CN105087777A - 核酸检测系统 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及核酸检测系统。本申请披露了一种用于检测靶核酸的系统，该系统包括：包含核酸扩增混合物的容器，其中核酸扩增混合物包括在5′和3′端用不同半抗原标记的引物，和可选的用半抗原标记的dNTP以形成核酸复合物；以及侧流试验装置，该装置包括：储存区，该储存区包括适合于特异性(专一性)结合配体与核酸复合物进行结合的试剂条件；染料区，该染料区包括核酸复合物的特异性结合配体，其中特异性结合配体被连接或轭合至报道染料或另一种半抗原；以及试验区，该试验区包括对所述核酸复合物的不同部分是特异性的不同特异性结合配体。

Description

核酸检测系统
本申请是申请日为2005年4月7日的题为“核酸检测系统”的中国专利申请No.200580016495.6的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2004年4月7日提交的美国临时申请第60/560,197号、以及于2004年5月3日提交的第60/567,845号的优先权，其全部内容结合于此作为参考。
关于在本发明中政府利益的声明
本研究工作得到美国陆军医学研究和材料指挥部的支持，合同号为DAMD17-03-C-0098。
技术领域
本发明涉及通过利用侧流(lateralflow)核酸检测系统的高敏感性(灵敏度)地检测核酸分子的领域。
背景技术
预防医学的进展大大有助于保护现代军人免于疾病，如当军人被部署到热带区域或亚热带区域时的蚊媒登革热(mosquito-bornedenguefever)。然而，尽管在现场采取了预防措施，但是部分军人仍然感染登革热或更严重的登革出血热(denguehemorrhagicfever)/登革休克综合征(dengueshocksyndrome)(DHF/DSS)。疾病的快速现场水平(field-level)检测对于及时治疗和预防进一步的大量繁殖来说是关键的。
黄病毒科(familyFlaviviridae)包含几乎70种病毒，其中包括引起黄热病、登革热、西尼罗河热以及日本脑炎的那些病毒。由于全球旅游的增长，这些病毒的大量繁殖已开始更加频繁地在热带地区以外出现。在美国大陆，圣路易脑炎病毒的大量繁殖以及最近开始于纽约并扩展到美国的整个东海岸的西尼罗河病毒的大量繁殖。此外，在美国是存在两种带菌蚊，埃及伊蚊(AedesAegypti)和白蚊伊蚊(Aedesalbopictus)，并且在某些环境下，每种蚊可以传染登革热病毒。根据CDC，这种类型的传染已在得克萨斯州南部于1980年、1986年以及1995年被检测到，并且与墨西哥北部的登革热流行病有关。
登革热和DHF/DSS已形成为人类最重要的节肢动物传染的病毒性疾病(GublerandClark,InfectDis.1995Apr-Jun；1(2):55-7)。有四种不同的登革热病毒类型(DEN-1、DEN-2、DEN-3、以及DEN-4)，每种类型都能够引起人类疾病。四种登革热病毒血清型的保守3′-非编码序列已成功地被用来开发基于TaqMan的RT-PCR(2002年至2003年，由MIDRPSTOA/L资助)以定量地鉴定(识别)来自世界不同地区的登革热病毒。
聚合酶链反应(PCR)提供了准确的病原体鉴定，但需要严格的试样制备、有限贮藏寿命的复杂反应组分、精确的温度调节、繁杂的硬件、复杂的检测过程、以及经培训的工作人员，所有这些在现场或在“实时”条件下如在生物恐怖攻击的情况下都难以保证。
这适于实验室诊断，但在“实时(real-time)”现场条件下的利用则有限，在“实时”现场条件下，快速评估生物污染的性质和存在是将其影响降低至最低程度的关键。用作蛋白质检测方法的层析侧向检测(chromatographiclateralassay)原理可以开发为DNA检测系统。
