JP2005532827A - 側方フローアッセイ用のデバイスおよびその方法 - Google Patents

Abstract

サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するための側方フローアッセイデバイスが開示される。本発明の側方フローアッセイデバイスは、（ｃ）デバイスを試験されるサンプルと接触させるためのサンプル収容区域、（ｄ）核酸をサンプルから抽出するための抽出区域（８）、（ｃ）サンプル収容区域との液体連絡状態にある核酸増幅区域（１８）、および（ｄ）核酸増幅区域において行われた核酸増幅反応の生成物を直接的または間接的に検出するための検出区域（２０）を含み、この場合、前記核酸検出区域（２０）は増幅区域（２０）との液体連絡状態にあるか、または、増幅区域（２０）との液体連絡状態で配置可能である。

Description

本発明は、サンプル中の標的核酸配列の存在および／または量を検出するために使用され得る側方フローアッセイデバイス、そのような側方フローデバイスを含むキット、ならびにアッセイを行う方法に関する。

核酸の高感度検出は、近年、様々な核酸検出技術および核酸増幅技術の開発により進歩している。これらの増幅技術は、大まかには、特異的な標的増幅およびシグナル増幅に分けることができる。標的増幅技術の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）（米国特許第５，１３０，２３８号）、および転写媒介増幅（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号）が含まれる。シグナル増幅技術の例には、ＲＮＡシグナル媒介増幅技術（ＳＭＡＲＴ）（国際公開公報ＷＯ９３／０６２４０）、スプリットプロモーター増幅反応（ＳＰＡＲ）（国際公開公報９９／３７８０５号）、Ｉｎｖａｄｅｒ（米国特許第５，８４６，７１７号）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（欧州特許第０，３２０，３０８号）が含まれる。これらの技術は、（ＰＣＲなどのように）熱サイクルが必要であるか、または、単一の温度で（等温的に）操作することができるかのいずれかにより、標的／シグナルを増幅するその能力によってさらに細分化することができる。本明細書において言及されるすべての刊行物の内容は、特に、参照により援用される。

これらの技術の間における１つの共通点は、前段でのサンプル調製（核酸抽出）および後段でのアンプリコン検出が必要であるということである。これらの技術はすべてが、アンプリコンの検出を達成するために多段階のプロセスを伴っており、そのため、現在の開発は、分析物をハイスループットに処理するための手段を提供するために、これらのプロセスを自動化するための複雑なシステムを目標としている。

様々な核酸増幅技術が先行技術分野では広く記載および例示されているが、これらはすべてが、核酸に依存する酵素の作用に依っている。１つのそのような技術、すなわち、ＳＭＡＲＴ（国際公開公報ＷＯ９３／０６２４０）は、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの作用の後でＲＮＡシグナルを生じさせる三成分結合（ＴＷＪ）構造を形成させるために目的の配列と組み合わせられる２つのプローブの相互作用に依っている。ＴＷＪから生じたＲＮＡシグナルは線状の増幅プローブによってさらに増幅され得る（例えば、国際公開公報０１／０９３７６を参照のこと）。ＲＮＡシグナルの検出は、先行技術分野で広く記載されている、分子ビーコン（米国特許第５，９２５，５１７号）、ラテックスビーズ、ＦＲＥＴ／ＤＦＲＥＴ（これらに限定されない）を含む多数の手段によって達成され得る。

上記プロセスの一部については、高価で複雑な装置が、そのような技術を行うために、一定レベルの熟練者とともに要求される。これらの技術が臨床的適用および産業的適用の両方のために広く使用されるためには、試験の複雑さ（すなわち、要求される工程数および技術基盤）の軽減、ならびに、試験あたりの計測および費用の減少が要求される。

具体的には、これらの試験が、患者の近く（治療の場所、すなわち、「ＰｏＣ」）で、またはプロセスレベルの近くで適用可能であるためには、簡便で、使用が容易で、費用的に競争可能なシステムが要求される。

様々なクロマトグラフィーアッセイまたは側方フローアッセイが、半熟練者または未熟
練者の使用者によって行うことができ、かつ、最小限の設備が要求されるように試験の実施を簡便化するために何年も前から使用されている。従って、それらは理想的にはＰｏＣ試験に適している。しかしながら、今日まで、それらの適用は主に、核酸の試験よりも複雑でない免疫アッセイに限られている。これは、免疫アッセイは、増幅工程が存在しない単純な検出アッセイであるからである。

側方フロー試験では、典型的には、アッセイを行うために必要な試薬のいくつか（または好ましくはすべて）を含有する１つの毛細管デバイスまたは多孔性キャリアが利用される。これらの試薬は典型的には、流体が毛細管流動によってデバイスに沿って流れるに従い、様々な反応が連続して行われ、サンプル中の分析物の存在および／または量を示すシグナルが検出区域において生じるように、デバイスの別個の区域の中に含有される。デバイスは、試薬が特定の部位に置かれた１枚のメンブランであり得る（例えば、米国特許第４，１６１，１４６号、米国特許第４，３６１，５３７号）か、または、それらの端が相互に液体接触状態にあるように配置された一連の別個のパッドまたはメンブラン（それぞれが反応物を含有しないか、または１つもしくは複数の反応物を含有する）から構成され得る（例えば、欧州特許第０１８６７９９号）。

典型的な側方フローデバイスは、サンプル収容区域（これは、場合により、試験に必要なバッファおよび化学薬品を含有し得る）、標識区域（これは、放出可能にメンブランに結合した分析物特異的な結合試薬（例えば、抗体など）を含有する）、捕捉・検出区域（これは、動かないようにメンブランに固定化された分析物結合試薬を含有する）、および、結合していない標識された試薬を検出区域から洗い流すことができるために十分な容量を有する吸収区域または廃液溜を含む。パッドまたはメンブランは、典型的には、不透過性の支持用裏材に取り付けられ、かつ、パッドまたはメンブランは、（通常的には、端部を重ね合わせこと、および接着剤または積層化層の使用によって達成される）相互の液体接触状態にある。場合により、デバイスは、サンプルの適用および結果の可視化のための規定された開口部を有する保護ハウジングに入れられる。そのようなデバイスの例には、米国特許第５，６５６，５０３号、米国特許第５，６２２，８７１号、米国特許第５，６０２、０４０号、米国特許第４，８６１，７１１号に開示されるデバイスが含まれる。

そのようなアッセイを行うために、サンプルが、毛細管力によってデバイス内に引き込まれるサンプル収容区域に加えられる。サンプル適用区域に組み込まれたフィルターデバイスを使用して、血液細胞などを除くことができ、また、そのようなフィルターデバイスは体積制御デバイスとして作用し得る（欧州特許第０１８６７９９号）。その後、サンプルは水和し、標識されている結合試薬（例えば、発色団で標識された抗体）と混合し、サンプル中に存在する何らかの分析物が特異的な様式でこれと反応して、標識された分析物複合体を形成する。この複合体がデバイスに沿って検出区域に移動し、検出区域において、ストリップに固定化されている第２の結合試薬が、標識された分析物複合体に結合し、標識された分析物複合体のさらなる移動を防止する。結合していない標識された結合試薬は検出区域を通り抜けて吸収区域に引き込まれる。従って、検出区域におけるシグナルの存在により、サンプル中の分析物の存在が示される。

様々な標識が側方フローアッセイのために使用されており、これらには、放射活性標識（米国特許第４，３６１，５３７号）および蛍光標識（米国特許第６，２３８，９３１号）が含まれる。だが、可視的標識がＰｏＣ適用のためには好ましい。これらには、酵素により生じる比色測定用シグナル（米国特許第４，７４０，４６８号）、および粒子状発色団（米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，９４３，５２２号、米国特許第５，７１４，３８９号）、例えば、コロイド状金粒子または有色のポリスチレン粒子もしくは「ラテックス」粒子などが含まれる。

従来の免疫型側方フローアッセイでは、界面活性剤が、タンパク質（例えば、抗体および特定の分析物など）の使用されるマトリックスへの付着を防止するために、また、流動力の改善のために使用されている。タンパク質は、主としてアミノ酸から構成されるポリマーであり、そのアミノ酸組成により、その静電荷が決定され、従って付着性が決定される。特に、タンパク質は正味の静電荷を有しないことがある。しかしながら、核酸は、一般にはデオキシリボヌクレオチドユニットまたはリボヌクレオチドユニット（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のいずれかから構成されるポリマーであり、分子に正味の負電荷をもたらすリン酸エステル骨格を有しており、従って、何らかの正荷電表面に付着しやすい。

側方フロー技術を利用する核酸に基づく分析が先行技術では記載されている。例えば、国際公開公報００／１２６７５には、核酸抽出、特異的な標的増幅および検出を統合するアッセイシステムが開示される。これに記載されるデバイスは、一方のみが閉じた端部と、多数のチャンバーとをその中に有する中空の細長い円筒を含む。核酸抽出工程および核酸増幅工程が円筒内で行われる。その後、増幅産物が、アッセイの検出工程を行うために側方フロー試験スティックの近位端と接触する。従って、国際公開公報ＷＯ００／１２６７５に開示されるデバイスは比較的複雑である。特に、このシステムは、核酸抽出工程が側方フローデバイスの内部または表面で行われるものではない。

米国特許出願第２００１／００３６６３４号には、熱サイクル処理の増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を伴う核酸アッセイを行うための装置が開示される。この装置は、側方フロー試験スティックと、核酸増幅反応混合物が試験スティックに沿って移動するに従い、多数の定常的な熱区域を通過し、その結果、反応混合物が、ポリメラーゼ連鎖反応を行うために好適な様式で熱サイクル処理されるようにされる関連した熱調節可能な装置とを含む。核酸増幅反応混合物はアッセイ装置の外側で調製され、側方フロー試験スティックのサンプル収容区域に加えられる。従って、米国特許出願第２００１／００３６６３４号に開示される試験スティックは、一体化した核酸抽出区域を含まない。

さらに、米国特許出願第２００１／００３６６３４号に開示される装置は熱サイクル処理に依っている。そのため、高価な熱サイクル処理装置の使用が要求されるので、これは、特にＰｏＣタイプの使用のためには理想的ではない。さらに、ＰＣＲは標的増幅システムであるので、汚染に対して極めて敏感である。従って、より安価で、影響をより受けにくいアッセイデバイスが非常に好都合である。

第１の局面において、本発明は、サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するための側方フローアッセイデバイスであって、
（ａ）デバイスを試験されるサンプルと接触させるためのサンプル収容区域、
（ｂ）核酸をサンプルから抽出するための抽出区域、
（ｃ）サンプル収容区域との液体連絡状態にある核酸増幅区域、および
（ｄ）増幅区域において行われた核酸増幅反応の生成物を直接的または間接的に検出するための検出区域を含み、前記検出区域が増幅区域との液体連絡状態にあるか、または、増幅区域との液体連絡状態で配置可能である、側方フローアッセイデバイスを提供する。

第２の局面において、本発明は、サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するための側方フローアッセイデバイスであって、
（ａ）デバイスを試験されるサンプルと接触させるためのサンプル収容区域、
（ｂ）サンプル収容区域との液体連絡状態にある核酸等温増幅区域、および
（ｃ）増幅区域において行われた等温核酸増幅反応の生成物を直接的または間接的に検出するための検出区域を含み、前記検出区域が増幅区域との液体連絡状態にあるか、また
は、増幅区域との液体連絡状態で配置可能である、側方フローアッセイデバイスを提供する。

上記に規定される第２の局面によるアッセイデバイスは２つの点で第１の局面のアッセイデバイスと異なる：
（ｉ）第１の局面のデバイスを使用して行われる増幅反応は、代替として熱サイクル処理を伴い得る場合を除いて等温的である場合があり（好ましくは等温的であり）、一方、第２の局面のデバイスを使用して行われる増幅反応はもっぱら等温的である；
（ｉｉ）抽出工程が、第１の局面によるデバイスの（典型的には、サンプル収容区域の一部を形成するか、またはサンプル収容区域に隣接する）抽出区域の表面または内部で行われる−そのような工程はまた、場合により、第２の局面によるデバイスのサンプル収容区域の表面または内部で行われ得る（好ましくは、サンプル収容区域の表面または内部で行われる）。しかしながら、あるいは、抽出工程は、アッセイデバイスと離れて行うことができ、得られた抽出サンプルを続いて、第２の局面によるデバイスのサンプル収容区域に加えることができる。

第３の局面において、本発明は、サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量を検出する方法であって、目的とする配列を含むサンプルを本発明の第１の局面による側方フローアッセイデバイスのサンプル収容区域と接触させる工程、核酸抽出工程を側方フローアッセイデバイスの表面または内部で行う工程、および、核酸増幅反応をデバイスの核酸増幅区域において行わせる工程、および、増幅反応の生成物をデバイスの検出区域において直接的または間接的に検出する工程を含む方法を提供する。

第４の局面において、本発明は、サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量を検出する方法であって、目的とする配列を含むサンプルを本発明の第２の局面による側方フローアッセイデバイスのサンプル収容区域と接触させる工程（この場合、サンプルは、サンプル収容区域との接触に先立って抽出工程に供されているか、または、アッセイデバイスの表面もしくは内部での抽出工程に供されるかのいずれかである）、核酸増幅反応をデバイスの増幅区域において行わせる工程、および、増幅反応の生成物をデバイスの検出区域において直接的または間接的に検出する工程を含む方法を提供する。

第５の局面において、本発明は、上記で規定される本発明の第１の局面および／または第２の局面による側方フローアッセイデバイスを作製する方法であって、増幅区域および検出区域を含む多孔性マトリックスまたは他の流体輸送手段を形成する工程を含む方法を提供し、この場合、前記増幅区域はサンプル収容区域との液体流連絡状態にあるか、または、サンプル収容区域との液体流連絡状態で配置可能であり、サンプル収容区域は、サンプル収容区域に固定化または放出可能に結合している１つまたは複数の試薬を含み、その結果、サンプル収容区域と接触した核酸含有サンプルに対する核酸抽出工程を行うようにされている。典型的には、１つまたは複数の試薬は、界面活性剤；塩基；キレート化剤；およびフリーラジカル捕捉剤の１つまたは複数（好ましくはすべて）を含む。これらの試薬はどこかでより詳しく記載される。

