WO2021124468A1 - 分子複合体、および生体ポリマ分析方法 - Google Patents

分子複合体、および生体ポリマ分析方法 Download PDF

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WO2021124468A1
WO2021124468A1 PCT/JP2019/049521 JP2019049521W WO2021124468A1 WO 2021124468 A1 WO2021124468 A1 WO 2021124468A1 JP 2019049521 W JP2019049521 W JP 2019049521W WO 2021124468 A1 WO2021124468 A1 WO 2021124468A1
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nanopore
dna
strand
molecular complex
biological polymer
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PCT/JP2019/049521
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佑介 後藤
玲奈 赤堀
満 藤岡
周志 隅田
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株式会社日立ハイテク
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the present disclosure relates to molecular complexes and biopolymer analysis methods.
  • a solution containing an electrolyte is contacted with pores (hereinafter referred to as nanopores) having a diameter of several ⁇ to several nm embedded in a thin film having a thickness of several ⁇ to several tens of nm, and a potential difference is created between both ends of this thin film.
  • nanopores pores
  • the nanopore can be passed through a solution containing an electrolyte.
  • the electrical characteristics around the nanopore, particularly the resistance value change. Therefore, it is possible to detect the object to be measured by detecting the change in the electrical characteristics. ..
  • the object to be measured is a biological polymer
  • the electrical characteristics of the periphery of the nanopore change in a pattern according to the monoma arrangement pattern of the biological polymer.
  • a method for performing monoma sequence analysis of a biological polymer using this has been actively studied.
  • the biological polyma When the biological polyma is DNA, it is a DNA base sequence analysis system (DNA sequencer), and when the biological polyma is a protein, it is an amino acid sequence analysis system (amino acid sequencer), and each can decode a much longer sequence length than before. It is expected as a system. In particular, research and development to put nanopores into practical use as a DNA sequencer using the blockage current method is active.
  • DNA sequencer DNA base sequence analysis system
  • amino acid sequencer amino acid sequence analysis system
  • bio-nanopores that use proteins with pores in the center embedded in the lipid bilayer membrane
  • solid nanopores that have pores processed into an insulating thin film formed by a semiconductor processing process.
  • bio-nanopore the amount of change in ion current is measured using the pores (diameter 1.2 nm, thickness 0.6 nm) of modified proteins (Mycobacterium smegmatis porin A (MspA), etc.) embedded in the lipid bilayer as the biopolyma detector. Measure.
  • the solid pore a structure in which nanopores are formed on a thin film of silicon nitride (SiN), which is a semiconductor material, or a thin film made of a monolayer such as graphene or molybdenum disulfide is used as a device.
  • SiN silicon nitride
  • a thin film made of a monolayer such as graphene or molybdenum disulfide is used as a device.
  • a device composed of a nanopore device, a solution containing a measurement object and an electrolyte, and a pair of electrodes sandwiching the nanopore device is used as a basic unit.
  • a material that enables an electron transfer reaction with an electrolyte in a solution (which can perform an electrochemical oxidation-reduction reaction) is typically used for the electrode.
  • silver / silver silver chloride electrodes are often used because of their electrochemical potential stability and high reliability.
  • the potassium chloride aqueous solution under neutral pH is most typically used as the electrolyte.
  • Non-Patent Document 1 Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, and Patent Document 1.
  • the nanopore DNA sequencer is required to precisely transport and control DNA strands.
  • it is known to drive an enzyme as a molecular motor.
  • an enzyme as a molecular motor.
  • a DNA polymerase undergoes an extension reaction or when a DNA helicase reacts to break a single strand of a double-stranded DNA
  • the power controlled by a molecular motor is used to obtain a single-stranded DNA as a template.
  • the transport control of DNA passing through the nanopore is performed by shifting the position by one base.
  • DNA polymerase binds a primer to a template DNA, passes a single-stranded portion through a nanopore, and the polymerase binds to the primer terminal to cause an extension reaction.
  • Non-Patent Document 4 Non-Patent Document 5, Patent Document 2, Patent Document 3, Patent Document 4, and Patent Document 5.
  • the reading accuracy when the sequence is estimated by using a certain algorithm from the pattern change of the obtained feature amount is conventionally obtained.
  • the reading accuracy of a conventional DNA sequencer is 99% or more per read, but the reading accuracy of a nanopore DNA sequencer is known to be about 80-95% per read (for example, non-read). See Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 7 a method of performing an RCA reaction during nanopore measurement has been attempted.
  • a pre-circulated DNA strand is hybridized with a DNA strand (primer) having a simple complementary sequence, and the RCA method is used with the primer as a starting point until a single-strand protruding DNA strand is generated.
  • the extension reaction is stopped once, then the above-mentioned single-stranded DNA strand is introduced into the nanopore, and then the extension reaction is restarted by adding a reagent for the extension reaction. ..
  • the above-mentioned RCA method and the method performed while measuring nanopores require various complicated procedures. Since a simple primer is used, first, in order to induce the DNA strand into the nanopore, the single-strand protruding DNA strand is once extended by the RCA method so that the nanopore can be introduced, and then a stop reaction is performed. It is generated by things. This termination reaction generally requires inactivating the DNA polymerase reaction, typically heating or adding a denaturing reagent. This process is usually an irreversible phenomenon that causes protein denaturation, and it is necessary to re-add new DNA polymerase later.
  • the stop reaction is generally a random phenomenon, and it is difficult to make the extended base lengths uniform and stop, and as a result, the start sequence points of the sequence in the subsequent process become disjointed.
  • the strand substitution activity of DNA polymerase is used for double-stranded DNA in order to carry out the loop extension reaction, but this loop reaction is stopped when the strand substitution activity of DNA polymerase is inactivated.
  • the present disclosure provides a technique for improving the necessity of complicated processing, the difficulty of handling, and the difficulty of precise sequencing in performing repeated reading.
  • a molecular complex having a single-stranded protruding double-stranded DNA which comprises a biological polymer, a nanopore-introduced strand, and the like. It includes a primer shorter than the biological polymer, a DNA polymerase bound to the three ends of the primer, a spacer that stops the extension reaction of the DNA polymerase, and a control strand, and the DNA polymerase is bound in the vicinity of the spacer.
  • a molecular complex having a single-stranded protruding double-stranded DNA, which comprises a biological polymer, a nanopore-introduced strand, and the like. It includes a primer shorter than the biological polymer, a DNA polymerase bound to the three ends of the primer, a spacer that stops the extension reaction of the DNA polymerase, and a control strand, and the DNA polymerase is bound in the vicinity of the spacer.
  • the biopolymer analysis device used for analyzing a biopolymer composed of nucleic acids and the like has a different composition depending on the method for introducing the biopolymer into the nanopore, but here, as an example, particularly when the biopolymer is introduced into the nanopore by electrophoresis. Describe about.
  • the biological polymer analysis device 100 includes a first liquid tank 104A and a second liquid tank 104B, each of which is filled with an electrolyte solution, and a first and second liquid tanks 104A and 104B. It is composed of a thin film 102 for partitioning the above, and first and second electrodes 105A and 105B provided in the first and second liquid tanks 104A and 104B.
  • the biological polymer analysis device 100 can also be configured as an array device.
  • the array device refers to a device including a plurality of sets of liquid chambers partitioned by the thin film 102.
  • the first liquid tank 104A is a common tank
  • the second liquid tank 104B is a plurality of individual tanks.
  • the array device can be configured by arranging the electrodes in each of the common tank and the individual tank.
  • the biopolymer analyzer 10 transmits the biopolymer analysis device 100, the electrodes 105A and 105B provided in the biopolymer analysis device 100, and the ion current (blocking signal) flowing between the electrodes 105A and 105B.
  • the measuring unit 108 to be measured is included, and the monoma sequence information of the biological polyma is acquired based on the measured value of the ion current (blocking signal) (the measuring unit 108 may be configured by, for example, a computer). it can).
  • the biological polymer analyzer 10 can obtain information on the biological polymer by acquiring a tunnel current and detecting a change in transistor characteristics by providing an electrode in the nanopore.
  • the configuration for acquiring the monoma sequence information in the biological polymer based on the electrical signal is shown, but the configuration may be such that the monoma sequence information in the biological polymer is acquired based on the optical signal. That is, the monoma sequence is labeled with a characteristic fluorescence wavelength for each monoma, and a method of determining each monoma sequence by measuring the fluorescence signal may be used.
  • the biological polymer refers to DNA or RNA having a nucleic acid as a monoma, or a polypeptide having an amino acid as a monoma.
  • the transport control in this embodiment is mainly performed by a molecular motor using DNA polymerase. Transport control by DNA polymerase needs to be initiated only near the nanopores. In order to realize this, it is desirable to have a molecular complex as shown in FIG.
  • the above-mentioned molecular complex has the characteristics of satisfying the following (a) to (d).
  • (A) The 5-terminal portion of the spacer is connected to the 3-terminal portion of the biological polymer to be read, and the 5-terminal portion of the control chain is connected to the 3-terminal portion of the spacer;
  • (B) A primer having a complementary sequence of the control strand forms a double-stranded structure complementary to the control strand;
  • the 3-terminal portion of the nanopore-introduced chain is linked to the 5-terminal portion of the primer;
  • D) A DNA polymerase (molecular motor) is bound near the three ends of the primer.
  • the biological polymer to be read is the main chain of DNA, and the DNA sequence serving as a primer is contained in the main chain.
  • a primer refers to a DNA sequence that is a complementary strand of a control strand.
  • the spacer has a role as a switch that controls the reaction of the molecular motor, and normally stops the reaction of the molecular motor, but it starts the reaction of the molecular motor when the measurement by the nanopore, that is, the force by the voltage is applied. It has a function to make it.
  • the spacer is preferably debased, and examples thereof include Spacer C3 (iSpC3), Hexanediol, Spacer 9, Spacer 18, dSpacer and the like. In particular, it is desirable that Spacer C3 is continuously introduced for 4 mer or more.
  • the biological polymer has a single-stranded pop-out consisting of a main-chain DNA (template) to be read and a complementary-strand DNA (primer) shorter than the main-chain DNA.
  • a molecular motor forms a molecular complex in which the single-stranded portion and the double-stranded portion are bound near the boundary (see FIG. 2).
  • the enzyme used as a molecular motor refers to all enzymes having a binding ability to a biological polymer and capable of replicating and extending the biological polymer.
  • the biological polymer is DNA
  • DNA polymerase can be mentioned as a candidate.
  • the biological polymer is RNA
  • RNA polymerase and the like can be mentioned as candidates.
  • the dissociation step proceeds to the vicinity of the molecular motor coupling portion, the force of the molecular motor binding to the molecular complex is stronger than the above-mentioned dissociation force, so that the dissociation step by the electric field force is temporarily stopped here.
  • the molecular motor cannot pass through the nanopore because it is generally larger than the diameter of the nanopore.
  • the nanopore diameter is in the range of 0.8 nm, which is the lower limit that single-stranded DNA can pass through, and 3 nm, which is the upper limit value that the enzyme, which is a molecular motor, does not pass through.
  • the binding force of the molecular motor to the molecular complex needs to be stronger than the dissociating force due to the electric field force.
  • the electric field force generated in the vicinity of the nanopore triggers the molecular motor staying in the vicinity of the nanopore to jump over the spacer, so that the extension / dissociation reaction of the complementary sequence of the biological polymer is started from the three ends of the primer.
  • the molecular motor advances the 1-base extension reaction
  • the double-strand dissociation step from the control strand side is advanced by 1 base, and "nanopore-introduced strand + primer + complementary sequence of biological polymer synthesized by DNA polymerase" is obtained.
  • Transport control is performed sequentially to the nanopores.
  • the biological polymer is analyzed from the change in the ionic current acquired at that time.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a state of driving a molecular motor.
  • step (a) the molecular complex bound to the molecular motor is electrophoretically guided from the 5-terminal portion of the nanopore-introduced chain into the inside of the nanopore.
  • step (b) the double-stranded structure is dissociated from the three-terminal portion of the control chain by the electric field force in the vicinity of the nanopore, and the dissociation step proceeds to the coupling point of the molecular motor.
  • step (c) the molecular motor jumps over the spacer and shifts to the extension reaction start position starting from the electric field force, so that the extension reaction start from the primer 3 terminal portion is induced, and the single base extension reaction starts first.
  • step (d) as the single base is extended from the primer portion, the double-stranded structure on the biological polymer side can be newly decomposed by one base, so that the double-stranded dissociation by the electric field force is separated by one base again. Will be.
  • the nanopore-introduced chain side is lowered by one base to the nanopore side by the electric field force, and the process proceeds to step (c) again.
  • the cycle of step (c) ⁇ step (d) is repeated until the elongation reaction of the molecular motor reaches the 5th end of the biological polymer.
  • step (e) with the completion of the elongation reaction, the molecular motor is detached from the molecular complex, and the DNA strand on the nanopore introduction strand side is completely passed through to the electric field application side on the nanopore side by the electric field force.
  • the complementary sequence of the biological polymer synthesized by DNA polymerase or RNA polymerase is lowered to the nanopore, and it is possible to acquire the base sequence information of the DNA part of the biological polymer accordingly. It becomes.
