WO2020084705A1 - 生体ポリマ分析デバイス及びそれを用いた分析装置、並びに分析方法 - Google Patents

生体ポリマ分析デバイス及びそれを用いた分析装置、並びに分析方法 Download PDF

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WO2020084705A1
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biopolymer
nanopore
dna
enzyme
dna polymerase
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PCT/JP2018/039466
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English (en)
French (fr)
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佑介 後藤
玲奈 赤堀
満 藤岡
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株式会社日立ハイテク
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Definitions

  • the present disclosure relates to a biopolymer analysis device, an analysis device using the same, and an analysis method.
  • An analyzer using a nanopore device has been developed as an analyzer for analyzing the monomer sequence of a biopolymer.
  • Such an analyzer is used as a DNA base sequence analysis system (DNA sequencer) when the biopolymer is DNA, and as an amino acid sequence analysis system (amino acid sequencer) when the biopolymer is protein. It is expected as a system capable of decoding long sequence lengths.
  • a nanopore device is a thin film with pores (nanopores) with a diameter of several ⁇ to several nanometers and a liquid tank on each side of a thin film with a thickness of several ⁇ to several tens of nanometers.
  • An electrolyte solution is passed through the nanopores by creating a potential difference across both ends of the nanopore.
  • a pH neutral aqueous potassium chloride solution is typically used as the electrolyte solution.
  • the ionic current around the nanopore changes in a pattern according to the monomer arrangement pattern.
  • the ionic current is proportional to the cross-sectional area of the nanopore as a first approximation.
  • the biopolymer blocks the nanopore and reduces the effective cross-sectional area through which the ions can pass, thus reducing the ionic current. This reduction amount is called a blocking current.
  • Such a blocking current type nanopore device can analyze a monomer arrangement of a biopolymer by detecting a change in ionic current. Since the analysis accuracy of the monomer array is determined by the amount of change in ion current, the larger the difference in ion current amount between monomers, the better.
  • nanopore devices There are two types of nanopore devices: a bio-nanopore type that uses a protein with a central pore that is embedded in a lipid bilayer, and a solid nanopore type that uses an insulating thin film formed by a semiconductor processing process.
  • a bio-nanopore type that uses a protein with a central pore that is embedded in a lipid bilayer
  • a solid nanopore type that uses an insulating thin film formed by a semiconductor processing process.
  • the pores (diameter 1.2 nm, thickness 0.6 nm) of the modified protein (Mycobacterium smegmatisporinA (MspA) etc.) embedded in the lipid bilayer membrane are used as the biopolymer detector to detect ionic current. Measure the amount of change.
  • MspA Mycobacterium smegmatisporinA
  • the solid nanopore type a structure in which nanopores are formed in a thin film of silicon nitride (SiN) which is a semiconductor material or a thin film composed of a monomolecular layer such as graphene or molybdenum disulfide is used.
  • SiN silicon nitride
  • a monomolecular layer such as graphene or molybdenum disulfide
  • Patent Document 1 As a solid nanopore type nanopore DNA sequencer, it has been reported that the blocking current amount of homopolymer adenine base, cytosine base, thymine base, and guanine base was measured using an aqueous potassium chloride solution under neutral pH (Patent Document 1).
  • a DNA polymerase binds a primer to DNA serving as a template, passes a single-stranded portion through a nanopore, and an elongation reaction occurs when the DNA polymerase binds to a primer end, so that the DNA is pulled by an electric field.
  • the delivery of DNA is realized against the force.
  • an ion current signal corresponding to the base species can be obtained (Patent Documents 2 to 5).
  • the problem with the above transport control method is that it is difficult to control the enzyme under high salt concentration.
  • the electrical conductivity of the nanopores is higher under a high salt concentration, so that the fluctuation amount of the blockade current signal corresponding to the base sequence at the time of passing through the DNA is increased, while the noise signal is increased. Since it is almost constant, measurement can be realized with a high SN ratio (Signal / Noise ratio).
  • the enzyme is inactivated and cannot function as a molecular motor, so that there is a trade-off problem that DNA transport cannot be controlled.
  • a biopolymer analysis device that satisfactorily controls the transport of each monomer, an analysis apparatus using the same, and an analysis method are provided.
  • a biopolymer analysis device includes a thin film having nanopores, a first liquid tank and a second liquid tank that are arranged so as to sandwich the thin film, and store an electrolyte solution, An external field applying unit for applying an external field between the first liquid tank and the second liquid tank, wherein the first liquid tank has a biological polymer, an enzyme that binds to the biological polymer, and the enzyme. Is introduced into the nanopore by the application of the external field, the enzyme takes up the NTP analog, and the biopolymer is transported in the nanopore. It is characterized by
  • the schematic diagram which shows the conveyance control process of the biopolymer in the nanopore vicinity. The figure explaining the state of a living body polymer in the case where an extension reaction is started before introducing a nanopore of a living body polymer (a), and when an extension reaction is started after introducing a living body's nanopore (b).
  • the figure which shows the structural formula of dNTP The figure which shows the result of the electrophoresis in the salt tolerance test of Bst 3.0 DNA polymerase. The figure which shows the result of the electrophoresis in the salt tolerance test of Csa DNA polymerase.
  • 96-7 is a view showing a result of electrophoresis in a salt tolerance test of 96-7 DNA polymerase.
  • phi29 is a diagram showing the results of electrophoresis in a salt tolerance test of DNA polymerase.
  • the figure which shows the structural formula of NMP-PNP The figure which shows the result of the nanopore analysis when NMP-PNP is used as a substrate for Bst 3.0 DNA polymerase.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of an analyzer 1 according to the first embodiment.
  • the analysis apparatus 1 includes a biopolymer analysis device 100, an ammeter 106, a power supply 107, and a computer 108 (analysis unit).
  • the biological polymer to be analyzed is, for example, DNA or RNA whose nucleic acid is a monomer, or a polypeptide or protein whose amino acid is a monomer.
  • the analyzer 1 is a DNA sequencer that analyzes DNA will be described as an example.
  • the biopolymer analysis device 100 includes a thin film 102A having nanopores 101, liquid tanks 104A and 104B (first liquid tank and second liquid tank) containing an electrolyte solution 103, and electrodes 105A and 105B (external field application unit). Equipped with.
  • the biopolymer analysis device 100 adopts a method of introducing the biopolymer 109 into the nanopore 101 by electrophoresis.
  • the method of introducing the biopolymer 109 into the nanopore 101 is not limited to this, and other methods may be adopted.
  • the thin film 102A may be a lipid bilayer (bio-type nanopore) composed of an amphipathic molecule layer in which a protein having a pore in the center is embedded, or a thin film (Material formed by semiconductor microfabrication technology ( It may be a solid type nanopore).
  • Materials that can be formed by the semiconductor fine processing technology include, for example, silicon nitride (SiN), silicon oxide (SiO 2 ), silicon oxynitride (SiON), hafnium oxide (HfO 2 ), molybdenum disulfide (MoS 2 ), graphene, and the like. Is mentioned.
  • the thickness of the thin film 102A is preferably 1 ⁇ to 200 nm, more preferably 1 ⁇ to 100 nm, still more preferably 1 ⁇ to 50 nm, and for example, about 5 nm.
  • the depth of the nanopore 101 can be adjusted by adjusting the thickness of the thin film 102A.
  • the depth of the nanopore 101 is preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, further preferably 5 times or more as large as the monomer unit constituting the biopolymer 109.
  • the depth of the nanopore 101 is preferably, for example, 3 bases or more, that is, about 1 nm or more. This allows the biopolymer 109 to enter the nanopore 101 while controlling its shape and moving speed, and enables highly sensitive and highly accurate analysis.
  • the shape of the cross section of the nanopore 101 in the horizontal plane is basically circular, but it may be elliptical or polygonal.
  • the liquid tanks 104A and 104B are arranged on both sides of the thin film 102A and filled with the electrolyte solution 103. Electrode 105A is arranged in liquid tank 104A, and electrode 105B is arranged in liquid tank 104B.
  • the liquid tanks 104A and 104B are formed of a material, shape and size that do not affect the measurement of the blocking current.
  • the capacity of the electrolyte solution 103 is, for example, on the order of microliters or milliliters. Details of the electrolyte solution 103 will be described later.
  • the biopolymer 109 is introduced into the liquid tank 104A during the nanopore analysis in a state of being bound to the control chain 111 by the pretreatment.
  • the electrodes 105A and 105B are preferably made of a material capable of performing an electron transfer reaction (Faraday reaction) with the electrolyte in the electrolyte solution 103, and typically made of silver halide or alkali silver halide. To be done. From the viewpoint of potential stability and reliability, it is preferable to use silver or silver chloride.
  • Faraday reaction electron transfer reaction
  • the electrodes 105A and 105B may be made of a material that becomes a polarized electrode, for example, gold or platinum. In that case, in order to secure a stable ionic current, it is preferable to add a substance capable of assisting the electron transfer reaction to the electrolyte solution 103, such as potassium ferricyanide or potassium ferrocyanide. Alternatively, it is preferable to immobilize a substance capable of performing an electron transfer reaction, such as ferrocene, on the surface of the polarized electrode.
  • the electrodes 105A and 105B may be entirely made of the above material, or the surface of a base material (copper, aluminum, etc.) may be coated with the above material.
  • the shapes of the electrodes 105A and 105B are not particularly limited, but a shape that increases the surface area in contact with the electrolyte solution 103 is preferable.
  • connection terminals electrically connected to the electrodes 105A and 105B are provided on the outer peripheral surface of the biopolymer analysis device 100, whereby the electrodes 105A and 105B are connected to the power source 107 and It is connected to the ammeter 106.
  • the biopolymer 109 passes through the nanopore 101 while being coupled to the molecular motor 110. Since the molecular motor 110 is generally larger than the diameter of the nanopore 101, it cannot pass through the nanopore 101. In order to realize this limitation, the diameter of the nanopore 101 is in the range of 0.8 nm, which is the lower limit that allows single-stranded DNA to pass, and 3 nm, which is the upper limit that the enzyme that is the molecular motor 110 does not pass. Is preferred.
  • the ammeter 106 measures an ionic current (blocking current) flowing between the electrodes 105A and 105B. Although not shown, it has an amplifier for amplifying a current flowing between the electrodes 105A and 105B, and an analog / digital converter. The ammeter 106 is connected to the computer 108, and the analog / digital converter outputs the current value of the detected ion current to the computer 108 as a digital signal.
  • the computer 108 acquires the monomer arrangement information of the biopolymer based on the detected ionic current value. Further, the computer 108 records the current value and the acquired monomer arrangement information.
  • the current value measured in the absence of the biopolymer 109 is used as a reference (pore current), and the current observed when the biopolymer 109 is sealed (nanopore).
  • the blockage by the biopolymer 109 of 101) is measured, and the passage speed and state of the molecule are observed.
  • the acquired current value returns to the pore current. It is possible to analyze the nanopore passage speed of the biopolymer 109 from this blocking time, and to analyze the characteristics of the biopolymer 109 from the blocking amount.
  • the configuration may be such that the monomer arrangement information of the biopolymer 109 is acquired based on the optical signal. That is, a method may be used in which each monomer is labeled with a characteristic fluorescence wavelength, and the fluorescence signal is measured to determine each monomer sequence.