在大多数检测系统中，关键环节是获得独特的、可检测的信号，该信号是借助于基于非聚合酶链反应核酸的方法对特定靶序列(来自存在的生物病原体)的响应。
发明内容
本发明涉及信号放大系统，如连同层析侧流检测的铕包胶的微粒和/或电导率。这种系统是一种改进的核酸检测系统，其保留传统免疫层析检测的所有优点：1)一个步骤；2)可现场使用；3)利用稳定的试剂；4)没有特别的贮存要求；5)快速的结果。放大的信号通过较小的便携式读出器加以检测，得到定量或定性的结果。
本发明涉及按比例增加用于血清型特异性靶核酸检测的荧光核酸试剂盒的生产。本发明进一步涉及冷冻干燥的试剂盒组成，其是敏感的、特异性的以及稳定的。可以检测各种浓度的培养病原体，如包括登革热病毒或登革热病毒cDNA的病毒。
在一种具体实施方式中，本发明的系统采用用于基因扩增的现成可用的冻干试剂垫(试剂片，reagentpad)。反应基质可以包括缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶、标记特异性引物如登革热病毒血清型特异性引物(DEN-1、-2、-3、-4)、下游引物、生物素dUTP、Taq聚合酶、内部对照mRNA、以及控制mRNA特异性引物。加入生物素dUTP以标记核酸扩增产物，以便利用侧流检测技术进行检测和放大指示信号。当被结合到双链PCR产物中时，荧光引物用来增加它们的荧光强度(Nazarenkoetal.,NucleicAcidRes.2002May1；30(9):e37)以及将PCR产物用于侧流免疫层析法检测以鉴定登革热血清型。
在本发明的优选系统中，使用了时间分辨荧光技术(time-resolvedfluorescencetechnology)，优选这样的系统，其基于配合有抗半抗原抗体的铕嵌入(埋置)微粒和用于信号检测的时间分辨共焦扫描装置。这种特征为检测提供了另外的敏感性。这种高度敏感的层析侧流信号放大系统比荧光检测系统需要更少的阈循环数(thresholdcyclenumber)(Ct)。本发明的PCR产物检测系统是快速的(<30min)、一步形式、以及稳定的(在<30℃下贮存1年以上)。该检测容易操作、便宜、方便、使用热稳定试剂、并且没有特别的贮存要求。这些特征使其成为在实时条件下可由未经培训的人员使用的快速和容易的、立即可用的RT-PCR试剂盒。
本发明的检测系统还可以用来检测任何生物体，包括但不限于病原体如军事上有意义的病毒，包括黄病毒属，如日本脑炎病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒、天花等。其它病原体包括细菌，如炭疽杆菌(Bacillusanthracis)。
本发明还涉及通过利用基于铕和/或基于电导率的靶核酸检测方法的基于非基因扩增的靶核酸检测。
本发明的基于核酸的检测系统放大了来自低浓度特异性基因组的DNA序列(来自生物病原体)的信号，而无需严格的样品制备、有限贮藏寿命的复杂反应组分、繁杂的硬件、复杂的检测过程、或经培训的工作人员。这种方法也是独特的、特异性的、简单的，并且该放大系统容易以现场可采用的(field-deployable)模块的方式进行操作。
在本发明的具体实施例中，本发明涉及将基于登革热3′-非编码区的实时反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)技术的检测系统改进成立即可用(现成可使用，ready-to-use)的登革热病毒检测和诊断系统。示出了利用侧流免疫层析检测的现场可采用的和用户友好的诊断装置，其具有和没有实时荧光热循环器(thermalcycler)。本发明可以双重地应用于实时PCR和/或传统的PCR。
本发明进一步涉及连同有RT反应的血清型特异性信息的详细分析结果。多元PCR反应可以在单个试管中进行(图4)。所有用于RT反应和PCR反应的反应组分都被冷冻干燥在具有适当配方设计的基质中。加入生物素dUTP或标记的寡核苷酸引物以及荧光标记信标引物(beaconprimer)用来标记PCR产物和利用实时荧光热循环器或侧流检测试剂盒进行检测。在单个PCR反应中可以鉴定登革热病毒的四种血清型。这种反应试剂盒可以在室温下贮存1年以上。