  • step (d) In order to realize such a step, it is necessary that the double-stranded dissociation rate due to the electric field force in step (d) is faster than the extension reaction rate by DNA polymerase or RNA polymerase in step (c) (transport rate is extended). Make it dependent on the degree of reaction). Under this condition, the extension reaction in step (c) becomes a rate-determining process, and transport control in units of one base can be realized. If the double-stranded dissociation rate due to the electric field force in step (d) is slower than the extension reaction rate by DNA polymerase or RNA polymerase in step (c), the extension reaction in step (c) is completed first. As a result, the transfer control for each base by the molecular motor is no longer performed (because the care goes on and on before dissociation, the transfer control for each base cannot be performed).
  • One of the characteristics of the operation of the molecular complex according to this embodiment is that the molecular motor always stays in the vicinity of the nanopore when the feature amount analysis of the biological polymer is performed. This is because, after the extension reaction is carried out from the primer, the double strand is immediately dissociated by the electric field force, and the elongated DNA strand is always pulled down to the nanopore.
  • FIG. 4 is a diagram showing a configuration example of a molecular complex when the biological polymer is a circular DNA strand.
  • the difference from the structure of the molecular complex in FIG. 1 is that the 5-terminal portion of the biological polymer is linked to the 3-terminal portion of the control strand to form a circular DNA strand.
  • the operating principle of the molecular complex when the biological polymer is a circular DNA strand is the same as that in FIG. The difference is that since the biological polymer has a cyclic chain, the operation of steps (c) and (d) is performed until the extension reaction of the molecular motor is stopped due to inactivation because the 5-terminal portion of the biological polymer does not exist. To keep looping.
  • a molecular complex By forming such a molecular complex, if a molecular complex is formed in advance, it can be controlled spontaneously and automatically by performing nanopore measurement, and the reaction start point can also be controlled. Precise sequencing can be performed.
  • the actual sample (target part) usually has a double-stranded structure, and rarely has a single-stranded DNA structure as shown in FIGS. 2 and 4. Therefore, it is necessary to form a molecular complex that enables the operation shown in FIGS. 3 and 5 even if the target portion has a double-stranded DNA structure.
  • the three end portions of the spacer are connected to the five end portions of the control chain 112
  • the three end portions of the adapter A are connected to the five end portions of the spacer
  • the control chain and the adapter A are complemented.
  • a composite adapter of a molecular complex is prepared in which a primer having a sequence and an adapter B form a double strand, and a three-terminal portion of a nanopore-introduced chain is linked to the five-terminal portion of the primer.
  • the molecular motor needs to be a DNA polymerase or RNA polymerase having a strand substitution activity.
  • the three ends of the spacer are connected to the five ends of the control chain
  • the three ends of the adapter A are connected to the five ends of the spacer
  • the adapter C is connected to the three ends of the control chain.
  • the primer having the complementary sequence of the control strand
  • the adapter B having the complementary sequences of the adapter A and the adapter C at the 5-terminal portion and the 3-terminal portion, respectively, forming a double strand, and at the 5-terminal portion of the primer.
  • the three ends of the nanopore-introduced strand are linked, and the adapter B has a non-complementary sequence in the control strand corresponding portion so as not to form a double strand with the control strand, and forms a hairpin structure in the control strand corresponding portion.
  • the adapter B has a non-complementary sequence in the control strand corresponding portion so as not to form a double strand with the control strand, and forms a hairpin structure in the control strand corresponding portion.
  • step (c) of this molecular complex it is necessary to carry out an extension reaction while dissociating the double-stranded structure of the biological polymer by the chain substitution activity of the molecular motor. Therefore, in this structure, the molecular motor needs to be a DNA polymerase or RNA polymerase having strand substitution activity.
  • the feature of this structure is that the three-terminal portion of the main chain of the biological polymer is connected to the five-terminal portion of the main chain of the biological polymer via a composite adapter.
  • the 3-terminal portion of the complementary strand of the biological polymer is connected to the 5-terminal portion of the complementary strand of the biological polymer via a composite adapter.
  • a composite adapter as shown in FIG.
  • the three ends of the spacer are connected to the five ends of the control chain
  • the three ends of the adapter A are connected to the five ends of the spacer
  • the five ends of the adapter C are connected to the three ends of the control chain.
  • the parts are connected.
  • the 5-terminal portion of the adapter A and the 3-terminal portion of the adapter C have sequences that are complementary strands to each other, and the primer having the complementary strands of the control strand and the complementary strand of the control strand, and the complementary sequence portions of the adapter A and the adapter C are respectively.
  • step (c) of this molecular complex it is necessary to carry out an extension reaction while dissociating the double-stranded structure of the biological polymer by the chain substitution activity of the molecular motor. Therefore, in this structure, the molecular motor needs to be a DNA polymerase or RNA polymerase having strand substitution activity.
  • a feature of this structure is that the three ends of the main chain of the biological polymer are connected to the five ends of the main chain of the biological polymer via a composite adapter. Similarly, the 3-terminal portion of the complementary strand of the biological polymer is connected to the 5-terminal portion of the complementary strand of the biological polymer via a composite adapter.
  • the higher the electrical conductivity of the electrolyte solution the greater the amount of ionic current signal changes, making it possible to measure at a high SN ratio. It becomes. Although it depends on the ionic transport number and the like, it is generally possible to increase the electrical conductivity of the electrolyte solution by increasing the ionic strength, that is, the salt concentration. Therefore, in the nanopore analysis, the measurement is performed under the highest possible salt concentration from the viewpoint of the SN ratio. In particular, in nanopore analysis, a 1 M (1 mol) concentration potassium chloride aqueous solution is often used, and a high salt concentration condition having an ionic strength of 3 M or more is used.
  • the maximum salt concentration is the saturation concentration, which is the upper limit at which the electrolyte can be dissolved.
  • a 3M concentration potassium chloride aqueous solution or the like can be used.
  • the ion species may be lithium ion, sodium ion, rubidium ion, cesium ion, ammonium ion, or the like, which are monovalent cations of alkali metals.
  • a typical example is DNA polymerase, which is an A-family polymerase.
  • BST Bacillus stearothermophilus
  • BST3.0 polymerase manufactured by New England Biolabs (NEB) is capable of an extension reaction even under extremely high salt concentration conditions of 3M concentration or higher, and can be used particularly in nanopore analysis.
  • Nippon Gene's Csa polymerase and 96-7 polymerase are capable of extension reaction even under high salt concentration conditions.
  • NTP analog refers to one in which each site of dNTP has a modified chemical structure.
  • NMP-PNP which is one of the NTP analogs, refers to a structure in which the five-membered ring sugar structure is ribose and the oxygen between ⁇ and ⁇ site phosphorus is replaced by NH.
  • N means N of nucleoside, and the actual reagent name uses the abbreviation of each base (A, G, T, C, U).
  • NMP-PNP The official name of NMP-PNP is, for example, Adenosine-5'-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate in the case of A, and NMP-PNP, NppNHp, etc. are used as trivial names.
  • NTP analog By using such an NTP analog, the molecular motor having high salt tolerance outputs a good signal.
  • NTP analogs have one of their chemical structures modified with respect to normal dNTPs, which affects the ability of the enzyme to recognize the three-dimensional structure and cleave the bond. Therefore, when combined with a normal enzyme, the reaction is inhibited or the reaction rate is reduced. Therefore, NTP analogs are usually used with the expectation that such effects (reaction inhibition, reaction rate reduction) will appear.
  • the NMP-PNP used in the present embodiment does not have the effect of inhibiting the reaction or reducing the reaction rate, but the difference signal in units of one base becomes clearly visible.
  • the modified bases are, for example, 5-methylcytosine, N6-methyladenosine, N3-methyladenosine, N7-methylguanosine, 5-.
  • the biopolymer analysis device 100 used when measuring the ion current in the blockage current method is a pair of liquid tanks 104A and 104B filled with a solution (electrolyte solution) 103 with a thin film 102 on which the nanopore 101 is formed sandwiched therein. And a pair of electrodes 105A and 105B corresponding to each tank. At the time of measurement, a voltage is applied between the pair of electrodes by the power supply 107, a current flows between the electrodes of each liquid tank, and the current is recorded by a memory (not shown) included in the measuring unit (computer) 108.
  • a memory not shown
  • the biological polymer 109 Since the biological polymer 109 is not introduced into the nanopore at the initial application of the voltage, the current is measured according to the size (pore diameter) of the nanopore.
  • a molecular motor 110 is bound to the biological polymer 109, and the 5-terminal portion of the control chain 112 is connected to the 3-terminal portion of the biological polymer (see FIG. 2).
  • the primer 111 complementary to the control chain 112 forms a double strand, and the 3-terminal portion of the nanopore-introduced chain 114 is linked to the 5-terminal portion of the primer 111.
  • the molecular motor 110 starts an extension reaction from the primer 111 before the biological polymer is introduced into the nanopore. .. If the stretching reaction is completed before the biopolymer is introduced into the nanopore, the biopolymer cannot pass through the nanopore. Alternatively, if the stretching reaction has progressed halfway, the analysis length will be shorter than expected.
  • the feature of the biopolymer analysis system using nanopores is its long-chain decipherability, and the occurrence of the above-mentioned situation causes long-chain decipherability and a decrease in throughput.
  • a molecular structure in which the spacer 113 is provided between the control chain 112 and the biological polymer 109 is used (see FIG. 2).
  • the molecular motor 110 does not cause a stretching reaction in the reaction solution, and when the molecular motor 110 reaches the nanopore 101, the stretching reaction, that is, the transport control can be started.
  • the biological polymer 109 is encapsulated in the electrolyte with the control chain 112 bound. Further, the molecular motor 110 is dissolved in the electrolyte solution. The biopolymer and the molecular motor bind in the electrolyte solution.
  • the biological polymer 109 to which the molecular motor is bound is introduced into the nanopore 101 from the nanopore introduction chain 114 by the potential gradient generated in the vicinity of the nanopore (see FIG. 3).
  • the size of the spacer can be 2 or more bases (in the embodiment, a 4-base spacer is used).
  • the diameter of the molecular motor 110 is larger than the diameter of the nanopore 101, it cannot proceed in the direction of the exit of the pore and stays at the entrance of the nanopore.
  • the negatively charged biological polymer proceeds further toward the nanopore outlet along with the double-stranded dissociation step by the electric field force, and causes a shape change centering on the spacer.
  • the molecular motor 110 binds to the end of the primer 111 and jumps over the spacer to start the stretching reaction.
  • the signal change according to the characteristics of the biological polymer can be detected by alternately repeating the single-base extension in step (c) and the single-base double-stranded dissociation in step (d).
  • the voltage applied via the nanopore the voltage used at the time of introduction, the voltage applied at the start of the reaction of the molecular motor, and the voltage at the time of signal change measurement may all be the same.
  • the coupling force and the pulling force differ depending on the molecular motor type, it may be possible to detect a desired signal by using different voltages.
  • the force that contributes to the passing speed of the biological polymer is not only the force that the molecular motor holds the molecular complex and the electric field force derived from the potential gradient, but also the friction on the inner wall of the pore. Therefore, it is necessary to adjust the applied voltage according to the size of the pore (for example, if the pore is large, the applied voltage is lowered).
  • Example 1 In Example 1, BST3.0 polymerase, nanopore-introduced chain + primer chain (referred to as primer in the example) and control chain + spacer + biological polymer (referred to as template in this example) as molecular motors are shown in Table 1. The DNA of the sequence shown in is used for nanopore measurement. Below, we verified the case where iSpC3 (Spacer C3) was introduced as a spacer at the position indicated by Z.
  • iSpC3 Spacer C3
  • Table 1 shows the sequence of the DNA strand used as the molecular complex of FIG. 2 in this Example 1.
  • the "GCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT” of primer A forms a double strand by hybridization with the "AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC” sequence of the template.
  • the primer B "CCGGGAGTAGCTCATCCCCCGGACGCTGGCT” forms a double strand by hybridization with the "AGCCAGCGTCCGGGGATGAGCTACTCCCGG” sequence of template A.
  • the nanopore-introduced chain is the poly T sequence of primer A
  • the primer is the "GCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT" of primer 1.
  • the control chain is "AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC" of template A
  • the spacer is "ZZZZ”
  • the biological polymer is the entire sequence after the 5th terminal side of the spacer. Since the biological polymer portion of the primer B has a single-stranded structure, the primer B has a double-stranded structure so as not to be accidentally introduced into the nanopore from the biological polymer portion, and has a role as blocking.
  • Primer A, Primer B and Template A are mixed at a concentration of 10 ⁇ M at a ratio of 1: 1: 1 and using NEB's Isothermal Buffer II as a buffer solution at 30 ° C. for 30 minutes. It was formed by reacting.
  • DNA polymerase uses BST3.0 polymerase as a substrate, AMP-PNP, UMP-PNP, GMP-PNP, dCTP as a buffer solution, NEB's Isothermal Buffer II as a buffer solution, and potassium chloride (KCl) as a buffer solution.
  • Nanopore measurement was performed by setting the environmental temperature to 37 ° C., which is the nanopore measurement condition, under the condition of adding 3M concentration and the condition of not adding it.
  • FIG. 12 shows a representative diagram of the current waveform when the molecular complex in the first embodiment is operated by the molecular motor. With this structure, it can be confirmed that the synthesized DNA strand corresponding to the template is pulled down to the nanopore in units of one base, and the measurement is performed.