  • the power supply 107, the ammeter 106, and the computer 108 are not separate members from the biological polymer analysis device 100, but the power supply 107, the ammeter 106, and the computer 108 are used as the biological polymer analysis device 100. It may be integrated with.
  • the nanopore 101 is formed on the thin film 102A by, for example, electron beam irradiation by a transmission electron microscope or the like, or dielectric breakdown by voltage application.
  • the nanopore 101 can be formed by applying a voltage, for example, by the following procedure.
  • the Si 3 N 4 thin film is made hydrophilic by Ar / O 2 plasma (manufactured by Samco Co., Ltd.) under the conditions of 10 WW, 20 sccm, 20 Pa, and 45 sec.
  • the thin film 102A is set on the biopolymer analysis device 100.
  • the liquid tanks 104A and 104B are filled with the electrolyte solution 103, the electrodes 105A and 105B are introduced into the liquid tanks 104A and 104B, and a voltage is applied.
  • the liquid tank 104B located on the lower side is called a cis tank
  • the liquid tank 104A located on the upper side is called a trans tank.
  • the voltage Vcis applied to the electrode on the cis tank side is set to 0 V
  • the voltage Vtrans is applied to the electrode on the trans tank side.
  • the voltage Vtrans is applied as a pulse voltage by, for example, a pulse generator (41501B SMU AND Pulse Generator Expander, manufactured by Agilent Technologies).
  • the process of applying a voltage to form the nanopore 101 is controlled by, for example, a self-made program (Excel VBA, Visual Basic for Applications).
  • the current value after applying the pulse voltage can be read by an ammeter 106 (4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER, manufactured by Agilent Technologies).
  • the diameter of the nanopore 101 can be estimated from the ion current value.
  • a current value condition (threshold current) is selected in accordance with the diameter of the nanopore 101 formed before the application of the pulse voltage, and the diameter of the nanopore 101 is successively increased to obtain the target diameter.
  • the criteria for selecting the conditions are shown in Table 1.
  • the n-th pulse voltage application time t n (where n> 2 is an integer) is determined by the following equation.
  • the transport control of the biopolymer 109 in this embodiment will be described.
  • the transport control of the biopolymer 109 is mainly performed by the molecular motor 110 using an enzyme.
  • an enzyme capable of binding to the biopolymer 109 can be used without particular limitation.
  • the biopolymer 109 is DNA
  • DNA polymerase, DNA helicase, DNA exonuclease, DNA transposase and the like can be mentioned.
  • the biological polymer 109 is RNA, RNA polymerase, RNA helicase, RNA exonuclease, RNA transposase and the like can be mentioned.
  • the molecular motor 110 and the substrate are introduced into the liquid tank 104A during nanopore analysis by the analyzer 1.
  • control chain 111 is bonded to the biopolymer 109 that is the reading target.
  • the target of the reading of the monomer sequence is a DNA chain which is a main chain of single-stranded or partially single-stranded DNA, and a control chain 111 in the main chain. It is included.
  • the biopolymer 109 more preferably satisfies the following (a) to (c).
  • the control chain 111 exists in the biopolymer 109 to be read.
  • the primer 112 is bound to the control chain 111.
  • the spacer 113 is present in the control chain 111.
  • the primer 112 is a DNA sequence that is a complementary strand of the control strand 111.
  • the spacer 113 has a role as a switch that controls the reaction of the molecular motor 110, and normally stops the reaction of the molecular motor 110. However, when the measurement is performed by the nanopore 101, that is, a force is applied to the molecule, It has a function of starting the reaction of the motor 110.
  • the spacer 113 is preferably abasic, and is also preferably a linear linking body.
  • the spacer arrangement length may be 1 base or more from the primer connecting portion, but it is preferably 2 bases or more, that is, about 0.6 ⁇ 2 nm or more.
  • linkers examples include, but are not limited to, SpacerC3 (iSpC3), PC Spacer, Spacer9, Spacer18, dSpacer, hexanediol, linear carbon chain, linear chain.
  • suitable linkers include, but are not limited to, SpacerC3 (iSpC3), PC Spacer, Spacer9, Spacer18, dSpacer, hexanediol, linear carbon chain, linear chain.
  • suitable linkers include amino acids, straight chain fatty acids, straight chain sugar chains and the like. It is particularly preferable to introduce Spacer C3 continuously for 4 mer or more.
  • the biopolymer 109 has a structure of a single-stranded protruding double-stranded DNA (ssDNA-overhang dsDNA) composed of a main-stranded DNA (template) to be read and a complementary-stranded DNA (primer) shorter than the main-stranded DNA. It is preferable to have
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the configuration of the molecular complex according to the present embodiment.
  • the molecular motor 110 binds to the single-stranded protruding double-stranded DNA in the vicinity of the boundary between the single-stranded portion and the double-stranded portion to form a molecular complex.
  • the molecular motor 110 reacts with the primer 112 to move the relative positions of the main chain DNA and the nanopore 101 in the molecular complex described above by one base, thereby achieving good transport control. Done. This makes it possible to obtain the base sequence information in the main chain DNA.
  • the biopolymer 109 is pulled up from the nanopore 101.
  • the molecular motor 110 is a DNA helicase or a DNA exonuclease
  • the biopolymer 109 is pulled down to the nanopore 101.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the transport control process of the biopolymer 109 in the vicinity of the nanopore 101.
  • the biopolymer 109 is introduced into the electrolyte solution 103 in a state where the control chain 111 is bound.
  • the molecular motor 110 and the substrate are dissolved in the electrolyte solution 103, and the biopolymer 109 and the molecular motor 110 are bound in the electrolyte solution 103.
  • the biopolymer 109 bound to the molecular motor 110 is introduced into the nanopore 101 by the force 302 received from the electric field generated in the vicinity of the nanopore 101.
  • the molecular motor 110 since the diameter of the molecular motor 110 is larger than the diameter of the nanopore 101, it cannot proceed toward the exit of the nanopore 101 and stays at the entrance of the nanopore 101.
  • the biopolymer 109 having a negative charge further advances toward the exit of the nanopore 101 and undergoes a shape change around the spacer 113.
  • the molecular motor 110 binds to the end of the primer 112 in the control chain 111 and starts an extension reaction.
  • the biopolymer 109 has an electric field. It is conveyed in the opposite direction. At this time, it is possible to detect a signal change according to the characteristics of the biopolymer 109.
  • the voltage V1 used at the time of introduction, the voltage V2 applied at the time of coupling the molecular motor 110, and the voltage V3 at the time of measurement may all be the same.
  • the binding force and the pulling force differ depending on the type of the molecular motor 110, there are cases where a desired signal can be detected by using different voltages.
  • the force that contributes to the passing speed of the biological polymer 109 also contributes to the friction on the inner wall of the nanopore 101, in addition to the pulling force 301 and the force 302 that is received from the electric field. Therefore, it is necessary to adjust the applied voltage according to the size of the nanopore 101.
  • the molecular motor 110 starts the extension reaction from the primer 112 before the biopolymer 109 is introduced into the nanopore 101. This problem will be described with reference to FIG.
  • FIG. 4 shows a case where the extension reaction is started before the introduction of the biopolymer 109 into the nanopore 101 (a) and a case where the extension reaction is started after the introduction of the biopolymer 109 into the nanopore 101 (b). It is a figure explaining the mode of 109.
  • the extension reaction if the extension reaction is completed before the biopolymer 109 is introduced into the nanopore 101, the biopolymer 109 cannot pass through the nanopore 101. Alternatively, if the extension reaction has proceeded halfway, the analysis length will be shorter than expected.
  • the analysis of biopolymers using the nanopore 101 has the advantage of long-chain readability. However, if the extension reaction starts before introduction into the nanopore 101 as described above, the long-chain readability is reduced and throughput is reduced. Bring about a decline.
  • the molecular structure having the spacer 113 in the control chain 111 prevents the molecular motor 110 from causing extension reaction in the reaction solution as shown in FIG. 4B.
  • the extension reaction that is, the transport control can be started.
  • the electrolyte solution 103 includes a buffer suitable for the molecular motor 110.
  • Buffers can include, for example, Tris, EDTA, phosphate buffered saline (PBS), nonionic detergents, Tris-HCl, and the like.
  • potassium salt such as potassium chloride (KCl)
  • ammonium salt such as ammonium chloride (NH 4 Cl) or ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 )
  • magnesium chloride MgCl 2
  • commonly used electrolytes such as magnesium salts such as magnesium sulfate (MgSO 4 ) and magnesium sulfate can be used.
  • lithium salt, sodium salt, rubidium salt, cesium salt or the like may be used. Of these electrolytes, one kind may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
  • a solution containing (NH 4 ) 2 SO 4 , KCl, MgSO 4 , a nonionic surfactant, Tris-HCl, or the like is generally used.
  • Urea of 4 M or more, DMSO, DMF, and NaOH in the liquid tank 104B on the side where the molecular motor 110 is not introduced.
  • the electric conductivity of the electrolyte solution 103 by increasing the ionic strength, that is, the salt concentration, although it depends on the transport number of the ionic species. Therefore, in the nanopore analysis, from the viewpoint of the SN ratio, it is preferable to perform the measurement under the highest salt concentration possible.
  • the concentration of the electrolyte in the electrolyte solution 103 is preferably 1 M or more, and more preferably 3 M or more.
  • the upper limit of the concentration of the electrolyte is preferably a saturated concentration at which the electrolyte can be dissolved.
  • the electrolyte solution 103 is particularly preferably, for example, typically a 3M potassium chloride aqueous solution.
  • a suitable salt concentration is in the range of 50 mM to 300 mM, and therefore the activity may be lost under a salt concentration condition having an ionic strength of 1 M or more, and the extension reaction may not proceed. is there.
  • a typical example thereof is A-Family DNA polymerase.
  • Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA polymerase is particularly preferable because it allows an elongation reaction even under a high salt concentration condition.
  • Bst DNA polymerases Bst 3.0 DNA polymerase manufactured by New England Biolabs is particularly preferable for nanopore analysis because it can undergo an elongation reaction even under an extremely high salt concentration condition of 3M or higher.
  • Csa DNA polymerase manufactured by Nippon Gene Co., Ltd. or 96-7 DNA polymerase can be used as an enzyme that can function well as molecular motor 110 under high salt concentration conditions. .
  • Enzyme salt tolerance test> A salt tolerance test was performed on the DNA polymerase to verify that the elongation reaction is possible under high salt concentration conditions.
  • FIG. 5 is a diagram showing a structural formula of dNTP.
  • the partial double-stranded DNA concentration was 500 nM
  • the dNTP concentration was 100 ⁇ M
  • the Bst 3.0 DNA polymerase concentration was 6000 units / ml.
  • a sample was prepared by adding potassium chloride to the buffer solution so that the concentration thereof was 1.0 M, 1.5 M, 2.0 M, 2.5 M or 3.0 M.
  • the extension reaction was performed for 1 hour with the reaction temperature set at 37 ° C., which is the nanopore measurement condition.
