DE112019003646T5

DE112019003646T5 - Biomolekül-analysenvorrichtung und biomolekül-analysenverfahren

Info

Publication number: DE112019003646T5
Application number: DE112019003646.7T
Authority: DE
Inventors: Rena Akahori; Yusuke Goto; Itaru Yanagi; Mayu Aoki
Original assignee: Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2018-08-28
Filing date: 2019-07-03
Publication date: 2021-04-15
Also published as: GB2590846A; CN112567233A; JP2020031557A; US20210293750A1; WO2020044780A1; GB202102296D0

Abstract

Eine Biomolekül-Analysenvorrichtung umfasst einen Dünnfilm mit einer Nanopore, einen Flüssigkeitsbehälter, der in Kontakt mit dem Dünnfilm angeordnet ist und eine Elektrolytlösung enthält, eine Elektrode in Kontakt mit dem Flüssigkeitsbehälter, eine mit der Elektrode verbundene Messvorrichtung, und eine Steuervorrichtung, die eine an die Elektrode anzulegende Spannung entsprechend einem Messergebnis der Messvorrichtung steuert. Ein Biomolekül wird in die Elektrolytlösung eingeführt. Ein Kontrollstrang und ein molekularer Motor sind mit einem ersten Endbereich des Biomoleküls verbunden, und der Kontrollstrang ist an einen Primer an einer stromaufwärtigen Stelle des Kontrollstrangs gebunden und weist einen Spacer an einer stromabwärtigen Stelle des Kontrollstrangs auf.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Analysieren eines Biomoleküls (Biopolymers).
Stand der Technik
Auf dem Gebiet der DNA-Sequenziervorrichtungen der nächsten Generation hat ein Verfahren Beachtung gewonnen, bei dem die Basensequenz eines Biomoleküls (nachstehend als „DNA“ bezeichnet) elektrisch und direkt gemessen wird, ohne dass eine Extensionsreaktion oder eine Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Speziell wird die Erforschung und Entwicklung von Nanoporen-DNA-Sequenzierungsverfahren vorangetrieben. Dabei handelt es sich um ein Verfahren, bei dem ein DNA-Strang direkt ohne Verwendung eines Reagenz gemessen wird und eine Basensequenz bestimmt wird.
Bei diesem Nanoporen-DNA-Sequenzierungsverfahren wird die Basensequenz gemessen, indem man den Blockierungsstrom misst, der durch einen DNA-Strang, der eine in einem Dünnfilm ausgebildete Pore (nachstehend als „Nanopore“ bezeichnet) passiert, erzeugt wird. Da sich der Blockierungsstrom je nach den Unterschieden zwischen den einzelnen Basentypen, die im DNA-Strang vorhanden sind, verändert, können die Basentypen sequentiell identifiziert werden, indem man den Betrag des Blockierungsstroms misst. Bei diesem Verfahren wird eine Matrizen-DNA nicht mit einem Enzym amplifiziert und es wird auch keine Markierungssubstanz, z.B. eine Phosphorverbindung, verwendet. Daher gewährleistet dieses Verfahren einen hohen Durchsatz und geringe Betriebskosten und ermöglicht die Bestimmung langer DNA-Basenketten.
Eine Vorrichtung für die Biomolekül-Analyse, die zur DNA-Analyse beim Nanoporen-DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet wird, umfasst allgemein einen ersten und einen zweiten Flüssigkeitsbehälter, die mit einer Elektrolytlösung gefüllt sind, einen Dünnfilm als Trennwand zwischen dem ersten und zweiten Flüssigkeitsbehälter und eine erste bzw. eine zweite Elektrode, die im ersten bzw. zweiten Flüssigkeitsbehälter vorgesehen sind. Die Vorrichtung zur Biomolekül-Analyse kann auch als Reihenvorrichtung ausgebildet sein. Bei der Reihenvorrichtung handelt es sich um eine Vorrichtung mit einer Mehrzahl von Gruppen von Flüssigkeitskammern, die durch einen Dünnfilm getrennt sind. Beispielsweise kann der erste Flüssigkeitsbehälter als gemeinsamer Behälter verwendet werden, während der zweite Flüssigkeitsbehälter für eine Mehrzahl von einzelnen Behältern eingesetzt wird. In diesem Fall sind die Elektroden im gemeinsamen Behälter und jeweils in den Einzelbehältern angeordnet.
Bei dieser Konfiguration wird eine Spannung zwischen dem ersten Flüssigkeitsbehälter und dem zweiten Flüssigkeitsbehälter angelegt. Ein Ionenstrom, der dem Durchmesser der Nanopore entspricht, fließt durch die Nanopore. Ferner entsteht ein Potentialgradient in der Nanopore entsprechend der angelegten Spannung. Wenn das Biomolekül in den ersten Flüssigkeitsbehälter gegeben wird, wird das Biomolekül aufgrund von Diffusion und des erzeugten Potentialgradienten durch die Nanopore in den zweiten Flüssigkeitsbehälter transportiert. Dabei wird die Biomolekül-Analyse entsprechend der Blockierungsrate der einzelnen Nucleinsäuren, die die Nanopore blockieren, durchgeführt. Dabei umfasst die Biomolekül-Analysenvorrichtung eine Messvorrichtung, die den Ionenstrom (Blockierungssignal), der zwischen den in der Vorrichtung zur Biomolekül-Analyse vorgesehenen Elektroden fließt, misst und Sequenzinformationen der Biomoleküle auf der Grundlage der durch Messung des Ionenstroms (Blockierungssignals) erhaltenen Werts erhält.
Eines der Ziele beim Nanoporen-DNA-Sequenzierungsverfahren besteht beispielsweise in der Steuerung des Transports der die Nanopore passierenden DNA. Dabei ist Folgendes zu berücksichtigen: Um die Messung der Unterschiede zwischen den einzelnen Basentypen, die im DNA-Strang enthalten sind, aufgrund des Betrags des Blockierungsstroms zu messen, muss die Geschwindigkeit des Durchtritts der DNA durch die Nanopore 100 µs oder mehr pro Base betragen, und zwar im Hinblick auf das Stromrauschen und die Zeitkonstante der Fluktuation der DNA-Moleküle während der Messung. Jedoch ergibt sich üblicherweise eine rasche Durchtrittsgeschwindigkeit der DNA durch die Nanopore von 1 µs oder weniger pro Base, so dass es schwierig ist, in ausreichender Weise den sich durch jede Base ergebenden Blockierungsstrom zu messen.
Bei einem Verfahren zur Steuerung des Transports wird die Transportsteuerung der durch die Nanopore tretenden DNA erreicht, indem man die Kraft zum Transportieren und Steuern des Einzelstrangs, der als eine Matrize dient, verwendet, wenn DNA-Polymerase eine Synthesereaktion vornimmt oder wenn Helicase zum Aufbrechen einer doppelsträngigen DNA in einem Einzelstrang eingesetzt wird (vergleiche NPL 1). Wenn die Polymerase an die DNA (mit angelagertem Primer), die durch Elektrophorese durch die Nanopore hindurchtritt, bindet und die Synthesereaktion der Polymerase startet, zieht die Polymerase die DNA in eine der Elektrophoreserichtung entgegengesetzte Richtung. Dabei kann die Messvorrichtung das Ionenstromsignal entsprechend dem Basentyp erfassen.
Literaturverzeichnis
Nicht-Patentliteratur
NPL 1: Gerald M. Cherf et al., Nat. Biotechnol. 2012
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Technisches Problem
Bei diesem Transportsteuerungsverfahren ist es jedoch erforderlich, den Synthesestartpunkt genau zu steuern. Die Polymerase sucht nach der Grenze zwischen Einzel- und Doppelsträngen und startet die Synthese. Dabei ist es erforderlich, einen Mechanismus für die Synthese nur in der Nähe der Nanopore zu realisieren und eine Synthese in einer Elektrolytlösung (Reaktionslösung) außerhalb des Nahbereichs der Nanopore zu verhindern. Bei der herkömmlichen Vorrichtung ergibt sich jedoch eine Schwierigkeit insofern, als die Synthese durch die Polymerase in der Elektrolytlösung außerhalb des Nahbereichs der Nanopore einsetzt und es somit nicht möglich ist, die Biomolekül-Analyse präzise vorzunehmen.
Lösung der Aufgabe
Um die vorstehende Aufgabe zu lösen, wird erfindungsgemäß eine Biomolekül-Analysenvorrichtung bereitgestellt, die Folgendes umfasst: einen Dünnfilm mit einer Nanopore, einen Flüssigkeitsbehälter, der in Kontakt mit dem Dünnfilm angeordnet ist und eine Elektrolytlösung enthält, eine Elektrode im Kontakt mit dem Flüssigkeitsbehälter, eine mit der Elektrode verbundene Messvorrichtung und eine Steuervorrichtung, die eine an die Elektrode anzulegende Spannung entsprechend einem Messergebnis der Messvorrichtung steuert. Ein Biomolekül wird in die Elektrolytlösung gegeben. Ein Kontrollstrang und ein molekularer Motor werden mit einem ersten Endbereich des Biomoleküls verbunden und der Kontrollstrang wird an einen Primer an der strangaufwärtigen Seite des Kontrollstrangs gebunden und weist einen Spacer an der stromabwärtigen Seite des Kontrollstrangs auf.
Ferner wird erfindungsgemäß ein Biomolekül-Analysenverfahren zum Analysieren eines Biomoleküls bereitgestellt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Einführen des Biomoleküls in einen Flüssigkeitsbehälter, wobei das Biomolekül einen ersten Endbereich aufweist, der mit einem Kontrollstrang und einem molekularen Motor verbunden ist, wobei der Kontrollstrang an einen Primer an einer strangaufwärtigen Stelle gebunden ist und strangabwärts einen Spacer aufweist, wobei der Flüssigkeitsbehälter in Kontakt mit einem Dünnfilm angeordnet ist und eine Elektrolytlösung enthält, und wobei der Dünnfilm eine Nanopore aufweist; Anlegen einer Spannung an den Flüssigkeitsbehälter und Einführen des Biomoleküls in die Nanopore; Kontaktieren des Primers mit dem molekularen Motor im Biomolekül, das in die Nanopore eingeführt worden ist; Transportieren des Biomoleküls in die Nanopore durch eine synthetische Reaktion des Biomoleküls nach Kontakt zwischen dem Primer und dem molekularen Motor; und Messen einer Veränderung eines während des Transports in der Nanopore fließenden Stroms.
Vorteilhafte Wirkungen der Erfindung
Erfindungsgemäß ist es möglich, den Synthesestartpunkt genau zu steuern, während die Transportsteuerung eines Biomoleküls vorgenommen wird.
Figurenliste

1 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus einer Biomolekül-Analysenvorrichtung gemäß einer ersten Ausführungsform.
2 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Wirkung eines Spacers 113.
3A erläutert im Konzept die Arbeitsweise eines Kontrollstrangs 111 und eines molekularen Motors 110.
3B ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung eines Verfahrens zur Messung eines Biomoleküls 109 in der ersten Ausführungsform.
4 zeigt das Ergebnis eines Experiments zur Erläuterung der Wirkung des Spacers 113.
5 zeigt experimentelle Daten über die Wirkung des molekularen Motors 110.
6 zeigt die Ergebnisse der Messung eines Blockierungsstroms für ein Biomolekül (Modellprobensequenzen), bei dem nur Adenin (A) und Cytosin (C) wiederholt jeweils in Form einer einzigen Base vorliegen (z.B. jeweils 50), wobei dieses Biomolekül als Matrizen-Biomolekül dient.
7 zeigt in schematischer Weise die Anordnung einer weiteren Biomolekül-Analysenvorrichtung 700.
8 ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung des Messverfahrens mit den Biomolekül-Messvorrichtungen 100 und 700.
9A ist eine schematische Darstellung der Struktur des Biomoleküls 109, das in einer Biomolekül-Messvorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform zu messen ist.
9B ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der zweiten Ausführungsform.
9C ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der zweiten Ausführungsform.
10A ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Struktur des Biomoleküls 109, das in der Biomolekül-Messvorrichtung gemäß einer dritten Ausführungsform zu messen ist.
10B ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der dritten Ausführungsform.
10C ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der dritten Ausführungsform.
10D ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der dritten Ausführungsform.
11A ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Struktur des Biomoleküls 109, das in der Biomolekül-Messvorrichtung gemäß einer vierten Ausführungsform zu messen ist.
11B ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der vierten Ausführungsform.
11C ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in der vierten Ausführungsform.
12 ist eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Messung des Biomoleküls 109 in einer fünften Ausführungsform.
13 ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung der Wellenformen einer angelegten Spannung und eines Signals bei der Messung des Biomoleküls 109 in der fünften Ausführungsform.