第６の局面において、本発明は、サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するためにアッセイを行うためのアッセイキットであって、本発明の第１の局面および／または第２の局面による側方フローアッセイデバイスと、アッセイを行うために要求される少なくとも１つの試薬の供給とを含むアッセイキットを提供する。好都合には、キットは、アッセイを行っている間中にわたってデバイスに加えられるキャリア液の供給をさらに含むことができる。前記少なくとも１つの試薬は、キャリア液に溶解または懸濁されて供給され得るか、あるいは、例えば、乾燥または凍結乾燥されて、好ましくは、直ちに使用できる分割量（ａｌｉｑｕｏｔ）で供給され得る。アッセイデバイス
とは別にキットに供給される試薬（１つまたは複数）は、例えば、下記の１つまたは複数であり得る：ＤＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡポリメラーゼ；分析物に特異的な核酸プローブ；アンプリコンに特異的な標識用試薬；ｒＮＴＰ類；ｄＮＴＰ類など。

次に、本発明のアッセイデバイスおよび関連する局面がさらに記載される。文脈が別のことを示さない限り、下記の記載は、一般に、本発明の第１の局面または第２の局面のいずれかによるアッセイデバイスに等しく適用される。

本発明の第１の局面のデバイスは、本質的な特徴として、核酸抽出区域を含む。そのような区域はまた、本発明の第２の局面によるデバイスの好ましい特徴でもある。抽出区域は、デバイスの別個の部分を形成し得るか、または、例えば、サンプル収容区域内に構成され得る。抽出区域は典型的には多数の試薬を含み、そのうちの１つまたは複数が、核酸抽出工程を行うために要求される。核酸抽出試薬は、好都合には、抽出区域内に、例えば、固定化されて、または放出可能に結合して（例えば、乾燥された形態で非特異的に吸着させられ、湿らされたときに移動可能であるように）存在する。これを達成する好適な様々な方法が当業者には広く知られている。核酸抽出試薬は、界面活性剤；塩基；キレート化剤の任意の１つまたは複数（好ましくはすべて）を含むことができる。

「抽出」工程は、
（ｉ）サンプルに存在する細菌細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞、酵母細胞または他の菌類細胞の溶解；
（ｉｉ）存在する場合には、サンプルに存在するウイルス粒子の破壊；
（ｉｉｉ）サンプル中の核酸の少なくとも部分的な精製（これは、例えば、脂質膜の断片からの核酸の分離および／またはポリペプチド混入物の除去を含む）；および
（ｉｖ）サンプルに存在するＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの不活性化
の任意の１つまたは複数を含むことができる。

要求される抽出量および抽出の種類は、少なくとも部分的には、サンプルの種類および目的とする標的配列の種類に依存する。例えば、分析物が二本鎖である場合、熱的（またはより好ましくは）化学的な変性工程が、典型的には抽出の一部として、アッセイが容易な一本鎖核酸を得るために都合良く行われる。そのような化学的変性を生じさせるために好適な薬剤を、好都合には、抽出区域に（例えば、固定化して、または放出可能に結合させて）存在させることができる。あるいは、標的がサンプル中に一本鎖形態（典型的には一本鎖ＲＮＡ）で既に存在する場合、通常、そのような熱的または化学的な変性工程は必要とされない。

標的が一本鎖にされると、鎖が再会合する可能性を減少させるために何らかの方法で標的を処理することは、通常、好都合である。これには、例えば、標的鎖の濃度を低下させるためにキャリア液で希釈すること、および／または、かなり過剰な１つもしくは複数の標的特異的プローブと迅速に接触させることが伴い得る。

本発明の第１の局面によるデバイスにおいて、核酸抽出は側方フローデバイスの表面または内部で行われる。これもまた、本発明の第２の局面によるデバイスの好ましい特徴である。この配置は、アッセイの本質的にすべての工程を側方フローデバイスの表面で行うことができ、これにより、先行技術の配置よりも大きい簡便性が提供されるという利点を有している。

抽出工程は、好ましくは、サンプル収容区域内および／またはその近くで行われる。特に、サンプル収容区域が、抽出区域としてさらに作用し、かつ、所望される抽出を達成す
ることができる薬剤を含むことが好ましい。典型的には、そのような薬剤は、多孔性マトリックスの表面および／または内部に放出可能に結合または固定化されている。そのような薬剤には、望ましくは、下記の１つまたは複数（好ましくはすべて）が含まれる：界面活性剤（例えば、トライトンＸ １００など）、塩基、キレート化剤およびフリーラジカル捕捉剤。いくつかの好適な薬剤の詳細が、中でも、米国特許第５，４９６，５６２号、同第５，８０７，５２７号、同第５，９８５，３２７号、同第５，７５６，１２６号および同第５，９７２，３８６号に含まれる。

界面活性剤はアニオン性界面活性剤（例えば、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）など）または非イオン性（例えば、ノニデットＮＰ４０）であり得る。特に好ましい界面活性剤はＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）であり、これは、非常に効果的であるが、シクロデキストリンの添加またはシクロデキストリンとの接触によって容易に中和される。従って、ＤＴＡＢ／シクロデキストリンの系は、本発明の目的のために特に適している。これは、シクロデキストリンは、増幅反応において用いられる様々な酵素をそれ以外の場合には阻害しやすく、従って、増幅工程を行う前にＤＴＡＢを除くための洗浄工程または類似する工程を必要とする界面活性剤を中和することができるからである。このようなＤＴＡＢ／シクロデキストリンの系が国際公開公報ＷＯ９２／１２２５３および米国特許第５，５５８，９８６号にさらに詳しく記載されている。好都合には、ＤＴＡＢを核酸抽出区域において提供することができ、シクロデキストリンをＤＴＡＢの下流側に存在させることができ、あるいは、核酸抽出工程が行われていると、アッセイデバイスに加えることができる。

塩基は、好都合には弱塩基であり、典型的には一価である。塩基は、その対応する塩（好ましくは炭酸塩）として提供され得ること、および、本明細書中で使用される用語「塩基」は、文脈によりそのようなことが可能である場合にはそれに従って解釈されなければならないことに留意する。好ましい塩基はＴｒｉｓ（すなわち、トリス−ヒドロキシメチルメタン）である。好ましいキレート化剤はＥＤＴＡ（すなわち、エチレンジアミン四酢酸）である。フリーラジカル捕捉剤は、界面活性剤、塩基およびキレート化剤よりも重要性が低い。好適なフリーラジカル捕捉剤は尿酸または尿酸塩である。フリーラジカル捕捉剤は、サンプルが、アッセイデバイスと接触した後、直ちに処理されず、何らかの増幅反応が行われる前に（例えば、保存されるために）しばらく放置される状況では特に有用であり得る。他の状況では、フリーラジカル捕捉剤は、通常、不要であり得る。

１つの実施形態において、本発明の第１の局面または第２の局面による側方フローアッセイデバイスは、好ましくはサンプル収容区域において、ＦＴＡマトリックスまたは類似のものを含む。ＦＴＡ紙が、Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、英国）から入手可能であり、これは、細胞膜および核膜を溶解し、ポリペプチドを変性させ、酵素（例えば、ヌクレアーゼなど）を不活性化する薬剤、および核酸をＵＶ媒介の損傷または他の環境的損傷から保護する薬剤（例えば、上記の薬剤など）で被覆されたセルロース系マトリックスを含む。ＦＴＡ紙は、前段落で参照された米国特許に詳しく記載されている。類似物がＩｓｏＣｏｄｅ（登録商標）として知られており、これはＳｃｈｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌから入手可能である。

例示目的のために、好適なサンプル収容／抽出区域マトリックスは、下記のような（１ｃｍ²の紙あたりの）最少負荷量を有するセルロース系の紙（例えば、ろ紙など）を含む：ＳＤＳまたはトライトンＸ１００、１ｍｇ；Ｔｒｉｓ、８マイクロモル（９６８．８ｍｇの遊離型塩基）；ＥＤＴＡ、０．５マイクロモル（１４６．１ｍｇの遊離型酸）、および場合により、尿酸、２マイクロモル（３３６．２４ｍｇ）。

サンプルに存在する核酸は一時的にマトリックスの内部に捕捉される。洗浄液またはキ
ャリア液（例えば、ＴＥバッファ）を、所望されない混入物を洗い流すために加えることができる。加えられる流体の量は、側方フローアッセイマトリックスおよび芯（通常の場合には存在する）を飽和させるほど多くならないように注意しければならない。そうでない場合には、その後の毛細管流動が不可能になる。

ＦＴＡ紙または類似するそのような材料はサンプル収容区域に限定され得るか、または、側方フローアッセイデバイスの多孔性マトリックスのすべての部分もしくは実質的な部分を構成し得る。増幅反応をＦＴＡ紙上で行うことができる。この場合、酵素などを不活性化する試薬は、洗浄液またはキャリア液を加えることによってマトリックスから洗い流される。あるいは、ＦＴＡマトリックスの内部に一時的に捕捉された核酸は、（例えば、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファまたは他のＥＤＴＡ含有水溶液をマトリックスに加えることによって）溶出させることができ、従って、一般には従来のニトロセルロースまたは類似する多孔性マトリックスを含む側方フローデバイスの下流側部分に輸送することができ、その後、その内部で増幅反応を行うことができる。あるいは、本発明の第２の局面によるデバイスにおいて、サンプル収容区域は、事前に抽出された核酸を含有するサンプルが加えられる本質的には不活性な従来のマトリックス（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）であり得る。

核酸の操作を伴う分子技術では、特定の適用については、表面での吸着による物質の喪失を防止するために、有機シリコン酸化物ポリマーが使用される。例えば、ジクロロジメチルシランは、微量遠心チューブおよび使い捨てピペットチップなどをコーティングして、これらのデバイスの表面における付着による核酸の喪失を防止するために使用されるシラン化溶液における活性な成分である。

本発明者らは、核酸とともに使用される側方フローデバイスにおいて利用される特定の表面が、核酸型プローブおよび／または分析物のデバイスマトリックスへの付着を防止するためにシラン化溶液で処理され得ることを提案する。従って、例えば、ガラス繊維またはプラスチックを含むマトリックスを処理することができる。そのような処理はまた、デバイスの流動動力学を改善し得る。

ＤＮＡがカオトロピック性塩の存在下で可逆的な様式でシリカに結合することが１９５０年代初期から知られている。ケイ酸塩は、カオトロピック性塩によりリン酸ジエステル骨格を脱水し、それにより、露出したリン酸残基がシリカに吸着することを可能にすることによって二本鎖ＤＮＡと相互作用すると考えられている。吸着すると、二本鎖ＤＮＡは未変性の状態または一部が変性した（一本鎖）状態のいずれかでとどまり、他の生物ポリマー（例えば、ＲＮＡおよび炭水化物など）を追い出す溶媒によってマトリックスから溶出させることができない。しかしながら、固定化されたＤＮＡは、水性バッファで洗浄することによって再水和および回収することができる。

従って、さらなる実施形態にはまた、核酸に基づく側方フロー試験のためのマトリックスとして（薄層クロマトグラフィーにおけるように）ガラスまたはプラスチックにコーティングされたシリカ（様々な規格品）の使用が含まれ得る。デバイス上の様々な区域を、例えば、様々な反応区域を隔てるためのスクロースゲートを含ませることによって作製することができる。ゲートの厚さにより、反応物がそれぞれの区域に留まり、それにより、遠位側に設置された区域の中に入る前に、特定の反応を完了させることを可能にする時間が決定される。核酸はまた、カオトロピック剤の使用によって特定の区域に保持することができ、かつ、遠位側に設置された区域への移動を可能にするための水性バッファの添加によって放出させることができる。

目的とする核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの混合物を含むことができ、ま
た、自然界に存在する分子または合成された分子であり得る。典型的には、目的とする配列は、ヒトもしくは動物の感染性疾患病原体、食物腐敗生物、または、動物（特に哺乳動物）起源、ヒト起源もしくは植物起源に由来し得る。本発明のアッセイデバイスは、感染性疾患または他の病理学的状態の診断（例えば、特定の遺伝学的異常に関連する遺伝性の障害または状態の診断）、および、食物における腐敗生物の検出、または、水もしくは他の環境サンプルにおける病原体もしくは糞便汚染のマーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出を助けるための診断ツールとして特に応用される。従って、アッセイデバイスのサンプル収容区域に加えられるサンプルは、（必要に応じて）、目的とする任意のサンプルであり得るか、または目的とする任意のサンプルに由来し得る。サンプルは、典型的には、生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、血清、尿または汗など）、食物もしくは飲料物のサンプル、または環境サンプル（例えば、水サンプルもしくは表面からの塗抹物など）であり得る。

本発明の側方フローアッセイデバイスは、典型的には、低価格品であり、１回の使用の後で廃棄される。一般に、アッセイデバイスは、透過性もしくは多孔性のマトリックス、または他の液体流動手段を含み、これらは、近位端がサンプル収容区域との液体連絡状態にあり、その結果、サンプル収容区域に加えられた液体が毛細管作用によってデバイスに沿って透過性マトリックスもしくは多孔性マトリックスを通過して流れることができるようになっている。高吸収性の「廃液溜」または吸上部材を、毛細管流動を高めるために、多孔性マトリックスの遠位端に提供することは従来的である。液体に懸濁または溶解された分析物および／または試薬は液体の流れによってデバイスに沿って輸送され得る。

典型的には、多孔性マトリックスおよび吸上部材は、デバイスの取り扱いを容易にし、かつ、マトリックスを汚染から保護するために、合成プラスチック材を含むことが多い不透過性の外被の中に実質的に包まれる。