  • the product after the completion of the extension reaction was electrophoresed on Tapestation 4200 manufactured by Agilent Technologies. Results are shown in FIG.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of electrophoresis in a salt tolerance test. As is clear from FIG. 6, it was found that Bst 3.0 DNA polymerase exhibits a good elongation reaction even in a salt solution having a high concentration of 3.0 M KCl.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of electrophoresis in a salt tolerance test of Csa DNA polymerase. As shown in FIG. 7, it was confirmed that Csa DNA polymerase is capable of elongation reaction under the condition of 1.0 M KCl concentration.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of electrophoresis in a salt tolerance test of 96-7 DNA polymerase. As shown in FIG. 8, it was confirmed that 96-7 DNA polymerase is capable of extension reaction under the condition of 3.0 M KCl concentration.
  • the phi29 DNA polymerase is known as a conventional DNA polymerase used as a molecular motor. Therefore, it was verified that the conventional phi29 DNA polymerase could not successfully perform the elongation reaction under the high salt concentration condition.
  • phi29 DNA polymerase was used instead of Bst 3.0 DNA polymerase, the sample was prepared so that the concentration of phi29 DNA polymerase was 500 units / ml, and the KCl concentration was 30 mM, 100 mM, 200 mM or 300 mM.
  • An extension reaction was performed in the same manner as in Example 1, and the product after the reaction was electrophoresed. The results are shown in Fig. 9.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of electrophoresis in the salt tolerance test of phi29 DNA polymerase.
  • the KCl concentration is as low as 30 mM
  • an extension reaction is carried out, and a band appears near the original band with a total length of 80 bp.
  • the band near 80 bp became thinner and the band at the unreacted band position became darker.
  • the KCl concentration of 300 mM almost no band around 80 bp was confirmed, and it was revealed that the elongation reaction could not be performed under the KCl concentration of 300 mM or more. Therefore, it was revealed that the conventional phi29 DNA polymerase cannot perform the extension reaction well under a high salt concentration.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of electrophoresis in a termination test of extension reaction with a spacer. As shown in FIG. 10 (a), it was confirmed that the elongation reaction can be stopped when the number of SpacerC3 is 2 to 4 under the condition that the KCl concentration is 0M. On the other hand, it was revealed that the extension reaction cannot be stopped when the number of SpacerC3 is one, because the extension reaction is carried out.
  • dNTP which is an ordinary substrate of DNA polymerase
  • an NTP analog can be used as a substrate.
  • the NTP analog has a structure in which a part of the structure of dNTP is modified.
  • Examples of NTP analogs include those in which oxygen between ⁇ and ⁇ site phosphorus or oxygen between ⁇ and ⁇ site phosphorus is substituted with NH, hydrocarbon, etc., and those in which the five-membered ring sugar structure is ribose. Can be mentioned.
  • NTP analogs include NMP-PNP, 5'-bromo-dNTP, 5'-bromo-NTP, 5'-amino-allyl-dNTP, 5'-amino-allyl-NTP, dNMP-NPP, NMP. -PPP and the like can be mentioned. Among them, NMP-PNP is particularly preferable because it can carry and control signals in units of one base.
  • FIG. 12 is a diagram showing the structural formula of NMP-PNP.
  • NMP-PNP has a structure in which the five-membered ring sugar structure is ribose and the oxygen between the ⁇ and ⁇ site phosphorus is replaced with NH.
  • N of NMP means N of nucleoside, and actual reagent names use abbreviations of the respective bases (A, G, T, C, U).
  • the official name of NMP-PNP is, for example, adenosine-5 ′-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate when the nucleoside is adenosine (A), and NMP-PNP, NppNHp, etc. are used as common names. ing.
  • NTP analogs when dNMP-NPP or NMP-NPP is used as a substrate, a single base signal may not be clearly separated.
  • dNMP-NPP also known as dNpNHpp, formal name: 2'-deoxyadenosine-5 '-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate (when the nucleoside is adenosine)
  • dNpNHpp formal name: 2'-deoxyadenosine-5 '-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate (when the nucleoside is adenosine)
  • NMP-NPP also known as NpNHpp, formal name: adenosine-5 ′-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate (when the nucleoside is adenosine)
  • NpNHpp formal name: adenosine-5 ′-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate (when the nucleoside is adenosine)
  • NpNHpp formal name: adenosine-5 ′-[( ⁇ , ⁇ ) -imido] triphosphate (when the nucleoside is adenosine)
  • ⁇ has a structure in which oxygen between ⁇ -site phosphorus is replaced with NH.
  • modified bases include 5-methylcytosine, N6-methyladenosine, N3-methyladenosine, N7-methylguanosine, and 5-hydroxymethylcytosine.
  • a partial double-stranded DNA having a short tandem repeat sequence with a total length of 100 bases in which an adenine base (A) and a cytosine base (C) are alternately repeated one by one was used.
  • the final volume was 200 ⁇ L, and the partial double-stranded DNA concentration was 10 nM, the dNTP concentration was 100 ⁇ M, the Bst 3.0 DNA polymerase concentration was 600 units / ml, and the potassium chloride concentration was 3.0 M. ⁇ Isothermal Buffer II) was added to prepare a sample.
  • the ion current was measured using the analyzer 1 having a Si 3 N 4 film nanopore. As shown in the sequence of Table 5, iSpC3 (SpacerC3) was bound to the position shown by Z as a spacer. The applied voltage was 0.1V. The results are shown in Fig. 11 (b).
  • the ideal signal obtained is a pattern signal in which two-level signals are alternately repeated about 50 times.
  • FIG. 11 (b) when dNTP was used as a substrate as in Reference Example 1, although a 2-level signal could be barely observed, a pattern in which 2-level signals were alternately repeated about 50 times was obtained. Turned out not.
  • the blocking current of the nanopore was measured using Bst 3.0 DNA polymerase as the molecular motor and NMP-PNP as the substrate as follows. From this, it was confirmed that the molecular motor can convey the biopolymer so that the elongation reaction occurs even under a high salt concentration condition and the signal of one base unit becomes clear.
  • Example 1 A sample was prepared in the same manner as in Reference Example 7 except that NMP-PNP was used as the substrate, and the ion current was measured using the analyzer 1. The results are shown in Fig. 13.
  • FIG. 13A shows a measured signal
  • FIG. 13B shows a standardized waveform in which only the level is extracted from the measured signal.
  • Example 5 Salt resistance test> [Examples 2 and 3]
  • the results in FIG. 13 also indirectly show that the extension reaction of the polymerase is carried out when NMP-PNP is used as a substrate under the conditions of nanopore analysis, but the same test as in Reference Example 1 (FIG. 6) It was directly verified that the extension reaction was carried out even when the salt concentration was high when NMP-PNP was used as a substrate.
  • NMP-PNP was used instead of dNTP, and the extension reaction was performed in the same manner as in Reference Example 1 except that the potassium chloride concentration was 0 M (Example 2) or 3.0 M (Example 3), The product after the reaction was electrophoresed. The results are shown in Fig. 14.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of electrophoresis in a salt tolerance test when NMP-PNP was used as a substrate for Bst 3.0 DNA polymerase. As is clear from FIG. 14, Bst 3.0 DNA polymerase shows a good elongation reaction even in the case of the NTP analog NMP-PNP in a salt solution having a high concentration of 3.0 M KCl. Was found.
  • Example 6 Measurement of ion current> [Reference Examples 8 and 9]
  • a signal of one base unit is not clearly generated by any NTP analog. Therefore, the ion current was measured in the same manner as in Reference Example 7 except that dNMP-NPP (Reference Example 8) or NMP-NPP (Reference Example 9) was used as the substrate.
  • FIG. 15 (a) shows the waveform of the ionic current when dNMP-NPP was used as the substrate
  • FIG. 15 (b) shows the waveform of the ionic current when NMP-NPP was used as the substrate.
  • FIG. 17 is a schematic diagram showing the configuration of the analysis device 2 according to the second embodiment.
  • the biopolymer analysis device 200 of the analyzer 2 according to the second embodiment is different from that of the first embodiment in that it includes a plurality of nanopores 101 and the liquid tank 104B is divided into a plurality of liquid tanks.
  • the biopolymer analysis device 200 includes a plurality of partition bodies 102 each having a nanopore 101 formed therein.
  • the partition 102 is composed of a thin film 102A on which the nanopore 101 is formed, and thin film fixing members 102B and 102C that sandwich the thin film 102A.
  • the nanopore 101 may be formed at any position on the thin film 102A.
  • the interval for disposing the plurality of thin films 102A is preferably 0.1 mm to 10 mm, more preferably 0.5 mm to 4 mm, depending on the capacity of the electrodes used and the electric measurement system.
  • the thin film fixing member 102B and the thin film 102A form a part of the structure of the liquid tank 104A. Further, the thin film 102A and the thin film fixing member 102C form a part of the structure of the liquid tank 104B.
  • the thin film fixing member 102C has four spaces separated by three partition walls, and these spaces are respectively used as the liquid tank 104B.
  • the liquid tank 104A is used as a common liquid tank for the four liquid tanks 104B located on the lower side.
  • the number of liquid tanks 104B is not limited to four and can be changed arbitrarily.
  • the dimension of the thin film 102A exposed at the through hole provided in the thin film fixing members 102B and 102C is an area where two or more nanopores 101 are difficult to be formed when the nanopores 101 are formed by applying a voltage, and the strength is allowable.
  • the area must be The area is, for example, 100 nm to 500 nm.
  • a film thickness of 3 nm to 7 nm that can form the nanopore 101 having an effective film thickness equivalent to one base is suitable.
  • Each liquid tank 104B is provided with a single nanopore 101 and an electrode 105B, and the liquid tanks 104B are insulated from each other by the partition wall of the thin film fixing member 102C. Therefore, the current flowing through each nanopore 101 can be measured independently.
  • the biopolymer analysis device 200 of this embodiment has the plurality of nanopores 101, it is possible to efficiently perform nanopore analysis of the biopolymer.
  • the nanopore device for analyzing the biopolymer according to the above embodiment includes the above-mentioned configuration as an element.
  • the nanopore device can be provided together with instructions describing use procedures, usage amounts, and the like.
  • the control chain, the NTP analog, etc. may be provided in a state in which they can be used immediately, or may be provided in a state in which only the biopolymer to be measured is not bound. Such forms and adjustments can be understood by those skilled in the art.
  • the nanopore may be provided in a state in which the nanopore is formed in a ready-to-use state, or may be provided in a state in which the nanopore is formed.
  • the present disclosure is not limited to the above-described embodiments and includes various modifications.
  • the above-described embodiments have been described in detail in order to explain the present disclosure in an easy-to-understand manner, and it is not necessary to include all the configurations described.
  • part of one embodiment can be replaced with the configuration of another embodiment.
  • the configuration of another embodiment can be added to the configuration of one embodiment.
  • a part of the configuration of each embodiment may be added, deleted, or replaced with a part of the configuration of another embodiment.
