CN105543402B - 等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于包括下列组分：100‑800mM Tris‑HCl缓冲液，10‑150mM氯化钠，10‑150mM氯化钾，10‑50mM氯化镁，5‑15mM二硫苏糖醇，5‑20％聚乙烯吡咯烷酮，10‑20mM ATP，1‑5mM dNPTs，10‑50mM磷酸烯醇丙酮酸，500‑1500ng/μl丙酮酸激酶，100‑500ng/μl BSA，25‑200pmol引物组，50‑200ng/μl T4噬菌体DNA解旋酶gp41蛋白，100‑500ng/μl天蓝色链霉菌recA蛋白，200‑1000ng/μl单链结合蛋白，50‑200ng/μl大肠杆菌DNA聚合酶I。本发明还提供了一种等温核酸扩增方法，通过使用本发明提供的等温核酸扩增反应试剂和等温核酸扩增方法实现了在温度较低的等温条件下对核酸进行扩增，大大简化了传统核酸扩增反应过程。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体而言，本发明涉及一种灵敏度高的可在等温下实现快速扩增的等温核酸扩增反应试剂和等温核酸扩增方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)技术自1983年由Mullis等发明以来，在生命科学研究等方面得到广泛应用。传统的PCR反应中，在存在DNA模板、引物、四种dTTP、适当的缓冲液的反应混合物的条件下，通过DNA聚合酶催化从而对目的DNA片段进行扩增。PCR反应一般包括变性、退火和延伸三个步骤，每个步骤重复30至40次，由此对少量目的DNA片段进行指数级扩增已达到可以检测的水平。由于PCR技术可将少量核酸分子进行扩增达到仪器可检测的水平，因此迅速应用于多个领域，例如，疾病诊断、动植物病理学研究、微生物检测等等。
基于PCR的强大的扩增能力，在实际应用中，将PCR与其它分子生物学方法以及免疫学方法等相结合发展得到了多种检测技术，例如荧光定量PCR技术、多重PCR检测技术等已在疾病检测方面得到广泛使用。
然而，出于热循环过程中温度变化和特定温度条件要求，传统PCR技术要求仪器必须具备精细的温度控制程序，能够在预定时间准确地升降温度，从而实现温度的循环变化，这大大增加了仪器研制成本，使仪器价格昂贵，并且由于温度的变化和维持完全依赖于电源，因此电力消耗非常大。目前已经研发出多种等温体外核酸扩增技术，如TMA技术(转录介导的核酸扩增技术)、SDA技术(链置换核酸扩增技术)、LAMP(环介导核酸扩增技术)、HDA(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)等等，这些技术在恒定的温度(60至65度)下就可以实现高效的核酸扩增，从而使无需使用对温度进行精准控制的PCR仪。然而这些技术需要的温度仍然较高，如果能实现在更低温度下进行等温核酸扩增，则将使核酸扩增技术变得更加节能和简单易行，并进一步扩大核酸扩增技术的应用范围。
发明内容
针对传统PCR技术的缺陷，本发明的发明人在研究中发现天蓝色链霉菌recA蛋白可在常温条件下与单链DNA结合，在T4噬菌体DNA解旋酶gp41蛋白打开DNA双链的前提下，将结合的单链DNA与同源互补区域进行置换作用，在单链结合蛋白和DNA聚合酶的存在下进行链的延伸反应，从而在恒温等温条件下实现特定核酸序列的指数扩增，该核酸扩增过程可降低对体外核酸扩增仪器的要求，使得核酸扩增过程在常温等温条件下即可实现，不需要传统PCR扩增的机械式升温降温过程。
一方面，本发明提供一种等温核酸扩增试剂，所述等温核酸扩增试剂包括：
本发明的等温核酸扩增反应，是指在恒定的温度下进行核酸扩增。优选地，本发明的等温核酸扩增反应试剂的反应温度为20℃至42℃。
在本发明的一种实施方式中，所述试剂中的Tris-HCl缓冲液的pH为8.0，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的分子量为40000-1200000，优选为360000。
在本发明的另一实施方式中，所述引物组包括至少两种引物。
在本发明的又一实施方式中，所述反应试剂还包括荧光染料。所述荧光染料为SYBRGREEN 1、SYTO-13或者SYTO-82。
另一方面，本发明提供一种等温核酸扩增方法，所述方法包括以下步骤：(1)提供DNA或cDNA模板；(2)加入本发明的等温核酸扩增反应试剂，在20℃至42℃下反应15分钟至50分钟，完成核酸扩增。其中，所述等温核酸扩增反应试剂中的引物组根据步骤(1)中的DNA或cDNA模板设计得到。
本发明试剂中的引物，是指可用于特异性扩增目标核酸的寡核苷酸链，长度为28-36个碱基之间，引物序列不形成二级结构区、回文序列以及连续的重复碱基序列；引物的Tm值不作为设计主要素。
本发明试剂中的四种酶蛋白：噬菌体DNA解旋酶gp41蛋白、天蓝色链霉菌recA蛋白、单链结合蛋白和大肠杆菌DNA聚合酶I在扩增反应的过程中行使不同功能，缺一不可，通过这些酶蛋白的相互作用在等温条件下实现核酸的快速体外扩增。