  • Example 2 shows the sequence of the DNA strand used as the molecular complex of FIG. 11 in Example 2.
  • template B and template C are DNA strands having complementary sequences in their own molecules, and intramolecular hybridization is performed in the "AGCCAGCGTCCGGGGATGAGCTACTCCCGG” portion and the “CCGGGAGTAGCTCATCCCCGGACGCTGGCT” portion to form a hairpin structure.
  • the control strand is "AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC” of template B and template C
  • the primer is "GCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT” of primer A
  • the nanopore introduction strand is the poly T sequence of primer A.
  • the self-hybridating template B and the template C can be bound to each other by ligation, and the molecular complex shown in FIG. 11 can be formed by ligation.
  • This molecular complex is first reacted at 30 ° C. for 30 minutes using NEB's Isothermal Buffer II as a buffer solution, self-hybridizing each of template B and template C independently, and then NEB's Blunt / TA. It was formed by ligating with Ligase Master Mix, purifying with AM Pure manufactured by Beckman Coulter, and then reacting Primer A and the purified product as a buffer solution with Isothermal Buffer II manufactured by NEB at 30 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 13 shows an excerpt representative diagram of the current waveform when the molecular complex in Example 2 is operated by the molecular motor. With this structure, it can be confirmed that the synthesized DNA strand corresponding to the cyclic template is pulled down to the nanopore in 1 base units and the measurement is performed.
  • biopolymer analysis device having the above-mentioned thin film and the device for analyzing the control chain-bound biopolymer using the device will be described in more detail. explain.
  • FIG. 14 shows a configuration example of the biological polymer analyzer 1400.
  • a configuration example of the biopolymer analyzer 1400 including the biopolymer analysis device, the power supply 107, the ammeter 106, and the measuring unit (computer) 108 is shown. It includes two liquid tanks 104A and 104B separated by a device for biopolymer analysis. The liquid tank is further divided into a plurality of liquid tanks. In the case of this embodiment, the thin film fixing member 102B has four spaces separated by three partition walls, and each of these spaces is used as the liquid tank 104B.
  • the liquid tank 104A is used as a common tank for the four liquid tanks 104B located on the lower side.
  • the partition body 102 is composed of a thin film 102A on which the nanopore 101 is formed, and thin film fixing members 102B and 102C thereof.
  • the nanopore 101 may be formed at any position of the thin film 102A.
  • the thin film fixing member 102B and the thin film 102A form a part of the structure of the liquid tank 104A. Further, the thin film 102A and the thin film fixing member 102C form a part of the structure of the liquid tank 104B.
  • each liquid tank 104B is provided with a single nanopore 101 and an electrode 105B, and is insulated from each other by a partition wall. Therefore, the current flowing through each nanopore 101 can be measured independently.
  • the dimensions of the thin film 102A exposed at the through holes provided in the thin film fixing members 102B and 102C are an area in which two or more nanopores 101 are difficult to be formed when the nanopores 101 are formed by applying a voltage.
  • the area must be acceptable in terms of strength.
  • the area is, for example, about 100 to 500 nm.
  • the film thickness of the thin film 102A can be set to about 3 to 7 nm capable of forming the nanopore 101 having an effective film thickness equivalent to one base.
  • Both the liquid tank 104A and the liquid tank 104B are filled with the electrolyte solution 103.
  • the volume of the electrolyte solution 103 is on the order of microliters or milliliters.
  • KCl for example, KCl, NaCl, LiCl, RbCl, CsCl are used.
  • urea of 4 M or more, DMSO, DMF, and NaOH can be mixed in order to suppress the formation of self-complementary chains of the biological polymer on the liquid side (104B) in which the molecular motor is not introduced. It is also possible to mix a buffer to stabilize the biological polymer.
  • Tris, EDTA, PBS and the like are used as the buffer.
  • the liquid tank 104A is provided with an electrode 105A
  • the liquid tank 104B is provided with an electrode 105B.
  • Electrodes 105A and 105B are, for example, Ag, AgCl, platinum and are in contact with the electrolyte solution 103.
  • connection terminals electrically connected to the electrodes 105A and 105B are provided on the outer peripheral surface of the biopolymer analysis device, and are connected to the above-mentioned power supply 107 and ammeter 106. ..
  • the above-mentioned ammeter 106 has an amplifier and an ADC (Analog to Digital Converter) that amplify the current flowing between the electrodes by applying a voltage.
  • the detected value which is the output of the ADC, is output to the measuring unit (computer) 108.
  • the measuring unit (computer) 108 collects and records the detected current value.
  • the power supply 107, ammeter 106, and measuring unit (computer) 108 are not configured separately for the biopolymer analysis device, but the power supply 107, ammeter 106, and measuring unit (computer) 108 are used for biopolymer analysis. It may be integrated with the device.
  • the control chain to be bound to the biological polymer is provided separately and is introduced into the liquid tank 104A after being pretreated for sample preparation.
  • a buffer suitable for driving a molecular motor coexists in the electrolyte of the liquid tank 104A.
  • a buffer suitable for the molecular motor used is used, and in general, for example, (NH 4 ) 2 SO 4 , KCl, DDL 4 , Tween, Tris-HCl and the like are mixed.
  • the thin film 102A on which the nanopore 101 is formed may be a lipid bilayer (biopore) composed of an amphipathic molecular layer in which a protein having a pore in the center is embedded, or is made of a material that can be formed by semiconductor microfabrication technology. It may be a thin film (solid pore). Materials that can be formed by semiconductor micromachining technology include, for example, silicon nitride (SiN), silicon oxide (SiO 2 ), silicon oxynitride (SiON), hafnium oxide (HfO 2 ), molybdenum disulfide (MoS 2 ), and graphene. is there.
  • the thickness of the thin film can be 1 ⁇ to 200 nm, 1 ⁇ to 100 nm, or 1 ⁇ to 50 nm, and is about 5 nm in this example.
  • the dimensions of the nanopore 101 can be selected as appropriate depending on the type of biological polymer to be analyzed, and is, for example, 0.9 nm to 100 nm or 0.9 nm to 50 nm. More specifically, it can be about 0.9 nm or more and 10 nm or less.
  • the diameter of the nanopore 101 used for the analysis of single-stranded DNA having a diameter of about 1.4 nm can be about 0.8 nm to 10 nm, 0.8 nm to 3 nm, or about 0.8 nm to 1.6 nm. ..
  • the diameter of the nanopore 101 used for the analysis of double-stranded DNA having a diameter of about 2.6 nm can be about 3 nm to 10 nm, or about 3 nm to 5 nm.
  • the depth of the nanopore 101 can be adjusted by adjusting the thickness of the thin film 102A.
  • the depth of the nanopore 101 is twice or more, preferably three times or more, more preferably five times or more the size of the monoma unit constituting the biological polymer.
  • the depth of the nanopore 101 is preferably a size of 3 or more bases, for example, about 1 nm or more.
  • the biological polymer can enter the nanopore 101 while controlling its shape and moving speed, and highly sensitive and accurate analysis becomes possible.
  • the shape of the nanopore 101 is basically circular, but it can also be elliptical or polygonal.
  • the thin films 102A having nanopores 101 it is preferable to regularly arrange the thin films 102A having nanopores 101.
  • the interval at which the plurality of thin films 102A are arranged can be 0.1 mm to 10 mm, or 0.5 mm to 4 mm, depending on the electrodes used and the capabilities of the electrical measurement system.
  • the method for forming the nanopore 101 in the thin film 102A is not particularly limited, and for example, electron beam irradiation by a transmission electron microscope or dielectric breakdown due to voltage application can be used.
  • electron beam irradiation by a transmission electron microscope or dielectric breakdown due to voltage application can be used.
  • the method described in “Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014)” can be used.
  • the formation of the nanopore 101 can be performed, for example, by the following procedure.
  • the Si 3 N 4 thin film is hydrophilized under the conditions of 10 WW, 20 sccm, 20 Pa, and 45 sec by Ar / O 2 plasma (SAMCO Inc., Japan). ..
  • the partition body 102 is set in the device for biopolymer analysis.
  • the liquid tanks 104A and 104B were filled with 1 M KCl, 1 mM Tris-10 mM EDTA, and pH 7.5 solution, and electrodes 105A and 105B were introduced into each of the liquid tanks 104A and 104B, respectively.
  • the voltage is applied not only at the time of forming the nanopore 101, but also at the time of measuring the ion current flowing through the nanopore 101 after the nanopore 101 is formed.
  • the liquid tank 104A located on the upper side is called a cis tank
  • the liquid tank 104B located on the lower side is called a trans tank.
  • the voltage Vcis applied to the electrode on the cis tank side is set to 0V
  • the voltage Vtrans is applied to the electrode on the trans tank side.
  • the voltage Vtrans is generated by a pulse generator (41501B SMU AND Pulse Generator Expander, Agilent Technologies, Inc.).
  • the current value after applying the pulse was read by an ammeter 106 (4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER, Agilent Technologies, Inc.).
  • the process of applying a voltage for forming the nanopore 101 and the process of reading the ion current value were controlled by a self-made program (Excel VBA, Visual Basic for Applications).
  • the current value condition is selected according to the diameter of the nanopore 101 formed before the application of the pulse voltage, and the desired diameter is obtained while sequentially increasing the diameter of the nanopore 101.
  • the diameter of the nanopore 101 was estimated from the ionic current value.
  • the nth pulse voltage application time t n (where n> 2 is an integer) is determined by the following equation.
  • nanopore 101 is possible not only by applying a pulse voltage but also by electron beam irradiation with a TEM (A.J. Storm et al., Nat. Mat. 2 (2003)).
  • the liquid tanks 104A and 104B that can store the measurement solution that comes into contact with the thin film 102A can be appropriately provided with a material, shape, and size that do not affect the measurement of the blocking current.
  • the measurement solution is injected so as to come into contact with the thin film 102A that partitions the liquid tanks 104A and 104B.
  • the electrodes 105A and 105B can be made of a material capable of performing an electron transfer reaction (Faraday reaction) with the electrolyte in the measurement solution, and are typically made of silver halide or alkali silver halide. Can be done. From the viewpoint of potential stability and reliability, silver or silver silver chloride may be used.
  • Faraday reaction electron transfer reaction
  • the electrodes 105A and 105B may be made of a material that serves as a polarization electrode, and may be made of, for example, gold or platinum. In that case, it is preferable to add a substance capable of assisting the electron transfer reaction, such as potassium ferricyanide or potassium ferrocyanide, to the measurement solution in order to secure a stable ion current. Alternatively, a substance capable of carrying out an electron transfer reaction, for example, ferrocenes, can be immobilized on the surface of the polarization electrode.
  • the structures of the electrodes 105A and 105B may be all made of the above-mentioned material, or the above-mentioned material may be coated on the surface of the base material (copper, aluminum, etc.).
  • the shape of the electrode is not particularly limited, but a shape having a large surface area in contact with the measurement solution is preferable.
  • the electrodes are joined to the wiring and an electrical signal is sent to the measurement circuit.
  • the nanopore device for analyzing the biological polymer includes the above-mentioned configuration as an element.
  • the nanopore device may be provided with instructions describing usage procedures, usage amounts, and the like.
  • the control chain, the NTP analog, and the like may be provided in a state in which they can be used immediately, or may be provided in a state in which only the biological polymer to be measured is not bound. Such forms and preparations can be understood by those skilled in the art.
  • the nanopore device may be provided in a state in which the nanopore is formed in a ready-to-use state, or may be provided in a state in which the nanopore is formed at the delivery destination.
  • the extension reaction of the DNA polymerase is started by the electric field force of the nanopore as a trigger.
  • the elongated template is dissociated into a single strand by the electric field force of the nanopore.
  • repeated reading can be performed by an RCA reaction. As a result, it is possible to spontaneously start the elongation reaction simply by continuously applying the electric field force to the nanopore, and it is possible to perform precise sequencing without requiring a complicated procedure.
  • the molecular complex according to the present embodiment includes a single-stranded protruding double-stranded DNA, and has a biological polymer (target), a primer shorter than the biological polymer, and a primer. It contains a DNA polymerase bound to the end and a spacer that stops the extension reaction of the DNA polymerase. Then, the biological polymer and the DNA polymerase are linked by a spacer at the linking position of the single-stranded portion and the double-stranded portion at the three-terminal portion of the primer.
  • the spacer has a role as a switch that controls the reaction of the molecular motor (DNA polymerase), and normally stops the reaction of the molecular motor, but the molecule is measured by nanopores, that is, when a force due to voltage is applied. It has a function to start the reaction of the motor.
  • the molecular motor can avoid a situation in which the extension reaction starts from the primer before the biopolymer is introduced into the nanopore. ..
  • the molecular motor does not cause a stretching reaction in the reaction solution, and when the molecular motor reaches the nanopore, the stretching reaction, that is, the transport control can be started.
  • the length of the spacer can be set to 2 bases or more in order to properly control the transfer.
  • the biological polymer may be composed of circular DNA.
  • the biological polymer is a circular DNA strand
  • the biological polymer can be read over and over again by a circular elongation reaction.
  • the complex molecule may be further provided with an adapter having a single-stranded protruding DNA.