  • Analytical apparatus 100 200 ... Biopolymer analysis device 101 ... Nanopore 102A ... Thin film 103 ... Electrolyte solution 104A, 104B ... Liquid tank 105A, 105B ... Electrode 106 ... Ammeter 107 ... Power supply 108 ... Computer 109 ... Living body Polymer 110 ... Molecular motor 111 ... Control chain 112 ... Primer 113 ... Spacer 301 ... Force to pull up biopolymer 302 ... Force that biopolymer receives from electric field

Abstract

モノマ単位での搬送制御を良好に行う生体ポリマ分析デバイス及びそれを用いた分析装置、並びに分析方法を提供する。本開示の生体ポリマ分析デバイスは、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する第１の液槽及び第２の液槽と、前記第１の液槽及び前記第２の液槽間に外部場を印加する外部場印加部と、を備える。前記第１の液槽には、生体ポリマ、前記生体ポリマと結合する酵素及び該酵素の基質となるＮＴＰ類似体が導入され、前記外部場の印加によって前記生体ポリマが前記ナノポアへ導入されることにより、前記酵素が前記ＮＴＰ類似体を取り込み、前記ナノポア内において前記生体ポリマが搬送されることを特徴とする。

Description

生体ポリマ分析デバイス及びそれを用いた分析装置、並びに分析方法
　本開示は、生体ポリマ分析デバイス及びそれを用いた分析装置、並びに分析方法に関する。
　生体ポリマのモノマ配列を解析する分析装置として、ナノポアデバイスを用いた分析装置が開発されている。このような分析装置は、生体ポリマがＤＮＡの場合はＤＮＡ塩基配列解析システム（ＤＮＡシーケンサ）として、生体ポリマがタンパク質の場合はアミノ酸配列解析システム（アミノ酸シーケンサ）として用いられ、それぞれ従来よりも遥かに長い配列長を解読可能なシステムとして期待されている。
　ナノポアデバイスは、直径数Å～数ｎｍの細孔（ナノポア）を設けた厚み数Å～数十ｎｍの薄膜の両側に液槽を設け、各液槽に電解質溶液と電極を設けてなり、薄膜の両端間に電位差を発生させることにより、ナノポアに電解質溶液を通過させる。電解質溶液として、ｐＨ中性の塩化カリウム水溶液が典型的に使用される。
　生体ポリマがナノポアを通過すると、モノマ配列パターンに応じて、ナノポア周辺部のイオン電流がパターン状に変化する。イオン電流は一次近似としてナノポアの断面積に比例する。生体ポリマがナノポアを通過する際に、生体ポリマがナノポアを封鎖し、イオンが通過できる有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この減少量を封鎖電流という。このような封鎖電流方式のナノポアデバイスは、イオン電流の変化を検出することによって、生体ポリマのモノマ配列を解析することが可能である。モノマ配列の解析精度は、イオン電流の変化量によって決定されるため、モノマ間のイオン電流量の差が大きいほど好ましい。
　ナノポアデバイスとして、脂質二重膜に埋め込まれた中心に細孔を有するタンパク質を用いたバイオナノポア式と、半導体加工プロセスにて形成した絶縁薄膜に細孔を加工したソリッドナノポア式の２つの方式が存在する。バイオナノポア式においては、脂質二重膜に埋め込まれた改変タンパク質（Mycobacterium smegmatis porin A (MspA)等）の細孔（直径１．２ｎｍ、厚さ０．６ｎｍ）を生体ポリマ検出部としてイオン電流の変化量を測定する。一方、ソリッドナノポア式においては、半導体材料である窒化ケイ素（ＳｉＮ）の薄膜や、グラフェンや二硫化モリブデンのような単分子層からなる薄膜にナノポアを形成した構造体が用いられる。
　ソリッドナノポア式のナノポアＤＮＡシーケンサとして、ｐＨ中性下での塩化カリウム水溶液を用いてホモポリマのアデニン塩基、シトシン塩基、チミン塩基、グアニン塩基の封鎖電流量を測定した報告が為されている（特許文献１）。
　このようなナノポアＤＮＡシーケンサの課題の１つとして、ナノポアを通過するＤＮＡの搬送制御が挙げられる。ＤＮＡ鎖に含まれる個々の塩基種を封鎖電流量で計測するには、計測時の電流ノイズ及びＤＮＡ分子の揺らぎの時定数から、ＤＮＡのナノポア通過速度を１塩基当たり１００μ秒以上にする必要があると考えられている。ナノポアを用いてＤＮＡをシーケンシングする際、ナノポアの上下に位置する電極を用いて電位勾配を形成し、負電荷を持つＤＮＡをナノポアへ通過させる。しかし、ＤＮＡのナノポア通過速度は通常１塩基当たり１μ秒以下と非常に速く、各塩基由来の封鎖電流を十分に計測することが困難である。
　これを解決する搬送制御法の一つとして、酵素を分子モータとして駆動させる試みがある。例えば、ＤＮＡポリメラーゼが伸長反応する際や、ＤＮＡヘリカーゼが二本鎖ＤＮＡのうち一本鎖を解く反応を行う際に、鋳型となる一本鎖ＤＮＡを１塩基ずつ、位置をずらして制御する力を利用して、ナノポアを通過するＤＮＡの搬送制御を実現する手法がある。特に、ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型となるＤＮＡに対してプライマを結合し、一本鎖部をナノポアに通過させ、ＤＮＡポリメラーゼがプライマ末端に結合することで伸長反応が起きるため、ＤＮＡが電界で引っ張られる力に抗ってＤＮＡの搬送が実現される。この際、塩基種に応じたイオン電流信号を取得することができる（特許文献２～５）。
国際公開第２０１７／１１０２２６号 米国特許第７１８９５０３号明細書 米国特許出願公開第２０１４／００５１０６８号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０１５２４９５号明細書 米国特許出願公開第２０１５／０３４４９４５号明細書
　上記の搬送制御法の課題として、高塩濃度下における酵素の制御が困難であることが挙げられる。封鎖電流方式のナノポアＤＮＡシーケンサは、高塩濃度下の方がナノポアの電気伝導度が高く、そのためにＤＮＡ通過時の塩基配列に対応した封鎖電流信号の変動分が増加する一方で、ノイズ信号がほぼ一定であるため、高いＳＮ比（Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ比）で計測が実現可能となる。しかしながら、一般的に高塩濃度下においては酵素が失活して分子モータとして機能することができなくなり、ＤＮＡの搬送制御が出来ないというトレードオフの課題があった。
　そこで、本開示では、モノマ単位での搬送制御を良好に行う生体ポリマ分析デバイス及びそれを用いた分析装置、並びに分析方法を提供する。
　上記課題を解決するために、本開示の生体ポリマ分析デバイスは、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する第１の液槽及び第２の液槽と、前記第１の液槽及び前記第２の液槽間に外部場を印加する外部場印加部と、を備え、前記第１の液槽には、生体ポリマ、前記生体ポリマと結合する酵素及び該酵素の基質となるＮＴＰ類似体が導入され、前記外部場の印加によって前記生体ポリマが前記ナノポアへ導入されることにより、前記酵素が前記ＮＴＰ類似体を取り込み、前記ナノポア内において前記生体ポリマが搬送されることを特徴とする。
　本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
　本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
　本開示によれば、モノマ単位での搬送制御を良好に行うことが可能となる。
　上記以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
第１の実施形態に係る分析装置の構成を示す模式図。 分子複合体の構成を示す模式図。 ナノポア近傍における生体ポリマの搬送制御プロセスを示す模式図。 生体ポリマのナノポア導入前に伸長反応が開始される場合（ａ）と、生体ポリマのナノポア導入後に伸長反応が開始される場合（ｂ）における生体ポリマの様子を説明する図。 ｄＮＴＰの構造式を示す図。 Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図。 Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図。 ９６－７　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図。 ｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図。 スペーサによる伸長反応の停止試験における電気泳動の結果を示す図。 Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼに対してｄＮＴＰを基質とした場合のナノポア分析の結果を示す図。 ＮＭＰ－ＰＮＰの構造式を示す図。 Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼに対してＮＭＰ－ＰＮＰを基質とした場合のナノポア分析の結果を示す図。 Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼに対してＮＭＰ－ＰＮＰを基質とした場合の耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図。 Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼに対してＮＭＰ－ＮＰＰ及びｄＮＭＰ－ＮＰＰを基質とした場合のナノポア分析の結果を示す図。 基質がｄＮＴＰ又はＮＭＰ－ＰＮＰである場合のＢｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼの平均反応速度を示す図。 第２の実施形態に係る分析装置の構成を示す模式図。
　以下、図面に基づいて、本開示の実施の形態を説明する。なお、添付の図面は、本開示の原理に則った具体的な実施例を示しているが、それらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。
１．第１の実施形態
　図１は、第１の実施形態に係る分析装置１の構成を示す模式図である。分析装置１は、生体ポリマ分析デバイス１００、電流計１０６、電源１０７及びコンピュータ１０８（分析部）を備える。本開示において、分析対象となる生体ポリマは、例えば、核酸をモノマとするＤＮＡやＲＮＡ、あるいはアミノ酸をモノマとするポリペプチドやタンパク質である。本実施形態においては、一例として、分析装置１がＤＮＡを分析するＤＮＡシーケンサである例を説明する。
　生体ポリマ分析デバイス１００は、ナノポア１０１を有する薄膜１０２Ａ、電解質溶液１０３を収容する液槽１０４Ａ及び１０４Ｂ（第１の液槽及び第２の液槽）、並びに電極１０５Ａ及び１０５Ｂ（外部場印加部）を備える。生体ポリマ分析デバイス１００は、電気泳動により生体ポリマ１０９をナノポア１０１へ導入する方式を採用する。なお、生体ポリマ１０９のナノポア１０１への導入方式はこれに限定されず、その他の方式を採用してもよい。
　薄膜１０２Ａは、中心に細孔を有するタンパク質が埋め込まれた両親媒性分子層からなる脂質二重層（バイオ式ナノポア）であってもよいし、半導体微細加工技術で形成可能な材質からなる薄膜（ソリッド式ナノポア）であってもよい。半導体微細加工技術で形成可能な材質としては、例えば窒化ケイ素（ＳｉＮ）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、グラフェンなどが挙げられる。
　薄膜１０２Ａの厚さは、１Å～２００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは１Å～１００ｎｍ、さらに好ましくは１Å～５０ｎｍであり、例としては約５ｎｍである。
　ナノポア１０１の深さは、薄膜１０２Ａの厚さを調節することにより調節することができる。ナノポア１０１の深さは、好ましくは生体ポリマ１０９を構成するモノマ単位の２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上の大きさである。生体ポリマ１０９が核酸から構成されている場合には、ナノポア１０１の深さは、例えば塩基３個以上の大きさ、すなわち約１ｎｍ以上とすることが好ましい。これにより、生体ポリマ１０９をその形状と移動速度を制御しながらナノポア１０１に進入させることができ、高感度及び高精度な解析が可能となる。また、ナノポア１０１の水平面における断面の形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