应当理解，可以使用任何适宜的检测系统，包括基于荧光、化学发光、酶或任何其它染料的系统，只要利用本发明的侧流系统可检测地检测探针与样品中的靶核酸的结合。这样的染料系统可以包括具有基于荧光素标记的分子信标型系统，或它可以包含其它标记如具有胶体金配合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素配体或任何其它可检测的可配合的化学物质如镧系元素(如铕)的生物素标记。其它类型的检测标记和方法属于本发明的范围内。
本发明进一步涉及自进行(自执行，self-performing)的装置。这种快速核酸检测系统包含以精确量的所有试剂和组分以在样品加入后产生测试结果。该系统还可以具有内置加热垫(heatingpad)以精确匹配基于探针寡核苷酸组成的核苷酸靶序列鉴定。
样品中生物病原体的靶DNA可以和铕颗粒标记的寡核苷酸、铕颗粒标记的肽核酸(PNA)发生反应，其具有光寻址直接电子读出器(LightaddressableDirectElectricalReadout,LADER)、或电导率。与胶体金微粒相比，这种连同侧流检测系统一起工作的铕标记寡聚体和电导率检测方法可以增加10至1,000倍的敏感性(图5)。这两种信号放大系统可以增加敏感性高于103个靶/100μl(＝10aM)。另外，与平衡板检测(equilibriumplateassay)相比，这些检测系统与层析侧流检测的结合可以使敏感性增加10倍以上(Hampletal.AnalBiochem2001；176-187)。
在一个方面，本发明涉及用于检测靶核酸的侧流装置，该装置包括：储存区(reservoirarea)、染料区(dyearea)以及试验区(检测区，testarea)，其中储存区包括立即可用的核酸扩增混合物，而该核酸扩增混合物包括用半抗原标记的引物和/或用半抗原标记的dNTP；染料区包括连接报道染料(reporterdye)的第一类型半抗原的特异性结合配体(specificbindingpartner)；以及试验区包括第二类型半抗原的特异性结合配体。该装置可以包括具有一种以上的不同的第二类型半抗原的储存器(储罐，reservoir)，在其中检测多种形式的靶核酸。第一类型的半抗原可以是生物素(biotin)，并且其特异性结合配体可以是抗生蛋白链菌素(streptavidin)，并且报道染料可以是铕或金。此外，第二类型的半抗原可以是生物素、荧光团(fluorophore)、或寡肽，并且如果检测单一形式的靶核酸，则其特异性结合配体可以是抗生蛋白链菌素或对荧光团或寡肽是特异性的抗体。此外，第二类型的半抗原可以是多种类型的荧光团或寡肽，并且其特异性结合配体可以是对每种类型的荧光团或寡肽是特异性的抗体。靶核酸的来源可以是病原体，其可以是病毒如登革热病毒，并且该登革热病毒颗粒的血清型可以利用不同的第二类型的半抗原加以检测。同样，引物可以是分子信标类型。
本发明还涉及用于检测样品中存在靶核酸的方法，该方法包括将样品接触根据以上所述的装置的储存区，其中如果在样品中存在靶核酸，则对靶核酸进行扩增并用至少两种类型的半抗原进行标记，然后被输送到染料区，在其中第一半抗原结合至其特异性结合配体(其连接于报道染料)，然后通过毛细作用被进一步输送通过试验区，并结合至在试验区上的第二类型半抗原-特异性结合配体，其检测表明在样品中存在靶核酸。储存器可以包括一种以上的不同的第二类型半抗原，其中检测多种形式的靶核酸。第一类型半抗原可以是生物素，而其特异性结合配体可以是抗生蛋白链菌素，并且报道染料可以是铕或金。第二类型半抗原可以是生物素、荧光团、或寡肽，并且如果检测单一形式的靶核酸，则其特异性结合配体可以是抗生蛋白链菌素或对荧光团或寡肽是特异性的抗体。第二类型半抗原可以是多种类型的荧光团或多种类型的寡肽，并且它们的特异性结合配体可以是对每种类型的荧光团或寡肽是特异性的抗体。靶核酸的来源可以是病原体。