  • the biological polymer composed of circular DNA has a double-stranded structure including a main chain and a complementary strand. Then, the 5-terminal portions of the main chain and the complementary strand of the circular DNA are connected to the 3-terminal portions of the main chain and the complementary strand of the circular DNA via an adapter to form a molecular complex.
  • A-family polymerase can be used as a molecular motor (DNA polymerase). By using A-family polymerase, the extension reaction is possible even under high salt concentration conditions.
  • the biological polymer (target) has a double-stranded DNA structure
  • the molecular motor (NA polymerase) has a strand substitution activity.
  • an NTP analog may be included as a biological polymer (target) substrate. If an NTP analog is used as a substrate, it can exhibit a good function as a molecular motor.
  • the composite molecule is configured to include first and second composite adapters at both ends of a biological polymer (target) composed of double-stranded DNA containing a main chain and a complementary strand.
  • the first and second composite adapters are a primer shorter than the biological polymer, a DNA polymerase bound to the three ends of the primer, a spacer that stops the extension reaction of the DNA polymerase, a first adapter, and a first adapter. It includes a second adapter having a complementary sequence of one adapter. Then, both ends of the biological polymer are connected to the first and second adapters of the first composite adapter and the first and second adapters of the second composite adapter.
  • the five ends of the first adapter of the first and second composite adapters are linked to the three ends of the main and complementary strands of the biological polymer, respectively.
  • the 3 end portions of the 2nd adapter of the 1st and 2nd composite adapters are connected to the 5 end portions of the main chain and the complementary chain of the biological polymer, respectively.
  • the present embodiment also discloses a biopolymer analysis method in which a molecular complex containing a biopolymer is introduced into a nanopore to analyze the biopolymer.
  • a molecular complex (a biopolymer and a DNA polymerase are formed at three ends of a primer) by an electric field force obtained by applying a voltage between a pair of electrodes provided in the biopolymer analyzer.
  • Introducing a structure in which the single-stranded portion and the double-stranded portion are connected by a spacer) into the nanopore and the introduction of the molecular complex into the nanopore trigger the extension of DNA polymerase.
  • the measurement unit of the polymer analyzer measures the characteristic amount derived from the synthetic strand, which is generated when the synthetic strand is transferred to the nanopore and controlled to be transported to the nanopore by the extension reaction of DNA polymerase, and the characteristic quantity derived from the synthetic strand is controlled to be transported to the nanopore. Includes sequencing synthetic strand sequences by detection by.
  • control of transport of the synthetic strand to the nanopore is carried out by the spontaneous extension reaction of the DNA polymerase while dissociating the double-stranded DNA of the synthetic strand from the three-terminal portion of the biological polymer by an electric field force.
  • the unit sequence is determined from the periodic feature amount using the periodic feature amount obtained by sequencing the synthetic strand based on the circular DNA. ..
  • the circular DNA is sequenced, a feature amount is obtained periodically, and the unit sequence of the biological polymer can be appropriately determined from this feature amount.
  • the salt concentration of the electrolyte solution can be set to 3M or more, and the diameter of the nanopore can be set to 0.8 to 3.0 nm.
  • Biopolymer analyzer 100 Biopolymer analysis device 101 Nanopore 102 Thin film 103 Electrolyte solution 104A, 104B Liquid tank 105A, 105B Electrode 106 Ammeter 107 Power supply 108 Computer 109 Biopolymer 110 Molecular motor 111 Primer 112 Control chain 113 Spacer 114 Nanopore Introduced Chain 115 Adapter A 116 Adapter B 117 Adapter C

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Abstract

繰返し読取を行うに当って、煩雑な処理の必要性、ハンドリングの困難性、精密なシーケンシングの困難性を改善する技術を提供する。本開示は、一本鎖飛び出し二本鎖DNAを備える分子複合体であって、生体ポリマと、ナノポア導入鎖と、生体ポリマより短いプライマーと、プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、制御鎖と、を備え、DNAポリメラーゼは、スペーサの近傍に結合している、分子複合体を提供する（図２参照）。

Description

分子複合体、および生体ポリマ分析方法
　本開示は、分子複合体、および生体ポリマ分析方法に関する。
　厚み数Å～数十ｎｍ程度の薄膜に埋め込まれた直径数Å～数ｎｍ程度の細孔（以下、ナノポアと呼ぶ）に電解質を含んだ溶液を接液し、この薄膜の両端間に電位差を発生させるとナノポアに電解質を含んだ溶液を通過させることができる。この時、測定対象物がナノポアを通過すると、ナノポア周辺部の電気的特性、特に抵抗値が変化するため、その電気的特性の変化を検出することによって測定対象物を検出することが可能である。測定対象物が生体ポリマの場合、生体ポリマのモノマ配列パターンに応じて、ナノポア周辺部の電気的特性がパターン状に変化する。これを利用して、生体ポリマのモノマ配列解析を行う方法が近年盛んに研究されている。
　中でも、生体ポリマがナノポアを通過した時に観測されるイオン電流の変化量がモノマ種によって異なることを原理とした方式が有望視されている。この際、モノマ配列の解析精度は上記イオン電流の変化量によって決定されるため、モノマ間のイオン電流量差は大きいほど望ましい。上記方式は従来とは異なり生体ポリマの断片化を伴う化学操作を必要とせずに、生体ポリマを直接読取することが可能である。生体ポリマがDNAの場合はDNA塩基配列解析システム（DNAシーケンサ）であり、生体ポリマがタンパク質の場合はアミノ酸配列解析システム（アミノ酸シーケンサ）であり、それぞれ従来よりも遥かに長い配列長を解読可能なシステムとして期待されている。特に封鎖電流方式を用いて、ナノポアをDNAシーケンサとして実用化する研究開発が盛んである。
　ナノポアデバイスとしては、脂質二重膜に埋め込まれた中心に細孔を有するタンパク質を用いたバイオナノポアと半導体加工プロセスにて形成した絶縁薄膜に細孔を加工したソリッドナノポアの2種類が存在する。バイオナノポアでは脂質二重膜に埋め込まれた改変タンパク質（Mycobacterium smegmatis porin A (MspA)等）の細孔（直径１．２ｎｍ、厚さ０．６ｎｍ）を生体ポリマ検出部としてイオン電流の変化量を測定する。一方、ソリッドポアでは半導体材料である窒化シリコン（SiN）の薄膜や、グラフェンや二硫化モリブデンのような単分子層からなる薄膜にナノポアを形成した構造体をデバイスとして用いる。
　このような分析用デバイスは、ナノポアデバイス、測定対象物および電解質を含んだ溶液、ナノポアデバイスを挟んだ１対の電極、から構成されるデバイスが基本単位として用いられる。このような構成は例えば非特許文献１に記載されている。電極には、溶液中の電解質との電子授受反応を可能にする（電気化学的に酸化還元反応を行うことができる）材質が典型的に採用される。具体的には、その電気化学的な電位安定性と信頼性の高さからしばしば銀／銀塩化銀電極が用いられる。電解質にはｐＨ中性下での塩化カリウム水溶液が最も典型的に使用される。その理由は、塩化物イオンが銀／銀塩化銀電極と電子授受反応が可能であり、カリウムイオンが塩化物イオンと電気移動度が等しいために電気伝導度が十分確保できるからである。ソリッドナノポアにおいては、これまでにｐＨ中性下での塩化カリウム水溶液を用いてホモポリマやモノマのアデニン塩基、シトシン塩基、チミン塩基、グアニン塩基の封鎖電流量を測定した報告が為されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、および特許文献１参照）。
　ナノポアDNAシーケンサには、DNA鎖を精密に搬送制御していくことが求められる。これを実現する搬送制御法の一つとして、酵素を分子モータとして駆動させることが知られている。例えば、DNAポリメラーゼが伸長反応する際や、DNAヘリカーゼが二本鎖DNAのうち一本鎖を解く反応を行う際に、分子モータの制御する力を利用して、鋳型となる一本鎖DNAについて１塩基ずつ位置をずらしてナノポアを通過するDNAの搬送制御を行う。特に、DNAポリメラーゼは、鋳型となるDNAに対して、プライマーを結合し、一本鎖部をナノポアに通過させ、ポリメラーゼがプライマー末端に結合することで伸長反応がおきる。このため、DNAが電界で引っ張られる力に抗ってDNAの搬送が実現される。この際、塩基種に応じたイオン電流信号を取得することが出来る（例えば、非特許文献４、非特許文献５、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５参照）。
　上記酵素を用いたナノポアDNAシーケンサの課題の１つとして、得られた特徴量のパターン変化（典型的には電流値のパターン変化）からあるアルゴリズムを用いて配列推定した際の読取精度が、従来型のDNAシーケンサの読取精度と比較すると低い点が挙げられる。典型的には従来型のDNAシーケンサの読取精度は１リードあたり９９％以上であるが、ナノポアDNAシーケンサの読取精度は１リードあたり８０－９５％程度であることが知られている（例えば、非特許文献６参照）。