　液槽１０４Ａ及び１０４Ｂは、薄膜１０２Ａの両側に配置され、電解質溶液１０３が満たされる。液槽１０４Ａ内に電極１０５Ａが配置され、液槽１０４Ｂ内に電極１０５Ｂが配置される。液槽１０４Ａ及び１０４Ｂは、封鎖電流の測定に影響を及ぼさない材質、形状及び大きさで形成される。電解質溶液１０３の容量は、例えばマイクロリットルオーダー又はミリリットルオーダーである。電解質溶液１０３の詳細は後述する。
　詳細は後述するが、生体ポリマ１０９は、前処理により制御鎖１１１と結合された状態で、ナノポア分析時に液槽１０４Ａに導入される。
　電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、電解質溶液１０３中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製されることが好ましく、典型的には、ハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製される。電位安定性及び信頼性の観点からは、銀又は塩化銀を使用することが好ましい。
　電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、分極電極となる材質で作製されてもよく、例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合、安定的なイオン電流を確保するために電解質溶液１０３に電子授受反応を補助することができる物質、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することが好ましい。あるいは、電子授受反応を行うことが可能な物質、例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することが好ましい。
　電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、全体的に上記の材質で構成されていてもよいし、下地材（銅、アルミニウムなど）の表面に上記の材質が被覆されていてもよい。電極１０５Ａ及び１０５Ｂの形状は特に限定されるものではないが、電解質溶液１０３と接する表面積が大きくなる形状が好ましい。
　電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、配線と接合されて、電流計１０６の測定回路へと電気的信号が送られる。図１において図示は省略しているが、生体ポリマ分析デバイス１００の外周面には、電極１０５Ａ及び１０５Ｂと電気的に接続された接続端子が設けられ、これにより電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、電源１０７及び電流計１０６と接続される。
　生体ポリマ１０９の分析時において、電源１０７により、電極１０５Ａと電極１０５Ｂとの間に電圧を印加すると、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２Ａの両面の間に電位差（外部場）が生じ、上側の液槽１０４Ａに溶解している生体ポリマ１０９が、ナノポア１０１を通過して、下側に位置する液槽１０４Ｂの方向に泳動される。
　後述するように、生体ポリマ１０９は、分子モータ１１０と結合された状態でナノポア１０１を通過する。分子モータ１１０は、一般にナノポア１０１の直径よりも大きいため、ナノポア１０１を通過することができない。この制限を実現するために、ナノポア１０１の直径は、一本鎖ＤＮＡが通過可能な下限値である０．８ｎｍから、分子モータ１１０である酵素が通過しない上限値である３ｎｍの範囲にあることが好ましい。
　電流計１０６は、電極１０５Ａと１０５Ｂとの間に流れるイオン電流（封鎖電流）を測定する。図示は省略しているが、電極１０５Ａと１０５Ｂとの間に流れる電流を増幅するアンプと、アナログ／デジタル変換器とを有する。電流計１０６は、コンピュータ１０８に接続され、アナログ／デジタル変換器は、検出したイオン電流の電流値をデジタル信号としてコンピュータ１０８に出力する。
　コンピュータ１０８は、検出されたイオン電流の電流値に基づいて、生体ポリマのモノマ配列情報を取得する。また、コンピュータ１０８は、電流値や、取得したモノマ配列情報を記録する。
　生体ポリマ分析デバイス１００を用いた封鎖電流計測では、生体ポリマ１０９の非存在下で計測される電流値を基準（ポア電流）とし、生体ポリマ１０９を封入した際に観測される電流の減少（ナノポア１０１の生体ポリマ１０９による封鎖）を計測し、分子の通過速度や状態を観測する。生体ポリマ１０９がナノポア１０１を通過し終わると、取得電流値は、ポア電流に戻る。この封鎖時間から、生体ポリマ１０９のナノポア通過速度を解析し、封鎖量から生体ポリマ１０９の特性を解析することができる。
　上記の構成の代わりに、ナノポア１０１の内部に電極を設けることで、トンネル電流を取得する方法や、トランジスタ特性変化を検出する方法によっても、生体ポリマ１０９のモノマ配列情報を得ることが可能である。また、光学的信号に基づいて生体ポリマ１０９のモノマ配列情報を取得する構成であってもよい。すなわち、モノマごとに特徴的な蛍光波長を有する標識が為されており、その蛍光信号を計測することによって、各モノマ配列を決定する方法であってもよい。
　なお、図１に示すように、電源１０７、電流計１０６及びコンピュータ１０８を生体ポリマ分析デバイス１００に対して別部材とするのではなく、電源１０７、電流計１０６及びコンピュータ１０８を生体ポリマ分析デバイス１００と一体構成としても良い。
　次に、薄膜１０２Ａ中にナノポア１０１を形成する方法について説明する。ナノポア１０１は、例えば、透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などにより、薄膜１０２Ａに形成される。
　電圧印加によるナノポア１０１の形成は、例えば以下の手順で行うことができる。薄膜１０２Ａを生体ポリマ分析デバイス１００等にセットする前に、Ａｒ／Ｏ２　ｐｌａｓｍａ（サムコ株式会社製）により、１０ＷＷ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件で、Ｓｉ３Ｎ４薄膜を親水化する。次に、生体ポリマ分析デバイス１００に薄膜１０２Ａをセットする。その後、液槽１０４Ａ及び１０４Ｂに電解質溶液１０３を満たし、液槽１０４Ａ及び１０４Ｂのそれぞれに電極１０５Ａ及び１０５Ｂを導入し、電圧を印加する。
　ここで、下側に位置する液槽１０４Ｂをｃｉｓ槽と呼び、上側に位置する液槽１０４Ａをｔｒａｎｓ槽と呼ぶ。ｃｉｓ槽側の電極に印加する電圧Ｖｃｉｓを０Ｖに設定し、ｔｒａｎｓ槽側の電極に電圧Ｖｔｒａｎｓを印加する。電圧Ｖｔｒａｎｓは、例えばパルス発生器（41501B SMU AND Pulse Generator Expander、アジレントテクノロジーズ社製）によりパルス電圧として印加される。ナノポア１０１の形成のために電圧を印加するプロセスは、例えば自作プログラム（Excel VBA、Visual Basic for Applications）で制御する。
　パルス電圧の印加後の電流値は、電流計１０６（4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER、アジレントテクノロジーズ社製）で読み取ることができる。ナノポア１０１の直径は、イオン電流値から見積もることができる。パルス電圧の印加前に形成されたナノポア１０１の直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し、順次、ナノポア１０１の直径を大きくしつつ、目的とする直径を得る。
　条件選択の基準は表１の通りである。ここで、ｎ番目のパルス電圧印加時間ｔｎ（ただし、ｎ＞２の整数。）は、次式で決定される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　次に、本実施形態における生体ポリマ１０９の搬送制御について説明する。分析装置１による生体ポリマ１０９のナノポア分析においては、生体ポリマ１０９がナノポア１０１を通過する際に、１塩基単位での搬送制御を行うことが求められる。本開示において、生体ポリマ１０９の搬送制御は、主に酵素を用いた分子モータ１１０により行われる。
　分子モータ１１０として、生体ポリマ１０９と結合可能な酵素であれば特に限定はなく使用することができる。特に、生体ポリマ１０９がＤＮＡの場合、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡエクソヌクレアーゼ、ＤＮＡトランスポザーゼ等が挙げられる。生体ポリマ１０９がＲＮＡの場合、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ、ＲＮＡエクソヌクレアーゼ、ＲＮＡトランスポザーゼ等が挙げられる。
　分子モータ１１０及び基質は、分析装置１によるナノポア分析時に液槽１０４Ａに導入される。
　分子モータ１１０による搬送制御は、ナノポア１０１近傍でのみ開始される必要がある。そこで、本実施形態において、読み取り対象である生体ポリマ１０９に対し、制御鎖１１１を結合する。
　読み取り対象の生体ポリマ１０９がＤＮＡの場合、モノマ配列の読み取り対象となるのは、一本鎖又は部分的に一本鎖のＤＮＡの主鎖であり、主鎖中に制御鎖１１１となるＤＮＡ配列が含まれている。
　生体ポリマ１０９は、以下の（ａ）～（ｃ）を満たすことがより好ましい。
（ａ）読み取り対象の生体ポリマ１０９に制御鎖１１１が存在する。
（ｂ）制御鎖１１１にプライマ１１２が結合している。
（ｃ）制御鎖１１１にスペーサ１１３が存在する。
　プライマ１１２は、制御鎖１１１の相補鎖となるＤＮＡ配列である。
　スペーサ１１３は、分子モータ１１０の反応を制御するスイッチとしての役割を有し、通常時には分子モータ１１０の反応を停止しているが、ナノポア１０１での計測、すなわち電圧による力が印加されると分子モータ１１０の反応を開始させる機能を有する。スペーサ１１３は、脱塩基であることが好ましく、また、直鎖状連結体であることが好ましい。スペーサ配置長は、プライマ連結部から１塩基以上であればよいが、２塩基以上、即ち約０．６×２ｎｍ以上有することが好ましい。適当なリンカーの例は当該分野で良く知られており、限定されるものではないが、例えばＳｐａｃｅｒＣ３（ｉＳｐＣ３）、ＰＣ　Ｓｐａｃｅｒ、Ｓｐａｃｅｒ９、Ｓｐａｃｅｒ１８、ｄＳｐａｃｅｒ、ヘキサンジオール、直鎖状炭素鎖、直鎖状アミノ酸、直鎖脂肪酸、直鎖状糖鎖等が挙げられる。ＳｐａｃｅｒＣ３を４ｍｅｒ以上、連続で導入することが特に好ましい。
　このように、生体ポリマ１０９は、読み取り対象である主鎖ＤＮＡ（テンプレート）と主鎖ＤＮＡよりも短い相補鎖ＤＮＡ（プライマ）からなる一本鎖飛び出し二本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ－ｏｖｅｒｈａｎｇ　ｄｓＤＮＡ）の構造を有することが好ましい。
　図２は、本実施形態に係る分子複合体の構成を示す模式図である。図２に示すように、この一本鎖飛び出し二本鎖ＤＮＡに対し、分子モータ１１０が一本鎖部分と二本鎖部分の境界部近傍に結合して、分子複合体を形成する。このような分子複合体において、分子モータ１１０がプライマ１１２と反応することにより、前述した分子複合体中の主鎖ＤＮＡとナノポア１０１の相対位置を１塩基ずつ移動させることにより、良好な搬送制御が行われる。これにより、主鎖ＤＮＡ中の塩基配列情報を取得することが可能となる。
　ナノポア１０１の近傍に滞在する分子モータ１１０に対して制御鎖１１１中のプライマ１１２が近づくことで、伸長・乖離反応が開始される。その結果、分子モータ１１０が相補鎖を伸張・乖離する際の力により生体ポリマ１０９がナノポア１０１から引き上げられ、又は引き下げられる。
　特に、分子モータ１１０がＤＮＡポリメラーゼの場合、生体ポリマ１０９はナノポア１０１から引き上げられる。分子モータ１１０がＤＮＡヘリカーゼやＤＮＡエクソヌクレアーゼの場合、生体ポリマ１０９はナノポア１０１へと引き下げられる。
　図３は、ナノポア１０１近傍における生体ポリマ１０９の搬送制御プロセスを示す模式図である。まず、生体ポリマ１０９は、制御鎖１１１が結合した状態で電解質溶液１０３中に導入される。電解質溶液１０３中には分子モータ１１０及び基質が溶解しており、生体ポリマ１０９及び分子モータ１１０は、電解質溶液１０３中で結合する。
　図３（ａ）に示すように、分子モータ１１０が結合した生体ポリマ１０９は、ナノポア１０１の近傍に発生している電界から受ける力３０２によって、ナノポア１０１へ導入される。
　図３（ｂ）に示すように、分子モータ１１０の直径はナノポア１０１の直径よりも大きいため、ナノポア１０１の出口方向に進むことが出来ず、ナノポア１０１の入口でとどまる。一方、負電荷を帯びている生体ポリマ１０９は、さらにナノポア１０１の出口方向に進み、スペーサ１１３を中心に形状変化を起こす。このとき、分子モータ１１０は、制御鎖１１１中のプライマ１１２の末端に結合し、伸長反応を開始する。
　図３（ｃ）に示すように、伸長反応時は、電界から受ける力３０２により生体ポリマ１０９がナノポア１０１を通過する力よりも、生体ポリマ１０９を引き上げる力３０１が強いため、生体ポリマ１０９は電界方向とは逆向きに搬送される。この際に生体ポリマ１０９の特性に応じた信号変化を検出することが可能となる。