Beschreibung der Ausführungsformen
Nachstehend werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. Obgleich die beigefügten Zeichnungen spezielle Beispiele gemäß den erfindungsgemäßen Prinzipien zeigen, dienen diese Beispiele lediglich einem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung anzusehen.
Erste Ausführungsform
Nachstehend wird der Aufbau einer Biomolekül-Analysenvorrichtung gemäß der ersten Ausführungsform unter Bezugnahme auf 1 beschrieben. Bei der Vorrichtung handelt es sich um eine Vorrichtung für die biomolekulare Analyse, bei der ein Ionenstrom mittels eines Blockierungsstromverfahrens gemessen wird. Die Biomolekül-Analysenvorrichtung umfasst einen Dünnfilm 102, an dem eine Nanopore 101 ausgebildet ist, sowie ein Paar von Flüssigkeitsbehältern 104 (erster Flüssigkeitsbehälter 104A und zweiter Flüssigkeitsbehälter 104B), die so angeordnet sind, dass der Dünnfilm 102 dazwischen angeordnet ist und dass sie in Kontakt mit dem Dünnfilm 102 stehen. Die Behälter sind mit einer Elektrolytlösung 103 gefüllt. Ein Paar von Elektroden 105 (erste Elektrode 105A und zweite Elektrode 105B) steht in Kontakt mit dem ersten Flüssigkeitsbehälter 104A bzw. den zweiten Flüssigkeitsbehälter 104B. Bei der Messung wird eine vorbestimmte Spannung von einer Spannungsquelle 107 zwischen dem Paar von Elektroden 105 angelegt. Somit fließt ein Strom zwischen dem Paar von Elektroden 105. Die Stärke des Stroms, der zwischen den Elektroden 105 fließt, wird mit einem Amperemeter 106 gemessen. Der Messwert wird von einem Rechner 108 analysiert.
Beispielsweise werden KCl, NaCl, LiCl und CsCl für die Elektrolytlösung 103 verwendet. Die Lösung im zweiten Flüssigkeitsbehälter 104B, in die der nachstehend beschriebene molekulare Motor nicht eingeführt wird, kann mit Harnstoff in einer Konzentration von 4M oder mehr, DMSO, DMF und NaOH vermischt werden, um die Bildung von selbstkomplementären Strängen der Biomoleküle zu unterdrücken. Ferner ist es möglich, einen Puffer zuzumischen, um das Biomolekül zu stabilisieren. Als Puffer werden Tris, EDTA, PBS und dergleichen verwendet. Die erste Elektrode 105A und die zweite Elektrode 105B können beispielsweise aus Ag, AgCl oder Pt hergestellt werden.
In die Elektrolytlösung 103 wird ein Biomolekül (DNA-Strang oder dergleichen) 109 als Messziel gegeben. Das Biomolekül 109 umfasst beispielsweise einen molekularen Motor 110 und einen Kontrollstrang 111 an einem Ende. Der molekulare Motor wird durch eine Polymerase gebildet. Ferner ist der Kontrollstrang 111 an einen Primer 112 an einem Ende an der Seite, die vom molekularen Motor 110 entfernt ist, gebunden, und der Kontrollstrang 111 weist einen Spacer 113 an dem Ende, das näher am molekularen Motor 110 liegt, auf. Da der Spacer 113 vorgesehen ist, steht der Primer 112 nicht in Kontakt mit dem molekularen Motor 110 und eine Synthesereaktion läuft nicht ab, bevor das Biomolekül 109 die Nanopore 101 erreicht hat. Wenn der molekulare Motor 110 die Nanopore 101 erreicht und somit der Kontrollstrang 111 deformiert wird, kommt der Primer 112 in Kontakt mit dem molekularen Motor 110 und die Synthesereaktion setzt erstmals ein. Daher ist es mit der vorstehend beschriebenen Struktur möglich, den Synthesebeginn des molekularen Motors 110 zu steuern und das Messergebnis zu verbessern. Dieser Sachverhalt wird später ausführlich beschrieben.
Es ist darauf hinzuweisen, dass in der in 1 dargestellten Vorrichtung der Dünnfilm 102 nur eine einzige Nanopore 101 aufweist, was jedoch nur ein Beispiel darstellt. Die Vorrichtung kann auch in Form einer Reihe so ausgebildet sein, dass eine Mehrzahl von Nanoporen 101 im Dünnfilm 102 ausgebildet ist und die entsprechenden Bereiche der Mehrzahl von Nanoporen 101 durch Trennwände voneinander getrennt sind. Bei der Reihenvorrichtung kann der erste Flüssigkeitsbehälter als gemeinsamer Behälter verwendet werden. Der zweite Flüssigkeitsbehälter kann in Form einer Mehrzahl von individuellen Behältern ausgebildet sein. Dabei können die Elektroden im gemeinsamen Behälter bzw. in den individuellen Behältern angeordnet sein.
Die Biomolekül-Analysenvorrichtung von 1 umfasst eine Messvorrichtung und einen Rechner 108 als Steuervorrichtung. Die Messvorrichtung misst einen Ionenstrom (Blockierungssignal), der zwischen den Elektroden fließt. Die Steuervorrichtung steuert die an die erste Elektrode 105A und die zweite Elektrode 105B anzulegende Spannung auf der Grundlage des Messergebnisses. Der Rechner 108 ermittelt Sequenzinformationen für das Biomolekül 109 auf der Grundlage des Betrags des gemessenen Ionenstroms (Blockierungssignal). Andererseits ist es durch Anordnen der Elektrode im Innern der Nanopore 101 auch möglich, die Informationen über das Biomolekül 109 durch Ermitteln eines Tunnelstroms oder durch Erfassen einer Veränderung der Transistoreigenschaften zu erhalten.
Nachstehend werden das zu messende Biomolekül 109, der Kontrollstrang 111, der Primer 112 und der Spacer 113 näher beschrieben.
Wenn in der Vorrichtung von 1 eine Spannung zwischen der ersten Elektrode 105A und der zweiten Elektrode 105B angelegt wird, entsteht eine Potentialdifferenz zwischen beiden Seiten des Dünnfilms 102, in dem die Nanopore 101 ausgebildet ist. Anschließend wird das Biomolekül 109, das im oberen Flüssigkeitsbehälter 104A gelöst ist, der Elektrophorese in Richtung zum Flüssigkeitsbehälter 104B, der sich an der Unterseite befindet, unterzogen. Das Amperemeter 106 umfasst einen Verstärker und einen ADC (Analog-DigitalUmsetzer). Der Verstärker verstärkt den zwischen den Elektroden fließenden Strom durch Anlegen einer Spannung (nicht dargestellt). Der erfasste Wert, bei dem es sich um die Ausgabe des ADC handelt, wird an den Rechner 108 ausgegeben. Der Rechner 108 sammelt die erfassten Stromwerte und zeichnet sie auf.
Der Kontrollstrang 111, der an das Biomolekül 109 zu binden ist, wird getrennt bereitgestellt und nach einer Vorbehandlung für die Probenvorbereitung in den Flüssigkeitsbehälter 104A gegeben. Ein zum Betrieb des molekularen Motors 110 geeigneter Puffer kann im Elektrolyt des Flüssigkeitsbehälters 104A vorliegen. Ein für den molekularen Motor geeigneter Puffer wird verwendet, und im Allgemeinen werden (NH₄)₂SO₄, KCl, MgSO₄, Tween, Tris-HCl und dergleichen zugemischt.
In der Biomolekül-Analysenvorrichtung ist es erforderlich, eine Transportsteuerung des Biomoleküls beim Durchtritt des Biomoleküls durch die Nanopore vorzunehmen. Die Transportsteuerung in der Vorrichtung der ersten Ausführungsform wird vorwiegend durch den molekularen Motor 110 vorgenommen. Die Transportsteuerung durch den molekularen Motor 110 darf erst in der Nähe der Nanopore 101 einsetzen. Bei eingehenden Untersuchungen durch den Erfinder wurden die folgenden Feststellungen gemacht. Wenn der Kontrollstrang 111 an das zu lesende Biomolekül 109 gebunden wird und der Spacer 113 an der dem molekularen Motor 110 des Kontrollstrangs 111 zugewandten Seite bereitgestellt wird, ist es möglich, dass die Transportsteuerung durch den molekularen Motor 110 erst dann einsetzt, wenn das Biomolekül 109 in die Nähe der Nanopore 101 gelangt.
In diesem Fall genügt der Kontrollstrang 111 vorzugsweise den folgenden Bedingungen (a) bis (d).

(a) Der Kontrollstrang 111 befindet sich an der strangaufwärtigen Seite des Biomoleküls 109 (an der gegenüberliegenden Seite des molekularen Motors 110 im Abstand vom zu messenden Biomolekül).
(b) Der Primer 112 ist an der strangaufwärtigen Seite (vom molekularen Motor 110 entfernte Seite) des Kontrollstrangs 111 gebunden. Dies bedeutet, dass die entfernt liegende Seite des Kontrollstrangs 111 die Primer-Bindungsstelle darstellt.
(c) Der Spacer 113 wird an der strangabwärtigen Seite des Kontrollstrangs 111 bereitgestellt.
(d) Die Länge des Spacers 113 kann beispielsweise den Wert 2 oder mehr aufweisen.