再度ではあるが、多孔性マトリックスの内部および／または表面に、典型的には乾燥形態または凍結乾燥形態で、放出可能に結合され、その結果、アッセイデバイスを液体と接触させることにより、試験試薬が放出され、これらが、その後、多孔性マトリックスに沿った液体の毛細管流動によって輸送され得るようにされている少なくとも１つの試験試薬を側方フローアッセイデバイスに提供することは慣用的である。少なくとも１つの試験試薬（典型的には、捕捉試薬）をデバイスの検出区域において提供することもまた慣用的である。この場合、そのような試薬は、マトリックスに沿った液体の流れにより、問題としている試薬が放出されないように、多孔性マトリックスの内部および／または表面に固定化されている。これにより、検出区域における分析物の濃縮および検出が容易になる。

本発明のアッセイデバイスは、通常、これらの慣用的な特徴を有している。本発明のデバイスの一般的な操作原理は、サンプル収容区域に加えられたサンプルに存在する目的とする核酸配列が、一般には目的とする配列の存在に依存して核酸増幅反応が行われる核酸増幅区域に、多孔性マトリックスに沿った毛細管流動によって輸送されるということである。そのような反応の増幅産物（これはアンプリコンとして知られている）は、典型的には、アンプリコンに特異的な様式で標識され、引き続き、多孔性マトリックスに沿って通過して、固定化されている捕捉分子によってアンプリコンが捕捉される検出区域に至る。

当業者は、アッセイを行うためには液体が存在することが必要であることを理解する。サンプルは、それ自体が液体の形態であり得る。あるいは、サンプルをアッセイデバイスと接触させる前、またはサンプル収容区域においてその場でのいずれかで、キャリア液をサンプルに加えることが必要であり得る。キャリア液は、通常、水性であり、これには、例えば、蒸留水もしくは脱イオン水、または、ＴＥバッファなどの水性バッファ溶液が含まれ得る。キャリア液は、すべてをひとまとめにして加えることができ、または、別個の
分割量で加えることができる（この後者の選択肢は、アッセイデバイスに沿った分析物および／または試薬の流れを制御することを助けるために有用に用いることができる）。好都合には、キャリア液は、アッセイを行うために要求される試薬（例えば、ＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼ；ｒＮＴＰ類またはｄＮＴＰ類；プローブ；標識など）の１つまたは複数を含むことができる。さらに、またはあるいは、上記で説明されたように、キャリア液は、サンプル収容区域から混入物を洗い流すために、かつ／または、抽出工程を行うために有用な薬剤ではあるが、その後の核酸増幅反応を阻害し得る薬剤をサンプル収容区域から溶出させるためにデバイスに加えることができる。デバイスに加えられるキャリア液の量は、典型的には５０μｌ〜２ｍｌの範囲であり、好ましくは１００μｌ〜１ｍｌの範囲である。

一般に、配置は、液体（ならびに、関連する分析物および／または再懸濁された試薬）が１つの区域から別の区域に流れ、これにより、アッセイの様々な工程が連続して行われることを可能にするようにされる。この流れは、実質的に一定の速度で、本質的には連続的であり得る。しかしながら、例えば、特定の反応生成物を蓄積させ、その後、反応生成物をデバイスの次の区域に進めさせるために、多孔性マトリックスに沿った種々の地点で流速が異なる不連続な流れを生じさせることが好ましい場合がある。流速の変化は、物理的なスイッチ、溶解可能なバリア（例えば、スクロース）、毛細管流動の制限（例えば、マトリックスの多孔性／透過性を変化させることによる制限）など（これらに限定されない）を含む多数の好適な手段のいずれかによって達成され得る。免疫アッセイの側方フローアッセイで使用される流体制御システムの例で、本発明において用いられ得る流体制御システムの例には、化学的ゲート（米国特許第６，２７１，０４０号）、遠心力（米国特許第４，９８９，８３２号）、毛細管制限（米国特許第６，２７１，０４０号）、試薬に対して異なる経路長を有する別個の流体経路（米国特許第４，９６０，６９１号；米国特許第５，１９８，１９３号）、または物理的手段（例えば、Ｃ−Ｑｅｎｔｅｃから得られるＷｈｅａｔＲｉｔｅ試験）の使用が含まれる。多孔性マトリックスを、１枚の連続したストリップとして配置することができ、または、１つの部分から隣接する部分への液体の流路を提供するように液体連絡状態で保持または配置可能である２つ以上の部分から形成させることができる。

１つの実施形態において、側方フローアッセイデバイスは、１つの部分から別の部分への液体の流速に影響を与えるように多孔性マトリックスの２つ以上の部分の相対的な位置を変化させるための手段を含む。これは、例えば、マトリックスの以前に隔てられた部分を、相互の液体流連絡状態にするために作動させることができるプランジャーまたは押しボタンを含むことができる。あるいは、デバイスは、２つの構成要素が第１の形態では液体流連絡状態でないが、デバイスの折り畳み可能な部分を（例えば、刻み目線または測方に平らにされた折り目に沿って）折り畳むことにより、以前には分かれていた構成要素が液体流連絡状態になるように折り畳み可能な部分を含むことができる。

さらに、または、側方フローデバイスの異なる部分の間で流速に影響を及ぼすことの代替として、デバイス内の液体の流路に影響を及ぼすための手段が提供され得る。例えば、流路は、液体が２つ以上の異なる方向の１つで流れることができる１つまたは複数の分岐点を含むことができ、アッセイデバイスは、液体により選ばれた流路に影響を及ぼすための手段を含むことができる。１つの実施形態において、２つ以上の多孔性または吸収性の部材を分岐点の下流側に配置することができ、この場合、それぞれの下流側の多孔性または吸収性の部材により、可能な流路がもたらされる。所望される場合、下流側の多孔性または吸収性の部材の１つまたは複数を配置することができ、その結果、初期状態では、それらが分岐点との液体流連絡状態ではないが、例えば、液体不透過性バリア（例えば、合成プラスチック材の薄いフィルムなど）を除くことによって、または、使用者がスイッチ機構を（例えば、分岐点と下流側部材とのすき間または空間を閉じるようにバイアス手段
に対して圧力を加えることにより）作動させることによって、続いてそのような液体流連絡状態にされるようにすることができる。あるいは、下流側部材は、最初に液体流連絡状態であり得るが、物理的分離によって（例えば、スイッチ手段またはバイアス手段を動かすことによって）、または、不透過性バリアを挿入することによってそのような連絡から強制的に引き離すことができる。このような方法で、液体を、所望されるように、様々な液体流路の間で送達することができる。

多孔性マトリックスは、例えば、セルロースおよび／またはセルロース誘導体（特にニトロセルロース）を含むことができる。だが、任意の好適な多孔性材料（例えば、ガラス繊維、ナイロン、ポリスルホン）を使用することができる。好ましくは、多孔性マトリックスは、増大した強度および剛性を提供するために、支持用裏材（典型的には、１枚のプラスチックシート材、例えば、Ｍｙｌａｒ（登録商標））に配置される。典型的には、多孔性マトリックスは、分析物または試薬の非特異的な結合／吸収を防止するために従来の薬剤で処理することができる。非特異的な結合の好適な阻止剤には、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれる。

いくつかの実施形態において、側方フローアッセイデバイスは、核酸増幅反応のために要求される少なくとも１つの試薬を含み、そのような試薬は、増幅区域内または増幅区域の上流側において、多孔性マトリックスに放出可能に結合させて提供される。いくつかの実施形態において、核酸増幅反応のために要求される少なくとも１つの試薬が、側方フローアッセイデバイスに（典型的にはサンプル収容区域において）加えられるキャリア液に懸濁または溶解されて提供される。さらに、増幅反応のために要求される少なくとも１つの試薬が多孔性マトリックス表面または多孔性マトリックス内に固定化され得ること（すなわち、その結果、マトリックスに沿った液体の流れにより、試薬が放出されなくなるようにすること）もまた可能である。例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドプローブ、およびプライマーなどを、フェニルジイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）またはジスクシンイミジルスベラートによってアミノ活性化マトリックスに固定化することができる。

直前に記載された実施形態は相互に排他的ではなく、任意の組合せで組み合わせることができることが認められる。例えば、核酸増幅反応のために要求される１つまたは複数の試薬をマトリックスに放出可能に結合させることができ、１つまたは複数をマトリックス表面またはマトリックス内に固定化することができ、一方で、１つまたは複数の他の試薬を、側方フローアッセイデバイスに加えられる液体に存在させることができる。典型的には、増幅反応では、目的とする標的配列、標的配列に対して相補的な部分を含む少なくとも１つの核酸プローブ、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼ、および、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成するために核酸ポリメラーゼによって利用され得るヌクレオチド三リン酸が要求される。

核酸増幅区域は、好適な条件で増幅反応が行われるように、増幅反応の必須成分のすべてが一緒にされるアッセイデバイスのそのような一部である。従って、増幅区域は、側方フローアッセイデバイスの明らかに識別可能な部分もしくは別個の部分であってもよく、またはそのような部分でなくてもよい。特に、増幅区域は、サンプル収容区域と同一の広がりを有し得るか、またはサンプル収容区域の一部を形成し得る。

さらに、増幅反応は、標的配列の増幅（すなわち、多数コピーの標的配列の合成）をもたらす反応であり得るか、または、シグナル配列の増幅をもたらす反応（この場合、シグナル配列の生成は最終的にはサンプル中の目的とする標的配列の存在に依存する）であり得る。用いられ得る標的配列増幅技術の例には、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号）およびＴＭＡ（米国特許第５，３９９，４９１号）が含まれる。用いら
れ得るシグナル配列増幅技術の例には、ＳＭＡＲＴ（国際公開公報ＷＯ９３／０６２４０号）、ＳＰＡＲ（国際公開公報ＷＯ９９／３７８０５）およびＩｎｖａｄｅｒ／Ｃｌｅａｖａｓｅ（米国特許第５，８４６，７１７号）が含まれる。

本発明の第２の局面によるデバイスにおいて、増幅反応が等温反応（すなわち、熱サイクル処理を伴うことなく実質的に一定の温度で行われる反応）であることは本質的な特徴の１つである。本発明の第１の局面によるデバイスにおいて、増幅反応が等温反応であることは好ましい特徴の１つである。等温増幅反応は室温（例えば、２０℃）で行われ得るか、または特定の他の温度で行われ得る。反応速度を増大させるために、かつ／または、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大させるために、反応を高い温度（例えば、３０℃〜５０℃の範囲の温度）で行うことが選ばれることがある。熱サイクル処理が要求されないので、単純な「熱ブロック」、オーブン、水浴または他のインキュベーターを使用して、アッセイデバイスを加熱し、かつ、アッセイデバイスを、必要な時間、所望の温度で保持することができる。

好ましい等温増幅技術はシグナル増幅法である。特に、好ましい増幅反応は、ＳＭＡＲＴ（国際公開公報ＷＯ９３／０６２４０に開示されるようなもの）および／またはＳＰＡＲ（国際公開公報ＷＯ９９／３７８０５に開示されるようなもの）を含む。これらの技術ではともに、目的とする標的の配列に対して相補的である配列を含む少なくとも１つの核酸プローブの使用が要求される。

ＳＭＡＲＴの場合、２つのそのようなプローブが用いられる。この場合、それぞれが、標的核酸の、異なるが隣接する部分に対して相補的であり、その結果、標的の存在下で、２つのプローブ（一方が「テンプレート」プローブであり、他方が「伸張」プローブである）が、「三成分結合」体として知られている複合体で、標的上において互いに隣接してハイブリダイゼーションさせられる。２つのプローブが非常に接近した状態でハイブリダイゼーションすることにより、プローブのそれぞれの「アーム」部分の相互のさらなるハイブリダイゼーションが可能になる。これらのアームの１つ（「テンプレート」プローブのアーム）は他方よりも長い（短い方のアームが「伸張」プローブのアームである）。これにより、２つのアームの短い方を、大きい方のアームをテンプレートとして使用して、ｄＮＴＰ類の存在下でＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼによって伸張させることができる。アームの伸張は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列）を含む核酸の二本鎖部分を生じさせる。

従って、好適なＲＮＡポリメラーゼおよびｒＮＴＰ類の存在下で、プローブの一方の多数のＲＮＡコピーが形成される。これは「シグナル」増幅をもたらし、そして、多数のＲＮＡコピーはそれ自身が、所望する場合には、当業者に知られている多数の増幅プロセスのいずれか１つ（例えば、国際公開公報ＷＯ０１／０９３７６に開示されるようなプロセス）によって、さらに増幅され得る。ＲＮＡコピーまたはその増幅されたコピーが、その後、典型的には検出区域において捕捉および検出され得る。

従って、ｄＮＴＰ類、ｒＮＴＰ類、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび好適なバッファがともに、テンプレートプローブおよび伸張プローブと同様に要求され得る。好都合には、これらの試薬の大部分が、アッセイデバイスのサンプル収容区域に加えられるキャリア液で提供され、かつ／または、デバイスの多孔性マトリックスに放出可能に結合している。１つの実施形態において、プローブの一方（好ましくはテンプレートプローブ）が多孔性マトリックスの内部または表面に固定化され、それ以外の試薬が、アッセイデバイスのサンプル収容区域に加えられるキャリア液に存在し、かつ／または、多孔性マトリックスに放出可能に結合している。

標識化
好都合には、アンプリコン（すなわち、増幅反応の増幅された最終生成物）は、容易に検出され得る標識と検出区域の上流で会合する。標識は、容易に検出され得る任意の好適な物質（例えば、放射性標識または酵素標識）であり得る。しかしながら、標識が直接的な視覚標識（すなわち、何らかの事前の処理を伴うことなく観察者に明らかである標識）、例えば、粒子状の着色された「ラテックス」（実際、これらの「ラテックス」粒子はポリスチレンである）またはコロイド状の金粒子などであることは非常に好ましい。

標識化はアンプリコン特異的であることが望ましい。これを達成する最も単純な方法の１つは、アンプリコンが、標識区域に入る核酸の中で本質的に他と異なる配列を有することを確実にし、かつ、標識用試薬が配列特異的な様式でアンプリコンにハイブリダイゼーションするように、アンプリコンの塩基配列に対して相補的である塩基配列を含む標識用試薬を提供することである。