　ナノポア１０１を介して印加する電圧に関して、導入の際に用いられた電圧Ｖ１と、分子モータ１１０を結合させる際に印加する電圧Ｖ２と、計測時の電圧Ｖ３とは、全て同じでも良い。一方で、分子モータ１１０の種類に応じて結合力、引き上げ力が異なるため、異なる電圧を用いた方が所望の信号が検出できる場合もある。生体ポリマ１０９の通過速度に寄与する力は、引き上げる力３０１や電界から受ける力３０２以外に、ナノポア１０１の内壁での摩擦も寄与する。その為、ナノポア１０１の寸法に応じても印加電圧を調整する必要がある。
　ここで、制御鎖１１１中にスペーサ１１３が存在しない場合、分子モータ１１０は、生体ポリマ１０９がナノポア１０１に導入される前にプライマ１１２から伸長反応を開始してしまう。この不具合について、図４を参照して説明する。
　図４は、生体ポリマ１０９のナノポア１０１への導入前に伸長反応が開始される場合（ａ）と、生体ポリマ１０９のナノポア１０１への導入後に伸長反応が開始される場合（ｂ）における生体ポリマ１０９の様子を説明する図である。
　図４（ａ）に示すように、生体ポリマ１０９がナノポア１０１に導入される前に伸長反応が完了してしまうと、生体ポリマ１０９はナノポア１０１を通過することができない。もしくは、伸長反応が途中まで進んでしまっていると、想定よりも解析長が短くなってしまう。ナノポア１０１を用いた生体ポリマの解析は、長鎖解読性を長所としているが、上記のようにナノポア１０１への導入前に伸長反応が開始してしまうと、長鎖解読性の低下及びスループットの低下をもたらす。
　上述のように、本実施形態においては、制御鎖１１１中にスペーサ１１３を有する分子構造とすることで、図４（ｂ）に示すように、分子モータ１１０が反応溶液中では伸長反応を起こさず、分子モータ１１０がナノポア１０１に到達した際に、伸長反応、すなわち搬送制御を開始させることができる。
　次に、電解質溶液１０３について詳細に説明する。電解質溶液１０３は、分子モータ１１０に適したバッファを含む。バッファは、例えば、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌなどを含むことができる。
　電解質溶液１０３に溶解される電解質として、例えば塩化カリウム（ＫＣｌ）等のカリウム塩、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）や硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）等のアンモニウム塩、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）や硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）等のマグネシウム塩など、一般に用いられる電解質を使用することができる。電解質として、リチウム塩、ナトリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩等を使用してもよい。これらの電解質のうち、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
　電解質溶液１０３として、一般的には、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、非イオン界面活性剤及びＴｒｉｓ－ＨＣｌなどを含むものが用いられる。分子モータ１１０を導入しない側の液槽１０４Ｂには、生体ポリマ１０９の自己相補鎖形成抑制のため、４Ｍ以上のＵｒｅａや、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮａＯＨを混在させることも可能である。
　電気的信号、特にイオン電流の信号変化により生体ポリマ１０９を分析するナノポア手法においては、電解質溶液１０３の電気伝導度が高いほど、イオン電流の信号変化量が増大するため、高いＳＮ比での計測が可能となる。イオン種の輸率等にも依存するが、一般的には、イオン強度、即ち塩濃度を増加することによって、電解質溶液１０３の電気伝導度を高めることが可能となる。従って、ナノポア分析においては、ＳＮ比の観点から、可能な限り高塩濃度下で計測を行うことが好ましい。このことから、電解質溶液１０３中の電解質の濃度は、１Ｍ以上であることが好ましく、３Ｍ以上であることがより好ましい。電解質の濃度の上限は、電解質が溶解可能な飽和濃度とすることが好ましい。電解質溶液１０３は、例えば、典型的には３Ｍの塩化カリウム水溶液であることが特に好ましい。
　しかしながら、一般的に酵素は、高い塩濃度下において各アミノ酸が有する電荷が遮蔽されて立体構造が崩れる等の理由により、酵素活性がしばしば失われることが広く知られている。ＤＮＡポリメラーゼを例とすると、好適な塩濃度は５０ｍＭ～３００ｍＭの範囲内であるため、１Ｍ濃度以上のイオン強度を有する塩濃度条件下においては活性が失われてしまい、伸長反応が進まない場合がある。
　発明者らは鋭意検討の結果、１Ｍ濃度以上の高塩濃度条件下においても分子モータ１１０として良好に機能可能な酵素を発見した。その代表例としては、Ａ－ＦａｍｉｌｙのＤＮＡポリメラーゼである。Ａ－ＦａｍｉｌｙのＤＮＡポリメラーゼの中でも、特にＢｓｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼは、高塩濃度条件下においても伸長反応が可能である点から好ましい。Ｂｓｔ　ＤＮＡポリメラーゼの中でも、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＢｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼは、３Ｍ濃度以上の極めて高い塩濃度条件下であっても伸長反応が可能であるため、ナノポア分析においては特に好ましい。
　また、高塩濃度条件下において分子モータ１１０として良好に機能可能な酵素として、Ａ－ＦａｍｉｌｙのＤＮＡポリメラーゼの他に、ニッポンジーン社製のＣｓａ　ＤＮＡポリメラーゼや、９６－７　ＤＮＡポリメラーゼも使用することができる。
＜実験例１：酵素の耐塩性試験＞
　ＤＮＡポリメラーゼに対して耐塩性試験を行い、高塩濃度条件下において伸長反応が可能であることを検証した。
［参考例１］
　伸長反応を行う前に、表２に示す配列のプライマとテンプレート（８０ｂｐ）を１：１で混合し、３７℃においてバッファ溶液で１０分間インキュベーションし、ハイブリ形成させて部分二本鎖ＤＮＡを作製した。なお、伸長反応を可能とするために、上記部分二本鎖ＤＮＡにはスペーサは含まれていない。
　ＤＮＡポリメラーゼとしてＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＢｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼ、基質としてｄＮＴＰ（デオキシヌクレオチド）、バッファ溶液としてＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＩｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ、電解質として塩化カリウム（ＫＣｌ）を用いた。図５は、ｄＮＴＰの構造式を示す図である。
　最終体積を２０μＬとし、部分二本鎖ＤＮＡ濃度が５００ｎＭ、ｄＮＴＰ濃度が１００μＭ、Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼ濃度が６０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるように、これらをバッファ溶液に添加した。表３のサンプル構成に示すように、塩化カリウム濃度が１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、２．５Ｍ又は３．０Ｍとなるようにバッファ溶液に添加して、サンプルを調製した。反応温度をナノポア計測条件である３７℃として、１時間伸長反応を行った。伸長反応終了後の産物をアジレントテクノロジーズ社製Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ　４２００にて電気泳動した。結果を図６に示す。
［ネガティブコントロール１］
　表３に示すサンプル構成にて、ネガティブコントロール１として、ｄＮＴＰを用いず、塩化カリウム濃度を０Ｍ、１．０Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、２．５Ｍ又は３．０Ｍとしてサンプルを調製し、参考例１と同様にして伸長反応を行い、伸長反応終了後の産物を電気泳動した。結果を図６に示す。
［ポジティブコントロール１］
　表３に示すサンプル構成にて、ポジティブコントロール１として、塩化カリウム濃度を０Ｍとしてサンプルを調製し、参考例１と同様にして伸長反応を行い、伸長反応終了後の産物を電気泳動した。結果を図６に示す。
（結果）
　伸長反応が行われない場合、未反応のＤＮＡは一本鎖飛び出しＤＮＡ部分を含み、見かけ上の電気泳動度が低下する。これにより、通常の鎖長（８０ｂｐ）よりも長い位置にバンドが出現する（１００ｂｐ付近のネガティブコントロールのバンド）。また、伸長反応が行われなかった場合、分子モータが結合した分子複合体のバンドが現れる（３２０ｂｐ付近のバンド）。一方、伸長反応が正常に行われた場合、ＤＮＡは全て二本鎖となり、全長８０ｂｐの本来の位置へバンドが出現する。
　図６は、耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図である。図６から明らかなように、Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼは、３．０Ｍ　ＫＣｌという高濃度の塩溶液下においても良好に伸長反応を示すことが見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［参考例２］
　Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ニッポンジーン社製のＣｓａ　ＤＮＡポリメラーゼを用い、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼの濃度が４００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるようにサンプルを調製し、ＫＣｌ濃度を０．３Ｍ、１．０Ｍ又は３．０ｍＭとしたこと以外は参考例１と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図７に示す。
［ネガティブコントロール２］
　ネガティブコントロール２として、ｄＮＴＰを添加せず、ＫＣｌ濃度を０Ｍ、０．３Ｍ、１．０Ｍ又は３．０ｍＭとしたこと以外は参考例２と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図７に示す。
［ポジティブコントロール２］
　ポジティブコントロール２として、塩化カリウム濃度を０Ｍとしたこと以外は参考例２と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図７に示す。
（結果）
　図７は、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図である。図７に示すように、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼは、１．０Ｍ　ＫＣｌ濃度条件下において伸長反応が可能であることが確認された。
［参考例３］
　Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ニッポンジーン社製の９６－７　ＤＮＡポリメラーゼを用い、９６－７　ＤＮＡポリメラーゼの濃度が４００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるようにサンプルを調製し、ＫＣｌ濃度を０．３Ｍ、１．０Ｍ又は３．０ｍＭとしたこと以外は参考例１と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図８に示す。
［ネガティブコントロール３］
　ネガティブコントロール３として、ｄＮＴＰを添加しなかったこと以外は参考例３と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図８に示す。
（結果）
　図８は、９６－７　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図である。図８に示すように、９６－７　ＤＮＡポリメラーゼは、３．０Ｍ　ＫＣｌ濃度条件下において伸長反応が可能であることが確認された。
　以上のように、Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼと同様に、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼ及び９６－７　ＤＮＡポリメラーゼも高い耐塩性を示すことが確認された。通常、このような高塩濃度条件下で伸長反応可能かどうかを調査された例はない。従って、これらのＤＮＡポリメラーゼ群は、分子モータを用いたナノポア分析において高いＳＮ比を実現するために好適である。
［参考例４］