　この課題を克服する試みとして、同じ配列を何度も繰返して読み取り、得られた複数の配列推定データからコンセンサス配列を生成することによって読取精度を向上させる方法が行われている。例えば、目的DNA鎖を環状化させ、Rolling Circle Amplification（RCA）法を用いることにより事前に目的配列を複数有する二本鎖を増幅・生成させ、その配列を読み取ることによりコンセンサス配列を得ることが試みられている（非特許文献７）。また、別の方法として、ナノポア計測中にRCA反応を行う方法が試みられている（特許文献６）。この方法では、事前に環状化されたDNA鎖を単純な相補配列を有するDNA鎖（プライマー）とハイブリさせ、プライマーを開始点としてRCA法を用いて、一本鎖飛び出しDNA鎖が生成されるまで増幅させた後、一旦伸長反応を停止させ、その後、ナノポアへ上記一本鎖飛び出しDNA鎖を導入させた後、また伸長反応の試薬を添加することで伸長反応を再開させる手法が取られている。
国際公開２０１７／１１０２２６号パンフレット 米国特許第７１８９５０３号明細書 米国特許出願公開第２０１４／００５１０６８号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０１５２４９５号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０３４４９４５号明細書 米国特許出願公開第２０１８／０２０１９９３号明細書
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　しかしながら、上述のような同じ配列を繰り返し読み取る方法には様々な課題がある。つまり、事前に目的DNA鎖を増幅する手法においては、まずDNAシーケンシングを行う前にサンプルの前処理が必要であり、煩雑となってしまう。加えて、RCA法で増幅したDNA鎖は全長が長く、目的DNA鎖が長ければ長いほど生成DNA鎖は長くなる。一般的に知られるように長鎖DNAはハンドリングが難しく、液体のせん断応力で容易に切断されてしまうため、DNAシーケンシングを行う前に増幅したサンプルが切断されてしまう。
　また、前述したRCA法とナノポア計測しながら行う手法では、様々な複雑な手順が必要である。単純なプライマーが用いられているため、まずナノポアへとDNA鎖を誘導するために、ナノポア導入可能となるように一本鎖飛び出しDNA鎖をRCA法にて一旦伸長反応した後、停止反応を行う事で生成させている。この停止反応は一般的にDNAポリメラーゼ反応を失活させる必要があり、典型的には加熱や変性試薬の添加が行われる。この過程は通常タンパク変性を引き起こす不可逆現象であり、後ほど新たにDNAポリメラーゼを再添加する必要がある。また、停止反応は一般的にランダムな現象であり、伸長した塩基長を揃えて停止することは困難であり、結果として後工程におけるシーケンスの開始配列点がバラバラとなってしまう。また、従来法ではループ伸長反応を行うために二本鎖DNAをDNAポリメラーゼの鎖置換活性を用いているが、DNAポリメラーゼの鎖置換活性が失活した段階でこのループ反応は停止してしまう。
　本開示はこのような状況に鑑み、繰返し読取を行うに当って、煩雑な処理の必要性、ハンドリングの困難性、精密なシーケンシングの困難性を改善する技術を提供する。
　上記課題を解決するために、例えば請求の範囲に記載の構成を採用する。本開示は、上記課題を解決する手段を複数含んでいるが、その一例を挙げるならば、一本鎖飛び出し二本鎖DNAを備える分子複合体であって、生体ポリマと、ナノポア導入鎖と、生体ポリマより短いプライマーと、プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、制御鎖と、を備え、DNAポリメラーゼは、スペーサの近傍に結合している、分子複合体を提供する。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される請求の範囲の様態により達成され実現される。ただし、本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の請求の範囲又は適用例を如何なる意味においても限定するものではないことを理解する必要がある。
　本開示によれば、繰返し読取を行うに当って、煩雑な処理の必要性、ハンドリングの困難性、精密なシーケンシングの困難性を改善することが可能となる。
本実施形態におけるナノポアデバイスの構成例を示す図である 本実施形態における分子複合体の基本構成例を示す図である。 本実施形態における分子複合体の基本動作を説明するための図である。 本実施形態における環状分子複合体の基本構成例を示す図である。 本実施形態における環状分子複合体の基本動作を説明するための図である。 本実施形態における複合アダプタの基本構成例を示す図である。 本実施形態における複合アダプタが連結された分子複合体の基本構成例を示す図である。 本実施形態における環状化向け複合アダプタの基本構成例を示す図である。 本実施形態における環状化向け複合アダプタが連結された環状分子複合体の基本構成例を示す図である。 本実施形態における環状化向け複合アダプタの基本構成例を示す図である。 本実施形態における環状化向け複合アダプタが連結された環状分子複合体の基本構成例を示す図である。 実施例１における分子複合体が分子モータによって動作している際の電流波形例を示す図である。 実施例２における分子複合体が分子モータによって動作している際の電流波形例を示す図である。 本実施例による生体ポリマ分析装置１４００の構成例を示す図である。
　以下、図面に基づいて、本実施形態について説明する。なお、添付の図面は、本実施形態の原理に則った具体例を示しているが、それらは本実施形態の理解のためのものであり、決して本開示の技術を限定的に解釈するために用いられるものではない。
（１）実施形態
　＜生体ポリマ分析用デバイスおよびそれを備えた生体ポリマ分析装置の構成例＞
　核酸等から構成される生体ポリマを分析する際に使用する生体ポリマ分析用デバイスは、生体ポリマのナノポアへの導入法により構成が異なるが、ここでは一例として特に電気泳動でナノポアへ導入される際に関して記述する。
　生体ポリマ分析用デバイス１００は、図１に示したように、それぞれに電解質溶液が満たされている第１液槽１０４Ａおよび第２の液槽１０４Ｂと、第１および第２の液槽１０４Ａおよび１０４Ｂを仕切る薄膜１０２と、第１および第２の液槽１０４Ａおよび１０４Ｂに設けられる第１および第２の電極１０５Ａおよび１０５Ｂと、によって構成される。
　生体ポリマ分析用デバイス１００は、アレイデバイスとして構成することもできる。アレイデバイスは、薄膜１０２によって仕切られる液室の組を複数個備えるデバイスのことを指す。例えば、第１の液槽１０４Ａを共通槽とし、第２の液槽１０４Ｂを複数個の個別槽とする。この場合、共通槽と個別槽のそれぞれに電極を配置することによって、アレイデバイスを構成することができる。
　また、生体ポリマ分析装置１０は、生体ポリマ分析用デバイス１００と、生体ポリマ分析用デバイス１００に設けられた電極１０５Ａおよび電極１０５Ｂと、電極１０５Ａと電極１０５Ｂの間に流れるイオン電流（封鎖信号）を測定する測定部１０８を含み、測定されたイオン電流（封鎖信号）の値に基づいて生体ポリマのモノマ配列情報を取得することを基本とする（測定部１０８は、例えば、コンピュータによって構成することもできる）。また、生体ポリマ分析装置１０は、ナノポア内に電極を設けることで、トンネル電流を取得すること、トランジスタ特性変化を検出することでも生体ポリマの情報を得ることが可能である。
　上記構成としては、生体ポリマ中のモノマ配列情報を電気的信号に基づいて取得する構成を示したが、光学的信号に基づいて生体ポリマ中のモノマ配列情報を取得する構成であってもよい。すなわち、モノマ配列にはモノマごとに特徴的な蛍光波長を有する標識が為されており、その蛍光信号を計測することによって、各モノマ配列を決定する方法であってもよい。
　ここで生体ポリマとは核酸をモノマとするDNAやRNA、あるいはアミノ酸をモノマとするポリペプチドを示す。
　＜分子複合体の特徴について＞
　生体ポリマ分析装置１０では、生体ポリマがナノポアを通過する際に搬送制御を行う必要がある。ここで生体ポリマがDNAの場合、本実施形態における搬送制御は主にDNAポリメラーゼを用いた分子モータにより行われる。DNAポリメラーゼによる搬送制御はナノポア近傍でのみ開始される必要がある。これを実現するためには図２に示したような分子複合体を有することが望ましい。
　前述の分子複合体は、以下の（ａ）～（ｄ）を満たす特徴を有している。
（ａ）読み取り対象の生体ポリマの３末端部にスペーサの５末端部が連結され、スペーサの３末端部には制御鎖の５末端部が連結されている；
（ｂ）制御鎖の相補配列を有するプライマーが制御鎖に対して相補的に二本鎖構造を形成している；
（ｃ）プライマーの５末端部にはナノポア導入鎖の３末端部が連結されている；
（ｄ）プライマーの３末端部近傍にＤＮＡポリメラーゼ（分子モータ）が結合している。
　ここで、読み取り対象生体ポリマはDNAの主鎖であり、主鎖中にプライマーとなるDNA配列が含まれている。プライマーとは制御鎖の相補鎖となるDNA配列を指す。スペーサは分子モータの反応を制御するスイッチとしての役割を有し、通常時には分子モータの反応を停止しているが、ナノポアでの計測、すなわち電圧による力が印加されると分子モータの反応を開始させる機能を持つ。スペーサとは脱塩基であることが好ましく、Spacer C3（iSpC3）、Hexanediol、Spacer 9、Spacer 18、dSpacer等が挙げられる。特に、Spacer C3を４ｍｅｒ以上連続で導入していることが望ましい。
　上述の（ａ）～（ｄ）の特徴を満たすことにより、生体ポリマは、読み取り対象である主鎖DNA（テンプレート）と主鎖DNAよりも短い相補鎖DNA（プライマー）から成る一本鎖飛び出し二本鎖DNA（ssDNA-overhang dsDNA）に対して、分子モータが一本鎖部分と二本鎖部分の境界部近傍に結合している分子複合体を形成する（図２参照）。このような分子複合体に対して、分子モータが反応することにより前述した分子複合体中の主鎖DNAとナノポアの相対位置を１塩基ずつ移動させることにより、良好な搬送制御が行われ、主鎖DNA中の塩基配列情報を取得することが可能となる。
　ここで、分子モータとして用いられる酵素としては、生体ポリマと結合能を有し、生体ポリマを複製・伸長させることが可能な酵素全般を指す。特に生体ポリマがDNAの場合、DNAポリメラーゼが候補として挙げられる。生体ポリマがRNAの場合、RNAポリメラーゼ等が候補として挙げられる。
　＜分子複合体の動作原理＞
　以下、本実施形態による分子複合体が動作する原理について説明する。電解質溶液中に配置されたナノポアの両端に電圧が印加されると、ナノポア近傍において電界が発生し、その電場力によりナノポア導入鎖部分からナノポアへと分子複合体が導入される。この時、同時にナノポア近傍の電界によって発生した力によって、プライマーと制御鎖から構成される二本鎖構造が、制御鎖の３末端部より一本鎖へと解離（unzip）される。解離工程が進み、分子モータ結合部付近まで進んだ時、分子モータが分子複合体に結合している力が上記解離力よりも強いため、電場力による解離工程はここで一旦停止する。この時、分子モータは一般にナノポア直径よりも大きいためにナノポアを通過することができない。この制限を実現するために、ナノポア直径は一本鎖DNAが通過可能な下限値である０．８ｎｍから分子モータである酵素が通過しない上限値である３ｎｍの範囲にあることが望ましい。また、分子モータの分子複合体への結合力が電場力による解離力よりも強い必要がある。この条件下において、ナノポア近傍に発生した電界力をトリガーとして、ナノポア近傍に滞在する分子モータがスペーサを飛び越えることによって、プライマーの３末端部より、生体ポリマの相補配列の伸長・解離反応が開始される。この結果、分子モータが１塩基伸長反応を進めるごとに、制御鎖側からの二本鎖解離工程が１塩基進められ、「ナノポア導入鎖＋プライマー＋DNAポリメラーゼにより合成された生体ポリマの相補配列」がナノポアへと順次搬送制御されていく。典型的にはその際に取得されるイオン電流の変化から生体ポリマの分析が行われる。
　図３は、分子モータ駆動の様子を示す模式図である。ステップ（ａ）では、分子モータと結合した分子複合体が、ナノポア導入鎖の５末端部よりナノポア内部へと電気泳動にて誘導される。ステップ（ｂ）ではナノポア近傍における電場力により、制御鎖の３末端部より二本鎖構造の解離が行われ、分子モータの結合点まで解離工程が進む。ステップ（ｃ）では電場力を起点として、分子モータがスペーサを飛び越えて伸長反応開始位置へとシフトすることによってプライマー３末端部からの伸長反応開始が誘導され、まず１塩基伸長反応が始まる。ステップ（ｄ）ではプライマー部からの１塩基伸長に伴い、生体ポリマ側の二本鎖構造を新たに１塩基分解離することが可能となるので、再び電場力による二本鎖解離が１塩基分行われる。この時、同時に電場力によってナノポア導入鎖側はナノポア側へと１塩基分引き下げられ、再びステップ（ｃ）へと移行する。ステップ（ｃ）→ステップ（ｄ）のサイクルを分子モータの伸長反応が生体ポリマの５末端部へと到達するまで繰返し行われる。ステップ（ｅ）では伸長反応の終了に伴い、分子モータが分子複合体より脱離し、ナノポア導入鎖側のDNA鎖は電場力によってナノポア側の電場印加側へと通過完了する。このような一連の制御反応を行うことにより、DNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼによって合成された生体ポリマの相補配列がナノポアへと引き下げられ、それに伴い生体ポリマのDNA部の塩基配列情報を取得することが可能となる。
　このようなステップを実現するには、ステップ（ｃ）におけるDNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼによる伸長反応速度よりも、ステップ（ｄ）における電場力による二本鎖解離速度が速い必要がある（搬送速度が伸長測反応度に依存するようにする）。この条件下において、ステップ（ｃ）における伸長反応が律速過程となり、１塩基単位での搬送制御が実現可能となる。仮に、ステップ（ｃ）におけるDNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼによる伸長反応速度よりも、ステップ（ｄ）における電場力による二本鎖解離速度が遅い場合は、ステップ（ｃ）における伸長反応が先に完了してしまい、分子モータによる１塩基単位での搬送制御が実施されなくなってしまう（解離を行う前に慎重がどんどん進んでしまい、一塩基ずつの搬送制御ができない）。
　本実施形態による分子複合体の動作の特徴として、生体ポリマの特徴量解析を行っている際、分子モータは常にナノポア近傍に留まっていることが挙げられる。これはプライマーより伸長反応が行われた後、即座に電場力によって二本鎖の解離が行われ、それによって伸長したDNA鎖がナノポアへと常に引き下げられていくためである。