本发明提供的等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法可在20℃至42℃的较低恒定温度下对核酸进行等温扩增；通过设计多组引物，可同时进行多重核酸扩增；本发明的链置换反应系统还可以包含荧光染料，所述的荧光染料可以是SYBRGREEN 1、SYTO-13或者SYTO-82，可以根据荧光直接判读扩增结果，实现在非实验室环境下的核酸扩增检测及其结果判读。由此可见，通过本发明提供的等温核酸扩增反应试剂和等温核酸扩增方法进行核酸扩增在很大程度上降低了对仪器以及技术的要求，大大简化了核酸扩增反应过程。
附图说明
图1为实施例1中等温核酸扩增产物的检测结果，泳道1显示以样本1为模板的核酸扩增产物，泳道2显示以样本2为模板的核酸扩增产物。
图2为实施例2中等温核酸扩增产物的检测结果，泳道1显示以样本3为模板的核酸扩增产物。
图3为实施例3中等温核酸扩增产物的检测结果，泳道1显示以样本4为模板的核酸扩增产物，泳道2显示以样本5为模板的核酸扩增产物，泳道3显示以样本6为模板的核酸扩增产物，泳道4和5分别显示以样本4和样本6为模板的二重核酸扩增产物，泳道6和7分别显示以样本4、样本5和样本6为模板的三重核酸扩增产物。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例仅仅是为了举例说明，对发明不构成任何限定。
除非另有说明，本发明采用的分子生物学、基因工程等生物学领域的常规技术，这些技术在本领域技术人员所理解的范围之内。
实施例1 转基因玉米NOS终止子的基因扩增
转基因玉米含有NOS终止子，而野生型玉米则没有该基因序列，因此，可以通过对该序列进行扩增来鉴别转基因玉米。在本实施例中，通过采用本发明提供的等温扩增试剂和方法来对转基因玉米的NOS终止子进行检测。
(1)引物设计
选择玉米NOS终止子的全序列提交至美国国家生物中心网站上的数据库(http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast检索，通过网站Blast程序分析寻找NOS终止子和玉米的基因组序列没有高同源性的DNA片段。根据Blast结果在NOS终止子中选取了一段253bp的序列(SEQ ID No.1)进行引物设计。
模板序列(SEQ ID No.1)：
cgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatcggg
引物：
正向引物5’gattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc 3’SEQ ID NO：2
反向引物5’gtttgcgcgctatattttgttttctatcgcgta 3’SEQ ID NO：3
(2)玉米基因组DNA的提取
在通风橱中，使用植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)对转基因玉米样本提取高纯度DNA，得到DNA样本50μl，标记为样本1；及非转基因玉米样本提取的DNA样本50μl标记为样本2。
(3)核酸扩增及检测
从样本1和样本2中各取出1μl到一个新的200μl的PCR管中，再加入49μl等温核酸扩增链替换反应试剂(保存于-20℃冰箱)，其成分如下：
将PCR管放入37℃等温金属浴孵育30min。随后将PCR管取出，向PCR管中加入50μl酚/氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，购自北京索莱宝科技有限公司)，漩涡震荡30s，12000rpm离心5min，取8μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳。结果如附图1所示，可以看到对样本1进行扩增检测到176bp的目的条带，而对样本2则没有检测到目的条带。由此可见，使用本发明提供的等温扩增试剂和方法，可以对转基因玉米NOS终止子的特定位置进行有效链替换扩增，用于检测含有NOS终止子的转基因玉米。
实施例2 对结核分枝杆菌复合菌群的检测
在本实施例中，通过本发明提供的恒温扩增试剂盒方法对结核分枝杆菌复合菌群(MTBC)的插入序列IS6110基因片段进行扩增，以实现对结核分枝杆菌复合菌群的检测。
(1)引物设计
选择插入序列IS6110的全序列提交至美国国家生物中心网站上的数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast检索，通过网站Blast程序分析寻找插入序列IS6110特有的，和其他病毒没有高同源性的DNA片段。在本发明中，发明人根据Blast结果在插入序列IS6110中选取了一段523bp的序列(SEQ ID No.7)进行基因合成，并克隆到载体pET28a中，制备成重组质粒pET28a-6110。本方案中提供了一套可以用于该位置特异扩增的引物。这套引物均可以对MTBC的插入序列IS6110基因片段的特定位置进行有效链替换扩增。
模板序列(SEQ ID NO：4)：