　従来の分子モータとして使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、ｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼが知られている。そこで、高塩濃度条件下において、従来のｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼによっては上手く伸長反応ができないことを検証した。
　Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、ｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼを用い、ｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼの濃度が５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとなるようにサンプルを調製し、ＫＣｌ濃度を３０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ又は３００ｍＭとしたこと以外は参考例１と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図９に示す。
（結果）
　図９は、ｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼの耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図である。図９に示すように、ＫＣｌ濃度が３０ｍＭと低い場合においては、伸長反応が行われ、全長８０ｂｐの本来のバンド付近にバンドが出現する。しかし、ＫＣｌ濃度が増加するにつれて、８０ｂｐ付近のバンドは薄くなり、また未反応であるバンド位置のバンドが濃くなることが確認された。特に、３００ｍＭのＫＣｌ濃度条件下においては、８０ｂｐ付近のバンドはほぼ確認されず、３００ｍＭ以上のＫＣｌ濃度条件下においては伸長反応ができないことが判明した。従って、従来のｐｈｉ２９　ＤＮＡポリメラーゼは、高塩濃度下では良好に伸長反応ができないことが明らかとなった。
＜実験例２：スペーサによる伸長反応の停止試験＞
［参考例５］
　高耐塩性のＤＮＡポリメラーゼに対して、スペーサによる伸長反応の停止試験を行った。表４に示す配列のテンプレート及びプライマを用い、スペーサとしてＳｐａｃｅｒＣ３（ｉＳｐＣ３）を用いて、スペーサ数がそれぞれ１～４の部分二本鎖ＤＮＡを予め形成した。
　それぞれの部分二本鎖ＤＮＡについて、塩化カリウムを添加しなかったこと以外は参考例１と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１０（ａ）に示す。
［ネガティブコントロール４］
　ネガティブコントロール４として、スペーサ数を０とし、ｄＮＴＰを添加しなかったこと以外は参考例５と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１０（ａ）に示す。
［ポジティブコントロール３］
　ポジティブコントロール３として、スペーサ数を０としたこと以外は参考例５と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１０（ａ）に示す。
（結果）
　図１０は、スペーサによる伸長反応の停止試験における電気泳動の結果を示す図である。図１０（ａ）に示すように、ＫＣｌ濃度が０Ｍの条件下では、ＳｐａｃｅｒＣ３数が２～４個において伸長反応が停止できることを確認した。その一方で、ＳｐａｃｅｒＣ３数が１個では伸長反応が行われてしまい、伸長反応を停止できないことが判明した。
［参考例６］
　濃度が３．０Ｍとなるように塩化カリウム（ＫＣｌ）をバッファ溶液に添加したこと以外は参考例５と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１０（ｂ）に示す。
［ネガティブコントロール５］
　ネガティブコントロール５として、スペーサ数を０とし、ｄＮＴＰを添加しなかったこと以外は参考例６と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１０（ｂ）に示す。
［ポジティブコントロール４］
　ポジティブコントロール４として、スペーサ数を０としたこと以外は参考例６と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１０（ｂ）に示す。
（結果）
　図１０（ｂ）に示すように、塩化カリウム濃度が３．０Ｍの高塩濃度条件下においては、ＳｐａｃｅｒＣ３数が１～４個の全てにおいて伸長反応を停止できることが確認された。実際の使用においては、高塩濃度条件下において伸長反応の停止を試みることから、ＳｐａｃｅｒＣ３数は１個でも十分であることがわかる。確実に反応を停止するという観点からは、ＳｐａｃｅｒＣ３が連続で４個導入されていることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　発明者らは、ＤＮＡポリメラーゼの通常の基質であるｄＮＴＰは、ナノポア分析との組み合わせにおいて、１塩基単位での搬送制御・信号生成の面においては不十分であることを見出した。
　そこで、鋭意検討の結果、基質としてＮＴＰ類似体を用いることによって、上記耐塩性が高い分子モータはより良好な信号を出力することが分かった。
　このように、本実施形態において、基質としてＮＴＰ類似体を使用することができる。ＮＴＰ類似体は、ｄＮＴＰの構造の一部が改変された構造を有する。ＮＴＰ類似体として、例えば、β，γ部位リン間の酸素又はα，β部位リン間の酸素がＮＨや炭化水素等で置換されたもの、五員環糖構造がリボースとなっているもの等が挙げられる。
　ＮＴＰ類似体の具体例としては、ＮＭＰ－ＰＮＰ、５'－ブロモ－ｄＮＴＰ、５'－ブロモ－ＮＴＰ、５'－アミノ－アリル－ｄＮＴＰ、５'－アミノ－アリル－ＮＴＰ、ｄＮＭＰ－ＮＰＰ、ＮＭＰ－ＰＰＰ等が挙げられる。中でも、ＮＭＰ－ＰＮＰは、１塩基単位での搬送制御・信号生成ができるため、特に好ましい。
　図１２は、ＮＭＰ－ＰＮＰの構造式を示す図である。図１２に示すように、ＮＭＰ－ＰＮＰは、五員環糖構造がリボースであり、β、γ部位リン間の酸素がＮＨで置換された構造を有する。ＮＭＰのＮはヌクレオシドのＮを意味し、実際の試薬名は各塩基の略称の頭文字を用いる（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｕ）。ＮＭＰ－ＰＮＰの正式名称は、例えばヌクレオシドがアデノシン（Ａ）の場合、アデノシン－５'－［（β，γ）－イミド］三リン酸であり、慣用名としてＮＭＰ－ＰＮＰやＮｐｐＮＨｐ等が使われている。
　なお、ＮＴＰ類似体のうち、ｄＮＭＰ－ＮＰＰやＮＭＰ－ＮＰＰを基質として用いた場合には、１塩基信号が明瞭に分離する結果が得られない場合がある。
　ｄＮＭＰ－ＮＰＰ（別名：ｄＮｐＮＨｐｐ、正式名称：２'－デオキシアデノシン－５'－［（α，β）－イミド］三リン酸（ヌクレオシドがアデノシンの場合））は、五員環糖構造がデオキシリボースであり、α、β部位リン間の酸素がＮＨで置換された構造を有する。
　ＮＭＰ－ＮＰＰ（別名：ＮｐＮＨｐｐ、正式名称：アデノシン－５'－［（α，β）－イミド］三リン酸（ヌクレオシドがアデノシンの場合））は、五員環糖構造がリボースであり、α、β部位リン間の酸素がＮＨで置換された構造を有する。
　一方で、基質ではなくテンプレート側のＤＮＡ中にメチル化された修飾塩基などが存在すると、その箇所だけポリメラーゼ等の伸長反応速度が変化（典型的には遅くなる）することが知られている。本開示のＮＴＰ類似体であるＮＭＰ－ＰＮＰを分子モータ１１０として駆動させた場合でも同様であり、テンプレート側にメチル化された塩基が存在すると、そこで速度の変化が観測される。このような速度変化を観測することにより、修飾塩基の位置及び種類を検出することも可能である。
　修飾塩基として、例えば５－メチルシトシン（5-methylcytosine）、Ｎ６－メチルアデノシン（N6-methyladenosine）、Ｎ３－メチルアデノシン（N3-methyladenosine）、Ｎ７－メチルグアノシン（N7-methylguanosine）、５－ヒドロキシメチルシトシン（5-hydroxymethylcytosine）、擬ウリジン（pseudouridine）、チオウリジン（thiouridine）、イソグアノシン（isoguanosine）、イソシトシン（isocytosine）、ジヒドロウリジン（dihydrouridine）、キューオシン（queuosine）、ワイオシン（wyosine）、イノシン（inosine）、トリアゾール（triazole）、ジアミノプリン（diaminopurine）、β－Ｄ－グルコピラノシルオキシメチルウラシル（beta-D-glucopyranosyloxymethyluracil）、８－オキソグアノシン（8-oxoguanosine）、２'－Ｏ－メチルアデノシン（2'-O-methyladenosine）、２'－Ｏ－メチルシチジン（2'-O-methylcytidine）、２'－Ｏ－メチルグアノシン（2'-O-methylguanosine）、２'－Ｏ－メチルウリジン（2'-O-methyluridine）等が挙げられる。
＜実験例３：イオン電流の測定＞
［参考例７］
　Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼと、通常の基質であるｄＮＴＰとを使用し、１塩基単位の搬送制御及び信号生成が可能かどうかを検証した。
　生体ポリマとして、表５に示す配列の通り、アデニン塩基（Ａ）とシトシン塩基（Ｃ）が交互に１塩基ずつ繰り返す、全長１００塩基のショートタンデムリピート配列を有する部分二本鎖ＤＮＡを使用した。
　最終体積を２００μＬとし、部分二本鎖ＤＮＡ濃度が１０ｎＭ、ｄＮＴＰ濃度が１００μＭ、Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼ濃度が６００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、塩化カリウム濃度が３．０Ｍとなるように、これらをバッファ溶液（１×Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ　ＩＩ）に添加して、サンプルを調製した。
　Ｓｉ３Ｎ４膜ナノポアを有する分析装置１を用いてイオン電流を測定した。表５の配列に示すように、Ｚで示される位置には、ｉＳｐＣ３（ＳｐａｃｅｒＣ３）をスペーサとして結合させた。印加電圧は、０．１Ｖとした。結果を図１１（ｂ）に示す。
（結果）
　図１１（ａ）に示すように、アデニン塩基とシトシン塩基が交互に繰り返すことから、得られる理想的な信号は２レベルの信号が交互に約５０回繰り返すパターン信号である。しかし、図１１（ｂ）に示すように、参考例１と同様にｄＮＴＰを基質として用いた場合、辛うじて２レベル信号は観測できるものの、２レベルの信号が交互に約５０回繰り返すパターンは得られないことが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜実験例４：イオン電流の測定＞
　参考例７の結果のように、耐塩性が高い分子モータに対して、通常の用いられるＮＴＰは良好な基質とならないという課題に対して、発明者らは、ＮＴＰ類似体を基質として利用することで、分子モータとして良好な機能が発揮できることを見出した。
　そこで、以下のように、分子モータとしてＢｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼを用い、基質としてＮＭＰ－ＰＮＰを用いて、ナノポアの封鎖電流計測を行った。これにより、高い塩濃度条件下でも伸長反応が起き、かつ１塩基単位の信号が明瞭化するように、分子モータが生体ポリマを搬送できることを確認した。
［実施例１］
　基質としてＮＭＰ－ＰＮＰを用いたこと以外は参考例７と同様にしてサンプルを調製し、分析装置１を用いてイオン電流を測定した。結果を図１３に示す。
（結果）
　図１３（ａ）は実測信号を示し、図１３（ｂ）は実測信号からレベルのみを抽出した規格化波形を示す。図１３から分かるように、分子モータとしてＢｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼを用い、基質としてＮＭＰ－ＰＮＰを用いることで、２レベルの信号が交互に出現し、かつ約５０回繰り返すような理想的な信号が得られた。このことから明らかなように、高い耐塩性を有する分子モータに対して、ＮＴＰ類似体を基質として用いることにより、ナノポア分析において良好な１塩基単位の信号が出力されることが明らかとなった。
＜実験例５：耐塩性試験＞
［実施例２及び３］
　図１３の結果でも、ナノポア分析の条件下において、ＮＭＰ－ＰＮＰを基質とした場合にポリメラーゼの伸長反応が行われることが間接的に示されているが、参考例１（図６）同様の試験にてＮＭＰ－ＰＮＰを基質とした場合に高塩濃度下でも伸長反応が行われることを直接的に検証した。
　基質として、ｄＮＴＰの代わりにＮＭＰ－ＰＮＰを使用し、塩化カリウム濃度を０Ｍ（実施例２）又は３．０Ｍ（実施例３）としたこと以外は参考例１と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１４に示す。