望ましくは、標識用試薬は、多孔性マトリックスに放出可能に結合されて、検出区域の上流で提供され、その結果、アンプリコンがアッセイデバイスに沿って移動するに従い、液体の毛細管流動によって放出される標識用試薬と会合し、その後、アンプリコンと標識用試薬との複合体が検出区域に移動するようになる。

標識化成分は、好都合には、標識に加えて、特異的な結合対（「ｓｂｐ」）の構成因子である成分を含む。そのようなｓｂｐは当業者には広く知られており、これらには、抗原／抗体、核酸の相補的な鎖、およびリガンド／受容体などが含まれる。本発明の目的のための好ましいｓｂｐはビオチン／ストレプトアビジンである。

検出
標識されたアンプリコンは検出区域において検出される。これは、好都合には、標識されたアンプリコン複合体について特異的である捕捉分子（より詳細には、アンプリコンについて特異的である捕捉分子）を多孔性マトリックスに固定化することによって達成される。アンプリコン特異的な捕捉分子は、アンプリコンに対して特異的な様式で結合することができ、かつ、多孔性マトリックスに固定化され得る任意の分子であり得る。好都合には、アンプリコン特異的な捕捉分子は、アンプリコンの配列に対して相補的である核酸配列を含むことができ、または、核酸結合タンパク質（例えば、「ジンクフィンガー」ポリペプチド）または配列特異的な抗ＤＮＡ抗体もしくは抗ＲＮＡ抗体（もしくはその効果的な結合性部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど）を含むことができる。

アンプリコン特異的な捕捉分子は、好都合には、多孔性マトリックスを横断して線状もしくはバンド状に、または他の認識可能な位置に固定化することができ、好ましくは、アッセイデバイスに沿った液体の流れ方向に対して実質的に横向きに配置される。従って、標識されたアンプリコンは捕捉および濃縮され、目に見える線を検出区域において形成する。しかしながら、例えば、スポットまたは他の形状を形成するように、捕捉分子を他の形態で設置することは完全に可能である。さらに、捕捉分子を２つ以上の位置に設置するようにデバイスを配置することは可能である。所望される場合、２つ以上の異なる捕捉分子（この場合、それぞれの捕捉分子がそれぞれのアンプリコンに対して特異的である）をそれぞれの位置に配置することができ、その結果、１個のデバイスを使用して、目的とする異なる配列のそれぞれの数の存在および／または量について試験することができるようになる。当然のことではあるが、異なる標的（またはそれに由来する配列）を増幅するための増幅試薬もまた提供される必要がある。

アッセイデバイスがコントロール区域を好都合には検出区域の下流側に含むこともまた
好ましい。コントロール区域は、典型的には、増幅反応および／もしくは検出反応に加わる試薬に対して、または、コントロール核酸増幅反応により生じ得る試薬に対して特異的に結合する固定化された捕捉試薬を含む。１つの好都合な配置は、コントロール区域が、標識用試薬に対して特異的な結合を示す固定化された試薬の線またはバンドを含むためのものである（例えば、標識用試薬はビオチン化オリゴヌクレオチドである場合があり、固定化されたコントロール区域捕捉分子はストレプトアビジンを含む）。

代替的な実施形態において、捕捉区域は、過剰な標識されたアンプリコンを捕捉する捕捉分子の固定化アレイを含む。

不確実さを避けるために、「好ましい」、「好都合な」、「望ましい」または「都合よく」などとして本明細書中に記載されている発明の特徴はどれも、そのように記載されている任意の他の特徴との組合せで、または分離でのいずれかで、本発明の実施形態において組み込まれ得ることが明記される。

次に、本発明は、例示的な例として、また、添付された図面を参照してさらに記載される。

本実施例では、本質的には国際公開公報ＷＯ９９／３７８０６に概略される方法（ＳＭＡＲＴ）が、側方フローデバイスにおいて使用されるような固体マトリックスの様々なサンプルにおいて行われ得ることが明らかにされる。Ｅ．ｃｏｌｉの２３Ｓ ｒＲＮＡが本実施例のための標的として使用された。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ａ合成機を製造者の説明書に従って使用してホスホルアミダイト化学によって合成された。オクタンジオール取り込みが、成長中の鎖のオクタンジオール−ホスホルアミダイト（Ｏｓｗｅｌ）との反応によって達成された。オリゴヌクレオチドプローブのビオチン化が、ビオチンホスホルアミダイトを取り込むことによって達成された。アルカリホスファターゼで機能化されたオリゴヌクレオチドが、製造者所有の方法（Ｏｓｗｅｌ）を使用して調製された。オリゴヌクレオチドはすべてが、標準的な技術を使用してＨＰＬＣ精製された。

ＲＮＡの調製
陽性反応のためのＲＮＡを、製造者の説明書を使用して、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡ調製キットを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株から調製した。ＲＮＡを、製造者の説明書に従って、リボグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）蛍光染色を使用して定量した。市販の酵母ＲＮＡを陰性コントロールのために使用した（Ｒｏｃｈｅ）。

固体マトリックスにおけるＳＭＡＲＴ反応
各マトリックスのディスク（６ｍｍの直径）を、標準的な紙穴パンチを使用して調製した。マトリックスがＳＭＡＲＴ反応体積全量を吸収したことを確保するために、各マトリックスタイプの３ｘディスク層サンドイッチ物が１回のＳＭＡＲＴ反応ごとに使用された。このサンドイッチ物は、０．２ｍＬの反応チューブに、チューブが細くなり始める位置で、水平に置かれた。試験された種々のマトリックスは、Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／ＡＶＡ；Ｓ＆Ｓ ２６６８；Ａｈｌｓｔｒｏｍ ２２２；Ｓ＆Ｓ ８−Ｓ；Ｗｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２７Ｑ；Ｗｈａｔｍａｎ Ｆ０７５−１７；Ｓ＆Ｓ ＧＦ３３；Ｗｈａｔｍａｎ Ｆ０７５−１４；およびＷｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２４Ｑであった。

混合物「Ａ」＆混合物「Ｃ」を（反応あたり）含む開始混合物を作製した（５μｌの各混合物）。混合物Ａの１００μｌのマスター混合物は、１．０ｎＭのプローブ１；０．２ｎＭのプローブ２；２０ｎＭのプローブ３；２０ｎＭのプローブ４；４．０ｎＭのプローブ５；１８０ｎＭのプローブ７；１６ｍＭの各ｒＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）；０．２２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）；５％のスクロース；１％のフィコール；１％のＰＶＰ；５μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ＆１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）から構成され、分子グレードの水で所定の体積にされた。混合物Ｃの１００μｌのマスター混合物は、１６０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）；２４ｍＭのＭｇＣｌ₂；８ｍＭのスペルミジン；４０ｍＭのＤＴＴ；６００ｍＭのＮａＣｌから構成され、分子グレードの水で所定の体積にされた。１回の反応あたりの一緒にされたＡ＆Ｃの開始混合物（合計、１０μｌ）を、５ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＮＡ（陽性）または５ｎｇの酵母ＲＮＡ（陰性）のいずれかを含有する５μｌのＴＥと混合した。得られた１５μｌの混合物を０．２ｍＬの反応チューブ内のマトリックスサンドイッチ物に加えた。コントロール反応のために、１５μｌの混合物を０．２ｍＬの反応チューブに直接加えた。反応チューブをサーマルサイクラーに入れ、９５℃に５分間加熱し、その後、０．１℃ｓｅｃ^-1で４１℃に冷却した。反応液を４１℃で６０分間インキュベーションした。この６０分の段階のとき、酵素（混合物Ｄ）および酵素希釈液（混合物Ｅ）のマスター混合物を調製した。１回の反応につき、これは、混合物Ｄについては、２μｌ（＝４００ユニット）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）；１μｌ（＝８ユニット）のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）からなり、混合物Ｅについては、６６．６７ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）；１０ｍＭのＭｇＣｌ₂；３．３３ｍＭのスペルミジン；１６．６７ｍＭのＤＴＴ；５．５６％のスクロース；１．１１％のフィコール；１．１１％のＰＶＰからなり、分子グレードの水で所定の体積（２７μｌ）にされた。３０μｌの酵素／酵素希釈液混合物（Ｄ／Ｅ）を反応チューブ内のマトリックスサンドイッチ物に加え（または、コントロールの場合には反応チューブに直接加え）、これらを４１℃で９０分間インキュベーションした。

合成されたＲＮＡの捕捉および検出
ＲＮＡシグナルを検出するために、２つのサンプルがそれぞれの反応のために選ばれた。第１のサンプルは、反応チューブの底から回収された液体からなった。第２のサンプルは、最後の検出反応に加えられたマトリックスサンドイッチ物そのものからなった。生じたＲＮＡシグナルの捕捉および検出は、下記のようにＥＬＯＳＡによって達成された。

プローブ６（３〜６ｐｍｏｌ）を５５μｌの溶液Ｈ（ハイブリダイゼーションバッファ）に加えた。溶液Ｈは、２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）からなり、ＨＣｌでｐＨ８．０に調節され、分子グレードの水で所定の体積にされた。反応から得られた液体サンプルをストレプトアビジン被覆のマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウェルに加え、その後、５５μｌの溶液Ｈ＋プローブ６を加えた。マトリックスサンプルを、５５μｌの溶液Ｈ＋プローブ６を既に含有するマイクロタイタープレートのウエルに加えた。ウエルを接着性の使い捨てプラスチックプレートシーラーでシールして、振とう（２００ｒｐｍ）しながら室温で３０分間インキュベーションした。プレートシーラーを除き、廃棄した。ウエルの内容物もまた廃棄した。ウエルを２００μｌの溶液Ｗ（洗浄液）で２回洗浄した。溶液Ｗは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１３８ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ＭのＫＣｌ、２１．３４ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１％のツイーン２０からなり、ＨＣｌでｐＨ８．０に調節され、滅菌蒸留水で所定の体積にされた。最終的な発色反応のために、５ｍｇ／ｍＬのｐ−ニトロフェニルホスファート（ｐＮｐｐ）を含有する１００μｌの溶液Ｓ（基質バッファ）を各ウエルに加えた。溶液Ｓは、１Ｍのジエタノールアミン、２１．３２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１５．３８ｍＭのアジ化ナトリウムからなり、ＨＣｌでｐＨ９．８に調節され、滅菌蒸留水で所定の体積にされ、１錠のｐＮｐｐ（
Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｎ２７６５）が４ｍＬの溶液Ｓに溶解された。ウエルを新しいプレートシーラーでシールして、プレートを３７℃で１５分間インキュベーションした。発色反応を、１００μｌの溶液Ｔ（停止液）を加えることによって停止させた。溶液Ｔは、１９．５ｍｌの１Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄に加えられた３０．５ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄からなった（リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．０）。発色反応の光学濃度をＯＤ₄₀₅ｎｍで読み取った。

オリゴヌクレオチドのリスト
プローブ１（伸張）

プローブ２（テンプレート）

プローブ３（促進因子１）

プローブ４（促進因子２）

プローブ５（線状）

プローブ６

プローブ７

結果が図４および図５に示される。

結論
陽性のＳＭＡＲＴシグナル（これはＥ．ｃｏｌｉの２３Ｓ ｒＲＮＡの検出を示す）が、Ｗｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２７ＱマトリックスおよびＷｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ
２４Ｑマトリックスでの固相反応から得られた（図４）。低い陽性シグナルが、Ｓ＆Ｓ
ＧＦ３３マトリックスおよびＷｈａｔｍａｎ Ｆ０７５−１４マトリックスを使用する２つの二連の固相反応の１つで得られた。反応チューブの底から回収された液体は、Ｗｈａｔｍａｎ ２７Ｑマトリックスを含有するチューブから陽性シグナルを示した（図５）。Ｗｈａｔｍａｎ ２４Ｑマトリックスを含有する反応チューブの底から回収された液体の１つの二連の反応は、低い陽性シグナルを与えた。

本実施例では、本質的には国際公開公報ＷＯ９９／３７８０６に記載される等温核酸増幅方法（ＳＭＡＲＴ）を使用して、標的核酸が、細菌細胞の溶解、および、Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ紙による核酸の推定的な固定化の後に検出されることが明らかにされる。本実施例ではまた、Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ紙（ＦＴＡ（登録商標）Ｃｌａｓｓｉｃ Ｃａｒｄ）へのＳＭＡＲＴ試薬の添加は、前記の溶解および固定化の後、標的特異的なＳＭＡＲＴ反応をもたらすことも明らかにされる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、実施例１に記載されるように合成および精製された。さらに、西洋ワサビペルオキシダーゼで機能化されたオリゴヌクレオチドが、製造者所有の方法（Ｏｓｗｅｌ）を使用して調製された。

ＲＮＡの調製
陽性反応のための細胞を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２を栄養ブイヨン（Ｏｘｏｉｄ）において３７℃で１６時間インキュベーションすることによって調製した。陰性反応のための細胞を、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ ｓｐｐ．を栄養ブイヨン（Ｏｘｏｉｄ）において３７℃で１６時間インキュベーションすることによって調製した。

細胞の溶解
１．ピペットを使用して、５μｌの培養液サンプルをＦＴＡ紙に加え、１時間風乾させた。

２．サンプルを含有するＦＴＡ紙の２ｍｍディスクを、Ｈａｒｒｉｓ Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｎｃｈツールを使用して作製した。パンチ物を反応チューブ（０．２ｍｌ）に移した。