本发明进一步涉及用于检测样品中存在靶核酸的方法，该方法包括将样品接触侧流装置的储存区，其中如果在样品中存在靶核酸，则将靶核酸进行扩增并用至少一种类型的半抗原进行标记，然后被输送到染料区，在其中半抗原结合至其特异性结合配体(其连接于报道染料)，然后通过毛细管作用被进一步输送通过试验区，并在试验区中结合至的靶特异性寡核苷酸，其检测表明在样品中存在靶核酸，其中检测是通过光寻址直接电子读出器或通过检测报道染料完成的。试验区中的杂交(hybridization)可以通过侧流装置中的内置加热垫加以控制。半抗原可以是生物素，并且其特异性结合配体是抗生蛋白链菌素，并且报道染料可以是铕或金。
本发明还涉及用于检测样品中存在靶核酸的方法，该方法包括将样品接触侧流装置的储存区，其中如果在样品中存在靶核酸，则通过毛细管作用将靶核酸输送通过试验区并结合至用铕标记的靶特异性寡核苷酸。此外，在被输送到试验区之前可以扩增靶核酸。如果用作同样敏感的检测，则可以不需要进行扩增，其中使用电导率和铕检测。
附图说明
根据以下的详细描述以及附图可以更充分地理解本发明，其中附图仅是说明性的而不是对本发明的限制，并且其中：
图1-A示出了经修饰的血清型特异性上游引物而图1-B示出了利用这些引物制成的发夹结构。
图2示出了分子信标登革热病毒血清型特异性上游引物的结构。
图3示出了用于PCR反义引物和RT反应引物的下游引物。
图4是多重PCR扩增的示意图。
图5-(A)至图5-(B)示出了本发明的检测系统。图5-(A)示出了试验前的系统的试验(测试)装置。该装置具有至少两个主要部分：在装置底部的样品孔以及在装置中部的结果读数窗。图5-(B)示出了检测后的试验结果。两条线表示正的(阳性的，positive)而一条线表示负的(阴性的，negative)。对照线用作内部内置(built-in)对照。如果正确进行检测，则其应当出现。
图6示出了多重PCR产物鉴定检测。
图7示出了PCR产物鉴定装置的图片。
图8示出了侧流装置的构造。
图9示出了连接2型正向引物的5′氨基修饰因子的结构。
图10示出了利用标记PCR产物的免疫层析PCR产物鉴定检测的结构(条格式(stripformat))。
图11示出了利用标记PCR产物的免疫层析PCR产物鉴定检测的构造(装置格式(deviceformat))。
图12示出了5′生物素化正向引物的结构。
图13示出了5′若丹明红(rhodaminered)标记的反向引物的结构。
图14示出了5′合成寡肽标记的正向引物的结构。
图15示出了用于条试验(striptest)的测定步骤。
图16示出了用于装置格式检测的测定步骤。
图17示出了用于登革热病毒血清型1(serotype1)检测的实时PCR和快速PCR产物分析试剂盒的比较结果。两种测试都是用1.5mM的MgCl2进行。A道(lane)：4,340,000个拷贝/试验，B道：868,000个拷贝/试验，C道：173,600个拷贝/试验，D道：34,720个拷贝/试验，E道：6,944个拷贝/试验，F道：1,388个拷贝/试验，G道：277个拷贝/试验，H道：55个拷贝/试验，I道：没有模板。
图18示出了用于登革热病毒血清型2检测的实时PCR和快速PCR产物分析试剂盒的比较结果。A道：3,720,000个拷贝/试验，B道：1,240,000个拷贝/试验，C道：413,000个拷贝/试验，D道：138,000个拷贝/试验，E道：45,900个拷贝/试验，F道：15,300个拷贝/试验，G道：5,100个拷贝/试验，H道：1,700个拷贝/试验，I道：567个拷贝/试验，J道：189个拷贝/试验，K道：63个拷贝/试验，L道：21个拷贝/试验，M道：没有模板。