Wenn eine Spannung von der Spannungsquelle 107 an die strangaufwärtige Seite und die strangabwärtige Seite der Nanopore 101 durch die erste Elektrode 105A und die zweite Elektrode 105B angelegt wird, entsteht in der Elektrolytlösung 103 ein elektrisches Feld in der Nähe der Nanopore 101. Die Stärke des elektrischen Felds bewirkt, dass das Biomolekül 109 in die Nanopore 101 eingeführt wird und dann die Nanopore 101 passiert. Da andererseits die Abmessung Dm des molekularen Motors 110 größer als der Durchmesser Dn der Nanopore 101 ist, ist es dem molekularen Motor 110 nicht möglich, durch die Nanopore 101 hindurchzutreten. Dabei startet die Synthesereaktion, wenn der Primer 112 im Kontrollstrang 111 sich dem molekularen Motor 110, der sich in der Nähe der Nanopore 101 befindet, nähert.
Als Ergebnis wird das Biomolekül 109 von der Nanopore 101 durch die Kraft, die entsteht, wenn der molekulare Motor 110 den komplementären Strang erweitert, von der Nanopore 101 aus zur strangaufwärtigen Seite (Seite der ersten Elektrode 105A) gezogen. Sodann wird das aus einer Nucleinsäure bestehende Biomolekül 109 aufgrund der Signaländerung, die dabei festgestellt wird, analysiert. Dieses Analysenergebnis ist für verschiedene Bereiche wertvoll, z.B. beim Testen, Stellen von Diagnosen, Behandeln, Auffinden von Arzneistoffen und bei grundlegenden Forschungsarbeiten. Wenn das Biomolekül 109, das auf die vorstehend beschriebene Weise vorbereitet worden ist, einer Synthesereaktion in einer Elektrolytlösung ohne die Nanopore 101 unterworfen wird, erfolgt keine Synthesereaktion. Ein Signal, das vom Molekültransport abgeleitet ist und durch das hindurchtretende Biomolekül erhalten wird, wird festgestellt, wenn der Strom unter Verwendung des Dünnfilms 102 mit der Nanopore 101 gemessen wird.
Nachstehend wird näher erläutert, wie der Aufbau des Kontrollstrangs 111 zur Steuerung des Synthesestarts beiträgt. Da in der Vorrichtung von 1 das Biomolekül 109 zu Beginn beim Anlegen der Spannung noch nicht die Nanopore 101 erreicht hat, wird ein Strom durch das Amperemeter 106 gemessen, der dem Durchmesser Dn der Nanopore 101 entspricht. Anschließend wird das Biomolekül 109 in den Flüssigkeitsbehälter 104A gegeben und gelangt durch ein elektrisches Feld in die Nähe der Nanopore 101.
Nachstehend wird unter Bezugnahme auf 2 ein Problem beschrieben, das dann auftritt, wenn der Spacer 113 nicht an dem Kontrollstrang 111, der an das Biomolekül 109 gebunden ist, bereitgestellt wird. Gemäß Darstellung in 2 startet der molekulare Motor 110 dann, wenn der Spacer 113 nicht bereitgestellt ist und der Primer 112 sich in Kontakt mit dem molekularen Motor 110 befindet, eine Synthesereaktion (Extensionsreaktion) vom Primer 112, bevor das Biomolekül 109 in die Nanopore 101 eingeführt wird. Wenn die Synthesereaktion vor Einführung des Biomoleküls 109 in die Nanopore 101 beendet ist, ist es für das Biomolekül 109 nicht möglich, durch die Nanopore 101 hindurchzutreten. Alternativ wird mit fortschreitender Extensionsreaktion die Länge (Analysenlänge) des Biomoleküls 109, dessen Messung durch die Vorrichtung bei Durchtritt durch die Nanopore 101 ermöglicht wird, kürzer. Das Nanoporenverfahren hat den Vorteil, dass eine Messung des Biomoleküls 109 mit einer Analysenlänge, die im Vergleich zu anderen Verfahren größer ist, ermöglicht wird. Wenn jedoch die Extensionsreaktion auf die vorstehend beschriebene Weise abläuft, geht dieser Vorteil verloren.
Als Maßnahme zur Beseitigung von derartigen ausbeuteverringernden Faktoren ist es möglich, sie durch Reaktionssteuerung mit einem Blockoligomer zu beseitigen (G. M. Cherf et al., Nat. Biotechnol. (2012)). Jedoch erfordert es die Verwendung von zwei Typen von Molekülen, nämlich einem Primer und einem Blockoligomer, dass die beiden Molekültypen gleichzeitig eine Bindung eingehen. Solange die Bindung in einem stochastischen Prozess erfolgt, stellt sie einen Faktor zur Verringerung der Ausbeute dar. Um sämtliche Ursachen für Ausbeuteverringerungen auszuschließen, ist es erforderlich, dass ein Mechanismus zum Stoppen der Synthesereaktion vorher eingebaut wird und dass eine Mehrzahl von stochastischen Vorgängen nicht vorgesehen ist.
Zur Lösung des vorgenannten Problems wird bei der ersten Ausführungsform der Primer 112 an der strangaufwärtigen Seite (vom molekularen Motor 110 entfernte Seite) des Kontrollstrangs 111 bereitgestellt, und der Spacer 113 wird an der strangabwärtigen Seite (Seite in der Nähe des molekularen Motors 110) bereitgestellt. Die Enden des Primers 112 und des molekularen Motors 110 sind durch den Spacer 113 getrennt. Somit beginnt die Synthesereaktion nicht, bevor der molekulare Motor 110 die Nanopore 101 erreicht (Bezugszeichen α und β in 2). Wenn das Biomolekül 109 durch die Nanopore 101 hindurchtritt und dann der molekulare Motor 110 die Nanopore 101 erreicht, wobei also der molekulare Motor 110 und ein Ende des Primers 112 in Kontakt miteinander kommen, können die Synthesereaktion und die Transportsteuerung einsetzen (Bezugszeichen γ in 2).
Die Funktion des Kontrollstrangs 111 und das Analysenverfahren für das Biomolekül werden nachstehend unter Bezugnahme auf die 3A und 3B näher beschrieben. 3A zeigt das Konzept der Funktion des Kontrollstrangs 111 und des molekularen Motors 110. 3B ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung eines Vorgangs zur Messung des Biomoleküls 109 in der ersten Ausführungsform. Wie schematisch in 3A dargestellt ist, wird das Biomolekül 109 in den Flüssigkeitsbehälter 104A, der die Elektrolytlösung 103 enthält, in einem Zustand gegeben, bei dem der Kontrollstrang 111 an das Biomolekül 109 gebunden ist. Der molekulare Motor 110 wird in der Elektrolytlösung 103 gelöst. Das Biomolekül 109 und der molekulare Motor 110 werden in der Elektrolytlösung 103 an den Kontrollstrang 111 gebunden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es auch möglich ist, den Kontrollstrang 111 oder den molekularen Motor 110 in einer anderen Lösung an das Biomolekül 109 zu binden und anschließend das Biomolekül in den Flüssigkeitsbehälter 104A einzuführen.
Der Kontrollstrang 111 wird an den Primer 112 an der strangaufwärtigen Seite gebunden und weist den Spacer 113 an der strangabwärtigen Seite des Kontrollstrangs auf. Der Primer 112 und der molekulare Motor 110 sind durch den Spacer 113 voneinander getrennt. Wie vorstehend ausgeführt, wird eine erste Spannung V1 durch die erste Elektrode 105A und die zweite Elektrode 105B an die Flüssigkeitsbehälter 104A und 104B angelegt, wobei das Biomolekül 109 mit dem aus dem Primer 112 und dem Spacer 113 zusammengesetzten Kontrollstrang 111 in der Elektrolytlösung 103 gelöst ist (Stufe S1 in 3B). Somit wird das Biomolekül 109, an das der molekulare Motor 110 gebunden ist, aufgrund des Potentialgradienten, der in der Nähe der Nanopore 101 entsteht, in die Nanopore 101 eingeführt, wie in (a) von 3A dargestellt ist.
Nachdem das Biomolekül 109 in die Nanopore 101 eingeführt worden ist, wird die Spannung zwischen den Elektroden 105A und 105B auf eine zweite Spannung V2 umgeschaltet (Stufe S2 in 3B). Somit bewegt sich das Biomolekül 109 weiter in Richtung nach unten, und der molekulare Motor 110 nähert sich der Nanopore 101. Da die Abmessung Dm des molekularen Motors 110 größer als der Durchmesser Dn der Nanopore 101 ist (Dm > Dn), ist es dem molekularen Motor 110 dann, wenn er den Einlass (Seite des Flüssigkeitsbehälters 104A) der Nanopore 101 erreicht, nicht möglich, durch die Nanopore 101 hindurchzutreten und zur Auslassseite (Seite des Flüssigkeitsbehälters 104B) zu gelangen. Somit stoppt der molekulare Motor 110 seine Bewegung am Einlass der Nanopore 101. Andererseits bewegt sich das Biomolekül 109, das negative Ladungen trägt, weiter in Richtung nach unten, und die Gestalt des Kontrollstrangs 111 verändert sich im Bereich um den Spacer 113 herum. Wenn sich die Gestalt des Kontrollstrangs verändert, kommt der molekulare Motor 110 in Kontakt mit dem Ende des Primers 112 im Kontrollstrang 111 und wird anschließend an das Ende des Primers 112 gebunden ((b) in 3A). Somit startet der an das Ende des Primers 112 gebundene molekulare Motor 110 die Synthesereaktion.
Nachdem der molekulare Motor 110 und der Primer 112 aneinander gebunden sind (in Kontakt miteinander gekommen sind), wird die Spannung zwischen den beiden Elektroden 105A und 105B auf eine dritte Spannung V3 umgeschaltet (Stufe S3 in 3B). Somit beginnen zwei Vorgänge, nämlich das Ziehen (Transportieren) des Biomoleküls 109 nach oben und die Sequenzierung. Wenn die Synthesereaktion durch den molekularen Motor 110 beginnt, wird das Biomolekül 109 in entgegengesetzter Richtung zur Richtung des elektrischen Felds transportiert, da die Kraft F1, mit der das Biomolekül 109 nach oben gezogen wird, größer ist als die Kraft F2, durch die das Biomolekül 109 durch die Nanopore 101 hindurchgeführt wird. Während dieses Transports können das Amperemeter 106 und der Rechner 108 ein Signal (Veränderung des Stroms) erfassen (Durchführung der Sequenzierung), das sich aus den Eigenschaften des Biomoleküls 109 ergibt.
Was die angelegte Spannung betrifft, können die erste Spannung V1, die beim Einführen des Biomoleküls 109 verwendet wird, die zweite Spannung V2, die bei der Bindung des molekularen Motors 110 an den Primer 112 angelegt wird, und die dritte Spannung V3 während der Messung alle gleich groß sein. Da andererseits die Bindungskraft und die Zugkraft sich je nach dem Typ des molekularen Motors 110 unterscheiden, ermöglicht das Anlegen unterschiedlicher Spannungen die Erfassung eines gewünschten Signals. Die Kraft F2, die zur Durchtrittsgeschwindigkeit des Biomoleküls 109 beiträgt, wird durch die Zugkraft F1, das elektrische Feld und die Reibungskraft an der Innenwand der Nanopore 101 bestimmt. Daher ist es erforderlich, die angelegten Spannungen V1 bis V3 entsprechend den Dimensionen (Durchmesser, Dicke und dergleichen) der Nanopore 101 einzustellen.

Bei der ersten Ausführungsform wird beispielsweise eine Polymerase als molekularer Motor 110 verwendet, und eine DNA mit der in Tabelle 1 gezeigten Sequenz wird als Biomolekül 109 und als Primer 112 verwendet. iSpC3 kann als Spacer 113 an der mit „Z“ bezeichneten Position angeordnet sein. Tabelle 1

BEZEICHNUNG	SEQUENZ
PRIMER 112	AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC
BIOMOLEKÜL 109	5'- ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA CACACZZZZACACACACACACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACACZZZZGCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGC T-3'