３．２００μｌのＦＴＡ精製試薬（Ｗｈａｔｍａｎ）を加え、ピペッティングにより混合した。

４．チューブにキャップをかぶせ、チューブを室温で５分間インキュベーションした。

５．精製試薬を、ピペットを用いて除いた。

６．工程３〜工程５をさらに２回繰り返して、合計で３回の洗浄を行った。

７．最後の洗浄および精製試薬の除去の後、２００μｌのＴＥをチューブに加え、ピペッティングにより混合した。

８．チューブにキャップをかぶせ、チューブを室温で５分間インキュベーションした。

９．ＴＥを、ピペットを用いて除いた。

１０．工程７〜工程９を繰り返した。

１１．パンチ物を、室温で６０分間〜９０分間、完全に風乾させた。

ＳＭＡＲＴ反応
混合物「Ａ」＆混合物「Ｃ」を（反応あたり）含む開始混合物を作製した（５μｌの各混合物）。マスター混合物Ａおよびマスター混合物Ｃの組成は実施例１について記載される通りであるが、下記に示されたプローブセットが使用された。５μｌの分子グレードの水をパンチ物に加えた。１回の反応あたりの一緒にされたＡ＆Ｃ開始混合物（合計で１０μｌ）を０．２ｍＬの反応チューブ内のパンチ物に加え、実施例１に記載されるような熱転移に供した。反応液を４１℃で６０分間インキュベーションし、その後、３０μｌの酵素／酵素希釈液混合物（Ｄ／Ｅ）（これは実施例１に記載される通りである）を、パンチ物を反応チューブに含有するチューブに加えた。これらを４１℃で９０分間インキュベーションした。

合成されたＲＮＡの捕捉および検出
生じたＲＮＡシグナルの捕捉および検出は、下記のようにＥＬＯＳＡによって達成された。

プローブ６（０．１ｐｍｏｌ）を５５μｌの溶液Ｈ（ハイブリダイゼーションバッファ）に加えた。溶液Ｈは、２０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１．０ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）からなり、ＨＣｌでｐＨ８．０に調節され、分子グレードの水で所定の体積にされた。反応から得られた液体サンプルをストレプトアビジン被覆のマイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のウエルに加え、その後、５５μｌの溶液Ｈ＋プローブ６を加えた。マトリックスのパンチ物サンプルを、５５μｌの溶液Ｈ＋プローブ６を既に含有するマイクロタイタープレートのウエルに加えた。ウエルを接着性の使い捨てプラスチックプレートシーラーでシールして、振とう（２００ｒｐｍ）しながら室温で３０分間インキュベーションした。インキュベーションのとき、液体の発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：Ｓｉｇｍａ）を４℃での貯蔵から取り出し、室温に平衡化させた。プレートシーラーを除き、廃棄した。ウエルの内容物もまた廃棄した。ウエルを２００μｌの溶液Ｗ（洗浄液）で２回洗浄した。溶液Ｗは、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、２．０ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％のツイーン２０からなり、ＨＣｌでｐＨ７．４に調節され、滅菌蒸留水で所定の体積にされた。最終的な発色反応のために、１００μｌのＴＭＢを各ウエルに加えた。発色反応は室温で５分間インキュベーションされた。発色反応を、１００μｌの１Ｎ ＨＣｌを加えることによ
って停止させた。発色反応の光学濃度をＯＤ₄₀₅ｎｍで読み取った。

実施例２のためのオリゴヌクレオチドのリスト
プローブ１（伸張）

プローブ２（テンプレート）

プローブ３（促進因子１）

プローブ４（促進因子２）

プローブ５（線状）

プローブ６

プローブ７

結果が図６に示される。

結論
Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ紙におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２細胞の溶解、その後の、風乾による固定化により、陽性の反応が、２３Ｓ ｒＲＮＡに対して特異的な３ＷＪプローブを含有するＳＭＡＲＴ反応によってもたらされた。アシネトバクターはシグナルをもたらさなかった。

本実施例では、ＳＭＡＲＴ反応（国際公開公報ＷＯ９９／３７８０６）からのシグナル（ＲＮＡ１）の合成ＤＮＡホモログが側方フローデバイス（ディップスティック）で検出され得ることが明らかにされる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、実施例１に記載されるように合成および精製された。さらに、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）で標識されたオリゴヌクレオチドが、製造者所有の方法（Ｏｓｗｅｌ）を使用して調製された。

側方フローデバイス（ディップスティック）を使用する合成標的の検出
長さが２０ｍｍで、幅が５ｍｍで、細孔サイズが５μｍ〜１２μｍであるニトロセルロースディップスティック（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に、スティックの基部から１０ｍｍのところで、一条（０．５ｍｍの幅）の抗ビオチン抗体を含浸させた。

ハイブリダイゼーション工程
０．２ｍＬの反応チューブにおいて、２μｌの５ｘ転写バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ、２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．９）、３０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのスペルミジンおよび５０ｍＭのＮａＣｌ）と、１μｌの１μＭ水溶液のビオチン化捕捉プローブ４と、ＤＮＰ標識された検出プローブ６とを混合した（「オリゴヌクレオチドのリスト」を参照のこと）。

１μｌの分子グレードの水を加えた後、合成された標的プローブ３の希釈系列（０ｎＭの陰性コントロールとともに、４０ｎＭから始まり、６．５ｎＭで終わる１組の２倍希釈物の５μｌ）を加えた。プローブを室温で１５分間ハイブリダイゼーションさせた。

発色工程
抗ＤＮＰで機能化された青色の着色されたラテックスビーズの懸濁物の５μｌ（１００μｇ／ｍｌ、０．５％の固形分−バッチ番号ＮＫ２２０５００）を５０μｌのラテックスビーズ希釈液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のツイーン、ｐＨ７．９）と混合した。ハイブリダイゼーション混合物を希釈後のラテックスビーズ懸濁物に加えて、マイクロタイタープレートのウエルに移した。試験ストリップをウエルの中に入れ、溶液の先端をストリップの上部に移動させた。

結果
薄い青色の線の２分以内の発色がストリップの基部から１０ｍｍのところに存在した。これにより、合成標的の明確な検出が確認された。標的を含まないコントロール反応につ
いては、青色の線が観測されなかった。

結論
ＤＮＰおよびビオチンで標識された捕捉用の１組の特異的なプローブ、および青色ラテックスビーズによる標識化を使用することによって、２５ｆｍｏｌの合成標的が検出された。

本実施例では、ＳＭＡＲＴ反応（国際公開公報ＷＯ９９／３７８０６）から生じたＲＮＡシグナル（ＲＮＡ１）が側方フローデバイス（ディップスティック）で検出され得ることが明らかにされる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、実施例１に記載されるように合成および精製された。さらに、Ｈｅｘ取り込みが、成長中の鎖を、１８−ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール、１−（（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル））ホスホルアミダイトと反応させることによって達成された。

側方フローデバイスを使用する転写されたＲＮＡ標的の検出
ＲＮＡ１アンプリコンをＳＭＡＲＴ反応から調製し、そして、反応からのシグナルを合成標的ＤＮＡの標準曲線と比較することによって、ＥＬＯＳＡ（実施例１および実施例２を参照のこと）を使用して定量化した。

ＳＭＡＲＴ反応
２つの開始混合物（ＡおよびＢ）を調製した。開始混合物Ａは、（反応あたり）０．４９ｎＭのプローブ１０、０．１ｎＭのプローブ１１、７７．７ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１１．６５ｍＭのＭｇＣｌ₂、３．８８ｍＭのスペルミジン、１９．４ｍＭのＤＴＴおよび２９０ｍＭのＮａＣｌを含み、分子グレードの水で１０．３μｌにされた（「オリゴヌクレオチドのリスト」を参照のこと）。

開始混合物Ａには、陽性反応のために、５μｌの分子グレードの水における０．１ｎＭのプローブ１２（合成標的）が加えられた。コントロールは５μｌの分子グレードの水であった。成分を混合し、その後、短い遠心分離工程を行って、すべての液体が反応チューブの底に存在することを確実にした。

開始混合物Ａ＋陽性の標的または陰性の標的を含有するチューブをサーマルサイクラーに置き、９５℃に５分間加熱し、その後、４１℃に０．１℃ｓｅｃ^-1で冷却した。反応液を４１℃で６０分間インキュベーションした。この間に、開始混合物Ｂを調製した。開始混合物Ｂは、反応あたり、２１．２８μＭの各ｄＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）、８．５１ｍＭの各ｒＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）、１．２μｌ（２４０ユニット）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）、および０．５μｌ（４ユニット）のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｈｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んだ（総体積＝４．７μｌ）。４．７μｌの開始混合物Ｂが、反応あたり、開始混合物Ａおよび陽性の標的または陰性の標的を含有する反応チューブに加えられた。

反応液をピペッティングによって混合し、その後、４１℃で３時間インキュベーションした。

使用されたディップスティックプロトコルおよび試薬は、（上記のように調製された）ＳＭＡＲＴ ＲＮＡ１アンプリコンが合成標的の代わりに標的として使用されたことを除
いて実施例３に記載される通りであった。

結果
薄い青色の線の２分以内の発色がスティックの基部から１０ｍｍのところに存在した。これにより、陽性の標的についてＳＭＡＲＴ ＲＮＡ１アンプリコンの明確な検出が確認された。陰性の標的の反応については線が観測されなかった。

結論
ＤＮＰおよびビオチンで標識された捕捉用の１組の特異的なプローブ、および青色ラテックスビーズによる標識化を使用することによって、５０ｆｍｏｌのＳＭＡＲＴ ＲＮＡ１アンプリコンが検出された。

本実施例では、側方フローデバイスにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２を検出するために設計されたＳＭＡＲＴ反応（国際公開公報ＷＯ９９／３７８０６）からのＲＮＡシグナルアンプリコン（ＲＮＡ２）が検出され得ることが明らかにされる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、前記の実施例に記載されるように合成および精製された。

側方フローデバイスを使用するＳＭＡＲＴ反応からの転写ＲＮＡの検出
５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＮＡが、ＲＮＡ２シグナルアンプリコンを生じさせるためのＳＭＡＲＴ反応によって検出された。

ＳＭＡＲＴ三成分結合（ＴＷＪ）反応
２つの開始混合物（ＡおよびＢ）を調製した。開始混合物Ａは、（反応あたり）０．４９ｎＭのプローブ１、０．１ｎＭのプローブ２、７７．７ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１１．６５ｍＭのＭｇＣｌ₂、３．８８ｍＭのスペルミジン、１９．４ｍＭのＤＴＴおよび２９０ｍＭのＮａＣｌを含み、分子グレードの水で１０．３μｌにされた。開始混合物Ａには、陽性反応のために、５μｌの分子グレードの水における５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ゲノムＤＮＡが加えられた。陰性のコントロールは、５μｌの分子グレードの水における５０ｎｇのマイクロコッカス属細菌ゲノムＤＮＡであった。成分を混合し、その後、短い遠心分離工程を行って、すべての液体が反応チューブの底に存在することを確実にした。

開始混合物Ａ＋陽性の標的または陰性の標的を含有するチューブをサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に置き、９５℃に５分間加熱し、その後、４１℃に０．１℃ｓｅｃ^-1で冷却した。反応液を４１℃で６０分間インキュベーションした。この間に、開始混合物Ｂを調製した。開始混合物Ｂは、反応あたり、２１．２８μＭの各ｄＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）、８．５１ｍＭの各ｒＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）、１．２μｌ（２４０ユニット）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）、および０．５μｌ（４ユニット）のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｈｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含んだ（総体積＝４．７μｌ）。４．７μｌの開始混合物Ｂが、反応あたり、開始混合物Ａおよび陽性の標的または陰性の標的を含有する反応チューブに加えられた。

反応液をピペッティングによって混合し、その後、４１℃で３時間インキュベーションした。

ＳＭＡＲＴリニア反応
ＳＭＡＲＴ ＴＷＪ反応インキュベーションのとき、混合物Ｃを調製した。これは、（反応あたり）、５．８８μＭの各ｄＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）、２．３５ｍＭの各ｒＮＴＰ（Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ）、０．７７μｌ（１５４ユニット）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）および０．５μｌ（４ユニット）のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｈｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０５．９ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）、１５．９ｍＭのＭｇＣｌ₂、５．３ｍＭのスペルミジンおよび２６．５ｍＭのＤＴＴを含み、分子グレードの水で１７μｌにされた。

ＴＷＪ反応が完了した後、ブロックの温度を３７℃に下げ、プローブ５の２．５ｎＭ溶液の８μｌを、混合しながらブロック内のチューブに直接加えた。

その後、混合物Ｃ（１７μｌ）を加え、ピペッティングによって混合し、続いて３７℃で２時間さらにインキュベーションした。

ハイブリダイゼーションアッセイ
新しい２００μｌ反応チューブにおいて、２０μｌのＳＭＡＲＴリニア反応液を、ビオチン化された捕捉プローブ８およびＤＮＰ標識された検出プローブ９の１μＭ水溶液の１μｌと混合した。プローブを室温で１５分間ハイブリダイゼーションさせた。プローブ３（ＳＭＡＲＴ ＴＷＪ反応で転写されたＲＮＡ１の合成アナログ）が使用されたコントロール実験もまた調製された。

発色工程
抗ＤＮＰで機能化された青色の着色されたラテックスビーズの懸濁物の５μｌ（１００μｇｍｌ^-1、０．５％の固形分−バッチ番号ＮＫ２２０５００）を５０μｌのラテックスビーズ希釈液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＴｗｅｅｎ、ｐＨ７．９）と混合した。

ハイブリダイゼーション混合物を希釈後のラテックスビーズ懸濁物に加えて、マイクロタイタープレートのウエルに移した。

試験ストリップをウエルの中に入れ、溶液の先端をストリップの上部に移動させた。

結果
薄い青色の線の２分以内の発色がスティックの基部から１０ｍｍのところに存在した。これにより、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２の明確な検出が確認された。マイクロコッカスの陰性コントロール反応については線が観測されなかった。

結論
ＤＮＰおよびビオチンで標識された捕捉用の１組の特異的なプローブ、および青色ラテックスビーズによる標識化を使用することによって、ＳＭＡＲＴ ＲＮＡ２アンプリコンが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２の明確な検出を示すストリップ上の薄い青色の線として検出された。

ストリップ上で観測された陽性の線は、プローブ７から得られた２００ｆｍｏｌのシグナルと同じくらいの強度であった。

実施例３、実施例４および実施例５のためのオリゴヌクレオチドのリスト
下記のオリゴヌクレオチドが、実施例３、実施例４および実施例５の１つまたは複数を行う際に用いられた。