图19示出了用于登革热病毒血清型3检测的实时PCR和快速PCR产物分析试剂盒的比较结果。两种试验都是用1.5mM的MgCl2进行。A道：5,090,000个拷贝/试验，B道：1,018,000个拷贝/试验，C道：203,600个拷贝/试验，D道：40,720个拷贝/试验，E道：8,144个拷贝/试验，F道：1,628个拷贝/试验，G道：325个拷贝/试验，H道：65个拷贝/试验，I道：没有模板。
图20示出了光寻址直接电子读出器(LADER)的原理。
图21说明读数装置的示意图以及用于CBT芯片(以EDDA格式)的接触头的放大图。
图22示出了在与匹配靶(其本身用铁铈(FcAc)标记加以修饰)杂交前后，用20个核苷酸的长捕获探针(captureprobe)加以修饰并共价连接Os标记的电极的电化学行为。
图23示出了利用电导率检测的自进行快速核酸检测系统的构造。
图24示出了利用时间分辨荧光发射和/或电导率变化检测来检测生物病原体特异性DNA序列的检测原理的示意图。
图25-A、图25-B、图25-C示出了用于加热系统的构造。
图26-A和图26-B示出了用于加热系统的构造。
图27-A和图27-B示出了用于加热系统的构造。
图28示出了具有用于仪器连接器的位置(空间)的试验装置的示意图。
图29示出了基因现场检验(基因即时检验，genepointofcaretesting,GPOCT)装置，其是一种集成的DNA采样器。
图30示出了GPOCT装置的一种详细的具体实施方式。
图31示出了GPOCT装置的一种详细的具体实施方式。
具体实施方式
在本申请中，“一”用来指单个和多个对象。
如在本文中所使用的，“多种形式的靶核酸”是指多种同种型或血清型的靶核酸，如登革热病毒，其可以具有四种血清型。
如在本文中所使用的，当用于探针装置时，术语“核酸”或“寡核苷酸”是指任何核苷酸串。因而，包括DNA、RNA或PNA。
如在本文中所使用的，“核酸扩增”是指聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、Qβ复制酶、链替代检测(stranddisplacementassay,SDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、或级联滚动循环扩增(cascaderollingcycleamplification，CRCA)。
如在本文中所使用的，在核酸扩增范围内的“立即可用(readytouse)”是指在与包括靶核酸的样品接触以后进行靶核酸扩增所需要的所有试剂和酶。
在一个方面，本发明涉及增强用于核酸检测的信号。该方法可以包括利用各种标记或半抗原以敏感地检测该信号。
在本发明的一个方面，立即可用的核酸扩增预混合物可以包含在一个容器中。可以将样品加入预混合物，然后进行核酸扩增。预混合物可以包括用于核酸扩增的试剂，其中包括在5′和/或3′端有差别地加以标记的引物。对于实时PCR应用，单个引物的5′和3′端可以以分子信标方式有差别地加以标记，其中荧光团在一端而猝灭剂在另一端。这些标记的每一种可以认为是半抗原，因为可以获得并且可以产生相对于这些标记的抗体。此外，扩增产物的主体可以可选地用半抗原标记dNTP(如生物素)加以标记。预混合物可以被干燥或冷冻干燥，并且通过等温扩增PCR和/或实时PCR，预混合物可以适用于扩增。
对于侧流检测，半抗原化的或标记的扩增核酸或非扩增基因组DNA(包含能够流动到染料区的靶核酸(通常用切割))在储存区接触侧流检测装置，其中储存区包含适合于杂交条件或抗体/抗原结合条件或其它特异性结合对条件的试剂。
然后核酸可以输送到染料区，该区包含核酸的靶核酸复合物的特异性结合配体以及连接至核酸的半抗原。因此，特异性结合配体可以是靶特异性寡核苷酸、半抗原之一的抗体或高亲合性配体如抗生蛋白链菌素，其高亲和性地结合于生物素。特异性结合抗生蛋白链菌素配体可以连接或配合于染料，优选高度敏感的染料，如铕或金以形成靶核酸特异性结合配体-染料的复合物。可替换地，特异性结合配体可以用一种不同的标记进一步加以半抗原化。此外，对于寡核苷酸特异性结合配体，标记可以是铕、荧光团、FITC、生物素、寡肽等，只要该标记可以通过任何方式加以检测。