4 zeigt ein experimentelles Beispiel bezüglich der Wirkung des Spacers 113.
Bei diesem Experiment wurde ein Biomolekül 109, an das der Kontrollstrang 111 gebunden war und das einen Spacer 113 aufwies, in eine Pufferlösung gegeben. Eine in der Lösung stattfindende Synthesereaktion des an den Kontrollstrang gebundenen Biomoleküls wurde durch Elektrophorese bestätigt. Ferner wurden eine Polymerase, die als Molekül des molekularen Motors 110 diente, und dNTP zur Bildung eines komplementären Strangs ebenfalls in die Pufferlösung gegeben. Ferner wurde als Vergleichsversuch (Referenz) die Extensionsreaktion auch dann gemessen, wenn die als molekularer Motor 110 verwendete Polymerase und das dNTP zur Bildung des komplementären Strangs nicht zugegeben wurden. Als Molekül(Polymerase) für den molekularen Motor 110 wurden zwei Molekültypen, nämlich das Molekül A und das Molekül B, geprüft.
In 4 bezeichnet das Symbol „oligo +“ einen Fall, bei dem der Spacer 113 bereitgestellt wird. Ferner bedeutet das Symbol „polymerase +“ ein Experiment, bei dem im Zustand (+) die Polymerase als molekularer Motor 110 in der Pufferlösung bereitgestellt wird. Das Symbol „polymerase -“ bezeichnet ein Experiment in einem Zustand (-), bei dem die Polymerase als molekularer Motor 110 nicht in der Pufferlösung bereitgestellt wird. „dNTP +“ bezeichnet ein Experiment in einem Zustand (+), bei dem dNTP zur Bildung des komplementären Strangs in der Pufferlösung bereitgestellt wird. „dNTP -“ bezeichnet ein Experiment in einem Zustand (-), bei dem dNTP zur Bildung des komplementären Strangs nicht in der Pufferlösung bereitgestellt wird.
Um ferner den Einfluss eines Salzes zu bestätigen, wurde das Ergebnis der Extensionsreaktion in einer Pufferlösung, die mit 0,3 M KCl versetzt war, ermittelt. In 4 bezeichnen die Symbole „0,3 M KCl +“ und „0,3 M KCl -“ die Situation, wenn 0,3 M KCl zur Pufferlösung gegeben wurde oder nicht. B1 bis E1 zeigen die Versuchsergebnisse bei Verwendung des Moleküls A und F1 bis A2 zeigen die Versuchsergebnisse bei Verwendung des Moleküls B.
Für beide Moleküle A und B war die Position einer Bande, die unter einer Pufferbedingung, (B1, F1) auftritt, bei der die Extensionsreaktion möglich war, die gleiche wie die Position einer Bande, die unter einer Pufferbedingung (C1, G1) auftritt, bei der die Extensionsreaktion nicht möglich war. Daraus ist ersichtlich, dass die Extensionsreaktion unter der Pufferbedingung, die die Extensionsreaktion ermöglichte, nicht erfolgte. Aus den Ergebnissen von D1 und H1 ist ersichtlich, dass die Extensionsreaktion mit 0,3 M KCl bei beiden Molekülen unterdrückt wurde. Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, dass die Extensionsreaktion in der Pufferlösung durch Bereitstellung des Spacers 113 im Kontrollstrang 111, der mit dem Biomolekül 109 verbunden ist, unterdrückt wird.
5 erläutert ein Experiment zur Prüfung der Frage, ob im Biomolekül 109, bei dem es sich um eine partiell doppelsträngige DNA mit dem molekularen Motor 110 und dem Spacer 113 handelt, die Extensionsreaktion einsetzt, wenn der molekulare Motor 110 in Kontakt mit der partiell doppelsträngigen DNA kommt, und ob der Transport des Biomoleküls 109 möglich ist oder ob dies nicht der Fall ist. Bei diesem Experiment wurden die gleichen Lösungsbedingungen wie in 4 für die Pufferlösungen in den Flüssigkeitsbehältern 104A und 104B, die durch den Dünnfilm 102 mit der Nanopore 101 getrennt waren, eingehalten. Anschließend wurde das Biomolekül 109, das mit dem Kontrollstrang 111 mit dem molekularen Motor 110 (BST-Polymerase) und dem Spacer 113 (der gleiche wie in 4) verbunden war, in der Pufferlösung gelöst und der Blockierungsstrom wurde gemessen.
Bei der Messung des Blockierungsstroms wird der in einem Zustand, bei dem das Biomolekül 109 nicht bereitgestellt wird, gemessene Stromwert als Referenzwert (Porenstrom) herangezogen. Die Abnahme des Stroms, die beobachtet wird, wenn das Biomolekül 109 eingekapselt wird (Blockierung der Nanopore 101 durch das Biomolekül 109) wird überwacht und die Durchtrittsgeschwindigkeit und der Zustand der Moleküle werden beobachtet.
Wenn das Biomolekül 109 den Durchtritt durch die Nanopore 101 beendet, kehrt der erfasste Stromwert auf den als Referenz dienenden Porenstrom zurück. Die Durchtrittsgeschwindigkeit des Biomoleküls 109 durch die Nanopore 101 kann aus dieser Blockierungszeit berechnet werden, und die Eigenschaften des Biomoleküls können aus dem Blockierungsbetrag analysiert werden. Die bei der Messung des Blockierungsstroms angelegte Spannung wurde bei diesem Experiment durchgehend auf 0,1 V eingestellt.
Beim Experiment unter Verwendung des molekularen Motors 110 wurde eine partiell doppelsträngige DNA durch vorherige Bindung des als Matrize verwendeten Biomoleküls 109 und des Primers 112 erzeugt, und anschließend wurde eine 10-minütige Inkubation in einer Pufferlösung bei 37°C durchgeführt, um eine Bindung an den molekularen Motor 110 zu erreichen. Sodann wurde die partiell doppelsträngige DNA, die an den molekularen Motor 110 gebunden war, mit 0,3 M KCl als Messlösung vermischt. Die DNA-Menge wurde auf 10 nM eingestellt.
5 (a) zeigt ein Blockierungssignal und ein Streudiagramm zur Erläuterung der Blockierungszeit, wobei der Blockierungsbetrag gemessen wird, wenn das Biomolekül 109 nicht an den molekularen Motor 110, sondern nur an den Primer 112 gebunden ist. Es ist ersichtlich, dass trotz der Variation der Wellenform des Blockierungssignals die Blockierungszeit des erhaltenen Signals 1 ms oder weniger beträgt und das Biomolekül 109 durch die Nanopore 101 mit sehr hoher Geschwindigkeit hindurchtritt.
5 (b) erläutert das Ergebnis einer ähnlichen Ermittlung des Blockierungssignals in einem Zustand, bei dem das Biomolekül 109 an den aus der Polymerase bestehenden molekularen Motor 110 gebunden ist. Es wurde ein Langzeitblockierungssignal (~ mehrere tausend ms) erhalten, was unter den Bedingungen von 5 (a) nicht der Fall war. Aus dem Streudiagramm der Blockierungszeit und des Blockierungsbetrags ist ersichtlich, dass eine Mehrzahl von Signalen mit einer Blockierungszeit von 1 ms oder mehr erfasst wird (angegeben als gestrichelte Kreislinie). Es wird angenommen, dass das Signal mit der Blockierungszeit von 1 ms oder mehr auf dem Fortschreiten der Extensionsreaktion, nachdem der molekulare Motor 110 die Nanopore 101 erreicht hat, beruht.
Ferner zeigt 5 (c) das durch Erfassen des Blockierungssignals erhaltene Ergebnis, wenn der aus der Polymerase bestehende molekulare Motor 110 an das Biomolekül 109 gebunden ist, jedoch das Substrat nicht in die Messlösung gegeben wird. Es wurde bestätigt, dass die Abnahme des Stroms für lange Zeit aufrechterhalten wurde. Nachdem die Abnahme des Stroms, d.h.ig. 6 die Blockierung der Pore, bestätigt worden war, kehrte der Stromwert nicht spontan zum Porenstrom zurück. Es wurde bestätigt, dass bei Umkehr der angelegten Spannung zu dem in 5 (c) mit einem Dreieck angegebenen Zeitpunkt der Strom zum Porenstrom zurückkehrte. Jedoch ergab sich nach einigen Sekunden, dass der Strom erneut abnahm. Die vorstehend beschriebene Erscheinung wiederholte sich. Diese Erscheinung wurde bei 5 (b) nicht bestätigt.
Aus den vorstehenden Ausführungen lassen sich die folgenden Schlussfolgerungen ziehen. Aus 5 (a) lässt sich gemäß der Darstellung auf der linken Seite von 5 (a) schließen, dass der Durchtritt der Probe, bei der das Biomolekül 109 als Matrize und der Primer 112 gebunden sind, festgestellt wird, und dass in der Nanopore 101 die reißverschlussartige Öffnung des Primers 112 von der Matrize beobachtet wird.
Ferner lässt sich in 5 (c) aus dem Ergebnis, dass die in der Lösung erfolgende Synthesereaktion durch Elektrophorese gemäß 4 bestätigt worden ist, der Schluss ziehen, dass die Extensionsreaktion durch den aus der Polymerase bestehenden molekularen Motor 110 nicht abläuft und in der Nähe der Nanopore 101 stoppt.
Andererseits lässt sich aus 5 (b) der Schluss ziehen, dass aufgrund der Tatsache, dass Substrat in der Lösung vorhanden ist, der aus der Polymerase bestehende molekulare Motor 110 die Extensionsreaktion vom Primer 112 aus vornehmen kann, so dass es möglich ist, den vom Transport durch die Polymerase abgeleiteten Blockierungsvorgang zu bestätigen. Es ist darauf hinzuweisen, dass dann, wenn die Blockierungszeit des Blockierungsvorgangs, der in 5 (b) nicht bestätigt worden ist, analysiert wird, der Mittelwert 1600 ms beträgt, was bedeutet, dass das Biomolekül mit einer Geschwindigkeit von 30 ms/nt hindurchtritt, was sich aus der Länge der bei diesem Experiment verwendeten Matrize von 53 nt ergibt. Dies entspricht in etwa der Transportzeit durch die Polymerase.
Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich, dass es möglich ist, den Transport in der Lösung durch den Spacer 113 zu stoppen, und dass der Transportbeginn und der Synthesebeginn des Biomoleküls 109 in der Nähe der Nanopore 101 erfolgt.
6 erläutert das Ergebnis der Messung des Blockierungsstroms, die unter Verwendung eines Biomoleküls (Modellprobensequenzen), bei der nur Adenin (A) und Cytosin (C) abwechselnd und wiederholt jeweils als einzelne Basen vorliegen (z.B. jeweils 50), als Matrizenbiomolekül auf ähnliche Weise wie in 5 erhalten worden ist. Das obere Diagramm von 6 zeigt die Wellenform des Blockierungsstroms. Das untere Diagramm zeigt eine normierte Wellenform, die durch Normieren der Wellenform des Blockierungsstroms gemäß zwei Schwellenströmen erhalten worden ist.
Wie im oberen Diagramm von 6 dargestellt ist, wurden dann, wenn die Wellenform des Blockierungsstroms gemäß den beiden Schwellenströmen (CACAC, ACACA) normiert wurden und die Anzahl der Impulse der normierten Wellenform gezählt wurde, Impulse beobachtet wurden, deren Anzahl der Zahl der Adenin- und Cytosinreste in einer zu messenden Modellprobenreihe entsprach. Aus den experimentellen Ergebnissen von 6 ist ersichtlich, dass das gemessene Blockierungsstromsignal ein Signal darstellt, das die Eigenschaften (Basensequenz) der Matrize (Biomolekül 109) strangabwärts vom Spacer 113 widerspiegelt, und dass die Extensionsreaktion mit einer Geschwindigkeit veranlasst wird, bei der die Unterschiede zwischen Signalen von benachbarten Basen beseitigt werden können.