［ネガティブコントロール６］
　ネガティブコントロール６として、ＮＭＰ－ＰＮＰを用いず、塩化カリウム濃度を０Ｍとしたこと以外は参考例９と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１４に示す。
［ポジティブコントロール５］
　ポジティブコントロール５として、基質としてｄＮＴＰを用い、塩化カリウム濃度を０Ｍとしたこと以外は参考例９と同様にして伸長反応を行い、反応後の産物を電気泳動した。結果を図１４に示す。
（結果）
　参考例１と同様に、伸長反応が行われない場合、未反応のＤＮＡは一本鎖飛び出しＤＮＡ部分を含むことにより見かけ上の電気泳動度が低下するため、通常の鎖長よりも長い位置にバンドが出現する。一方、伸長反応が正常に行われた場合、ＤＮＡは全て二本鎖となるため、全長本来の位置へバンドが出現する。
　図１４は、Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼに対してＮＭＰ－ＰＮＰを基質とした場合の耐塩性試験における電気泳動の結果を示す図である。図１４から明らかなように、Ｂｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼは、３．０Ｍ　ＫＣｌという高濃度の塩溶液下において、基質がＮＭＰ－ＰＮＰというＮＴＰ類似体であっても良好に伸長反応を示すことが見出された。
＜実験例６：イオン電流の測定＞
［参考例８及び９］
　しかしながら、どのようなＮＴＰ類似体であっても１塩基単位の信号が明瞭に生成されるわけではない。そこで、基質としてｄＮＭＰ－ＮＰＰ（参考例８）又はＮＭＰ－ＮＰＰ（参考例９）を用いたこと以外は参考例７と同様にして、イオン電流を測定した。図１５（ａ）は、基質としてｄＮＭＰ－ＮＰＰを用いた場合のイオン電流の波形を示し、図１５（ｂ）は、基質としてＮＭＰ－ＮＰＰを用いた場合のイオン電流の波形を示す。
（結果）
　図１５に示すように、ｄＮＭＰ－ＮＰＰ又はＮＭＰ－ＮＰＰを基質として用いた場合には、１塩基単位の信号が明瞭に生成される結果は得られなかったことがわかる。
＜実験例７：平均反応速度の測定＞
　ＮＴＰ類似体は、その化学構造のいずれかの部位がｄＮＴＰに対して改変されているため、通常、酵素の立体構造認識能や結合切断能に影響を及ぼす。そのため、ＮＴＰ類似体を通常の酵素と組み合わせた場合においては、その反応が阻害されるか、又は反応速度が低下するといった効果がもたらされる。従って、ＮＴＰ類似体は、このような効果（反応阻害、反応速度低下）が出現すると期待して使用されることが通常である。しかし、上述のように、ＮＭＰ－ＰＮＰは、反応が阻害されたり反応速度が低下したりするという効果は表れない一方で、１塩基単位での差分信号が明瞭に見えるようになる、という従来では予測できない効果が出現することを発明者らは見出した。
［参考例１０及び実施例４］
　分子モータとしてＢｓｔ　３．０　ＤＮＡポリメラーゼを用い、基質としてｄＮＴＰ（参考例１０）又はＮＭＰ－ＰＮＰ（実施例４）を用いて、参考例７と同様にして、表５に示す配列のサンプルについて伸長反応を行い、分析装置１を用いてイオン電流を測定して、平均反応速度を算出した。平均反応速度は、封鎖電流の総計測時間を塩基数で割った値とした。結果を図１６に示す。
（結果）
　図１６に示すように、ｄＮＴＰを用いて分子モータを駆動した場合の平均速度は６．８ｍｓ／塩基であり、ＮＭＰ－ＰＮＰを用いて分子モータを駆動した場合の平均速度は７．５ｍｓ／塩基であり、ほぼ同じ値であった。このことから明らかなように、ＮＴＰ類似体を用いても反応速度が低下することはなく、本開示の構成によって、期待される効果とは異なる効果が出現することがわかる。
２．第２の実施形態
　次に、図１７を参照して、第２の実施形態に係る分析装置２について説明する。
　図１７は、第２の実施形態に係る分析装置２の構成を示す模式図である。第２の実施形態に係る分析装置２の生体ポリマ分析デバイス２００は、複数のナノポア１０１を備え、液槽１０４Ｂが複数の液槽に分割されている点で、第１の実施形態と異なる。
　生体ポリマ分析デバイス２００は、それぞれナノポア１０１が形成される仕切り体１０２を複数備える。
　仕切り体１０２は、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２Ａと、薄膜１０２Ａを挟持する薄膜固定部材１０２Ｂ及び１０２Ｃとで構成される。ナノポア１０１は、薄膜１０２Ａのいずれかの位置に形成されていれば良い。複数の薄膜１０２Ａを配置する間隔は、使用する電極、電気測定系の能力に応じて、好ましくは０．１ｍｍ～１０ｍｍであり、より好ましくは０．５ｍｍ～４ｍｍとすることができる。
　薄膜固定部材１０２Ｂ及び薄膜１０２Ａは、液槽１０４Ａの構造の一部を構成する。また、薄膜１０２Ａと薄膜固定部材１０２Ｃは、液槽１０４Ｂの構造の一部を構成する。薄膜固定部材１０２Ｃは、３つの隔壁により分離された４つの空間を有し、これらの空間がそれぞれ液槽１０４Ｂとして用いられる。なお、液槽１０４Ａは、下側に位置する４つの液槽１０４Ｂに対する共通液槽として用いられる。液槽１０４Ｂの数は、４つに限定されるものではなく、任意に変更可能である。
　薄膜固定部材１０２Ｂ及び１０２Ｃに設けられた貫通孔の部分で露出する薄膜１０２Ａの寸法は、電圧印加によるナノポア１０１の形成時に２個以上のナノポア１０１が形成され難い面積であり、かつ、強度上許容される面積である必要がある。当該面積は、例えば１００ｎｍ～５００ｎｍである。ＤＮＡの一塩基分解能を達成するためには、一塩基相当の実効膜厚を有するナノポア１０１を形成可能な膜厚３ｎｍ～７ｎｍが適当である。
　各液槽１０４Ｂには、単一のナノポア１０１と電極１０５Ｂが設けられており、薄膜固定部材１０２Ｃの隔壁により、液槽１０４Ｂ同士は互いに絶縁されている。このため、各ナノポア１０１を流れる電流を独立に計測することができる。
　以上のように、本実施形態の生体ポリマ分析デバイス２００は、複数のナノポア１０１を有するため、生体ポリマのナノポア分析を効率的に行うことができる。
　上記の実施形態に係る生体ポリマを分析するためのナノポアデバイスは、上述した構成を要素として含む。ナノポアデバイスは、使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。制御鎖やＮＴＰ類似体等は、即時使用可能な状態で提供されてもよいし、計測対象となる生体ポリマのみが結合していない状態で構成提供されてもよい。そのような形態及び調整は、当業者であれば理解することができる。ナノポアデバイスに関しても同様に、即時使用可能な状態でナノポアが形成されている状態で提供されてもよいし、提供先で形成される状態で提供されてもよい。
　本開示は、上述した実施例に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施例は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施例の一部を他の実施例の構成に置き換えることができる。また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることもできる。また、各実施例の構成の一部について、他の実施例の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
１、２…分析装置
１００、２００・・・生体ポリマ分析デバイス
１０１…ナノポア
１０２Ａ…薄膜
１０３…電解質溶液
１０４Ａ、１０４Ｂ…液槽
１０５Ａ、１０５Ｂ…電極
１０６…電流計
１０７…電源
１０８…コンピュータ
１０９…生体ポリマ
１１０…分子モータ
１１１…制御鎖
１１２…プライマ
１１３…スペーサ
３０１…生体ポリマを引き上げる力
３０２…生体ポリマが電界から受ける力

Claims (15)

  1. 　ナノポアを有する薄膜と、
    　前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する第１の液槽及び第２の液槽と、
    　前記第１の液槽及び前記第２の液槽間に外部場を印加する外部場印加部と、を備え、
    　前記第１の液槽には、生体ポリマ、前記生体ポリマと結合する酵素及び該酵素の基質となるＮＴＰ類似体が導入され、
    　前記外部場の印加によって前記生体ポリマが前記ナノポアへ導入されることにより、前記酵素が前記ＮＴＰ類似体を取り込み、前記ナノポア内において前記生体ポリマが搬送されることを特徴とする生体ポリマ分析デバイス。
  2. 　前記酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡエクソヌクレアーゼ、ＤＮＡトランスポザーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ、ＲＮＡエクソヌクレアーゼ又はＲＮＡトランスポザーゼであることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
  3. 　前記生体ポリマは、主鎖と、該主鎖より短い相補鎖を有する一本鎖飛び出しｄｓＤＮＡであり、
    　前記酵素は、前記相補鎖との反応により、前記生体ポリマと前記ナノポアの相対位置を移動させることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
  4. 　前記酵素は、１Ｍ以上の塩濃度下で前記生体ポリマと反応することを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
  5. 　前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ａ－ＦａｍｉｌｙのＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼ又は９６－７　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２に記載の生体ポリマ分析デバイス。
  6. 　前記ＮＴＰ類似体は、ＮＭＰ－ＰＮＰであることを特徴とする請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイス。
  7. 　前記一本鎖飛び出しｄｓＤＮＡは、一本鎖部分と二本鎖部分がスペーサで連結されていることを特徴とする請求項３に記載の生体ポリマ分析デバイス。
  8. 　請求項１に記載の生体ポリマ分析デバイスと、
    　前記生体ポリマを分析する分析部と、を備える分析装置であって、
    　前記分析部は、前記生体ポリマが前記ナノポア中を搬送されることに伴い発生する信号により、前記生体ポリマを分析することを特徴とする分析装置。
  9. 　ナノポアを有する薄膜と、
    　前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する第１の液槽及び第２の液槽と、
    　前記第１の液槽及び前記第２の液槽間に外部場を印加する外部場印加部と、を備える生体ポリマ分析デバイスにおける生体ポリマの分析方法であって、
    　前記第１の液槽に前記生体ポリマ、前記生体ポリマと結合する酵素及び該酵素の基質となるＮＴＰ類似体を導入するステップと、
    　前記外部場印加部により前記外部場を印加して、前記生体ポリマを前記ナノポアへ導入するステップと、
    　前記酵素が前記ＮＴＰ類似体を取り込むことにより、前記ナノポア内において前記生体ポリマを搬送するステップと、を備えることを特徴とする分析方法。
  10. 　前記酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡエクソヌクレアーゼ、ＤＮＡトランスポザーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡヘリカーゼ、ＲＮＡエクソヌクレアーゼ又はＲＮＡトランスポザーゼであることを特徴とする請求項９に記載の分析方法。
  11. 　前記生体ポリマは、主鎖と、該主鎖より短い相補鎖を有する一本鎖飛び出しｄｓＤＮＡであり、
    　前記生体ポリマを搬送するステップは、前記酵素と前記相補鎖との反応により、前記生体ポリマと前記ナノポアの相対位置を移動するステップであることを特徴とする請求項９に記載の分析方法。
  12. 　前記酵素は、１Ｍ以上の塩濃度下で反応することを特徴とする請求項９に記載の分析方法。
  13. 　前記ＤＮＡポリメラーゼは、Ａ－ＦａｍｉｌｙのＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｓａ　ＤＮＡポリメラーゼ又は９６－７　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１０に記載の分析方法。
  14. 　前記ＮＴＰ類似体は、ＮＭＰ－ＰＮＰであることを特徴とする請求項９に記載の分析方法。
  15. 　前記一本鎖飛び出しｄｓＤＮＡは、一本鎖部分と二本鎖部分がスペーサで連結されていることを特徴とする請求項１１に記載の分析方法。
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