当复合物移动到试验区时，可以用其它半抗原之一的另一特异性结合配体来固定试验区，其中上述其它半抗原是在靶核酸复合物如对靶核酸是特异性的寡核苷酸中，因此复合物与试验区上的不同特异性结合配体的结合表明存在靶核酸。在染料区使用并在试验区固定的寡核苷酸可以是肽核酸或RNA。在固定在试验区上的DNA寡核苷酸的情况下，靶核酸复合物与在试验区上的寡核苷酸的杂交作用产生电导率信号，其可以通过高度敏感的LADER检测法加以检测。此外，当铕标记的寡核苷酸被杂交于固定在试验区上的寡核苷酸或PNA时，可以进行结合了LADER检测法和铕检测法的敏感性的高度敏感测定。例如，如果铕标记部分一致地被结合那么铕将产生强信号。如果铕标记区未被结合于固定的核酸，而仅是核酸的非铕标记部分被结合，那么可使用LADER电导率作为一种可替换的测定。
在本发明的另一个方面，试验区可以用靶特异性寡核苷酸和/或用于半抗原之一的至少一种其它的特异性结合配体加以固定，以进一步区别和确定靶核酸。因此，在一种具体实施方式中，靶核酸(如对5′标记或3′标记是特异性的)上的半抗原之一的特异性结合配体可以被固定在试验区，并且用于靶核酸的寡核苷酸探针也可以被固定，以便可以在具有更大特异性的情况下对靶核酸进行检测。
以下描述示例性地说明利用PCR的核酸扩增方法来检测登革热病毒，然而，应当理解，利用任何化学驱动的核酸扩增方法(如PCR、LCR、NASBA等)可以检测任何病原体。
反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)
反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)提供精确的病毒性病原体鉴定，但如目前常规使用的，需要严格的样品制备、有限贮藏寿命的复杂反应组分、精确的温度调控、繁杂的硬件、复杂的检测过程、以及经培训的工作人员。这适用于实验室诊断，但在“实时”现场条件下的应用有限。
本发明的系统可优化和按比例增加用于一般的和血清型特异性微生物检测(包括登革热病毒检测)的RT-PCR试剂盒的生产。开发了专用的冷冻干燥方案以产生干燥的和立即可用的登革热检测试剂盒，其包含所有用于在单个试管中的RT反应多重PCR反应的组分。试剂盒可以用于一般的热循环器(thermalcycler)或实时PCR热循环器如荧光PCR热循环器。
病毒RNA的提取
根据QiAampViralRNAHandbook(QiagenInc.Valencia,CA91355)，病毒RNA是提取自病毒感染的血清如登革热感染的血清的病毒悬浮液。
分子信标血清型特异性引物的设计合成
分子信标是形成茎-环结构并具有内部报道信号的“发夹”寡核苷酸，如荧光报道分子和猝灭剂分子。当它们形成发夹结构时，荧光报道分子和猝灭剂分子会靠近在一起，并且荧光被抑制。当它们结合至互补靶序列时，它们经历接通它们的荧光的构象转换(Bonnetetal.,ProcNatlAcadSciUSA.1999May25；96(11):6171-6.)。发夹分子信标可以用作荧光PCR引物或荧光探针。当寡核苷酸引物被修饰以形成具有荧光团的发夹结构时，这种引物可以提供该引物的较低初始荧光，其在形成PCR产物以后可增加至8倍(Nazarenkoetal.,NucleicAcidsRes.2002May1；30(9):e37)。发夹寡核苷酸可以和直链引物一样有效并且通过防止引物-二聚体和引物错配(mispriming)而可向PCR提供另外的特异性。