ctccgaccgacggttggatgcctgcctcggcgagccgctcgctgaaccggatcgatgtgtactgagatcccctatccgtatggtggataacgtctttcaggtcgagtacgccttcttgttggcgggtccagatggcttgctcgatcgcgtcgaggaccatggaggtggccatcgtggaagcgacccgccagcccaggatcctgcgagcgtaggcgtcggtgacaaaggccacgtaggcgaaccctgcccaggtcgacacataggtgaggtctgctacccacagccggttaggtgctggtggtccgaagcggcgctggacgagatcggcgggacgggctgtggccggatcagcgatcgtggtcctgcgggctttgccgcgggtggtcccggacaggccgagtttggtcatcagccgttcgacggtgcatctggccacctcgatgccctcacggttcagggttagccacactttgcgggcaccgtaaacaccgtagttggcggcgtggacgcggctgatgtgctc
等温核酸扩增链替换反应引物设计如下：
正向引物5’gctcgatcgcgtcgaggaccatggaggtggc 3’SEQ ID NO：5
反向引物5’gcaggaccacgatcgctgatccggccacagc 3’SEQ ID NO：6
(2)核酸扩增及检测
全基因合成的质粒pET28a-6110作为样本3。从样本3取出1μl到一个新的200μl的PCR管中，再加入49μl等温核酸扩增链替换反应试剂(保存于-20℃冰箱)，其成分如下：
关上PCR管盖子。将PCR管放入37℃恒温金属浴孵育30min。随后将PCR管取出，向PCR管中加入50μl酚/氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，购自北京索莱宝科技有限公司)，漩涡震荡30s，12000rpm离心5min，取8μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图2所示，可以看到对样本3进行扩增检测到228bp的目的条带。由此可见，采用本发明的等温核酸扩增试剂及等温核酸扩增方法可以在37℃的等温条件下快速扩增结核分枝杆菌复合菌群(MTBC)IS6110基因片段，从而实现对结核分枝杆菌复合菌群的快速检测。
实施例3 肉源成分CytB序列扩增
在该实施例中，通过本发明提供的恒温扩增试剂盒方法对肉源成份(鸡、鸭和牛)的线粒体基因组中色蛋白(CytB)序列进行扩增，以实现对样本中的鸡、鸭和牛三种成份的检测。
(1)引物设计
选择肉源成份(鸡、鸭和牛)的CytB序列提交至美国国家生物中心网站上的数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast检索，通过网站Blast程序分析寻找鸡、鸭和牛的CytB各自特有、其他基因序列没有高同源性的DNA片段。在本发明中，发明人根据Blast结果在鸡、鸭和牛的CytB序列中分别选择了一段进行引物设计。
鸡源模板序列SEQ ID NO：7：
tgtaatgtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacacccctcgccctacttgccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgcataactcctgaactttctcacttttcacgaagtcatctgtggattatcttcccctctttagtccgtgatcgcggcatcttctctcttctattgctgttggttccttctctttttggggcttcttcacaggttgcccttcacagtgcgggtgcggagtgctattcaagtgaagcctggactacacctgcgttgcgtcctatcctagtcctctcgtgtccctcgatgagacggtttgcgt
鸭源模板序列SEQ ID NO：8：
aatcgcaggaatcaccctagtccacttaaccttcctacacgaatcaggctcaaacaaccccctaggtcttgtatcagactgtgacaaaatcccattccacccctacttctcctttaaggacatcctaggatttatcctcatgcttacccccctcatagcactagccctattctcacctaaccttctaggggacccagaaaacttcacccccgcaaaccccctagtaaccccaccacacattaaaccagaatgatacttcctattcgcc
牛源模板序列SEQ ID NO：9：
aatttcggttccctcctgggaatctgcctaatcctacaaatcctcacaggcctattcctagcaatacactacacatccgacacaacaacagcattctcctctgttacccatatctgccgagacgtgaactacggctgaatcatccgatacatacacgcaaacggagcttcaatgttttttatctgcttatatatgcacgtaggacgaggcttatatta
