammerhälfte 13, die temperierbar ist. Die vordere Kammerhälfte 15 besteht aus durchsichtigem Polyacryl. Durch mehrere Einlässe 17, 18 und 19 ist es möglich, mittels der Pumpen 2 und 3 von oben die Puffer- oder Elektrolytlö­ sung(en) bzw. das aus dem Blut durch Zell-Lyse gewonnene Hämolysat in die Kammer 1 hineinzupumpen. Die Auftrennung durch die Free-Flow-Isotachophorese erfolgt entsprechend der Mobilität der einzelnen Probenbestandteile, wobei die Isolie­ rung unterhalb 8°C, insbesondere bei 4°C durchgeführt wird; Temperaturbereiche, die mittels des Kühlsystems 12 einstellbar sind.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trennkammer 1 mit einem Kammerpuffer 20, bestehend aus einer Lösung aus 14 mmol Na₂HPO₄-dihydrat/17 mmol KH₂PO₄-monohy­ drat-Puffer über den Einlaß 17 geflutet, wobei der Kammerpuf­ fer 20 die Kammer 1 von oben nach unten im freien Fluß durch­ fließt. Die entlang der Kammer 1 links und rechts eingelasse­ nen Elektroden 21 werden mit einem stabilisierten Strom von 170 mA belastet und leiten den angelegten elektrischen Strom in die Kammerflüssigkeit 20 hinein. Die Elektroden 21 werden von einem Elektrodenpuffer 22, bestehend aus 440 mmol Na₂HPO₄/560 mmol KH₂PO₄-Lösungen umspült und sind von der übrigen Kammer 1 durch Ionenaustauschmembranen 23 derart getrennt, daß eine Vermischung von Elektrodenpuffer 22 und Kammerpuffer 20 verhindert ist. Der Elektrodenpuffer 22 wird im oberen Bereich zugeführt und im unteren Bereich der Kammer 1 über Auslässe 28 aus der Kammer entnommen.

Das Lysat, vermischt mit den Spacern L-Methionin (5 mmol) und L-Histidin (5 mmol), wird mit einer Durchflußrate von 0,6 ml/h aufgebracht. Die Durchflußrate während der Isolierung beträgt 12 ml/min und wird mittels der 90-fach Schlauchpumpe 8 auf­ rechterhalten. Die Auftrennung in das hochreine Hämoglobin einerseits und die sonstigen Bestandteile des Hämolysates andererseits erfolgt dadurch, daß Hämoglobin im Gegensatz zu allen anderen Bestandteilen des Lysates keine Mobilität unter den vorliegenden Bedingungen zeigt. Während die erythrozytären Hüllen in Richtung Anode wandern, wandern die Mikroorganismen, Viren, Endo- und Exotoxine entsprechend ihrer Oberflächenla­ dung in Richtung Kathode oder Anode. Das unter den gegebenen Umständen positiv geladene L-Methionin und negativ geladene L-Histidin sorgen durch ihre Mobilität für die klare Abgren­ zung und die diskrete Konzentrierung der Hämoglobinmoleküle. Die negativ geladenen erythrozytären Hüllen zeigen eine höhere Mobilität als L-Histidin und konzentrieren sich vor den L-Ionen in Richtung der Anode.

Das hochreine Hämoglobin wird durch vorzugsweise zwei der 90 Schläuche der Schlauchpumpe 8 aufgefangen. Auf diese Weise kann ein Volumen von 15 ml/h aufgefangen werden. Die Isolie­ rung ist mit einer 30-fachen Verdünnung verbunden, d. h. die Ausbeute an Protein beträgt 0,5 ml/h 15%-iges Hämoglobin. Anschließend kann die derart gewonnene Hämoglobinlösung nach folgendem Verfahren aufkonzentriert werden. Mittels Platten­ dialyse durch eine Dialysemembran mit der Ausschlußgrenze von 10 000 Dalton wird die aufgefangene Hämoglobinlösung gegen eine 30%-ige Polyethylenglycollösung (PEG) im Gegenstromver­ fahren dialysiert, als Lösungsmittel dient hierbei pyrogen­ freies destilliertes Wasser. Das Durchflußvolumen für die Dialyseflüssigkeit beträgt 2 ml/min, für die Hämoglobinlösung 0,25 ml/min. Die Hämoglobinlösung kann innerhalb von 30 min auf einen Hämoglobingehalt von 15 vol% aufkonzentriert werden.

Die erhaltene Hämoglobinlösung läßt sich bei dem erfindungsge­ mäßen Verfahren dann wie folgt charakterisieren:
Hämoglobin 15%, Oxyhämoglobin 92,5%, Carboxyhämoglobin 3,4%, Methämoglobin 4,1%, pH 7,2, Molekulargewicht (Dalton) 64 500, Phospholipidgehalt "keine Phospholipide vorhanden", Gelchromatographie "keine Fremdproteine vorhanden", p50-Wert 15,4 mmHg, Sauerstoffdissoziationskurve "sigmoidal".

Diese Werte erhält man durch eine nachgeschaltete Analyse des gewonnenen hochreinen Hämoglobins, bei der die Oxy-, Desoxy- und Methämoglobingehalte photometrisch nach Benesch und Be­ nesch erfaßt werden. Der pH-Wert wird nach standardisierter Methode mit einer Glaselektrode gemessen. Fremdproteine werden durch Elektrophorese mit einem Phast Gel-Gradienten von 8-25 (Phast-System Pharmacia) nachgewiesen. Gleichzeitig kann das Molekulargewicht der isolierten Hämoglobinlösung bestimmt werden. Der Phospholipidgehalt wird mit einem Laserdensitome­ ter (LKB Pharmacia) erfaßt. Die Struktur und die Funktionsfä­ higkeit des Hämoglobins wird durch Aufnahme der Sauerstoffdis­ soziationskurve ermittelt. Daraus ist auch der p50-Wert be­ rechenbar.

Mit der Erfindung ist ein isotachophoretisches System zur kontinuierlichen Herstellung von hochreinem Hämoglobin im freien Fluß gegeben, wobei das aus biologischem Material stammende Hämoglobin von seinen sonstigen Bestandteilen ver­ läßlich getrennt wird.

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin aus biologischem Material, wobei dem biologischen Material ein Spacer in Form von L-Methionin und/oder L-Histidin beigemengt wird und Hämoglobin kontinuierlich und im freien Fluß hochrein von den sonstigen Bestandteilen abgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Isotachophorese ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Puffer eine Free-Flow-Isotachophorese-Apparatur im freien Fluß durchquert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material und/oder der Puffer kontinuierlich zugeführt und das Hämoglobin, die sonstigen Bestandteile sowie der Puffer kontinuierlich abgeführt werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß es bei konstanter Temperatur unterhalb von 10°C, vorzugsweise bei 8°C, insbesondere bei 4°C durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das biologische Material freies Hämoglo­ bin enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das biologische Material Zellen auf­ weist, die an ihrer Oberfläche chemisch modifiziert sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Puffer aus Pufferlösungen unter­ schiedlicher Zusammensetzung und/oder Konzentration be­ steht.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß ein Puffer aus Na₂HPO₄-dihy­ drat/KH₂PO₄-Monohydrat eingesetzt wird.