　このような分子複合体において、生体ポリマを環状DNA鎖とすると環状伸長反応により、生体ポリマを何度も繰返し読み取ることが可能となる。図４は、生体ポリマを環状DNA鎖とした場合の分子複合体の構成例を示す図である。図１の分子複合体の構造と異なる点は生体ポリマの５末端部が制御鎖の３末端部と連結してすることによって、環状DNA鎖となっている点にある。このような環状DNA鎖上を分子モータが伸長反応していくことにより、RCA反応となって分子モータの伸長反応が停止するまで、生体ポリマを何度も繰返し読み取ることが可能となる。図５に示したように、生体ポリマを環状DNA鎖とした場合の分子複合体の動作原理は図３の場合と同じである。異なる点は生体ポリマが環状鎖となっていることにより、生体ポリマの５末端部が存在しないため、分子モータの伸長反応が失活により停止するまで、ステップ（ｃ）とステップ（ｄ）の動作をループし続けることにある。このような分子複合体とすることにより、予め分子複合体を形成しておけば、ナノポア計測を行う事で自発的・自動的に制御が行われ、かつ反応開始点も制御することができ、精密なシーケンシングを行うことが可能となる。
　実際のサンプル（ターゲット部分）は二本鎖構造であることが通常であり、図２や図４のような一本鎖DNA構造であることは少ない。そこで、ターゲット部分が二本鎖DNA構造であっても図３や図５の動作を可能にする分子複合体を形成する必要がある。例えば、図６に示したように、制御鎖１１２の５末端部にスペーサの３末端部が連結され、スペーサの５末端部にアダプタＡの３末端部が連結され、制御鎖およびアダプタＡの相補配列を有するプライマーおよびアダプタＢが二本鎖を形成しており、プライマーの５末端部にはナノポア導入鎖の３末端部が連結されている分子複合体の複合アダプタを準備する。このような複合アダプタを二本鎖の生体ポリマとライゲーション反応することにより、図７に示したように生体ポリマの両末端に複合アダプタを有する分子複合体が形成される。ここに分子モータを結合させることにより、図３と同様の動作をさせることが可能となる。この構造は対称構造を有しているため、分子複合体の両末端のどちらからナノポアへと導入されても同様に動作をさせることが可能となる。尚、図３と動作が一点異なるのは、ステップ（ｃ）において、生体ポリマの二本鎖構造を分子モータの鎖置換活性によって解離しながら伸長反応を行っていく必要がある点である。そのため、本構造において分子モータは、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼである必要がある。
　同様に、二本鎖構造の生体ポリマを環状鎖とするには、図８に示したような複合アダプタを準備する必要がある。この複合アダプタでは、制御鎖の５末端部にスペーサの３末端部が連結され、スペーサの５末端部にアダプタＡの３末端部が連結され、制御鎖の３末端部にはアダプタＣが連結され、制御鎖の相補配列を有するプライマー、アダプタＡおよびアダプタＣの相補配列を、５末端部および３末端部に有するアダプタＢが、それぞれ二本鎖を形成しており、プライマーの５末端部にはナノポア導入鎖の３末端部が連結され、アダプタＢは制御鎖と二本鎖を形成しないように非相補配列を制御鎖該当部分に有しており、制御鎖該当部分においてヘアピン構造を形成している。このような複合アダプタを二本鎖の生体ポリマとライゲーション反応させて環状化することにより、図９に示したように複合アダプタの両末端に生体ポリマが連結された環状構造を有する分子複合体が形成される。ここに分子モータを結合させることにより、図５と同様の動作をさせることが可能となる。この分子複合体においても同様にステップ（ｃ）において、生体ポリマの二本鎖構造を分子モータの鎖置換活性によって解離しながら伸長反応を行っていく必要がある点にある。そのため、本構造において、分子モータは、鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼである必要がある。この構造の特徴としては、生体ポリマの主鎖の３末端部は複合アダプタを介して、生体ポリマの主鎖の５末端部へと連結されていることにある。同様に生体ポリマの相補鎖の３末端部は複合アダプタを介して、生体ポリマの相補鎖の５末端部へと連結されている。
　二本鎖構造の生体ポリマを環状鎖とするには、図１０に示したような複合アダプタを準備することでも実施可能である。この複合アダプタでは、制御鎖の５末端部にスペーサの３末端部が連結され、スペーサの５末端部にアダプタＡの３末端部が連結され、制御鎖の３末端部にはアダプタＣの５末端部が連結されている。アダプタＡの５末端部およびアダプタＣの３末端部は互いに相補鎖となる配列を有しており、制御鎖と制御鎖の相補配列を有するプライマー、アダプタＡおよびアダプタＣの相補配列部分が、それぞれ二本鎖を形成している。プライマーの５末端部にはナノポア導入鎖の３末端部が連結され、アダプタＡおよびアダプタＣの一本鎖構造部分はヘアピン構造を形成している。このような複合アダプタを二本鎖の生体ポリマとライゲーション反応させて環状化することにより、図１１に示したように複合アダプタの両末端に生体ポリマが連結された環状構造を有する分子複合体が形成される。ここに分子モータを結合させることにより、図５と同様の動作をさせることが可能となる。この分子複合体においても同様にステップ（ｃ）において、生体ポリマの二本鎖構造を分子モータの鎖置換活性によって解離しながら伸長反応を行っていく必要がある点にある。そのため、本構造において、分子モータは鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼあるいはRNAポリメラーゼである必要がある。この構造の特徴としては、生体ポリマの主鎖の３末端部は、複合アダプタを介して、生体ポリマの主鎖の５末端部へと連結されていることにある。同様に、生体ポリマの相補鎖の３末端部は、複合アダプタを介して、生体ポリマの相補鎖の５末端部へと連結されている。
　電気的信号、特にイオン電流の信号変化により生体ポリマを分析するナノポア手法においては、電解質溶液の電気伝導度が高いほど、イオン電流の信号変化量が増大するため、高いＳＮ比での計測が可能となる。イオン種の輸率等にも依存するが、一般的にはイオン強度すなわち塩濃度を増加することによって、電解質溶液の電気伝導度を高めることが可能となる。したがって、ナノポア分析においては、ＳＮ比の観点から可能な限りの高塩濃度下での計測を行う。特に、ナノポア分析においては、１Ｍ（１モル）濃度の塩化カリウム水溶液が用いられることが多く、３Ｍ以上のイオン強度を有する高い塩濃度条件が用いられる。最大の塩濃度は、電解質が溶解可能な上限値である飽和濃度である。例えば、典型的には３Ｍ濃度の塩化カリウム水溶液等を用いることができる。他にもイオン種としては、塩化カリウム以外にもアルカリ金属類の１価カチオンである、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオンやアンモニウムイオン等であってもよい。
　一方、分子モータとして酵素を活用する場合、一般的に酵素は高い塩濃度下においては各アミノ酸が有する電荷が遮蔽されて立体構造が崩れる等の理由により、酵素活性がしばしば失われることが広く知られている。例えば、DNAポリメラーゼを代表例とした場合、好適な塩濃度値はしばしば５０ｍＭ～３００ｍＭの範囲内であって、ナノポア分析において好ましい１Ｍ濃度以上のイオン強度を有する塩濃度条件ではしばしば活性が失われ、伸長反応が進まない。
　このような状況の下、発明者らは鋭意検討の結果、ナノポア分析において１Ｍ濃度以上の塩濃度条件下においても分子モータとして機能可能な酵素を発見した。その代表例としては、A-familyポリメラーゼであるDNAポリメラーゼである。例えば、A-familyポリメラーゼの中でも、BST（Bacillus stearothermophilus）ポリメラーゼは、高い塩濃度条件下でも伸長反応が可能である。BSTポリメラーゼの中でもNew England Biolabs（NEB）社製のBST3.0ポリメラーゼは、３Ｍ濃度以上の極めて高い塩濃度条件下であっても伸長反応が可能であり、特にナノポア分析において使用することができる。他にもニッポンジーン社製のCsaポリメラーゼや、96-7ポリメラーゼは同じく高い塩濃度条件下であっても伸長反応が可能である。
　また、発明者らは鋭意検討の結果、NTP類似体を基質として利用すれば、分子モータとして良好な機能が発揮できることを見出した。ここで、NTP類似体とは、dNTPの各部位が改変された化学構造を有するものを指す。例えば、NTP類似体の１種である、NMP-PNPは、五員環糖構造がリボースであり、β、γ部位リン間の酸素がNHで置換された構造のことを指す。NはヌクレオシドのNを意味し、実際の試薬名は各塩基の略称の頭文字を用いる（A、 G、 T、 C、 U）。尚、NMP-PNPの正式名称は、例えばAの場合、Adenosine-5'-[(β、γ)-imido] triphosphateであり、慣用名としてNMP-PNPやNppNHp等が使われている。このようなNTP類似体を用いることによって、上記耐塩性が高い分子モータは良好な信号を出力する。
　通常、NTP類似体はその化学構造のいずれかが通常のdNTPに対して改変されているため、酵素の立体構造認識能や結合切断能に影響を及ぼす。そのため、通常の酵素と組み合わせた場合においては、その反応が阻害されるか、または反応速度が低下するといった効果がもたらされる。したがって、NTP類似体は、このような効果（反応阻害、反応速度低下）が出現すると期待して使用されることが通常である。しかし、本実施形態で用いるNMP-PNPは、反応が阻害される、または反応速度が低下するという効果は表れない一方で、１塩基単位での差分信号が明瞭に見えるようになる。
　一方で、基質ではなくテンプレート側のDNA中にメチル化された修飾塩基などが存在すると、その箇所だけポリメラーゼ等の伸長反応速度が変化（典型的には遅くなる）することが知られている。NTP類似体であるNMP-PNPで分子モータとして駆動させた場合でも同様であり、テンプレート側にメチル化された塩基が存在すると、そこで速度の変化が観測される。このような速度変化を観測することにより、修飾塩基の位置および種類を検出することも可能である。ここで修飾塩基とは、例えば5-メチルシトシン（5-methylcytosine）、N6-メチルアデノシン（N6-methyladenosine）、N3-メチルアデノシン（N3-methyladenosine）、N7-メチルグアノシン（N7-methylguanosine）、5-ヒドロキシメチルシトシン（5-hydroxymethylcytosine）、擬ウリジン（pseudouridine）、チオウリジン（thiouridine）、イソグアノシン（isoguanosine）、イソシトシン（isocytosine）、ジヒドロウリジン（dihydrouridine）、キューオシン（queuosine）、ワイオシン（wyosine）、イノシン（inosine）、トリアゾール（triazole）、ジアミノプリン（diaminopurine）、beta-D-glucopyranosyloxymethyluracil、8-オキソグアノシン（8-oxoguanosine）、2′-O-メチルアデノシン （2′-O-methyl adenosine）、2′-O-メチルシチジン（2′-O-methyl cytidine）、2′-O-メチルグアノシン（2′-O-methyl guanosine）、2′-O-メチルウリジン（2′-O-methyl uridine）である。
（２）実施例
　以下では、具体的な実施例について説明する。
　改めて図１の装置構成を概説する。封鎖電流方式においてイオン電流を測定する際に使用する生体ポリマ分析用デバイス１００は、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２を挟んで、溶液（電解質溶液）１０３が充填された一対の液槽１０４Ａおよび１０４Ｂと各槽に対応する一対の電極１０５Ａおよび１０５Ｂとで構成されている。測定時には、一対の電極の間に電圧が電源１０７によって印加され、各液槽の電極間に電流が流れ、測定部（コンピュータ）１０８に含まれるメモリ（図示せず）により電流が記録される。電圧の印加当初は、ナノポアに生体ポリマ１０９が導入されていないため、ナノポアの寸法（ポア径）に応じた電流が計測される。ここで、生体ポリマが上部液槽に導入されると、生体ポリマはナノポア近傍に形成された電位勾配によって電気泳動が誘発され、ナノポア内へと導入される。生体ポリマ１０９には分子モータ１１０が結合し、生体ポリマの３末端部に制御鎖１１２の５末端部が連結されている（図２参照）。また、制御鎖１１２に相補的なプライマー１１１が二本鎖形成しており、プライマー１１１の５末端部にナノポア導入鎖１１４の３末端部が連結されている。
　ここで、生体ポリマに結合する制御鎖１１２と生体ポリマ１０９の間にスペーサ１１３が存在しないと、分子モータ１１０は、生体ポリマがナノポアに導入される前にプライマー１１１から伸張反応を開始してしまう。生体ポリマがナノポアに導入される前に伸張反応が完了してしまうと、生体ポリマは、ナノポアを通過することが出来ない。もしくは、伸張反応が途中まで進んでしまっていると、想定よりも解析長が短くなってしまう事態となる。ナノポアを用いた生体ポリマ解析システムの特徴に、その長鎖解読性が挙げられており、上記の事態の発生は長鎖解読性の及びスループット低下をもたらすことになる。
　そこで、本実施形態では、制御鎖１１２と生体ポリマ１０９の間にスペーサ１１３を設ける分子構造を利用することとしている（図２参照）。この構造を採ることにより、分子モータ１１０が反応溶液中では伸張反応を起こさず、分子モータ１１０がナノポア１０１に到達した際に伸張反応すなわち搬送制御を開始させることが出来るようになる。生体ポリマ１０９は、制御鎖１１２が結合した状態で電解質中に封入される。また、電解質溶液中には分子モータ１１０が溶解している。生体ポリマと分子モータは、電解質溶液中で結合する。分子モータが結合した生体ポリマ１０９は、ナノポア近傍に発生している電位勾配によってナノポア導入鎖１１４よりナノポア１０１へ導入される（図３参照）。なお、スペーサのサイズは、２塩基以上とすることができる（当該実施例では４塩基のスペーサを用いている）。
　ここで、分子モータ１１０の直径はナノポア１０１の直径よりも大きいため、ポアの出口方向に進むことが出来ず、ナノポアの入口でとどまる。一方負電荷を帯びている生体ポリマは電場力による二本鎖解離工程に伴い、さらにナノポア出口方向に進み、スペーサを中心に形状変化を起こす。このとき、分子モータ１１０は、プライマー１１１の末端に結合し、スペーサを飛び越えることにより、伸張反応を開始する。伸張反応時は、ステップ（ｃ）の１塩基伸長とステップ（ｄ）の１塩基二本鎖解離を交互に繰り返すことにより、生体ポリマの特性に応じた信号変化を検出することが可能となる。
　ここで、ナノポアを介して印加する電圧に関して、導入の際に用いられた電圧と、分子モータの反応を開始させる際に印加する電圧と信号変化計測時の電圧は全て同じでも良い。一方で、分子モータ種に応じて結合力、引き上げ力が異なるため、異なる電圧を用いた方が所望の信号が検出できる場合もある。生体ポリマの通過速度に寄与する力は、分子モータが分子複合体を保持する力と電位勾配由来の電場力以外にポアの内壁での摩擦も寄与する。その為、ポアの寸法に応じても印加電圧を調整する（例えば、ポアが大きければ印加電圧を下げる）必要がある。
　（i）実施例１
　実施例１では、分子モータとしてBST3.0ポリメラーゼ、ナノポア導入鎖＋プライマー鎖（実施例ではプライマーと呼称する）および制御鎖＋スペーサ＋生体ポリマ（本実施例ではテンプレートと呼称する）は、表１に示した配列のDNAをナノポア計測の際に使用する。以下ではZで示される位置にiSpC3（Spacer C3）をスペーサとして導入した場合の検証を行った。