以序列SEQ ID NO：7为模板：
正向引物5’ tacttcatgaccagtctcaggcccattctttc 3’ SEQ ID NO：10
反向引物5’ tctcatcgagggacacgagaggactaggatag 3’ SEQ ID NO：11
以序列SEQ ID NO：8为模板：
正向引物5’ tcgcaggaatcaccctagtccacttaaccttc 3’ SEQ ID NO：12
反向引物5’ tatcattctggtttaatgtgtggtggggttac 3’ SEQ ID NO：13
以序列SEQ ID NO：9为模板：
正向引物5’ atttcggttccctcctgggaatctgcctaatc 3’ SEQ ID NO：14
反向引物5’ cattgaagctccgtttgcgtgtatgtatcgg 3’ SEQ ID NO：15
在通风橱中，使用组织基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)对鸡、鸭和牛鲜肉样本提取高纯度DNA，得到DNA样本50μl，分别标记为样本4、样本5和样本6。以样本4、样本5和样本6为模板，再加入49μl等温核酸扩增链替换反应试剂(保存于-20℃冰箱)，分别进行一重、二重、三重反应，其成分如下：
其中，分别以模板4、5、6为样本进行一重扩增反应时，反应体系中分别包含各样本及一组对应引物，进行二重扩增反应时，反应体系中包含两种样本及两组对应引物，进行三重扩增反应时，反应体系中包含三种模板及三组对应引物。
将PCR管放入37℃恒温金属浴孵育30min。随后将PCR管取出，向PCR管中加入50μl酚/氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，购自北京索莱宝科技有限公司)，漩涡震荡30s，12000rpm离心5min，取8μl上清液进行琼脂糖凝胶电泳。实验结果如图3所示，泳道1-3分别为鸡、鸭和牛的一重检测，泳道4和5分别为鸡和牛的二重检测，泳道6和7分别为鸡、鸭和牛的三重检测。由此可见，采用本发明的等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法可以在37℃的等温条件下快速扩增肉源成份(鸡、鸭和牛)的CytB序列，从而实现对样本中鸡、鸭和牛成份的单重或多重检测。
以上实施例仅仅用于对本发明进行举例说明，并不对本发明的保护范围构成任何限定。此外，尽管本发明说明书中结合具体实施例对本发明进行说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同变换，在不脱离本发明实质的前提下，任何修改或等同变换仍落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种等温核酸扩增反应试剂，其特征在于包括下列组分：
Tris-HCl缓冲液 100-800 mM
氯化钠 10-150 mM
氯化钾 10-150mM
氯化镁 10-50 mM
二硫苏糖醇 5-15 mM
聚乙烯吡咯烷酮 5-20%
ATP 10-20 mM
dNPTs 1-5 mM
磷酸烯醇丙酮酸 10-50 mM
丙酮酸激酶 500-1500 ng/μl
BSA 100-500 ng/μl
引物组 每种引物25-200pmol
T4噬菌体DNA解旋酶gp41蛋白 50-200 ng/μl
天蓝色链霉菌recA蛋白 100-500 ng/μl
单链结合蛋白 200-1000 ng/μl
大肠杆菌DNA聚合酶I 50-200 ng/μl；
所述等温核酸扩增反应试剂的反应温度为20℃至42℃；所述Tris-HCl缓冲液的pH 为8.0；所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为360000。
2.如权利要求1所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于，所述引物组包括至少两种引物。
3.如权利要求1所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于，所述反应试剂还包括荧光染料。
4.如权利要求3所述的等温核酸扩增反应试剂，其特征在于，所述荧光染料为SYBRGREEN1、SYTO-13或SYTO-82。
5.一种非疾病诊断的等温核酸扩增方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供DNA或cDNA模板；
(2)加入权利要求1至4中任一项所述的等温核酸扩增反应试剂，在20℃至42℃下反应15分钟至50分钟，完成核酸扩增。
6.如权利要求5所述的等温核酸扩增方法，其特征在于，所述等温核酸扩增反应试剂中的引物组根据步骤(1)中的DNA或cDNA模板设计。
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