基于这种先前的研究，可以对上游引物进行修饰以形成发夹结构(图1)。为了制成发夹引物，5′尾被伸展的，其互补于引物的3′端。5′尾在低于其解链的温度下形成平端(blunt-end)发夹结构。将报道荧光素(6-FAMTM(520nm)、HEXTM(556nm)、Texas(603nm)、(640nm)等)标记到自3′端的第三或第四碱基(T)。将猝灭剂荧光素(IowablackTM，猝灭范围为520nm至700nm)标记到伸展的的5′端(3′端的互补序列)。所有报道染料和猝灭剂可获自IntegratedDNATechnology,Inc.(Coralville,IA)和MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)。预计的二级结构和荧光标记位置示在图2中。
在本发明的另一个方面，荧光素还起半抗原抗原的作用以和抗半抗原抗体起反应，从而利用侧流快速一步鉴定测试试剂盒鉴定血清型特异性PCR产物。
反义引物和RT引物的设计合成
在登革热1-3的3′-非编码序列之间具有良好同源性的一般反义引物DV-L1(核苷酸残基368-388)被指定为用于这些病毒的RT引物。虽然登革热4基因组与DV-L1序列享有显著的同源性，但如图3所示，在DV-L1引物内存在5个核苷酸错配。因此，分开的反义引物DV-L2专一地用于登革热4病毒检测的RT反应。这两种反义引物(DV-L1和DV-L2)用作一般的RT引物组(primerset)，以转录用于所有四种登革热病毒血清型的RNA(Houngetal.,2001J.Virol.Meth.95:24-35)。
在单个试管中的多重RT-PCR反应
RT反应和多重PCR反应可以在单个试管中进行(图4)。用于RT反应和PCR反应的所有反应组分被冷冻干燥在具有适当配方设计的基质中。加入生物素dUTP和标记的寡核苷酸引物以及荧光标记的信标引物以标记PCR产物并利用实时荧光热循环器或侧流检测试剂盒进行检测。在单一PCR反应中可以鉴定登革热病毒的四种血清型。这种反应试剂盒可以在室温下储存1年以上。
PCR结果鉴定
商业上可获得的实时荧光PCR系统可以用于这种立即可用的试剂盒。取决于荧光检测系统，立即可用的试剂盒可以按用户专用化加以调整。此外，这种试剂盒可以在没有实时热循环器的非理想实验室条件下使用。
侧流免疫层析检测是鉴定扩增PCR产物的一种可替换系统。这种方法是独特的、特异性的，并且易于在现场可采用的系统中进行操作。这种系统可用于实际上所有生物病原体和病毒，并且在现场或在“实时”条件下(如在美国军人部署于登革热流行区域的情况下)可提供可靠的结果。
非PCR侧流核酸检测
快速、自进行核酸检测系统的构造示于图23中，其包含所有以精确量的试剂和组分以在样品加入后产生试验结果。该系统还具有内置加热垫以精确匹配基于探针寡核苷酸组成(组合物)的核苷酸靶序列鉴定。检测原理描述在示意图中(图24)。样品首先通过储存垫(储存片，reservoirpad)，其包含：优化样品pH的缓冲液、悬浮样品中所有组分的去污剂、以及产生通过装置的适当流动的多孔过滤材料。样品其后通过毛细管作用流动到染料区，在其中样品中的生物病原体的靶DNA与铕颗粒标记的寡核苷酸或肽核酸(PNA)起反应。如此形成的反应复合物然后迁移通过芯吸膜(毛细作用膜，wickingmembrane)，在其中捕获埋置在导电试验区和对照区的寡核苷酸。最初的铕标记探针反应使得可以打开靶核苷酸序列。
利用时间分辨荧光的侧流检测
超敏感时间分辨荧光(TRF)染料用于侧流检测格式。这可以确保改善的敏感性同时保持侧流检测的有益方面。纳米级的TRF染料包含由β-二酮诱捕的30,000-2,000,000个铕分子，其具有最高量子产率的已知镧系元素螯合物的一种(Harma,TechnologyReview126/2002,TEKES,NationalTechnologyAgency,Helsinki2002)。这种包胶(包封，encapsulation)基本上对染料的荧光效率没有影响。对于典型的100nm大小的铕颗粒，荧光产量相当于大约3,000个荧光素分子。通过比较，藻胆蛋白(phycobiliprotein)B-PE(也许是已知的最大荧光的物质)具有相当于大约30个荧光素分子的荧光产量。因为100nm的颗粒是藻胆蛋白B-PE直径的约10倍并且在体积/质量方面大上千倍，所以Seradyn铕颗粒的荧光基于摩尔比B-PE大100倍，但基于体积/质量仅为10％(Seradyn,Color-RichTMDyedandFluoro-MaxTMFlorescentMicroparticlesTechnicalBulletins1999)。利用这种TRF染料颗粒的侧流检测可以增加检测敏感性高达pg/ml的水平，这意味着阈循环数(Ct)可以被降低达10个循环。这种特征可提供另外的特异性。