プローブ１（伸張）

プローブ２（テンプレート）

プローブ３（ＳＭＡＲＴ ＲＮＡ１アンプリコンのＤＮＡホモログ）

プローブ４（ＳＭＡＲＴ ＲＮＡ１アンプリコンに対する５’ビオチン化捕捉プローブ）

プローブ５（線状）

プローブ６（ＳＭＡＲＴ ＲＮＡ１アンプリコンに対する３’ＤＮＰ標識検出プローブ）

プローブ７（ＳＭＡＲＴ ＲＮＡ２アンプリコンのＤＮＡホモログ）

プローブ８（ＳＭＡＲＴアンプリコンＲＮＡ２に対する５’ビオチン捕捉プローブ）

プローブ９（ＳＭＡＲＴアンプリコンＲＮＡ２に対する３’ＤＮＰ標識検出プローブ）

プローブ１０（ＲＮＡ１生成用の伸張プローブ）

プローブ１１（ＲＮＡ１生成用のテンプレートプローブ）

プローブ１２（ＲＮＡ１生成用の合成標的）

本実施例では、側方フローデバイスにより、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の１６Ｓ ｒＲＮＡを標的として使用する核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）反応から得られたアンプリコンが検出されることが明らかにされる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、前記の実施例に記載されるように合成および精製される。

精製されたＲＮＡ標的物質の調製
Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓから得られた１８０ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡフラグメントを、本質的にはＳｏｎｇら（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、３（２０００））に記載されるように
、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローン化し、転写して、得られた１６Ｓ ｒＲＮＡフラグメント転写物を精製する。

側方フローデバイスの調製
抗ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）の縞形成バッファで１ｍｇ／ｍｌに希釈する。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ニトロセルロースマトリックスカードに、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ１６００（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して、１．５μｌ／ｃｍの縞幅で、遠位端から１ｃｍのところで縞を付ける。３７℃で２時間、インキュベーター内で乾燥する。２ｃｍのＡｈｌｓｔｒｏｍ２２２マトリックスの上部芯をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５カードの遠位端に加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースとの５ｍｍの重なりを生じさせる。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して、カードを５ｍｍ幅のディップスティックに切断する。反応パッドを、Ａｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の１０ｍｍストリップを切断することによって調製し、そしてさらに、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して、３ｍｍ幅の反応パッドに切断する。反応パッドを、縞を付けた５ｍｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ディップスティックの近位端においてＭｙｌａｒ（登録商標）支持用裏材に接着して、反応パッドと、ＨＦ１３５ニトロセルロースの近位端との間に１０ｍｍのすき間を与える（すなわち、反応パッドとＨＦ１３５ニトロセルロースとは１０ｍｍのすき間によって隔てられる）。

ＮＡＳＢＡ反応
下記の構成成分を２つの０．２ｍｌ反応チューブに入れる：一方のチューブには５μｌの精製されたＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ転写物、第２のチューブ（陰性コントロール）には５μｌのｄＨ₂Ｏ、２μｌの酵素混合物、および１５μｌの増幅混合物（これは、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４６）、２ｍＭの各ＮＴＰ、１ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、１２ｍＭのＭｇＣｌ₂、９０ｍＭのＫＣｌ、０．２μＭの各プライマー（Ｐ１＆Ｐ２）、および１５％のＤＭＳＯからなる）。４０ユニットのＴ７ポリメラーゼ（ＵＳＢ）、８ユニットのＡＭＶ−ＲＴ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．）、０．２ユニットのＲＮａｓｅ Ｈ（ＵＳＢ）、１２．５ユニットのＲＮＡｇｕａｒｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）および１００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕａｌｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有する酵素混合物を反応液に加える。反応液をｄＨ₂Ｏで２５μｌの最終体積にする。これらの反応成分を反応チューブからディップスティック上の反応パッドに移し、（専用のアッセイデバイス容器がない場合には）パラフィルムで覆い、蒸発を防止するためにシールして、４１℃のインキュベーターに９０分間置く。

発色
２０ｍｍ×５ｍｍのＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４マトリックスストリップを調製する。抗ビオチンの４０ｎｍ金コンジュゲート（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｒｄｉｆｆ、英国）をＴｒｉｓ緩衝溶液（１リットルあたり、２．４２ｇのトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、９．０ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、１０．０ｇのＢＳＡ、１１．０ｇのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．２）で１ＯＤに希釈する。１μｌの３’ＨＲＰ捕捉プローブおよび１μのビオチン化検出プローブを、ＯＤが１の抗ビオチンコンジュゲートの９８μｌに加える。

インキュベーション後、ディップスティックをインキュベーターから取り出し、パラフィルムを除き、２０ｍｍ×５ｍｍのＡｈｌｓｔｒｏｍストリップを、反応パッドとニトロセルロース（ＨＦ１３５）との間の１０ｍｍのすき間を架橋するために置く。１００μｌのコンジュゲート／検出／捕捉プローブ混合物を反応パッドにゆっくり分注し、発色のた
めに３０分間ディップスティックに沿って移動させる。

結果
赤色の線により、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの１６Ｓ ｒＲＮＡ転写物の存在が示される。陰性のコントロールデバイスは赤色の線を生じさせない。

オリゴヌクレオチドのリスト
Ｐ１

（下線部の配列はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を示す）
Ｐ２

捕捉プローブ

検出プローブ

本実施例では、側方フローデバイスにより、ネズミチフス菌（Ｓａｌｏｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来の１６Ｓ ｒＲＮＡを標的として使用するＲＮＡシグナル媒介増幅技術（ＳＭＡＲＴ）反応から得られたＲＮＡアンプリコンが検出されることが明らかにされる。溶解がデバイスの外側で行われ、アニーリングおよび増幅がデバイスの近位端における反応パッドで行われる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、前記の実施例に記載されるように合成および精製された。

側方フローデバイスの調製
抗ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）をリン酸緩衝溶液（１リットルあたり、１．４８ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．４３ｇのＫＨ₂ＨＰＯ₄、１７．２ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．２）の縞形成バッファで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ニトロセルロースマトリックスカードに、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ１６００を使用して、１．５μｌ／ｃｍの縞幅で、遠位端から１ｃｍのところで縞
を付けた。その後、カードを、３７℃で２時間、インキュベーター内で乾燥した。その後、２ｃｍの上部芯（Ａｈｌｓｔｒｏｍ２２２）を、縞を付けたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５カードの遠位端に加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースとの５ｍｍの重なりを生じさせた。過剰な支持用裏材カードをメスの使用によって除いた。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用して、カードを５ｍｍ幅のディップスティックに切断した。

反応パッドを、Ｗｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２４Ｑの１０ｍｍストリップを切断し、その後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ０００ＭＣ１００の積層化された支持用裏材カードに接着することによって調製した。過剰な支持用裏材カードをメスの使用によって除いた。５ｍｍ幅のサンプルパッドを、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用して切断した。最終的なパッドサイズは１０×５ｍｍであった。反応パッドをＳｃｏｔｃｈ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｉｄｅｄ Ａｒｔｉｓｔ ＴａｐｅによってＲｉｖｅｒｓｉｄｅホイル支持用裏材に接着した。デバイスを、縞を付けた５ｍｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ディップスティックを反応パッドから１０ｍｍの近位に付けて、反応パッドと、ＨＦ１３５ニトロセルロースの近位端との間に１０ｍｍのすき間を与えることによって完成させた（すなわち、反応パッドとＨＦ１３５ニトロセルロースとは１０ｍｍのすき間によって隔てられる）。

架橋パッドを、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用してＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の２０ｍｍストリップをさらに５ｍｍ幅の反応パッドに切断することによって調製した。

標的の調製
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ１４０２８（陽性サンプル）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２（陰性サンプル）を１０ｍｌの緩衝ペプトン水（Ｍｅｒｃｋ）で一晩増殖させた。その後、細菌を、９５℃で１５分間、熱殺菌した。

ＳＭＡＲＴ反応
ＳＭＡＲＴ反応成分を０．２ｍｌの反応チューブに２０μｌにおける最終濃度が以下になるように加えた：４ｍＭのｒＮＴＰ混合物、５５μＭのｄＮＴＰ混合物、０．９ｐｍｏｌのプローブ８、凍結乾燥混合物（２．５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．５％（ｗ／ｖ）のフィコール、０．５％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｎｇのＳｉｇｍａマイクロコッカスＤＮＡ、１×Ａｍｂｉｏｎ転写バッファ、１０ｆｍｏｌのプローブ１、２０ｆｍｏｌのプローブ２、２ｐｍｏｌのプローブ３、２ｐｍｏｌのプローブ４、１５０ｆｍｏｌのプローブ５、６００ｆｍｏｌのプローブ６、６ｐｍｏｌのプローブ７（「オリゴヌクレオチドのリスト」を参照のこと）。

１０μｌの標的を加え、その後、３０μｌの反応液を反応パッドに移した。デバイスを標準的な実験室インキュベーターにおいて４１℃で３０分間インキュベーションした。

ＳＭＡＲＴ反応の酵素構成成分を反応パッドに６０μｌにおける最終濃度が以下になるように加えた：８００ＵのＡｍｂｉｏｎ社のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、１６ＵのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５×Ａｍｂｉｏｎ転写バッファ、凍結乾燥混合物（１７．９％（ｗ／ｖ）のスクロース、３．６％（ｗ／ｖ）のフィコール、３．６％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）、２ｐｍｏｌのプローブ９。反応パッドを２５×１５ｍｍのＰｅｃｈｉｎｅｙパラフィルムでシールした。デバイスを標準的な実験室インキュベーターにおいて４１℃で２時間インキュベーションした。
２０μｌのＳＭＡＲＴ反応構成成分
↓
＋１０μｌの標的
↓
シールしないで、４１℃で３０分間アニーリングする
↓
＋６０μｌのＳＭＡＲＴ反応酵素構成成分
↓
シールして、４１℃で２時間、増幅する
側方フローアッセイ
パラフィルムシールをデバイスから除き、Ａｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の架橋を加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースの近位端およびＲａｐｉｄ ２４Ｑ反応パッドの近位端と５ｍｍの重なりを生じさせた。１００μｌのＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社の抗ビオチン免疫金コンジュゲート（ＢＡ．Ｍａｂ４０；これはＴｒｉｓ緩衝溶液（１リットルあたり、２．４２ｇのトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、９．０ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、１０．０ｇのＢＳＡ、１１．０ｇのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．２）において１のＯＤ_520nmに希釈された）を反応パッドに加えた。陽性の結果が、側方流動を３０分間進行させた後、抗ＨＲＰストリップの位置における赤色線の存在によって示された。側方流動を、上部芯および架橋を除くことによって停止させた。

図７Ａには、このアッセイを行うために使用された構成成分が示され、図７Ｂには、アッセイが完了した後の組み立てられた構成成分の写真が示される。検出区域における着色されたバンドを陽性サンプルにおいて肉眼で明瞭に認めることができ、陰性コントロールでは観測されない。

実施例７のためのオリゴヌクレオチドのリスト
プローブ１（テンプレート）

プローブ２（伸張）

プローブ３（促進因子）

プローブ４（促進因子）

プローブ５（テンプレート）

プローブ６（伸張）

プローブ７（促進因子）

プローブ８（ビオチン化プローブ）

プローブ９（ＨＲＰプローブ）

本実施例では、側方フローデバイスにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来の１６Ｓ ｒＲＮＡを標的として使用するＲＮＡシグナル媒介増幅技術（ＳＭＡＲＴ）反応から得られたＲＮＡアンプリコンが検出されることが明らかにされる。溶解がデバイスの近位端における溶解パッドで行われ、アニーリングおよび増幅が別個の反応パッドで行われる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、前記の実施例に記載されるように合成および精製された。

側方フローデバイスの調製
抗ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）をリン酸緩衝溶液（１リットルあたり、１．４８ｇのＮａ
₂ＨＰＯ₄、０．４３ｇのＫＨ₂ＨＰＯ₄、１７．２ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．２）の縞形成バッファで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ニトロセルロースマトリックスカードに、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ１６００を使用して、１．５μｌ／ｃｍの縞幅で、遠位端から１ｃｍのところで縞を付けた。その後、カードを、３７℃で２時間、インキュベーター内で乾燥した。その後、２ｃｍの上部芯（Ａｈｌｓｔｒｏｍ２２２）を、縞を付けたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５カードの遠位端に加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースとの５ｍｍの重なりを生じさせた。過剰な支持用裏材カードをメスの使用によって除いた。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用して、カードを５ｍｍ幅のディップスティックに切断した。

デバイスを、Ｗｈａｔｍａｎ ＦＴＡ Ｃｌａｓｓｉｃ Ｃａｒｄ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、英国）の１０ｍｍストリップを溶解パッドのために切断し、その後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ０００ＭＣ１００の支持用裏材カードのストリップに接着することによって調製した。Ｗｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２４Ｑ（反応パッド）の１０ｍｍストリップをカードに接着して、溶解パッドと反応パッドとの間に５ｍｍのすき間を生じさせた。過剰な支持用裏材カードをメスの使用によって除いた。一緒にされたストリップを、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用して２５×５ｍｍの切片に切断した。最終的な溶解パッドサイズは１０×５ｍｍであった。最終的な反応パッドサイズは１０×５ｍｍであった。切片をＳｃｏｔｃｈ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｉｄｅｄ Ａｒｔｉｓｔ
ＴａｐｅによってＲｉｖｅｒｓｉｄｅホイル支持用裏材に接着した。デバイスを、縞を付けた５ｍｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ディップスティックを反応パッドから１０ｍｍの近位に付けて、反応パッドと、ＨＦ１３５ニトロセルロースの近位端との間に１０ｍｍのすき間を与えることによって完成させた（すなわち、反応パッドとＨＦ１３５ニトロセルロースとは１０ｍｍのすき間によって隔てられる）。

溶解−反応パッド架橋を、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用してＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の１５ｍｍストリップをさらに５ｍｍ幅の反応パッドに切断することによって調製した。

反応−ニトロセルロースパッド架橋を、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用してＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の２０ｍｍストリップをさらに５ｍｍ幅の反応パッドに切断することによって調製した。