Nachstehend wird das Material des Spacers 113 untersucht. Als Materialien für den Spacer 113, der im Kontrollstrang 111 enthalten ist, können die folgenden Materialien verwendet werden. Beim Spacer 113 handelt es sich um ein lineares Konjugat, das keine Base enthält. Die Länge des Spacers 113 muss der Länge von zwei Basen oder mehr entsprechen, d.h., etwa 0,6 x 2 nm oder mehr, ausgehend vom Verbindungsbereich des Primers 112. Beispiele für geeignete Linker sind auf dem einschlägigen Gebiet bekannt (aus der IDT-Homepage (http://sg.idtdna.com/site/Catalog/Modifications/Category/6), Diehl et al. Nature Methods, 2006, 3(7): 551-559). Die Ausführungsform ist aber nicht auf die Beispiele beschränkt. Die Ausführungsform kann (ohne Beschränkung hierauf) C3-Spacer, PC-Spacer, Spacer9, Spacer18 und d-Spacer, die in einem Strang vorliegen können, umfassen. Zusätzlich zu den vorstehenden Ausführungen können lineare Kohlenstoffstränge, lineare Aminosäuren, lineare Fettsäuren, lineare Zuckerstränge und dergleichen verwendet werden.
7 zeigt ein Beispiel des Aufbaus einer Biomolekül-Analysenvorrichtung 700, die sich von der Biomolekül-Analysenvorrichtung von 1 unterscheidet. Da die gleichen Komponenten wie in 1 mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet werden, werden Wiederholungen in der Beschreibung vermieden. Der Unterschied zur Vorrichtung von 1 besteht darin, dass der Dünnfilm 102B eine Mehrzahl von Nanoporen 101 aufweist und der Flüssigkeitsbehälter 104B unter dem Dünnfilm 102A durch Trennwände (speziell Seitenwände aus dem Dünnfilm 102C) in eine Mehrzahl von Abteilen unterteilt ist. In den Dünnfilmen 102B und 102C sind zum Fixieren des Dünnfilms 102A Durchgangslöcher an den den Nanoporen 101 entsprechenden Positionen vorgesehen. Die Mehrzahl von Abteilen wird durch die Seitenwände der Durchgangslöcher des Dünnfilms 102C gebildet. Die zweite Elektrode 105B ist in jeder der mehreren Abteile vorgesehen. Es ist darauf hinzuweisen, dass der Flüssigkeitsbehälter 104A als gemeinsamer Flüssigkeitsbehälter für die Mehrzahl von Abteilen, die sich an der Unterseite befinden, verwendet wird. Die mehreren Abteile werden voneinander durch Trennwände isoliert. Daher ist es möglich, in unabhängiger Weise den durch jede Nanopore 101 fließenden Strom zu messen.
Der Dünnfilm 102A, der in jedem der in den Dünnfilmen 102B und 102C vorgesehenen Durchgangslöcher exponiert ist, weist vorzugsweise eine Fläche auf, bei der es schwierig ist, zwei oder mehr Nanoporen 101 zu bilden, wenn die Nanopore 101 durch Anlegen einer Spannung gebildet wird. Dieser Bereich ist im Hinblick auf die Festigkeit vorgesehen. Der Bereich kann beispielsweise etwa 100 bis 500 nm betragen. Die Filmdicke des Dünnfilms 102A wird vorzugsweise auf einen Wert eingestellt, der die Bildung der Nanopore 101 mit einer effektiven Filmdicke entsprechend einer Base ermöglicht, um eine DNA-Auflösung von einer einzigen Base zu erreichen. Beispielsweise ist die Einstellung der Filmdicke auf etwa 7 nm oder weniger geeignet.
Der Flüssigkeitsbehälter 104A und der Flüssigkeitsbehälter 104B werden mit der Elektrolytlösung 103 gefüllt, ähnlich wie im Fall von 1. Im Fall von 7 liegt das Volumen der Elektrolytlösung 103 in der Größenordnung von Mikrolitern oder Millilitern.
Für die Elektrolytlösung 103 werden beispielsweise KCl, NaCl, LiCl und CsCl verwendet. Was die Lösung betrifft, können Harnstoff in einer Konzentration von 4 M oder mehr, DMSO, DMF und NaOH in den Flüssigkeitsbehälter 104B, in den der molekulare Motor 110 eingeführt wird, gegeben werden, um die Bildung von selbstkomplementären Strängen des Biomoleküls 109 zu unterdrücken. Ferner ist es möglich, einen Puffer zur Stabilisierung des Biomoleküls 109 zuzumischen. Als Puffer werden Tris, EDTA, PBS und dergleichen verwendet.
Nachstehend wird ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Biomolekül-Analysenvorrichtung beschrieben. Der grundlegende Aufbau der Biomolekül-Analysenvorrichtung, die zum Analysieren des Biomoleküls nach dem sogenannten Blockierungsstromverfahren verwendet wird, ist an sich aus dem Stand der Technik bekannt. Seine Bestandteile sind dem Fachmann geläufig. Beispielsweise wird verwiesen auf US-Patent 5795782, „Scientific Reports 4, 5000, 2014, Akahori et al.‟, „Nanotechnology 25 (27): 275501, 2014, Yanagi et al.", „Scientific Reports, 5, 14656, 2015, Goto et al." und „Scientific Reports 5, 16640, 2015“, in denen spezielle Vorrichtungen beschrieben sind.
Beim Dünnfilm 102, an dem die Nanopore 101 ausgebildet ist, kann es sich um eine Lipid-Doppelschicht (Biopore) handeln, die aus einer amphipatischen molekularen Schicht besteht, in der ein Protein mit einer Pore im Zentrum eingebettet ist, oder es kann sich um einen Dünnfilm (feste Pore) handeln, der aus einem Material, das durch eine Halbleiter-Mikrofabrikationstechnik herstellbar ist, gebildet ist. Zu Beispielen für das Material, das durch die Halbleiter-Mikrofabrikationstechnik herstellbar ist, gehören Siliciumnitrid (SiN), Siliciumdioxid (SiO₂), Siliciumoxinitrid (SiON) , Hafniumoxid (HfO₂) , Molybdändisulfid (MoS₂) und Graphen. Die Dicke des Dünnfilms beträgt 1 Å (Angström) bis 200 nm, vorzugsweise 1 Ä bis 100 nm, insbesondere 1 Ä bis 50 nm und beispielsweise etwa 5 nm.
Beispielsweise lässt sich ein Dünnfilm durch die Halbleiter-Mikrofabrikationstechnik nach folgendem Verfahren herstellen. Zunächst werden auf der Vorderseite eines 8-Zoll-Si-Wafers mit einer Dicke von 725 µm Schichten von Si₃N_4/SiO₂/Si₃N₄ mit Filmdicken von 12 nm/250 nm/100 nm hergestellt. Ferner wird Si₃N₄ auf die rückwärtige Fläche des Si-Wafers in einer Dicke von 112 nm aufgebracht.
Anschließend werden 500 nm² Si₃N₄ der obersten Schicht der Vorderfläche des Si-Wafers durch reaktives Ionenätzen entfernt. Gleichermaßen werden 1038 µm² Si₃N₄ auf der Rückseite des Si-Wafers durch reaktives Ionenätzen entfernt. Auf der Rückseite wird das Si-Substrat, das dem Ätzvorgang ausgesetzt war, weiter mit TMAH (Tetramethylammoniumhydroxid) geätzt. Während des Si-Ätzens wird vorzugsweise die Waferoberfläche mit einem Schutzfilm (ProTEKTMB3-Primer und ProTEKTMB3, Brewer Science, Inc.) geschützt, um ein Ätzen des SiO auf der Vorderseite zu verhindern. Beim SiO der Zwischenschicht kann es sich um Polysilicium handeln.
Sodann wird nach Entfernen des Schutzfilms die exponierte SiO-Schicht mit 500 nm² mit einer BHF-Lösung entfernt (HF/NH₄F = 1/60, 8 min). Somit wird ein Trennwandkörper, bei dem der Dünnfilm Si₃N₄ mit einer Filmdicke von 12 nm exponiert ist, erhalten. Wenn Polysilicium für die Opferschicht verwendet wird, wird der Dünnfilm durch Ätzen mit KOH exponiert. In diesem Stadium befindet sich im Dünnfilm keine Nanopore.
Was die Abmessungen der Nanopore 101 betrifft, können geeignete Abmessungen je nach dem Typ des zu analysierenden Biomoleküls gewählt werden. Beispielsweise können die Abmessungen der Nanopore 101 auf 0,9 nm bis 100 nm, vorzugsweise 0,9 nm bis 50 nm und insbesondere etwa 0,9 nm oder mehr und 10 nm oder weniger eingestellt werden. Beispielsweise kann der Durchmesser der Nanopore 101, die für die Analyse von ssDNA (einzelsträngige DNA) verwendet wird, auf einen Wert von etwa 1,4 nm, vorzugsweise von etwa 1,4 nm bis 10 nm, insbesondere etwa 1,4 nm bis 2,5 nm und ganz besonders etwa 1,6 nm eingestellt werden.
Ferner kann beispielsweise der Durchmesser der Nanopore 101, die zur Analyse von dsDNA (doppelsträngige DNA) verwendet wird, einen Wert von etwa 2,6 nm, vorzugsweise von etwa 3 nm bis 10 nm und insbesondere von etwa 3 nm bis 5 nm aufweisen.
Die Tiefe der Nanopore 101 kann durch Einstellen der Dicke des Dünnfilms festgelegt werden. Die Tiefe der Nanopore 101 wird so eingestellt, dass sie mindestens das 2-fache der Monomereinheit, die das Biomolekül bildet, beträgt, vorzugsweise mindestens das 3-fache und insbesondere mindestens das 5-fache. Wenn beispielsweise das Biomolekül aus einer Nucleinsäure besteht, wird die Tiefe der Nanopore 101 vorzugsweise auf eine Größe von drei oder mehr Basen, zum Beispiel etwa 1 nm oder mehr, eingestellt. Somit ist es möglich, dass das Biomolekül in die Nanopore 101 eintritt, wobei die Gestalt und die Bewegungsgeschwindigkeit des Biomoleküls gesteuert wird, wodurch eine hochgradige empfindliche und genaue Analyse möglich wird. Ferner ist die Gestalt der Nanopore 101 grundsätzlich kreisförmig, kann aber auch elliptisch oder polygonal sein.
Im Fall eines Aufbaus mit Reihenanordnung mit einer Mehrzahl von Dünnfilmen, die Nanoporen 101 aufweisen, ist es bevorzugt, dass die Dünnfilme Nanoporen 101 in regelmäßiger Anordnung aufweisen. Der Abstand, in dem die Mehrzahl von Dünnfilmen 111A angeordnet ist, kann 0,1 µm bis 10 µm und vorzugsweise 0,5 µm bis 4 µm betragen, jeweils in Abhängigkeit von den zu verwendenden Elektroden und den Möglichkeiten des elektrischen Messsystems.
Es ist darauf hinzuweisen, dass das Verfahren zur Bildung der Nanopore 101 im Dünnfilm keinen speziellen Beschränkungen unterliegt. Beispielsweise kann eine Elektronenstrahl-Bestrahlung mit einem Transmissionselektronenmikroskop oder ein dielektrischer Durchschlag durch Anlegen von Spannung herangezogen werden. Beispielsweise kann man sich des in „Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014)“ beschriebenen Verfahrens bedienen.
Die Nanopore 101 lässt sich beispielsweise nach folgendem Verfahren bilden. Vor dem Einsetzen des Trennwandkörpers in die Vorrichtung für die Biomolekülanalyse wird der Si₃N₄-Dünnfilm unter folgenden Bedingungen hydrophilisiert: 10 W, 20 sccm, 20 Pa und 45 sec mit Ar/O₂-Plasma (SAMCO Inc., Japan). Anschließend wird der Trennwandkörper in die Vorrichtung für die biomolekulare Analyse eingesetzt. Sodann werden der obere und der untere Flüssigkeitsbehälter, zwischen denen sandwichartig der Dünnfilm angeordnet ist, mit einer Lösung von 1 M KCl, 1 mM Tris-10 mM EDTA vom pH-Wert 7,5 gefüllt und die Elektroden 115A und 115B werden in die jeweiligen Flüssigkeitsbehälter eingesetzt.
Spannung wird nicht nur zum Zeitpunkt der Bildung der Nanopore 101 angelegt, sondern auch dann, wenn der Ionenstrom, der durch die Nanopore 101 fließt, nach Bildung der Nanopore 101 gemessen wird. Hier wird der Flüssigkeitsbehälter, der sich auf der Unterseite befindet, als cis-Behälter bezeichnet und der auf der Oberseite befindliche Flüssigkeitsbehälter wird als trans-Behälter bezeichnet. Ferner wird die Spannung Vcis, die an die Elektrode an der cis-Behälterseite angelegt wird, auf 0 V eingestellt, und die Spannung Vtrans wird an die Elektrode an der trans-Behälterseite angelegt. Die Spannung Vtrans wird durch einen Impulsgenerator erzeugt (zum Beispiel einen 41501B SMU AND Pulse Generator Expander, Agilent Technologies, Inc.).
Der Stromwert nach Impulsanwendung kann mit einem Amperemeter abgelesen werden (zum Beispiel 4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER, Agilent Technologies, Inc.). Die Stromwertbedingung (Schwellenstrom) kann je nach dem Durchmesser der gebildeten Nanopore 101 vor Anlegen der Pulsspannung gewählt werden und der erwünschte Durchmesser lässt sich erhalten, während der Durchmesser der Nanopore 101 sequentiell vergrößert wird.