　表１は、本実施例１における図２の分子複合体として用いたDNA鎖の配列を示している。ここでテンプレートの「AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC」配列に対して、プライマーＡの「GCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT」がハイブリダイゼーションにより二本鎖形成する。また、テンプレートＡの「AGCCAGCGTCCGGGGATGAGCTACTCCCGG」配列に対して、プライマーＢの「CCGGGAGTAGCTCATCCCCGGACGCTGGCT」がハイブリダイゼーションにより二本鎖形成する。ここで、ナノポア導入鎖はプライマーＡのポリＴ配列であり、プライマーはプライマー１の「GCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT」である。制御鎖はテンプレートＡの「AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC」、スペーサは「ZZZZ」、生体ポリマはスペーサの５末端より５末端側にある以降の全配列である。プライマーＢは生体ポリマ部分が一本鎖構造であるため、誤って生体ポリマ部分よりナノポアへ導入されないように二本鎖形成しており、ブロッキングとしての役割を有する。この分子複合体は、プライマーＡ、プライマーＢおよびテンプレートＡを濃度１０μＭとなるように１：１：１の比率で混合し、バッファ溶液としてNEB社製Isothermal Buffer IIを用いて、３０℃で３０分間反応させることにより形成した。DNAポリメラーゼは、BST3.0ポリメラーゼを、基質としてAMP-PNP、UMP-PNP、GMP-PNP、dCTPを、バッファ溶液としてNEB社製Isothermal Buffer IIを、電解質としては塩化カリウム（KCl）をバッファ溶液に３Ｍ濃度添加した条件と添加しない条件下において、環境温度をナノポア計測条件である３７℃下に設定してナノポア計測を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１２は、当該実施例１における分子複合体が分子モータによって動作している際の電流波形代表図を示している。本構造によって、１塩基単位でテンプレートに対応した合成されたDNA鎖がナノポアへと引き下げられ、計測が行われていることが確認できる。
（ii）実施例２
　表２は、実施例２における図１１の分子複合体として用いたDNA鎖の配列を示している。ここで、テンプレートＢとテンプレートＣは自己分子内に相補配列を有するDNA鎖であり、「AGCCAGCGTCCGGGGATGAGCTACTCCCGG」部分と「CCGGGAGTAGCTCATCCCCGGACGCTGGCT」部分において、自己分子内ハイブリダイゼーションを行い、ヘアピン構造を取る。制御鎖はテンプレートＢおよびテンプレートＣの「AGCAATATCAGCACCAACAGAACACCGC」であり、プライマーはプライマーＡの「GCGGTGTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT」であり、ナノポア導入鎖はプライマーＡのポリＴ配列である。ここで、自己ハイブリしたテンプレートＢとテンプレートＣは互いにライゲーションによって結合することが可能であり、ライゲーションによって図１１に示した分子複合体を形成できる。この分子複合体は、まずバッファ溶液としてNEB社製Isothermal Buffer IIを用いて、３０℃で３０分間反応させて、テンプレートＢおよびテンプレートＣをそれぞれ単独で自己ハイブリさせた後、NEB社製Blunt/TA Ligase Master Mixを用いてライゲーションし、Beckman Coulter社製AMPureによって精製した後、プライマーＡおよび精製産物をバッファ溶液としてNEB社製Isothermal Buffer IIを用いて、３０℃で３０分間反応させることにより形成した。
　図１３は、実施例２における分子複合体が分子モータによって動作している際の電流波形の抜粋代表図を示している。本構造によって、１塩基単位で環状テンプレートに対応した合成されたDNA鎖がナノポアへと引き下げられ計測が行われていることが確認できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（iii）生体ポリマ分析用デバイス及び生体ポリマ分析装置の例
　以下では、前述の薄膜を有する生体ポリマ分析用デバイスと、当該デバイスを使用して制御鎖結合した生体ポリマを分析する装置についてさらに詳細に説明する。
　図１４は、生体ポリマ分析装置１４００の構成例を示す。生体ポリマ分析用デバイスと、電源１０７と、電流計１０６と、測定部（コンピュータ）１０８とで構成される生体ポリマ分析装置１４００の構成例を示す。生体ポリマ分析用デバイスにより分離された２つの液槽１０４Ａと１０４Ｂを備えている。液槽はさらに複数の液槽に分割されている。本実施例の場合、薄膜固定部材１０２Ｂは、３つの隔壁により分離された４つの空間を有し、これらの空間がそれぞれ液槽１０４Ｂとして用いられる。なお、液槽１０４Ａは、下側に位置する４つの液槽１０４Ｂに対する共通槽として用いられる。
　仕切り体１０２は、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２Ａと、その薄膜固定部材１０２Ｂおよび１０２Ｃとによって構成される。ナノポア１０１は、薄膜１０２Ａのいずれかの位置に形成されていれば良い。
　薄膜固定部材１０２Ｂと薄膜１０２Ａは、液槽１０４Ａの構造の一部を構成する。また、薄膜１０２Ａと薄膜固定部材１０２Ｃは、液槽１０４Ｂの構造の一部を構成する。
　本実施例の場合、各液槽１０４Ｂのそれぞれには、単一のナノポア１０１と電極１０５Ｂが設けられており、隔壁により互いに絶縁されている。このため、各ナノポア１０１を流れる電流を独立に計測することができる。
　薄膜固定部材１０２Ｂ及び１０２Ｃに設けられた貫通孔の部分で露出する薄膜１０２Ａの寸法は、電圧の印加によるナノポア１０１の形成の際に２個以上のナノポア１０１が形成され難い面積であり、かつ、強度上許容される面積である必要がある。当該面積は、例えば１００～５００ｎｍ程度である。また、DNA一塩基分解能を達成するために、薄膜１０２Ａの膜厚は、一塩基相当の実効膜厚を有するナノポア１０１を形成可能な３～７ｎｍ程度とすることができる。
　液槽１０４Ａと液槽１０４Ｂは、いずれも電解質溶液１０３で満たされている。本実施例の場合、電解質溶液１０３の容量は、マイクロリットルオーダー又はミリリットルオーダーである。
　電解質溶液１０３には、例えばKCl、NaCl、LiCl、RbCl、CsClが用いられる。これらの溶液に対して、分子モータを導入しない液側（１０４Ｂ）には生体ポリマの自己相補鎖形成抑制のために4M以上のUreaや、DMSO、DMF、NaOHを混在することも可能である。また、生体ポリマの安定化のため、緩衝剤を混在させることも可能である。緩衝剤としては、TrisやEDTAやPBSなどが用いられる。
　液槽１０４Ａには電極１０５Ａが設けられ、液槽１０４Ｂには電極１０５Ｂが設けられている。電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、例えばAg、AgCl、プラチナであり、電解質溶液１０３と接触している。図１４では図示していないが、生体ポリマ分析用デバイスの外周面には電極１０５Ａ及び１０５Ｂと電気的に接続された接続端子が設けられており、前述の電源１０７及び電流計１０６と接続される。
　電極１０５Ａと電極１０５Ｂの間に電圧を印加すると、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２Ａの両面の間に電位差が生じ、上側の液槽１０２Ａに溶解しているDNA鎖（複合体：図２、７、９、１１参照）が、下側に位置する液槽１０４Ｂの方向に泳動される。因みに、前述の電流計１０６は、電圧の印加によって電極間に流れる電流を増幅するアンプとＡＤＣ（Analog to Digital Converter）を有している。ＡＤＣの出力である検出値が測定部（コンピュータ）１０８に出力される。測定部（コンピュータ）１０８は、検出された電流値を収集し記録する。なお、電源１０７、電流計１０６および測定部（コンピュータ）１０８を生体ポリマ分析用デバイスに対して別構成とするのではなく、電源１０７、電流計１０６および測定部（コンピュータ）１０８を生体ポリマ分析用デバイスと一体構成としても良い。
　生体ポリマに結合させる制御鎖は、別途提供され、サンプル調整の前処理を行った上で、液槽１０４Ａに導入される。液槽１０４Ａの電解質には、分子モータの駆動に適したバッファを共存させる。バッファ中には、用いた分子モータに適したバッファを利用し、一般には、例えば、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Tween、Tris-HClなどを混在させる。
　以下では、前述した生体ポリマ分析用デバイスの作製方法について説明する。いわゆる封鎖電流方式で生体ポリマの分析に用いられる生体ポリマ分析用デバイスの基本的な構成自体は当技術分野で既知であり、その構成要素も当業者であれば容易に理解することができる。例えば、米国特許第5795782号や“Scientific Reports 4, 5000, 2014,Akahori, et al.”, “Nanotechnology 25(27):275501, 2014, Yanagi, et al.”, “Scientific Reports, 5, 14656, 2015, Goto, et al.”, “Scientific Reports 5, 16640, 2015”に具体的なデバイスが開示されている。
　ナノポア１０１が形成される薄膜１０２Ａは、中心に細孔を有するタンパク質が埋め込まれた両親媒性分子層からなる脂質二重層（バイオポア）であってもよいし、半導体微細加工技術で形成できる材質からなる薄膜（ソリッドポア）であってもよい。半導体微細加工技術で形成できる材質としては、例えば窒化ケイ素（SiN）、酸化ケイ素（SiO2）、酸窒化ケイ素（SiON）、酸化ハフニウム（HfO2）、二硫化モリブデン（MoS2）、グラフェンなどがある。薄膜の厚さは、１Å～２００ｎｍ、１Å～１００ｎｍ、あるいは１Å～５０ｎｍとすることができ、本実施例では約５ｎｍとしている。
　ナノポア１０１の寸法は、分析対象である生体ポリマの種類に応じて適切な寸法を選択することができ、例えば０．９ｎｍ～１００ｎｍ、あるいは０．９ｎｍ～５０ｎｍである。さらに具体的には、およそ０．９ｎｍ以上１０ｎｍ以下とすることができる。例えば、直径が約１．４ｎｍである一本鎖DNAの分析に用いるナノポア１０１の径は、０．８ｎｍ～１０ｎｍ、０．８ｎｍ～３ｎｍ、あるいは０．８ｎｍ～１．６ｎｍ程度とすることができる。また、例えば、直径が約２．６ｎｍである二本鎖DNAの分析に用いるナノポア１０１の径は、３ｎｍ～１０ｎｍ程度、あるいは３ｎｍ～５ｎｍ程度とすることができる。
　ナノポア１０１の深さは、薄膜１０２Ａの厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア１０１の深さは、生体ポリマを構成するモノマ単位の２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上の大きさとする。例えば生体ポリマが核酸から構成されている場合には、ナノポア１０１の深さは、塩基３個以上の大きさ、例えば約1 nm以上とすることが好ましい。これにより、生体ポリマをその形状と移動速度を制御しながらナノポア１０１に進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。また、ナノポア１０１の形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
　ナノポア１０１を有する薄膜１０２Ａを複数備えるアレイ型の装置構成の場合には、ナノポア１０１を有する薄膜１０２Ａを規則的に配列することが好ましい。複数の薄膜１０２Ａを配置する間隔は、使用する電極、電気測定系の能力に応じて、０．１ｍｍ～１０ｍｍ、あるいは０．５ｍｍ～４ｍｍとすることができる。
　薄膜１０２Ａ中にナノポア１０１を形成する方法は、特に限定されるものではなく、例えば透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などを用いることができる。例えば“Itaru Yanagi et al., Sci. Rep. 4, 5000 (2014)”に記載されている方法を使用することができる。
　ナノポア１０１の形成は、例えば以下の手順で行うことができる。仕切り体１０２を生体ポリマ分析用デバイス等にセットする前に、Ar／O2 plasma（SAMCO Inc., Japan）により、１０ＷＷ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件で、Si3N4薄膜を親水化する。次に、生体ポリマ分析用デバイスに仕切り体１０２をセットする。その後、液槽１０４Ａおよび１０４Ｂを、１Ｍ KCl、１ｍＭ Tris-１０ｍＭEDTA、ｐＨ７．５溶液で満たし、各液槽１０４Ａおよび１０４Ｂのそれぞれに電極１０５Ａおよび１０５Ｂを導入した。
　電圧の印加は、ナノポア１０１の形成時だけでなく、ナノポア１０１が形成された後にナノポア１０１を介して流れるイオン電流の計測時にも行われる。ここでは、上側に位置する液槽１０４Ａをcis槽と呼び、下側に位置する液槽１０４Ｂをtrans槽と呼ぶ。また、cis槽側の電極に印加する電圧Ｖcisを０Ｖに設定し、trans槽側の電極に電圧Ｖtransを印加する。電圧Ｖtransは、パルス発生器（41501B SMU AND Pulse Generator Expander, Agilent Technologies, Inc.）により発生する。
　パルス印加後の電流値は、電流計１０６（4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER、 Agilent Technologies, Inc.）で読み取った。ナノポア１０１の形成のために電圧を印加するプロセス及びイオン電流値を読み取るプロセスは、自作プログラム（Excel VBA、 Visual Basic for Applications）で制御した。パルス電圧の印加前に形成されたナノポア１０１の直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し、順次、ナノポア１０１の直径を大きくしつつ、目的とする直径を得る。
　ナノポア１０１の直径は、イオン電流値から見積もった。ここで、ｎ番目のパルス電圧印加時間ｔn（ただし、ｎ＞２の整数。）は、次式で決定される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　ナノポア１０１の形成は、パルス電圧を印加する方法以外に、ＴＥＭによる電子線照射によっても可能である（A. J. Storm et al.、 Nat. Mat. 2 (2003)）。
　上下２つの液槽１０４Ａおよび１０４Ｂに設けられた電極１０５Ａおよび１０５Ｂに電源１０７から電圧が印加されると、ナノポア１０１の近傍に電場が生じ、液中で負に帯電したDNA鎖（複合体：図２、７、９、１１参照）は、ナノポア１０１内を通過する。その際、前述した封鎖電流Iｂが流れる。