標的の調製
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ１４０２８（陽性サンプル）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２（陰性サンプル）を１０ｍｌの緩衝ペプトン水（Ｍｅｒｃｋ）で一晩増殖させた。その後、細菌を、９５℃で１５分間、熱殺菌した。

ＳＭＡＲＴ反応
１０μｌの標的を溶解パッドに加え、室温で５分間インキュベーションした。溶解−反応パッド架橋を加えて、それぞれの端部において５ｍｍのすき間を生じさせた。５０μｌのＴＥを溶解パッドに加え、標的を、室温で１０分間、反応パッドに吸わせた。

ＳＭＡＲＴ反応成分を、反応パッドに、２０μｌにおける最終濃度が以下になるように加えた：４ｍＭのｒＮＴＰ混合物、５５μＭのｄＮＴＰ混合物、０．９ｐｍｏｌのプローブ８、凍結乾燥混合物（２．５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．５％（ｗ／ｖ）のフィコール、０．５％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｎｇのＳｉｇｍａマイクロコッカスＤＮＡ、１×Ａｍｂｉｏｎ転写バッファ、１０ｆｍｏｌのプローブ１、２０ｆｍｏｌのプローブ２、２ｐｍｏｌのプローブ３、２ｐｍｏｌのプロ
ーブ４、１５０ｆｍｏｌのプローブ５、６００ｆｍｏｌのプローブ６、６ｐｍｏｌのプローブ７。デバイスを標準的な実験室インキュベーターにおいて４１℃で６０分間インキュベーションした。

溶解−反応パッド架橋を除き、ＳＭＡＲＴ反応の酵素構成成分を反応パッドに６０μｌにおける最終濃度が以下になるように加えた：８００ＵのＡｍｂｉｏｎ社のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１６ＵのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５×Ａｍｂｉｏｎ転写バッファ、凍結乾燥混合物（１７．９％（ｗ／ｖ）のスクロース、３．６％（ｗ／ｖ）のフィコール、３．６％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）、２ｐｍｏｌのプローブ９。溶解／反応パッド切片を３０×２０ｍｍのＰｅｃｈｉｎｅｙパラフィルムでシールした。デバイスを標準的な実験室インキュベーターにおいて４１℃で２時間インキュベーションした。
１０μｌの標的を、室温で５分間、溶解パッドに加える
↓
＋溶解−反応パッド架橋 ＋５０μｌのＴＥを室温で５分間
↓
２０μｌのＳＭＡＲＴ反応構成成分を反応パッドに加える
↓
シールしないで、４１℃で６０分間アニーリングする
↓
溶解−反応架橋を除く ＋６０μｌのＳＭＡＲＴ反応酵素構成成分
↓
シールして、４１℃で２時間、増幅する
側方フローアッセイ
Ａｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の架橋をデバイスに加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースの近位端およびＲａｐｉｄ ２４Ｑ反応パッドの近位端と５ｍｍの重なりを生じさせた。

１００μｌのＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社の抗ビオチン免疫金コンジュゲート（ＢＡ．Ｍａｂ４０；これはＴｒｉｓ緩衝溶液（１リットルあたり、２．４２ｇのトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、９．０ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、１０．０ｇのＢＳＡ、１１．０ｇのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．２）で１のＯＤ_520nmに希釈された）を反応パッドに加えた。陽性の結果が、側方流動を３０分間進行させた後、抗ＨＲＰストリップの位置における赤色線の存在によって示された。側方流動を、上部芯および架橋を除くことによって停止させた。

実施例８のためのオリゴヌクレオチドのリスト
プローブ１（テンプレート）

プローブ２（伸張）

プローブ３（促進因子）

プローブ４（促進因子）

プローブ５（テンプレート）

プローブ６（伸張）

プローブ７（促進因子）

プローブ８（ビオチン化プローブ）

プローブ９（ＨＲＰプローブ）

図８Ａには、このアッセイを行うために使用された構成成分が示され、図８Ｂには、アッセイが完了したときの組み立てられた構成成分の写真が示される。検出区域における着色されたバンドを陽性サンプルにおいて肉眼で明瞭に認めることができ、陰性コントロールでは観測されない。

本実施例では、側方フローデバイスにより、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来の１６Ｓ ｒＲＮＡを標的として使用するＲＮＡシグナル媒介増幅技術（ＳＭＡＲＴ）反応から得られたＲＮＡアンプリコンが検出されることが明らかにされる。溶解、アニーリングおよび増幅が、デバイスの近位端における組み合わせられた溶解／増幅パッドで行われる。

オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドプローブはすべてが、前記の実施例に記載されるように合成および精製された。

側方フローデバイスの調製
抗ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）をリン酸緩衝溶液（１リットルあたり、１．４８ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、０．４３ｇのＫＨ₂ＨＰＯ₄、１７．２ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、ｐＨ７．２）の縞形成バッファで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ニトロセルロースマトリックスカードに、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ１６００を使用して、１．５μｌ／ｃｍの縞幅で、遠位端から１ｃｍのところで縞を付けた。その後、カードを、３７℃で２時間、インキュベーター内で乾燥した。その後、２ｃｍの上部芯（Ａｈｌｓｔｒｏｍ２２２）を、縞を付けたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５カードの遠位端に加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースとの５ｍｍの重なりを生じさせた。過剰な支持用裏材カードをメスの使用によって除いた。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用して、カードを５ｍｍ幅のディップスティックに切断した。

デバイスを、０．２％（ｗ／ｖ）のドデシルトリメチルアンモニウムブロミド抽出剤（ＤＴＡＢ；Ｓｉｇｍａ；Ｄ８６３８）で前処理されたＷｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２４Ｑの１０ｍｍストリップ（溶解パッド）を切断することによって調製した。乾燥（４１℃で１時間）後、前処理されたＷｈａｔｍａｎ Ｒａｐｉｄ ２４ＱをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ
ＨＦ０００ＭＣ１００の支持用裏材カードのストリップに接着した。過剰な支持用裏材カードをメスの使用によって除いた。組み合わせられたストリップを、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用して１０×５ｍｍの切片に切断した（最終的な溶解／反応パッドサイズは１０×５ｍｍであった）。切片をＳｃｏｔｃｈ Ｄｏｕｉｂｌｅ−Ｓｉｄｅｄ Ａｒｔｉｓｔ ＴａｐｅによってＲｉｖｅｒｓｉｄｅホイル支持用裏材に接着した。デバイスを、縞を付けた５ｍｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＦ１３５ディップスティックを反応パッドから１０ｍｍの近位に付けて、反応パッドと、ＨＦ１３５ニトロセルロースの近位端との間に１０ｍｍのすき間を生じさせることによって完成させた（すなわち、反応パッドとＨＦ１３５ニトロセルロースとは１０ｍｍのすき間によって隔てられる）。

溶解−反応パッド架橋を、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用してＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の１５ｍｍストリップをさらに５ｍｍ幅の反応パッドに切断することによって調製した。反応−ニトロセルロースパッド架橋を、Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ Ｍａｔｒｉｘ２３６０を使用してＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の２０ｍｍストリップをさらに５ｍｍ幅の反応パッドに切断することによって調製した。

標的の調製
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＡＴＣＣ１４０２８（陽性サンプル）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ２５９２２（陰性サンプル）を１０ｍｌの緩衝ペプトン水（Ｍｅｒｃｋ）で一晩増殖させた。その後、細菌を、９５℃で１５分間、熱殺菌した。

ＳＭＡＲＴ反応
１０μｌの標的を、組み合わせられた溶解／増幅パッドに加えた。ＤＴＡＢ抽出剤を、ＳＭＡＲＴ反応成分を２０μｌにおける最終濃度が以下になるように加えることによって直ちに中和した：４ｍＭのｒＮＴＰ混合物、５５μＭのｄＮＴＰ混合物、０．９ｐｍｏｌのプローブ８、凍結乾燥混合物（２．５％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．５％（ｗ／ｖ）のフィコール、０．５％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｎｇのＳｉｇｍａマイクロコッカスＤＮＡ、１×Ａｍｂｉｏｎ転写バッファ、１０ｆｍｏｌのプローブ１、２０ｆｍｏｌのプローブ２、２ｐｍｏｌのプローブ３、２ｐｍｏｌのプローブ４、１５０ｆｍｏｌのプローブ５、６００ｆｍｏｌのプローブ６、６ｐｍｏｌのプローブ７、１．４４％（ｗ／ｖ）のα−シクロデキストリン（Ｓｉｇｍａ、Ｃ４６４２）。シクロデキストリンにより、ＤＴＡＢが中和される。ＤＴＡＢは、中和されない場合、反応酵素を阻害する。デバイスを標準的な実験室インキュベーターにおいて４１℃で３０分間インキュベーションした。

ＳＭＡＲＴ反応の酵素構成成分を反応パッドに６０μｌにおける最終濃度が以下になるように加えた：８００ＵのＡｍｂｉｏｎ社のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、１６ＵのＮｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社のＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、１．５×Ａｍｂｉｏｎ転写バッファ、凍結乾燥混合物（１７．９％（ｗ／ｖ）のスクロース、３．６％（ｗ／ｖ）のフィコール、３．６％（ｗ／ｖ）のポリビニルピロリドン）、２ｐｍｏｌのプローブ９。溶解／反応パッドの切片を３０×２０ｍｍのＰｅｃｈｉｎｅｙパラフィルムでシールした。デバイスを標準的な実験室インキュベーターにおいて４１℃で２時間インキュベーションした。
１０μｌの標的を、ＤＴＡＢ抽出剤を含有する溶解パッドに加える
↓
α−シクロデキストリン中和剤を含む２０μｌのＳＭＡＲＴ反応構成成分を反応パッドに加える
↓
シールしないで、４１℃で３０分間アニーリングする
↓
溶解−反応架橋を除く ＋６０μｌのＳＭＡＲＴ反応酵素構成成分
↓
シールして、４１℃で２時間、増幅する
側方フローアッセイ
Ａｈｌｓｔｒｏｍ８９６４の架橋をデバイスに加えて、ＨＦ１３５ニトロセルロースおよびＲａｐｉｄ ２４Ｑ反応パッドの近位端と５ｍｍの重なりを生じさせた。

１００μｌのＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社の抗ビオチン免疫金コンジュゲート（ＢＡ．Ｍａｂ４０；これはＴｒｉｓ緩衝溶液（１リットルあたり、２．４２ｇのトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、９．０ｇのＮａＣｌ、１．３ｇのアジ化ナトリウム、１０．０ｇのＢＳＡ、１１．０ｇのＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．２）で１のＯＤ_520nmに希釈された）を反応パッドに加えた。陽性の結果が、側方流動を３０分間進行させた後、抗ＨＲＰストリップの位置における赤色線の存在によって示された。側方流動を、上部芯および架橋を除くことによって停止させた。

図９Ａには、このアッセイを行うために使用された構成成分が示され、図９Ｂには、アッセイが完了したときの組み立てられた構成成分の写真が示される。検出区域における着色されたバンドを陽性サンプルにおいて肉眼で明瞭に認めることができ、陰性コントロールでは観測されない。

オリゴヌクレオチドのリスト
プローブ１（テンプレート）

プローブ２（伸張）

プローブ３（促進因子）

プローブ４（促進因子）

プローブ５（テンプレート）

プローブ６（伸張）

プローブ７（促進因子）

プローブ８（ビオチン化プローブ）

プローブ９（ＨＲＰプローブ）

図１を参照すると、本発明の第１の局面および第２の局面の両方によるアッセイデバイスは、参照符号１により一般的に示される側方フローアッセイストリップを含む。ストリップには、透明な合成プラスチック材の支持用裏材（例えば、Ｍｙｌａｒ(登録商標）シートなど）が配置される。

ストリップは、保護外被２（破線により示される）を形成する不透明なプラスチック材の外被の中に実質的に包まれる。外被は、デバイスの近位側の上流端に開口部４を有し、遠位側の下流端に向かって窓６を有する。開口部４により、側方フローストリップは、サンプル収容区域８が存在するその近位端において、外被を超えて突き出ることができる。窓６により、使用者は、試験ライン１０における試験結果シグナルの形成およびコントロールライン１２におけるコントロール結果シグナルの形成を観察することができる。サンプル収容区域８はＷｈａｔｍａｎ ＦＴＡ紙を含み、そのような物質は、抽出工程を行うために有用であり、その結果、サンプル収容区域８は、実際には、組み合わせられたサンプル収容・抽出区域である。

サンプル収容区域８は、参照符号１４により一般的に示される多孔性マトリックスとの液体流連絡状態または液体流接触状態にあり、一方で、多孔性マトリックスは、自身が、高吸収性材料の吸上部材１６（例えば、約５ｍｍ×２０ｍｍの大きさのパッドでのＡｈｌｓｔｒｏｍ２２２）との液体流接触状態にある。

組み合わせられたサンプル収容・抽出区域８に隣接し、かつ、それとわずかに重なって、等温ＳＭＡＲＴ核酸増幅を行うための試薬を含むＷｈｔａｍａｎ ＧＦ／Ｃ多孔性材のパッドを含む増幅区域１８が存在する。この場合、試薬は、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）を含む：
（ｉ）２μｍのラテックス微粒子（これはアミノ修飾され、かつフェニルジイソチオシアナートにより架橋されている）に結合したテンプレートプローブ；
（ｉｉ）伸張プローブ；（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ；（ｉｖ）ＲＮＡポリメラーゼ；（ｖ）ｄＮＴＰ；（ｖｉ）ｒＮＴＰ；（ｖｉｉ）線状増幅プローブ；および（ｖｉｉｉ）４０ｎｍの金コロイドに結合したアンプリコン特異的な標識用プローブ（これは、４０ｎｍの金コロイド（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ）をチオールキャップ化プローブと１時間インキュベーションし、その後、過剰な結合部位を１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡでブロッキング処理することによって調製される）。

（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）を適切な濃度で含有する混合物が、１６０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．８）、２４ｍＭのＭｇＣｌ₂、８ｍＭのスペルミジン、４０ｍＭのＤＴＴ、６００ｍＭのＮａＣｌ、０．００２％のマイクロコッカスＤＮＡ、１％のフィコールおよび１％のＰＶＰを含有し、５％（ｗ／ｖ）のスクロースもまた含有する転写バッファにおいて調製され、５０μｌがパッドに分注される。その後、パッドは凍結乾燥によって乾燥させられ
る。