Der Durchmesser der Nanopore 101 wird aus dem Ionenstromwert bestimmt. Die Kriterien für die Auswahlbedingungen sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 BEDINGUNGEN BEIM ANLEGEN DER SPANNUNG

Durchmesser der Nanopore vor Anlegen der Impulsspannung	nicht offen ~ 0,7 nmΦ	~ 1,4 nmΦ	~ 1,5 nmΦ
angelegte Spannung (V_cis) [V]	10	5	3
anfängliche Anlegungszeit [s]	0,001	0, 01	0,001
Schwellenstrom	0,1 nA/0,4 V	0,6 nA/0,1 V	0,75 nA/0,1 V

Dabei wird die Zeitspanne des Anlegens der n-ten Impulsspannung tn (wobei n > 2 eine ganze Zahl darstellt) gemäß dem folgenden Ausdruck bestimmt. $t_{n} = 10^{- 3 + (1 / 6) (n - 1)} - 10^{- 3 + (1 / 6) (n - 2)} For n>2$
Die Nanopore 101 kann durch Elektronenstrahl-Bestrahlung mit einem Transmissionselektronenmikroskop (A. J. Storm et al., Nat. Mat. 2 (2003)) neben dem Verfahren zur Anlegung einer Impulsspannung gebildet werden.
Wenn eine Spannung von der Spannungsquelle an die Elektroden, die im oberen und unteren Flüssigkeitsbehälter vorgesehen sind, angelegt wird, entsteht ein elektrisches Feld in der Nähe der Nanopore 101, und das Biomolekül, das in der Flüssigkeit negativ geladen ist, passiert die Nanopore 101. Dabei fließt der vorstehend beschriebene Blockierungsstrom Ib.
Der Flüssigkeitsbehälter, der die in Kontakt mit dem Dünnfilm kommende Messlösung aufnehmen kann, kann in Bezug auf Material, Gestalt und Größe in geeigneter Weise ausgestaltet sein, so dass die Messung des Blockierungsstroms nicht beeinträchtigt wird. Die Messlösung wird eingespritzt, so dass sie in Kontakt mit dem Dünnfilm, der die Flüssigkeitsbehälter voneinander trennt, kommt.
Die Elektrode wird vorzugsweise aus einem Material hergestellt, das dazu geeignet ist, eine Elektronentransferreaktion (Faraday-Reaktion) mit dem Elektrolyt in der Messlösung hervorzurufen. Typischerweise wird sie aus Silberhalogenid oder Alkalisilberhalogenid hergestellt. Im Hinblick auf die Potentialstabilität und Zuverlässigkeit ist es bevorzugt, Silber oder Silber-Silberchlorid zu verwenden.
Die Elektrode kann aus einem Material hergestellt werden, das als Polarisationselektrode dient. Sie kann beispielsweise aus Gold oder Platin hergestellt werden. In diesem Fall wird vorzugsweise eine Substanz verwendet, die dazu befähigt ist, die Elektronenübertragungsreaktion zu unterstützen. Zum Beispiel wird Kaliumhexacyanoferrat[III] oder Kaliumhexacyanoferrat[II] zu der Messlösung gegeben, um einen stabilen Ionenstrom zu gewährleisten. Alternativ ist es bevorzugt, eine Substanz, die zur Ausführung der Elektronenübertragungsreaktion befähigt ist, zum Beispiel Ferrocene, an der Oberfläche der Polarisationselektrode zu immobilisieren.
Die Elektrode kann vollständig aus dem vorstehend beschriebenen Material hergestellt sein, oder die Oberfläche eines Grundmaterials (Kupfer, Aluminium und dergleichen) kann mit dem vorstehend beschriebenen Material beschichtet werden. Die Gestalt der Elektrode unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, jedoch wird eine Gestalt mit einer großen Oberfläche in Kontakt mit der Messlösung bevorzugt. Die Elektroden werden an die Verdrahtung angeschlossen und ein elektrisches Signal wird zu einer Messschaltung übertragen.
Die Biomolekül-Analysenvorrichtung von 7 umfasst die vorstehenden Bestandteile als Elemente. Die vorstehend beschriebene Biomolekül-Analysenvorrichtung vom Nanoporentyp kann zusammen mit einem Handbuch, das das Verfahren und die Einsatzmenge beschreibt, bereitgestellt werden. Der Kontrollstrang kann in einem gebrauchsfertigen Zustand bereitgestellt werden oder er kann in einem Zustand konfiguriert und bereitgestellt werden, bei dem nur das zu messende Biomolekül nicht gebunden ist. Derartige Formen und Zubereitungen sind dem Fachmann geläufig. Gleichermaßen kann eine Nanoporenvorrichtung in einem Zustand bereitgestellt werden, bei dem die Nanopore in einem gebrauchsfertigen Zustand ausgebildet ist, oder sie kann in einem Zustand bereitgestellt werden, bei dem die Nanopore an der Auslieferungsstelle gebildet wird.
8 ist ein Ablaufdiagramm zur Erläuterung des Messverfahrens durch die Biomolekül-Messvorrichtungen 100 und 700. Zunächst wird das zu messende Biomolekül 109 der Lösung entnommen (Stufe S11), und das Biomolekül 109 wird an den Kontrollstrang 111 gebunden (Stufe S12). Der Kontrollstrang 111 kann mit einem Molekül modifiziert sein, das zur Bindung einer modifizierenden Gruppe an der Oberfläche des Kügelchens, das später für die Gewinnung verwendet wird, befähigt ist. Das Biomolekül 109 kann beispielsweise erhalten werden, indem man es aus einer Zellflüssigkeit des Zielorganismus extrahiert. Nach der Extraktion wird das Biomolekül 109 an den Kontrollstrang 111 gebunden und gewonnen. Es ist üblich, bei der Gewinnung Kügelchen zu verwenden, und die Oberfläche der Kügelchen ist mit einem Molekül modifiziert, das zur Bindung an ein modifiziertes Molekül am Kontrollstrang geeignet ist.
Beispielsweise wird Streptavidin häufig an die Kügelchenoberfläche gebunden. Da dabei das 3'-Ende des Kontrollstrangs 111 mit Biotin modifiziert ist, kann nur die Probe, die mit dem Kontrollstrang 111 verbunden ist, mit den Kügelchen gewonnen werden. Das Bindungsziel von Streptavidin und Biotin kann auch umgekehrt sein. Nach Gewinnen der Zielprobe (zu messendes Biomolekül 109) mit den Kügelchen (Stufe S13) können in einigen Fällen die Kügelchen entfernt werden (Stufe S14). Bei der Entfernung der Kügelchen ist es auch möglich, die Kügelchen unter Anlegen eines elektrischen Felds von 800 mV oder mehr an beide Enden der Membran zu entfernen, wobei die Membran eine poröse Struktur aufweist, die geringer als der Kügelchendurchmesser ist. Alternativ ist es auch möglich, eine Dissoziation mit einem Reduktionsmittel vorzunehmen, indem eine Disulfid-Bindungsstelle strangabwärts von einer SA-Biotinbindung hergestellt wird.
Anschließend wird das extrahierte Biomolekül 109 in der Messlösung gelöst, und die Messlösung wird in die in 1 oder 7 dargestellte Biomolekül-Analysenvorrichtung injiziert. Anschließend wird das Biomolekül 109 durch Anlegen einer Spannung in die Nanopore 101 eingeführt, und das Biomolekül 109 wird durch Anlegen einer gewünschten Spannung analysiert.
Wie vorstehend ausgeführt, ist es mit der Biomolekül-Analysenvorrichtung und dem Analysenverfahren der ersten Ausführungsform möglich, präzise den Synthesestartpunkt unter Steuerung des Transports der Biomoleküle zu steuern.
Zweite Ausführungsform
Nachstehend wird eine Biomolekül-Analysenvorrichtung gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die 9A bis 9C beschrieben. Da die Gesamtkonfiguration der Biomolekül-Analysenvorrichtung bei der zweiten Ausführungsform ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform ist, werden Wiederholungen in der Beschreibung vermieden. Bei der zweiten Ausführungsform unterscheidet sich die Zusammensetzung des zu messenden Biomoleküls 109 von der der ersten Zusammensetzung.
Bei der ersten Ausführungsform wurde als Beispiel ein Fall beschrieben, bei dem das Biomolekül 109 aus einzelsträngiger DNA gemessen wird. Bei der zweiten Ausführungsform wird ein Biomolekül 109 aus doppelsträngiger DNA gemessen.
Im Fall von doppelsträngiger DNA ist es nicht möglich, das Biomolekül 109 durch Elektrophorese ohne Vorbehandlung in die Nanopore 101 einzuführen. Daher wird bei der zweiten Ausführungsform gemäß Darstellung in 9A an ein Ende des doppelsträngigen Genomfragments 901, das als Messziel dient, ein Einführungsstrang 904 addiert. Der Einführungsstrang 904 weist auf der Seite des zu messenden Genomfragements 901 mindestens eine doppelsträngige Struktur auf. Jedoch befindet sich an der Spitze des Einführungsstrangs 904 gegenüber der Seite des Genomfragments 901 ein vorstehendes Ende 903 eines Einzelstrangs, so dass eine Einführung in die Nanopore 101 möglich ist.
Der Kontrollstrang 111 wird mit dem proximalen Ende des Genomfragments 901 durch eine Molekülmotor-Bindungsstelle 902 verbunden, die ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform den molekularen Motor 110 umfasst. Der Primer 112 wird an den Kontrollstrang 111 wie bei der ersten Ausführungsform addiert, und der Spacer 113 wird zwischen dem Primer 112 und dem molekularen Motor 110 ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform vorgesehen.
Nachstehend wird das Verfahren zur Messung des Biomoleküls 109, das unter Bezugnahme auf 9A vorstehend beschrieben wurde, in der Biomolekül-Analysenvorrichtung der zweiten Ausführungsform unter Bezugnahme auf die 9B und 9C beschrieben.
Wenn das Genomfragment 901 von 9A beispielsweise in den Flüssigkeitsbehälter 104A von 1 eingeführt wird, und eine Spannung zwischen den beiden Elektroden 105A und 105B angelegt wird, wird der Einführungsstrang 904 des Genomfragments 901 von 9A in die Nanopore 101 eingeführt.
Wie in 9B dargestellt ist, wird dann, wenn das vorstehende Ende 903 des Einführungsstrangs 904 in die Nanopore 101 eingeführt wird, die doppelsträngige DNA des Einführungsstrangs 904 einer Reißverschlussöffnung unterzogen, wonach die doppelsträngige DNA des Genomfragments 901 ebenfalls geöffnet wird. Wenn dann gemäß Darstellung in 9C der molekulare Motor 110 die Nanopore 101 erreicht, kommen der molekulare Motor 110 und der Primer 112 miteinander in Kontakt, wodurch die Extensionsreaktion im einzelsträngigen Genomfragment 901' einsetzt. Die anschließenden Vorgänge sind im Wesentlichen die gleichen wie bei der ersten Ausführungsform. Gemäß der Konfiguration der zweiten Ausführungsform ist es somit möglich, auch ein Biomolekül mit einer doppelsträngigen Struktur durch die Vorrichtung vom Nanoporentyp gemäß Darstellung in 1 zu analysieren.
Dritte Ausführungsform
Nachstehend wird unter Bezugnahme auf die 10A bis 10D eine Biomolekül-Analysenvorrichtung gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben. Da die gesamte Konfiguration der Biomolekül-Analysenvorrichtung bei der dritten Ausführungsform ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform ist, werden Wiederholungen in der Beschreibung vermieden. Bei der dritten Ausführungsform unterscheidet sich die Zusammensetzung des zu messenden Biomoleküls von der in der ersten Ausführungsform. Die gleichen Konfigurationen wie die des Biomoleküls in der zweiten Ausführungsform werden in 10A mit den gleichen Bezugszeichen bezeichnet. Wiederholende Beschreibungen werden vermieden.
Bei einem Biomolekül 109 der dritten Ausführungsform wird der Einführungsstrang 904 an ein Ende des zu messenden Genomfragments 901 ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform addiert. Jedoch wird bei der dritten Ausführungsform ein zweiter Kontrollstrang 1011 zwischen dem Einführungsstrang 904 und dem Genomfragment eingebunden. Der zweite Kontrollstrang 1011 umfasst einen zweiten molekularen Motor 911, und ein Spacer 113' ist an einem Verbindungsbereich mit dem Genomfragment 901 bereitgestellt. Dies bedeutet, dass bei der dritten Ausführungsform das Genomfragment 901 als Biomolekül mit dem Kontrollstrang 111 und dem ersten molekularen Motor 110 an einem ersten Endbereich verbunden ist und mit dem zweiten molekularen Motor 911, der sich vom ersten molekularen Motor 110 unterscheidet, an einem zweiten Endbereich verbunden ist. Der zweite molekulare Motor 911 bewirkt die Funktion der Dissoziation des Doppelstrangs oder der Zersetzung des komplementären Strangs. Beim ersten molekularen Motor 110 handelt es sich um eine Polymerase und beim zweiten molekularen Motor 911 um eine Helicase.
Nachstehend wird für die dritte Ausführungsform ein Verfahren zum Einführen des Biomoleküls 109 in die Nanopore 101 beschrieben. Ähnlich wie in 9A ist der Kontrollstrang 111 an der strangaufwärtigen Seite des zu messenden Biomoleküls 109 durch die Molekülmotor-Bindungsstelle 902 gebunden. Der zweite Kontrollstrang 1011, der den molekularen Motor 911 umfasst, der die Dissoziation des Doppelstrangs oder die Zersetzung des komplementären Strangs eines Biomoleküls vornimmt, und der Spacer 113', der strangaufwärts vom molekularen Motor 911 vorgesehen ist, sind strangabwärts am Biomolekül 109 gebunden. Der Einführungsstrang 904 ist strangabwärts am zweiten Kontrollstrang 1011 verbunden.
Das Biomolekül 901 wird aus einer zu prüfenden lebenden Zelle extrahiert. Der erste Kontrollstrang 111, die Molekülmotor-Bindungsstelle 902 und der zweite Kontrollstrang 1011, der mit dem Einführungsstrang 904 verbunden ist, werden an das Biomolekül 901 gebunden und anschließend wird das Biomolekül 109 gewonnen. Sodann wird das gewonnene Biomolekül 109 in den Flüssigkeitsbehälter 104A in Kontakt mit dem Dünnfilm 102 eingeführt. Wenn eine Spannung an den Dünnfilm 102 angelegt wird, wird das Biomolekül 109 in die Nanopore 101, ausgehend vom Einführungsstrang 904 aus, eingeführt. Somit beginnt gemäß Darstellung in 10B die Dissoziation der doppelsträngigen Struktur des Einführungsstrangs 904.
Nachdem die Dissoziation des Einführungsstrangs 904 beendet ist und der zweite molekulare Motor 911 die Nanopore 101 erreicht hat, kommt der zweite molekulare Motor 911, der aus einer Helicase besteht, in Kontakt mit dem komplementären Strang des Genomfragments 901. Somit beginnt gemäß Darstellung in 10C die Dissoziation und Zersetzung des komplementären Strangs des Genomfragments 901. Wenn die Dissoziation oder die Zersetzung des komplementären Strangs des Genomfragments 901 beendet ist, wird der molekulare Motor 911 aus dem Genomfragment 901 freigesetzt.
Wenn die Zersetzung oder die Dissoziation des Genomfragments 901 beendet ist, erreicht der erste molekulare Motor 110, der aus einer Polymerase besteht, die Nanopore 101, wie in 10D dargestellt ist. Somit kann ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform die Extensionsreaktion durch Kontakt mit dem Primer 112 und dem ersten molekularen Motor 110 einsetzen, und die Analyse des einzelsträngigen Genomfragments 901 kann beginnen.