　薄膜１０２Ａに接触する測定溶液を収納できる液槽１０４Ａおよび１０４Ｂは、封鎖電流の測定に影響を及ぼさない材質、形状及び大きさで、適宜設けることができる。これらの液槽１０４Ａおよび１０４Ｂを仕切る薄膜１０２Ａに接液するように測定溶液が注入される。
　電極１０５Ａおよび１０５Ｂは、測定溶液中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製することができ、典型的には、ハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製することができる。電位安定性及び信頼性の観点からは、銀又は銀塩化銀を使用するようにしてもよい。
　電極１０５Ａおよび１０５Ｂは、分極電極となる材質で作製されてもよく、例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合、安定的なイオン電流を確保するために測定溶液に電子授受反応を補助することができる物質、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することが好ましい。あるいは、電子授受反応を行うことが可能な物質、例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することができる。
　電極１０５Ａおよび１０５Ｂの構造は、全てが上記材質で構成されていてもよく、あるいは上記材質が下地材（銅、アルミニウムなど）の表面に被覆されていてもよい。電極の形状は特に限定されるものではないが、測定溶液と接液する表面積が大きくなる形状が好ましい。電極は配線と接合されて、測定回路へと電気的信号が送られる。
　本実施例に係る生体ポリマを分析するためのナノポアデバイスは、上述した構成を要素として含む。ナノポアデバイスは、使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。制御鎖やNTP類似体等は、即時使用可能な状態で提供されてもよいし、計測対象となる生体ポリマのみが結合していない状態で構成提供されてもよい。そのような形態及び調製は、当業者であれば理解することができる。ナノポアデバイスに関しても同様に、即時使用可能な状態でナノポアが形成されている状態で提供されてもよいし、提供先で形成される状態で提供されてもよい。
（４）まとめ
（i）本実施形態によれば、１本鎖飛び出しDNAをナノポアへと導入することにより、ナノポアの電場力をトリガーとしてDNAポリメラーゼの伸長反応が開始される。伸長生成された鋳型は、ナノポアの電場力によって一本鎖へと解離されていく。また、鋳型となるDNA鎖を環状構造としておくことでRCA反応により、繰返し読取を行うことが可能となる。これにより、ナノポアへと電場力を印加し続けておくだけで、自発的な伸長反応開始が可能となり、煩雑な手順を必要とせず、かつ精密なシーケンシングを行うことが可能となる。
　具体的には、本実施形態による分子複合体（図２など参照）は、一本鎖飛び出し二本鎖DNAを備えており、生体ポリマ（ターゲット）と、生体ポリマより短いプライマーと、プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、を含んでいる。そして、生体ポリマとDNAポリメラーゼとは、プライマーの３末端部における一本鎖部分と二本鎖部分の連結位置において、スペーサで連結されている。スペーサは、分子モータ（DNAポリメラーゼ）の反応を制御するスイッチとしての役割を有し、通常時には分子モータの反応を停止しているが、ナノポアでの計測、すなわち電圧による力が印加されると分子モータの反応を開始させる機能を持っている。生体ポリマに結合する制御鎖と生体ポリマの間にスペーサを設けることにより、分子モータは、生体ポリマがナノポアに導入される前にプライマーから伸張反応が開始してしまうような事態を避けることができる。つまり、このような構造を採ることにより、分子モータが反応溶液中では伸張反応を起こさず、分子モータがナノポアに到達した際に伸張反応すなわち搬送制御を開始させることが出来るようになる。なお、搬送制御を適切に行うために、スペーサの長さを２塩基以上とすることができる。
　また、生体ポリマを、環状DNAで構成するようにしてもよい。生体ポリマを環状DNA鎖とすると環状伸長反応により、生体ポリマを何度も繰返し読み取ることが可能となる。また、当該複合分子体に、さらに、一本鎖飛び出しDNAを有するアダプタを設けてもよい。このとき、環状DNAで構成される生体ポリマは、主鎖と相補鎖とを含む二本鎖構造をなしている。そして、環状DNAの主鎖および相補鎖の５末端部は、アダプタを介して、環状DNAの主鎖および相補鎖の３末端部と連結されて環状をなすように分子複合体が構成される。
　さらに、分子モータ（DNAポリメラーゼ）として、A-familyポリメラーゼを用いることができる。A-familyポリメラーゼを用いることにより、高い塩濃度条件下でも伸長反応が可能となる。
　また、生体ポリマ（ターゲット）が二本鎖DNA構造の場合には、分子モータ（NAポリメラーゼ）が鎖置換活性を有するようにするとよい。また、生体ポリマ（ターゲット）基質としてNTP類似体を含めてもよい。NTP類似体を基質として利用すれば、分子モータとして良好な機能を発揮することができる。
　図７に示されるように、複合分子体を、主鎖と相補鎖とを含む二本鎖DNAで構成される生体ポリマ（ターゲット）の両端部に第１および第２複合アダプタを備えるように構成してもよい。この場合、第１および第２複合アダプタは、それぞれ、生体ポリマより短いプライマーと、プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、第１アダプタと、第１アダプタの相補配列を有する第２アダプタと、を備えている。そして、生体ポリマの両端部は、第１複合アダプタの第１および第２アダプタと、第２複合アダプタの第１および第２アダプタに連結されている。より詳細には、第１および第２複合アダプタの第１アダプタの５末端部はそれぞれ、生体ポリマの主鎖および相補鎖の３末端部と連結している。第１および第２複合アダプタの第２アダプタの３末端部はそれぞれ、生体ポリマの主鎖および相補鎖の５末端部と連結している。生体ポリマの両端に複合アダプタを連結させて対称構造にすることにより、どちらの末端部からナノポアに導入されても同様に搬送制御することができるようになる。また、上述同様に、生体ポリマに結合する制御鎖と生体ポリマの間にスペーサを設けることにより、分子モータは、生体ポリマがナノポアに導入される前にプライマーから伸張反応が開始してしまうような事態を避けることができる。
（ii）本実施形態は、生体ポリマを含む分子複合体をナノポアに導入して生体ポリマを分析する生体ポリマ分析方法についても開示している。当該生体ポリマ分析方法は、生体ポリマ分析装置に設けられた一対の電極の間に電圧を印加して得られる電場力によって、分子複合体（生体ポリマとDNAポリメラーゼとが、プライマーの３末端部における一本鎖部分と二本鎖部分の連結位置において、スペーサで連結されている構造をなしている）をナノポアに導入することと、分子複合体のナノポアへの導入をトリガーとして、DNAポリメラーゼの伸長反応を開始させることと、DNAポリメラーゼにより起こる、プライマーの３末端部からの伸長反応（自発的な伸長反応）によって、生体ポリマに対応する合成鎖を生成することと、電場力によって、合成鎖をナノポアに導入し、DNAポリメラーゼの伸長反応によって合成鎖をナノポアへと搬送制御することと、合成鎖をナノポアに搬送制御する際に発生する、合成鎖に由来の特徴量をポリマ分析装置の測定部によって検出することにより、合成鎖の配列をシーケンスすることと、を含んでいる。この場合、合成鎖のナノポアへの搬送制御は、合成鎖の二本鎖DNAを電場力によって生体ポリマの３末端部から解離しながら、DNAポリメラーゼの自発的な伸長反応によって実行される。このようにすることにより、煩雑な手順を必要とせず、かつ精密なシーケンシングを行うことが可能となる。
　また、生体ポリマが環状DNAで構成されている場合は、環状DNAを基に、合成鎖をシーケンスして得られた周期的な特徴量を用いて、周期的特徴量から単位配列が決定される。環状DNAをシーケンスする場合、周期的に特徴量が得られ、この特徴量から生体ポリマの単位配列を適切に決定することが可能となる。
　なお、本実施形態において、生体ポリマ分析を行う場合、電解質溶液の塩濃度を３Ｍ濃度以上とし、ナノポアの直径を０．８～３．０ｎｍにすることができる。
（iii）本開示による技術は、上述した実施形態および実施例に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることができる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の実施例の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
１０、１４００　生体ポリマ分析装置
１００　生体ポリマ分析用デバイス
１０１　ナノポア
１０２　薄膜
１０３　電解質溶液
１０４Ａ、１０４Ｂ　液槽
１０５Ａ、１０５Ｂ　電極
１０６　電流計
１０７　電源
１０８　コンピュータ
１０９　生体ポリマ
１１０　分子モータ
１１１　プライマー
１１２　制御鎖
１１３　スペーサ
１１４　ナノポア導入鎖
１１５　アダプタＡ
１１６　アダプタＢ
１１７　アダプタＣ

Claims (15)

  1. 　一本鎖飛び出し二本鎖DNAを備える分子複合体であって、
    　生体ポリマと、
    　ナノポア導入鎖と、
    　前記生体ポリマより短いプライマーと、
    　前記プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、
    　前記DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、
    　制御鎖と、を備え、
    　前記DNAポリメラーゼは、前記スペーサの近傍に結合している、
    分子複合体。
  2. 　請求項１において、
    　前記生体ポリマは、環状DNAで構成されている、分子複合体。
  3. 　請求項２において、
    　さらに、一本鎖飛び出しDNAを有するアダプタを備え、
    　前記環状DNAは、主鎖と相補鎖とを含む二本鎖構造で構成され、
    　前記環状DNAの主鎖および相補鎖の５末端部は、前記アダプタを介して、前記環状DNAの主鎖および相補鎖の３末端部と連結されて環状をなしている、分子複合体。
  4. 　請求項１において、
    　前記DNAポリメラーゼは、A-familyポリメラーゼである、分子複合体。
  5. 　請求項１において、
    　前記DNAポリメラーゼは、鎖置換活性を有する、分子複合体。
  6. 　請求項１において、
    　前記DNAポリメラーゼは、基質としてdNTP類似体を含む、分子複合体。
  7. 　請求項１において、
    　前記スペーサは、２塩基以上の長さを有する、分子複合体。
  8. 　主鎖と相補鎖とを含む二本鎖DNAで構成される生体ポリマの両端部に第１および第２複合アダプタを備え、
    　前記第１および第２複合アダプタは、それぞれ、
    　　前記生体ポリマより短いプライマーと、
    　　前記プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、
    　　前記DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、
    　　第１アダプタと、
    　　前記第１アダプタの相補配列を有する第２アダプタと、を備え、
    　前記生体ポリマの両端部は、前記第１複合アダプタの前記第１および第２アダプタと、前記第２複合アダプタの前記第１および第２アダプタに連結されている、分子複合体。
  9. 　請求項８において、
    　前記第１および第２複合アダプタの前記第１アダプタの５末端部はそれぞれ、前記生体ポリマの前記主鎖および前記相補鎖の３末端部と連結しており、
    　前記第１および第２複合アダプタの前記第２アダプタの３末端部はそれぞれ、前記生体ポリマの前記主鎖および前記相補鎖の５末端部と連結している、分子複合体。
  10. 　請求項８において、
    　前記スペーサは、２塩基以上の長さを有する、分子複合体。
  11. 　生体ポリマを含む分子複合体をナノポアに導入して前記生体ポリマを分析する生体ポリマ分析方法であって、
    　前記分子複合体は、一本鎖飛び出し二本鎖DNAを備える分子複合体であって、生体ポリマと、ナノポア導入鎖と、前記生体ポリマより短いプライマーと、前記プライマーの３末端部に結合したDNAポリメラーゼと、前記DNAポリメラーゼの伸長反応を停止するスペーサと、制御鎖と、を備え、前記DNAポリメラーゼは、前記スペーサの近傍に結合しており、
    　少なくとも１つ以上のナノポアを有する絶縁性の薄膜と、当該薄膜を挟んで設けられた、電解質溶液を収容する２つ以上の溶液槽と、当該２つ以上の溶液槽に設けられた少なくとも一対の電極と、当該一対の電極の間を流れるイオン電流を測定する測定部と、を備える生体ポリマ装置を準備することと、
    　前記一対の電極の間に電圧を印加して得られる電場力によって、前記分子複合体を前記ナノポアに導入することと、
    　前記分子複合体の前記ナノポアへの導入をトリガーとして、前記DNAポリメラーゼの伸長反応を開始させることと、
    　前記DNAポリメラーゼにより起こる、前記プライマーの３末端部からの伸長反応によって、前記生体ポリマに対応する合成鎖を生成することと、
    　前記電場力によって、前記合成鎖を前記ナノポアに導入し、前記DNAポリメラーゼの伸長反応によって前記合成鎖を前記ナノポアへと搬送制御することと、
    　前記合成鎖を前記ナノポアに搬送制御する際に発生する、前記合成鎖に由来の特徴量を前記測定部によって検出することにより、前記合成鎖の配列をシーケンスすることと、
    を含む生体ポリマ分析方法。
  12. 　請求項１１において、
    　前記合成鎖の前記二本鎖DNAを、前記電場力によって前記生体ポリマの３末端部から解離しながら、前記DNAポリメラーゼの伸長反応によって前記合成鎖を前記ナノポアに搬送制御する、生体ポリマ分析方法。
  13. 　請求項１１において、
    　前記生体ポリマは、環状DNAで構成されており、
    　前記環状DNAを基に、前記合成鎖をシーケンスして得られた周期的な特徴量を用いて、周期的特徴量から単位配列を決定する、生体ポリマ分析方法。
  14. 　請求項１１において、
    　前記電解質溶液の塩濃度は、３Ｍ濃度以上である、生体ポリマ分析方法。
  15. 　請求項１１において、
    　前記分子複合体を、直径０．８～３．０ｎｍのナノポアに導入する、生体ポリマ分析方法。
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JP2010263845A (ja) * 2009-05-15 2010-11-25 Hitachi High-Technologies Corp 核酸分析方法及び核酸分析装置
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