増幅区域１８は検出区域２０に隣接し、かつ、検出区域２０とわずかに重なっている。この重なりにより、良好な液体流連絡が多孔性マトリックス１４のそれぞれの区域の間で確保される。検出区域２０はニトロセルロース（ＨＦ１３５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のストリップ（５ｍｍ×２５ｍｍ）を含む。ニトロセルロース上には、試験ライン１０において、アンプリコン特異的な捕捉分子が、アンプリコンの配列に対して相補的なプローブオリゴヌクレオチドの形態で固定化されている。試験ライン１０は、アンプリコン特異的な捕捉プローブを、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する２５ｍＭリン酸バッファ（ｐＨ７．０）に懸濁し、ニトロセルロースを横断して懸濁物の縞を置き、その後、２０％未満の相対湿度において２１℃で一晩乾燥することによって形成される。

コントロールライン１２は、標識用プローブに対して特異的な捕捉分子を使用して、実質的に類似する様式で形成させることができる。

組み合わせられたサンプル収容・抽出区域８、増幅区域１８、および検出区域２０は、支持を提供し、かつそれらの正しい配向を確保するために、裏側が接着性であるＭｙｌａｒシート（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得られる）に積層される。構成要素間の液体の流れが、隣接する構成要素の間に２ｍｍの重なりを提供することによって確保される。これらの構成要素（８、１８および２０）は、それらのＭｙｌａｒ支持用裏材とともに、保護外被２を形成する成型された合成プラスチック材の中に置かれる。重なり点における外被２内の内部突出部により、良好な液体流連絡が隣接する構成要素の間で確保される。

例示された実施形態の非常に多数の変形が容易に考えられ得る。例えば、アッセイデバイスの多孔性マトリックス上に乾燥形態で設置され、かつ、キャリア液体と接触したときに可動化し、従ってアッセイデバイスに沿って移動し、その結果、テンプレートプローブ上の成分に対して特異的な結合活性を有するコントロールライン上に設置された捕捉成分によって捕捉されるか、または、捕捉成分が担持されているラテックス粒子によって捕捉され、それにより、視認可能なコントロール結果シグナルをコントロールラインにおいて形成し、これにより、十分な液体が、多孔性マトリックスに放出可能に結合している試薬を移動させるために、サンプル収容区域と接触していたということを試験使用者に視覚的に示し得る標識されたラテックス粒子に結合した核酸プローブ（特に、ＳＭＡＲＴアッセイテンプレートプローブ）などの成分の使用が考えられ得る。

Ｅ．ｃｏｌｉの２３Ｓ ｒＲＮＡに対するアッセイ
本実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉの２３Ｓ ｒＲＮＡを検出するための、本発明によるアッセイデバイスおよびアッセイ方法に関する。装置が長手軸方向の断面で図２に概略的に例示される。

図１に表された実施形態と類似する例示された装置の構成要素が、同じ参照符号によって示されている。

以前のように、組み合わせられたサンプル収容・抽出区域８（これはＦＴＡ紙を含む）、増幅区域１８、検出区域２０および吸上部材１６が、裏が接着性の１枚のＭｙｌａｒ（登録商標）２２に積層され、成型されたプラスチック被覆物（図示せず）の中に実質的に包まれる。

増幅区域１８および検出区域２０の接合部において、２ｍｍのすき間が、Ｍｙｌａｒ（
登録商標）の支持用裏材２０に接着されている各部分の間に置かれる。増幅区域１８の接着されていないフラップ部２４が、５ｍｍの長さで設けられる。フラップ部２４は検出区域２０と重なるが、増幅区域１８および検出区域２０の間での液体流連絡は、最初は、外被に設けられた開口部を通って少なくとも一部が突き出る不透過性プラスチック材の、間に入れられた除去可能なシート２６の存在によって妨げられている。開口部は、（図１における）結果の窓６と同じであり得るか、または離れた開口部であり得る。

アッセイを行うために、サンプルがサンプル収容・抽出区域８に加えられ、デバイスが、核酸の溶解および放出のために、４１℃の加熱されたブロックに置かれる。その後、キャリア液（例えば、ＴＥバッファ）が滴瓶またはマイクロピペットから加えられ、これにより、抽出された核酸が毛細管作用によって増幅区域１８に移動させられ、かつ、増幅区域１８において放出可能に結合している試薬が可動化させられる。典型的には、５０μｌ〜２ｍｌのキャリア液が加えられ、好ましくは、１００μｌ〜１ｍｌのキャリア液が加えられる。

放出された核酸を含有するキャリア液によって増幅区域１８内の増幅試薬が可動化された後、標的（Ｅ．ｃｏｌｉ由来の２３Ｓ ｒＲＮＡ）配列が存在する場合、アンプリコンの生成が続く。アンプリコンが増幅反応によって生じるに従い、アンプリコンは、コロイド状の金で標識されたアンプリコン特異的プローブに結合して、標識アンプリコン／アンプリコン特異的プローブの複合体を形成する。

検出区域２０との液体流連絡が除去可能なプラスチックシート２６によって阻止されているので、生じたアンプリコン、および、得られる標識された複合体が増幅区域１８に蓄積する。

４０分後、プラスチック分離シート２６が除かれ、これにより、液体を、標識されたアンプリコンおよび任意の過剰な遊離状態の標識されたアンプリコン検出プローブと一緒に検出区域２０内に移動させることができる。都合よいことに、不透過性プラスチックシート２６が除かれたとき、増幅区域１８を検出区域２０との十分な接触状態にさせるために、突出部および／またはバイアス部材が外被の内側表面に設けられる。何らかの標識されたアンプリコンが存在すると、アンプリコンは、試験ライン１０上に固定化されているアンプリコン検出プローブに結合し、赤く着色した線を形成する。遊離状態の標識されたアンプリコン検出プローブは試験ラインを通過し、コントロールライン１２上に固定化されているプローブ特異的な捕捉成分によって捕捉され、視認可能なコントロール結果を形成する。

試験ラインおよびコントロールラインは、外被における窓を介して可視化することができ（または、読み取り装置によって定量することができ）、赤色の線により、サンプル中のＥ．ｃｏｌｉの２３Ｓ ｒＲＮＡ標的の存在が示される。

さらなる実施形態が図３に概略的に例示される。再度ではあるが、図２に示される構成要素と類似するアッセイデバイスの構成要素が、共通する参照数字により示されている。

この実施形態では、空気のすき間が、増幅区域１８と、検出区域２０との間に設けられている。適切な時間が経過した後、アンプリコンを増幅区域１８に蓄積させるために、増幅区域１８および検出区域２０の少なくとも一部の相対的な位置が変化させられ、液体流連絡がそれらの間で確立される。図３に例示された具体的な実施形態において、少なくとも増幅区域１８のフラップ部２４の位置が、外被２に設けられた開口部３０の内部に収容されるプランジャーまたは押しボタン２８を作動させることによって、検出区域２０に対
して変化させられる。プランジャーまたは押しボタン２８を押し下げることにより、構成要素がフラップ２４を押さえつけ、これにより、フラップ２４が検出区域２０との十分な接触状態に押しつけられ、それにより、液体ならびに何らかの蓄積したアンプリコンおよび他の可動化された物質を検出区域２０内に入れることができる。

図２および図３で例示された実施形態において、増幅区域１８および検出区域２０の間での液体流路の遮断はまた、吸上部材１６の吸上作用を除くという結果を有することに留意しなければならない。従って、増幅区域１８は、サンプル収容区域／抽出区域８から分析物および／または試薬を引きつけるための十分な毛細管流動を提供するために適度な吸収性を有することは重要である。

本発明の第１の局面および／または第２の局面によるアッセイデバイスの様々な実施形態の概略図である。 本発明の第１の局面および／または第２の局面によるアッセイデバイスの様々な実施形態の概略図である。 本発明の第１の局面および／または第２の局面によるアッセイデバイスの様々な実施形態の概略図である。 異なる多孔性マトリックスを使用して得られた（ＥＬＯＳＡ、すなわち、酵素結合オリゴ吸着アッセイにより測定されたときの）シグナルの量を示す棒グラフである。 異なる多孔性マトリックスを使用して得られた（ＥＬＯＳＡ、すなわち、酵素結合オリゴ吸着アッセイにより測定されたときの）シグナルの量を示す棒グラフである。 標的特異的な増幅反応の後に得られた（ＥＬＯＳＡにより測定されたときの）シグナルの量を示す棒グラフである。 単純な側方フローアッセイデバイスを作製するために使用された構成要素を示す写真である。 得られた結果を示す、組み立てられた構成要素の写真である。 単純な側方フローアッセイデバイスを作製するために使用された構成要素を示す写真である。 得られた結果を示す、組み立てられた構成要素の写真である。 単純な側方フローアッセイデバイスを作製するために使用された構成要素を示す写真である。 得られた結果を示す、組み立てられた構成要素の写真である。

Claims (26)

1. サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するための側方フローアッセイデバイスであって、
   （ａ）デバイスを試験されるサンプルと接触させるためのサンプル収容区域、
   （ｂ）核酸をサンプルから抽出するための抽出区域、
   （ｃ）サンプル収容区域との液体連絡状態にある核酸増幅区域、および
   （ｄ）核酸増幅区域において行われた核酸増幅反応の生成物を直接的または間接的に検出するための検出区域を含み、前記検出区域が増幅区域との液体連絡状態にあるか、または、増幅区域との液体連絡状態で配置可能である、側方フローアッセイデバイス。
2. 核酸増幅が等温増幅反応を含む、請求項１に記載のアッセイデバイス。
3. サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するための側方フローアッセイデバイスであって、
   （ａ）デバイスを試験されるサンプルと接触させるためのサンプル収容区域、
   （ｂ）サンプル収容区域との液体連絡状態にある核酸等温増幅区域、および
   （ｃ）増幅区域において行われた等温核酸増幅反応の生成物を直接的または間接的に検出するための検出区域を含み、前記検出区域が増幅区域との液体連絡状態にあるか、または、増幅区域との液体連絡状態で配置可能である、側方フローアッセイデバイス。
4. 核酸をサンプルから抽出するための抽出区域をさらに含む、請求項３に記載の側方フローアッセイデバイス。
5. 請求項１に規定され、さらには請求項３に規定される、側方フローアッセイデバイス。
6. 多孔性マトリックスに放出可能に結合した１つまたは複数の試薬を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイス。
7. 放出可能に結合した１つまたは複数の試薬は、核酸増幅反応を行うために要求される１つまたは複数の試薬を含む、請求項６に記載の側方フローアッセイデバイス。
8. 多孔性マトリックスに固定化された１つまたは複数の試薬を含む、前述の請求項のいずれかに記載の側方フローアッセイデバイス。
9. 固定化された１つまたは複数の試薬は増幅特異的な捕捉成分を含む、請求項８に記載の側方フローアッセイデバイス。
10. 核酸を含む放出可能に結合したプローブまたは核酸を含む固定化プローブを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイス。
11. サンプル収容区域が、サンプル収容区域に加えられたサンプルに対する核酸抽出工程を行うために好適な試薬を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイス。
12. ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＦＴＡ紙、または同等な物質を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイス。
13. デバイス内の多孔性マトリックスに沿った液体の流れの中断、流速の変化、または流路の変化を生じさせるための手段を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フロー
    アッセイデバイス。
14. 多孔性マトリックスの２つ以上の部分の相対的な位置を変化させ、その結果、１つの部分から別の部分への液体の流速を変化させるようにするための手段を含む、請求項１３に記載の側方フローアッセイデバイス。
15. 増幅反応は、２つのプローブ分子との三成分結合が形成される際に目的とする配列を伴うＳＭＡＲＴ増幅反応を含む、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイス。
16. サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するためのアッセイを行うためのアッセイキットであって、前述の請求項のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイスと、アッセイを行うために要求される少なくとも１つの試薬の供給とを含むキット。
17. キャリア液の供給を含む、請求項１６に記載のアッセイキット。
18. 前記少なくとも１つの試薬がキャリア液に溶解および／または懸濁されて提供される、請求項１７に記載のアッセイキット。
19. サンプル中の目的とする核酸配列の存在および／または量について試験するためのアッセイを行うための方法であって、サンプルを請求項１〜１４のいずれか１項に記載の側方フローアッセイデバイスのサンプル収容区域と接触させ、その結果、核酸増幅反応を目的とする配列の存在下で生じさせるようにする工程、および、側方フローアッセイデバイスの検出区域において増幅反応の生成物を直接的または間接的に検出する工程を含む方法。
20. 増幅反応が、２つのプローブ分子との三成分結合が形成される際に目的とする配列を伴うＳＭＡＲＴ増幅反応を含む、請求項１９に記載の方法。
21. アッセイデバイスの抽出区域において核酸抽出工程を行う工程を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 抽出工程は、サンプル中の核酸を、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、すなわち「ＤＴＡＢ」と接触させること、および、続いて、抽出核酸／ＤＴＡＢ混合物をシクロデキストリンと接触させることを含む、請求項２１に記載の方法。
23. 上記に規定される本発明の第１の局面および／または第２の局面による側方フローアッセイデバイスを作製する方法であって、増幅区域および検出区域を含む多孔性マトリックスを形成させる工程を含み、前記増幅区域はサンプル収容区域との液体流連絡状態にあるか、または、サンプル収容区域との液体流連絡状態で配置可能であり、サンプル収容区域は、サンプル収容区域に固定化または放出可能に結合している１つまたは複数の試薬を含み、その結果、サンプル収容区域と接触した核酸含有サンプルに対する核酸抽出工程を行うようにされている、方法。
24. 実質的には本明細書中に記載される通りであり、かつ、添付された図面を参照するアッセイデバイス。
25. 実質的には本明細書中に記載される通りであり、かつ、添付された図面を参照するアッセイキット。
26. 実質的には本明細書中に記載される通りであり、かつ、添付された図面を参照するアッセイ方法。