Wie vorstehend ausgeführt, ist es gemäß der dritten Ausführungsform möglich, die Dissoziation des Genomfragments 901, bei dem es sich um eine doppelsträngige DNA handelt, durch den zweiten molekularen Motor 911 zu beginnen, nachdem die Dissoziation des eingeführten Strangs 904 beendet ist. Somit ist es möglich, rasch und genau mit dem Nanoporenverfahren die doppelsträngige DNA zu analysieren.
Vierte Ausführungsform
Nachstehend wird eine Biomolekül-Analysenvorrichtung gemäß einer vierten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf 11A beschrieben. Da die Gesamtkonfiguration der Biomolekül-Analysenvorrichtung der vierten Ausführungsform ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform ist, werden Wiederholungen in der Beschreibung vermieden. Bei der vierten Ausführungsform unterscheidet sich die Zusammensetzung des zu messenden Biomoleküls von der in der ersten Ausführungsform. In 11A werden gleiche Konfigurationen, die denen des Biomoleküls in der vierten Ausführungsform entsprechen, mit den gleichen Bezugszeichen wie in 1 bezeichnet. Wiederholungen in der Beschreibung werden vermieden.
Bei der vierten Ausführungsform wird eine Molekülmotor-Bindungsstelle 116 mit einem Ende des zu messenden doppelsträngigen Genomfragments 901 verbunden, und ein Einführungsstrang 1102 wird mit dem anderen Ende der Molekülmotor-Bindungsstelle 116 verbunden. Die Molekülmotor-Bindungsstelle 116 enthält einen molekularen Motor 1101, der aus einer Helicase besteht. Dies stellt einen Unterschied zu den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen dar, bei denen der molekulare Motor aus einer Polymerase besteht. Im Unterschied zu einer Polymerase kann ein molekularer Motor, der aus einer Helicase besteht, die Dissoziation eines doppelsträngigen Biomoleküls unter Bildung einer einzelsträngigen Struktur bewirken. Der aus einer Helicase bestehende molekulare Motor 1101 wird an einen einzelsträngigen Bereich des Kontrollstrangs an der Molekülmotor-Bindungsstelle 116 gebunden. Der Einführungsstrang 1102 weist ein vorstehendes Ende 1103 auf. Ein Spacer wird als vorstehendes Ende 1103 an Stelle eines Einzelstrangs verwendet.
Nachstehend wird im Rahmen der vierten Ausführungsform ein Verfahren zur Einführung des Genomfragments 901 in die Nanopore 101 unter Bezugnahme auf die 11B und 11C beschrieben. Zunächst wird das Genomfragment 901 aus einer Zelle mit dem zu messenden Genom extrahiert und gereinigt. Sodann wird eine Molekülmotor-Bindungsstelle 116, an die der Einführungsstrang 1102 gebunden ist, damit verbunden. Es ist darauf hinzuweisen, dass eine Stelle, die zur Bindung an einen Mechanismus, z.B. an Kügelchen, zum Extrahieren eines Biomoleküls befähigt ist, an ein Ende des Genomfragments 901 gegenüber der Seite, an der die Molekülmotor-Bindungsstelle 116 gebunden ist, befähigt ist.
Nach dem Abschneiden des Mechanismus zur Extraktion des Genomfragments 901 wird das extrahierte Genomfragment 901 in eine Messlösung in Kontakt mit dem Dünnfilm 102, der die Nanopore 101 aufweist, gebracht. Wenn bei der Vorrichtung von 1 oder 7 eine Spannung zwischen den Elektroden 105A und 105B angelegt wird, wird der Einführungsstrang 1102 des Genomfragments 901 in die Nanopore 101 eingeführt. Wenn der Einführungsstrang 1102 gemäß Darstellung in 11B in die Nanopore 101 eingeführt wird, beginnt die Dissoziation des komplementären Strangs der doppelsträngigen Region. Wenn die Dissoziation des komplementären Strangs beendet ist und der molekulare Motor 1101, der aus einer Helicase besteht, die Nanopore 101 erreicht, kommt der molekulare Motor 1101 in Kontakt mit einem Ende des Genomfragments 901. Somit beginnt die Dissoziation des komplementären Strangs durch die Helicase, und aus dem Genomfragment 901 entsteht ein Einzelstrang, der die Nanopore 101 passieren kann. Demzufolge wird das Genomfragment 901 ins Innere der Nanopore 101 transportiert, und die Analyse des Genomfragments 901 durch das Nanoporenverfahren beginnt.
Fünfte Ausführungsform
Nachstehend wird eine Biomolekül-Analysenvorrichtung gemäß einer fünften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die 12 und 13 beschrieben. Da die Gesamtkonfiguration der Biomolekül-Analysenvorrichtung bei der fünften Ausführungsform ähnlich wie bei der ersten Ausführungsform ist, werden Wiederholungen in der Beschreibung vermieden.
Bei der fünften Ausführungsform unterscheidet sich die Zusammensetzung des zu messenden Biomoleküls und der Betrieb der Vorrichtung von denen der ersten Ausführungsform. Bei der fünften Ausführungsform ist zur Verbesserung der Genauigkeit der Analyse des Biomoleküls das Biomolekül so aufgebaut, dass eine pendelartige Steuerung zur wiederholten Analyse des Biomoleküls erreicht werden kann. Dabei bezieht sich die pendelartige Steuerung auf eine Steuerung, bei der das Biomolekül 109 sich in der Nanopore 101 mehrmals nach oben und nach unten bewegt, um eine wiederholte Messung eines einzigen Biomoleküls 109 zu ermöglichen.
Ferner ist die Biomolekül-Analysenvorrichtung so aufgebaut, dass das Anlegen einer Spannung eine derartige pendelartige Steuerung ermöglicht. Speziell wird die pendelartige Steuerung durch Bindung von Stoppermolekülen 1201 und 1202 an beide Enden des Biomoleküls 109 ermöglicht, wobei diese Moleküle größer sind als die Nanopore 101. Es ist möglich, das gleiche Biomolekül wiederholt zu messen, indem man die pendelartige Steuerung vornimmt. Dadurch ist es möglich, die Messgenauigkeit zu verbessern.
Das Verfahren zum Analysieren eines Biomoleküls durch pendelartige Steuerung bei der fünften Ausführungsform wird nachstehend unter Bezugnahme auf 12 beschrieben. Die pendelartige Analyse durch pendelartige Steuerung wird erreicht, indem man das Biomolekül 109 in der Nähe der Nanopore 101 einfängt und wiederholt die Polarität der angelegten Spannung umkehrt, um eine pendelartige Bewegung auszuführen.
Zunächst wird gemäß Darstellung in 12 (a) ein erstes Stoppermolekül 1201 an ein Ende des zu messenden Biomoleküls 109 durch den Kontrollstrang 111 gebunden und im ersten Flüssigkeitsbehälter 104A eingeschlossen.
Wenn anschließend gemäß Darstellung in 12 (b) eine erste Spannung (V1) zwischen den Elektroden 105A und 105B angelegt wird, wird das Biomolekül 109 durch Elektrophorese in die Nanopore 101 eingeführt (hindurchgeführt). Da die Größe des ersten Stoppermoleküls 1201 größer als der Durchmesser der Nanopore 101 ist, ist es dem ersten Stoppermolekül 1201 nicht möglich durch die Nanopore 101 hindurchzutreten, und das Biomolekül 109 wird in der Nanopore 101 eingefangen.
Wenn das Biomolekül 109 durch die Nanopore 101 hindurchtritt, wie auf der rechten Seite von 12 (b) dargestellt ist, wird ein zweites Stoppermolekül 1202, das sich im zweiten Flüssigkeitsbehälter 104B befindet, an das andere Ende des Biomoleküls 109 gebunden. Auf diese Weise wird das Biomolekül 109 mit dem ersten Stoppermolekül 1201 und dem zweiten Stoppermolekül 1202 verbunden, wobei sich beide Enden des Biomoleküls 109 auf den beiden Seiten des Dünnfilms 102 befinden, so dass das Biomolekül 109 innerhalb der Nanopore 101 zwischen dem ersten Stoppermolekül 1201 und dem zweiten Stoppermolekül 1202 eine pendelartige Hin- und Herbewegung ausführen kann.
Wenn das Biomolekül 109 durch die Nanopore 101 hindurchtritt und beide Enden mit dem ersten und zweiten Stoppermolekül 1201 und 1202 verbunden sind, wird anschließend eine Primerbindungsstelle mit einem molekularen Motor 110 an das Biomolekül 109 gebunden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es einfach ist, den Primer 112 an den molekularen Motor 110 im Kontrollstrang 111 durch Umkehren der Polarität der ersten Spannung V1 zu binden.
Wenn anschließend gemäß Darstellung in 12 (c) eine zweite Spannung V2 zwischen den Elektroden 105A und 105B an Stelle der ersten Spannung V1 angelegt wird und der molekulare Motor 110 die Nanopore 101 erreicht, kommen der molekulare Motor 110 und der Primer 112 im Kontrollstrang 111 in Kontakt miteinander. Somit beginnt die Extensionsreaktion des Biomoleküls 109, und das Biomolekül wird auf ähnliche Weise wie bei der ersten Ausführungsform analysiert. Wenn die Extensionsreaktion bis zum Ende des Biomoleküls 109 fortschreitet, wird der molekulare Motor 110 vom Biomolekül 109 gelöst (vergleiche die rechte Seite von 12 (c)).
Wenn anschließend gemäß Darstellung in 12 (d) eine dritte Spannung V3 an Stelle der zweiten Spannung V2 angelegt wird, wird der komplementäre Strang 109C des durch den molekularen Motor 110 synthetisierten Biomoleküls 109 durch die Wirkung der Spannung V3 einer Reißverschlussöffnung unterzogen und vom Biomolekül 109 freigesetzt.
Wenn anschließend gemäß Darstellung in 12 (e) eine vierte Spannung V4, die sich von der dritten Spannung V3 unterscheidet, an Stelle der dritten Spannung V3 angelegt wird, werden der Primer 112 und der molekulare Motor 110 an den Kontrollstrang 111 gebunden, und somit kehrt das Biomolekül 109 in den in 12 (b) dargestellten Zustand zurück. Sodann wird die Messung des Biomoleküls 109 erneut durch Anlegen der zweiten Spannung V2 wiederholt.
Nach einer ausreichenden Anzahl von Wiederholungsmessungen für ein Biomolekül 109 wird eine fünfte Spannung V5 zwischen den Elektroden 105A und 105B an Stelle der vierten Spannung V4 angelegt, wie in 12 (f) dargestellt ist. Dabei werden das erste Stoppermolekül 1201 oder das zweite Stoppermolekül 1202 vom Biomolekül 109 abgetrennt. Die vorstehend beschriebene Messung kann für ein neues Biomolekül, das sich vom Biomolekül 109, dessen Messung beendet ist, unterscheidet, gestartet werden. Dabei handelt es sich bei der fünften Spannung V5 um eine Spannung, die zur Erzeugung eines elektrischen Felds befähigt ist, dessen Kraft größer als die Kraft der Bindungsstelle zwischen den Stoppermolekülen 1201 und 1202 und dem Biomolekül 109 ist. Wenn beispielsweise eine Bindung durch Streptavidin und Biotin herangezogen wird, kann ein Schneidevorgang vorgenommen werden, wenn eine Spannung von 800 mV im Fall der Verwendung einer Nanopore mit einer Filmdicke von 7 nm angelegt wird.
13 ist ein Diagramm zur Darstellung der Veränderung der Wellenform eines Signals, das erhalten wird, wenn die Stufen in 12 (a) bis 12 (f) durchgeführt werden, und einer Veränderung in der Wellenform der angelegten Spannung. In 13 wird eine ähnliche Spannungswellenform wiederholt vorgenommen. Wenn eine derartige Spannungswellenform wiederholt vorgenommen wird, lassen sich als Ergebnis mehrere Signalgruppen erhalten, wodurch es möglich ist, die Genauigkeit der Messung für das zu messende Biomolekül 109 zu verbessern. Es ist darauf hinzuweisen, dass die Signalgruppe ein Signal, das sich vom Biomolekül ableitet, und ein Signal für die Feststellung, dass die Transportsteuerung beendet ist, umfasst.
Der Rechner 108 erfasst den durch das Amperemeter 106 ermittelten Stromwert. Wenn ein vorgegebener Strom oder eine dem Strom entsprechende Spannung festgestellt werden, wird die zwischen den Elektroden 105A und 105B angelegte Spannung mit dem erfassten Wert als Trigger umgeschaltet (V1 → V2 → V3 → V4).
Wenn beispielsweise gemäß 13 in einer Signalgruppe (m) die zweite Spannung V2 angelegt wird, wird ein Signal 1211, das sich vom zu analysierenden Biomolekül 109 ableitet, erhalten. Beim Signal 1211 handelt es sich um ein Signal, das entsprechend der Sequenz und dergleichen der Nucleinsäuren des Biomoleküls 109 vibriert.
Wenn sich anschließend das Biomolekül 109 bewegt und die Analyse bis zum Ende des Biomoleküls 109 gekommen ist, endet die Vibration des Signals 1211 auf der Grundlage der Basensequenz, und es ergibt sich eine im Wesentlichen konstante Spannung 1212. Wenn der Rechner 108 die zuvor gegebene Spannung 1212 erfasst, schaltet der Rechner 108 die Spannung von der zweiten Spannung V2 auf die dritte Spannung V3 um, bei der es sich um die Spannung zum Zurückführen des Biomoleküls 109 in die Anfangsposition handelt. Auch beim Vorgang der Rückkehr des Biomoleküls 109 in die anfängliche Position variiert der vom Amperemeter 106 erfasste Stromwert je nach der Struktur des Biomoleküls 109. Wenn der Stromwert sich bei einem vorgegebenen Wert beruhigt, ist dies das Zeichen dafür, dass die Rückkehr zur anfänglichen Position beendet ist. Die angelegte Spannung V3 wird auf die vierte Spannung V4 mit entgegengesetzten Eigenschaften umgeschaltet. Somit werden der Primer 112 und der molekulare Motor 110 erneut an das Biomolekül 109 gebunden. Die erneute Messung des Biomoleküls 109 beginnt, und eine Signalgruppe (m+1) wird erhalten. Wenn die Messung des Biomoleküls 109 für eine Mehrzahl von Vorgängen (Faktor n) beendet ist, wird die fünfte Spannung V5 angelegt, und die Messung von einem Biomolekül 109 ist beendet.
Wie vorstehend ausgeführt, lässt sich das Biomolekül 109 beispielsweise durch Extraktion des Biomoleküls aus einer Zellflüssigkeit des Zielorganismus extrahieren. Nach der Extraktion wird das Biomolekül 109 an den Kontrollstrang 111 gebunden und gewonnen. Es ist üblich, für die Gewinnung Kügelchen zu verwenden, und die Oberfläche der Kügelchen wird mit einem Molekül modifiziert, das zur Bindung an einen Kontrollstrang, der mit einem Molekül modifiziert ist, befähigt ist. Als Stoppermoleküle 1201 und 1202, die vorstehend beschrieben wurden, können die Kügelchen selbst zur Gewinnung des Kontrollstrang-Bindungsmoleküls verwendet werden. Alternativ ist es auch möglich, eine Messung nach einem Verfahren durchzuführen, bei dem das Biomolekül nach Gewinnung mit Kügelchen entfernt und erneut das Stoppermolekül gebunden wird.
Vorstehend wurden mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben, jedoch stellen diese Ausführungsformen lediglich Beispiele dar und stellen keine Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung dar. Die neuartigen Ausführungsformen könne auch in verschiedenen anderen Formen realisiert werden, und es können verschiedene Weglassungen, Ergänzungen und Veränderungen vorgenommen werden, ohne dass vom Geist der Erfindung abgewichen wird. Die Ausführungsformen und deren Modifikationen fallen unter den Schutzumfang und den Geist der Erfindung und somit unter die in den Patentansprüchen beschriebene Erfindung und unter die entsprechenden Äquivalente davon.
Bezugszeichenliste

100, 700: Biomolekül-Analysenvorrichtung
101: Nanopore
102: Dünnfilm

103: Elektrolytlösung
104A, 104B: Flüssigkeitsbehälter
105A: erste Elektrode
105B: zweite Elektrode
106: Amperemeter
107: Spannungsquelle
108: Rechner
109: Biomolekül (DNA-Stränge und dergleichen)
110, 911, 1101: molekularer Motor
111, 1011: Kontrollstrang
112: Primer
113, 113': Spacer
116, 902: Molekülmotor-Bindungsstelle
901: Genomfragment
903, 1103: vorstehendes Ende
1201, 1202: Stoppermolekül
904, 1102: Einführungsstrang

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Gerald M. Cherf et al., Nat. Biotechnol. 2012 [0008]
Diehl et al. Nature Methods, 2006, 3(7): 551-559 [0054]
„Scientific Reports 4, 5000, 2014, Akahori et al.‟, „Nanotechnology 25 (27): 275501, 2014, Yanagi et al.“, „Scientific Reports, 5, 14656, 2015, Goto et al.“ und „Scientific Reports 5, 16640, 2015 [0059]
A. J. Storm et al., Nat. Mat. 2 (2003 [0074]

Claims

Biomolekül-Analysenvorrichtung, umfassend: einen Dünnfilm mit einer Nanopore; einen Flüssigkeitsbehälter, der in Kontakt mit dem Dünnfilm angeordnet ist und eine Elektrolytlösung enthält; eine Elektrode in Kontakt mit dem Flüssigkeitsbehälter; eine mit der Elektrode verbundene Messvorrichtung; und eine Steuervorrichtung, die eine an die Elektrode anzulegende Spannung entsprechend einem Messergebnis der Messvorrichtung steuert; wobei ein Biomolekül in die Elektrolytlösung gegeben wird, ein Kontrollstrang und ein molekularer Motor mit einem ersten Endbereich des Biomoleküls verbunden werden und der Kontrollstrang an einen Primer an einer stromaufwärtigen Stelle des Kontrollstrangs gebunden wird und einen Spacer an einer strangabwärtigen Stelle des Kontrollstrangs aufweist.
Biomolekül-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei eine Abmessung des molekularen Motors größer als die Größe der Nanopore ist.
Biomolekül-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Biomolekül ferner einen Einführungsstrang zum Einführen in die Nanopore an einem zweiten Endbereich des Biomoleküls aufweist und dieser Einführungsstrang eine doppelsträngige Struktur an mindestens einem Endbereich an einer Seite des Biomoleküls aufweist und eine einzelsträngige Struktur an einem Endbereich an der gegenüberliegenden Seite des Biomoleküls aufweist.
Biomolekül-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der erste Endbereich des Biomoleküls mit dem Kontrollstrang und dem molekularen Motor als erstem molekularem Motor verbunden ist. ein zweiter Endbereich des Biomoleküls, der sich vom ersten Endbereich unterscheidet, mit einem zweiten molekularen Motor, der sich vom ersten molekularen Motor unterscheidet, verbunden ist, der erste molekulare Motor über den Primer und den Spacer als ersten Spacer angeordnet ist und der zweite molekulare Motor über das Biomolekül und einen zweiten Primer angeordnet ist.
Biomolekül-Analysenvorrichtung nach Anspruch 4, wobei es sich beim ersten molekularen Motor um eine Polymerase und beim zweiten molekularen Motor um eine Helicase handelt.
Biomolekül-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Stoppermoleküle ferner mit beiden Enden des Biomoleküls verbunden sind und die Abmessungen der Stoppermoleküle größer als die Größe der Nanopore sind.
Biomolekül-Analysenvorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Flüssigkeitsbehälter einen ersten Flüssigkeitsbehälter umfasst, der sich auf einer ersten Oberflächenseite des Dünnfilms befindet, sowie einen zweiten Flüssigkeitsbehälter, der sich an einer zweiten Oberflächenseite des Dünnfilms befindet, wobei der zweite Flüssigkeitsbehälter durch eine Trennwand in einer Mehrzahl von Flüssigkeitsbehältern unterteilt ist, und wobei die Biomolekül-Analysenvorrichtung eine erste Elektrode, die im ersten Flüssigkeitsbehälter bereitgestellt ist; und eine zweite Elektrode umfasst, die in den einzelnen Flüssigkeitsbehältern, die durch Unterteilung des zweiten Flüssigkeitsbehälters erhalten worden sind, bereitgestellt ist.
Biomolekül-Analysenverfahren zum Analysieren eines Biomoleküls, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Einführen des Biomoleküls in einen Flüssigkeitsbehälter, wobei das Biomolekül einen ersten Endbereich umfasst, der mit einem Kontrollstrang und einem molekularen Motor verbunden ist, wobei der Kontrollstrang an einen Primer an einer strangaufwärtigen Seite gebunden ist und einen Spacer an einer stromabwärtigen Seite aufweist, wobei der Flüssigkeitsbehälter in Kontakt mit dem Dünnfilm angeordnet ist und eine Elektrolytlösung enthält, und wobei der Dünnfilm eine Nanopore aufweist; das Anlegen einer Spannung an den Flüssigkeitsbehälter und das Einführen des Biomoleküls in die Nanopore; das Inkontaktbringen des Primers mit dem molekularen Motor in dem Biomolekül, das in die Nanopore eingeführt worden ist; das Transportieren des Biomoleküls in der Nanopore durch eine Synthesereaktion des Biomoleküls nach Kontakt zwischen dem Primer und dem molekularen Motor; und das Messen einer Veränderung eines Stroms, der während des Transports in der Nanopore fließt.
Biomolekül-Analysenverfahren nach Anspruch 8, ferner umfassend: das Verbinden eines Einführungsstrangs für das Einführen in die Nanopore mit einem zweiten Endbereich des Biomoleküls, wobei der Einführungsstrang eine doppelsträngige Struktur an mindestens einem Endbereich an einer Seite des Biomoleküls aufweist und eine einzelsträngige Struktur an einem Endbereich an einer gegenüberliegenden Seite des Biomoleküls aufweist; und das Einführen der einzelsträngigen Struktur des Einführungsstrangs in die Nanopore und das reißverschlussartige Öffnen der doppelsträngigen Struktur des Biomoleküls, um eine einzelsträngige Struktur zu erhalten.
Biomolekül-Analysenverfahren nach Anspruch 8, wobei der erste Endbereich des Biomoleküls mit dem Kontrollstrang und dem molekularen Motor als erstem molekularen Motor verbunden ist, wobei ein zweiter Endbereich des Biomoleküls mit einem zweiten molekularen Motor, der sich vom ersten molekularen Motor unterscheidet, verbunden ist, wobei der erste molekulare Motor über den Primer und Spacer als erstem Spacer angeordnet ist, und wobei der zweite molekulare Spacer über das Biomolekül und einem zweiten Spacer angeordnet ist.
Biomolekül-Analysenverfahren nach Anspruch 10, ferner umfassend: das Dissoziieren des komplementären Strangs des Biomoleküls durch den zweiten molekularen Motor, wobei der erste molekulare Motor das Biomolekül nach Dissoziation des komplementären Strangs durch den zweiten molekularen Motor auf der Grundlage des Primers synthetisiert.
Biomolekül-Analysenverfahren nach Anspruch 10, wobei es sich beim ersten molekularen Motor um eine Polymerase handelt und wobei es sich beim zweiten molekularen Motor um eine Helicase handelt.
Biomolekül-Analysenverfahren nach Anspruch 8, wobei ein erstes Stoppermolekül und ein zweites Stoppermolekül ferner mit beiden Enden des Biomoleküls verbunden sind, und wobei die Abmessungen des ersten und des zweiten Stoppermoleküls größer als die Größe der Nanopore sind.
Biomolekül-Analysenverfahren zum Analysieren eines Biomoleküls, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Verbinden eines Kontrollstrangs mit einem ersten Endbereich des Biomoleküls mit einer doppelsträngigen Struktur und das Verbinden eines Einführungsstrangs mit einem Endbereich des Kontrollstrangs an der gegenüberliegenden Seite des Biomoleküls, wobei der Kontrollstrang einen molekularen Motor und einen Spacer zwischen dem molekularen Motor und dem Biomolekül umfasst und der Einführungsstrang eine doppelsträngige Struktur aufweist; das Einführen des Biomoleküls in einen Flüssigkeitsbehälter, der in Kontakt mit einem Dünnfilm angeordnet ist und eine Elektrolytlösung enthält, wobei der Dünnfilm eine Nanopore aufweist; das Anlegen einer Spannung an den Flüssigkeitsbehälter und das Einführen des Einführungsstrangs in die Nanopore, um die doppelsträngige Struktur des Einführungsstrangs zu dissoziieren; das Einleiten der Dissoziation der doppelsträngigen Struktur des Biomoleküls, indem ein komplementärer Strang des Biomoleküls in Kontakt mit dem molekularen Motor nach der Dissoziation der doppelsträngigen Struktur des Einführungsstrangs gebracht wird; das Transportieren des Biomoleküls in die Nanopore durch eine Dissoziationsreaktion des Biomoleküls; und das Messen einer Veränderung eines in der Nanopore während des Transports fließenden Stroms.