该系统需要简单和自进行的一步方法，该方法不需要复杂的和昂贵的自动化仪器。在图5中示出了较小的塑料片(包括本发明的自进行检测条以及其测试结果)的实例。
借助于本文提供的检测系统，可以在单次取样并且没有进一步的过程步骤的情况下检测多种被分析物。免疫层析检测系统是优选的。如果各种抗体-染料轭合物被埋置在染料垫区(dyepadarea)并且对每种报道染料是特异性的抗体被分别固定在膜上的分离区中，则每个检测线(试验线，testline)将提供关于每种特异性登革热血清型的区别性信息(图6)。
现场可采用的检测系统
可以设想现场可采用的检测系统。条形读数器可以用来检测样品的存在。例如，可以使用用于测量时间分辨镧系元素发射的仪器，其装备有氮激光器、衍射光栅分光计、电荷耦合器件(CCD)以及用于时闸(timegating)的机械斩波器(mechanicalchopper)。
本发明的范围并不限于本文描述的具体实施方式。事实上，除本文描述的之外，根据以上的描述和附图，对于本领域技术人员来说本发明的各种更改将是显而易见的。这些更改属于所附权利要求书的范围内。以下给出的实施例仅用来说明本发明，而不是限制本发明。
实施例
以下是逐步过程，其说明用于阳性对照的登革热病毒cDNA以及用于内部对照的兔珠蛋白mRNA。描述了扩增PCR产物鉴定系统的整个设计。
实施例1
分子信标引物的设计
利用BeaconDesigner2(Bio-Rad)引物和探针设计软件设计了分子信标引物。
双重标记分子信标引物的制备
将各种报道荧光素(Oregon(517nm)、6-FAMTM(520nm)、HEXTM(556nm)、TAMRATM(573nm)、Texas(603nm)、(640nm)等)标记到自3′端的第三或第四碱基(T)。将猝灭剂荧光素(IowablackTM，猝灭范围520nm至700nm)标记到伸展的5′端(3′端的互补序列)。所有报道染料和猝灭剂可获自IntegratedDNATechnology,Inc.(Coralville,IA)和MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)。
内部质量对照系统
立即可用的试剂盒包含作为内部反应对照的1ng兔球蛋白mRNA以及两种球蛋白特异性PCR引物的每一种。在对照区通过侧流鉴定试剂盒对兔球蛋白mRNA的PCR产物进行检测。这个对照区强度可以用作半定量结果的参考。
立即可用的RT-PCR反应试剂盒
评价了各种基体介质如纤维素、玻璃纤维、聚合物或人造纤维等。以下列出的配制组分在冷冻干燥器中、在恒定真空下加以干燥。相对于最佳试剂重新组成和RT-PCR反应来选择基质。
配制组分的列表：
RT-PCR缓冲液，
适当浓度的MgCl2
dNTP
生物素dUTP(生物素-16-dUTP或生物素-21-dUTP)
RNA酶抑制剂
反转录酶
标记登革热病毒血清型特异性引物(1、2、3、4型)
标记下游引物
兔球蛋白mRNA
两种球蛋白特异性PCR引物
Taq聚合酶
稳定剂(没有BSA和糖类的RNA酶/DNA酶等)。
这个步骤的主要目的是找到最佳冷冻干燥和关键组分(主要组分)的储存条件(结合有在RT-PCR反应下所有组分的释放和重新组成)。试验了各种化学物质(如但不限于缓冲液、去污剂、糖类和聚合物以及生物材料如蛋白质和其它生物聚合物)的各种组合以找到最佳条件。用iCyclerIQTM(BioRAD)和ABI7700实时荧光基因热循环器试验了立即可用的RT-PCR试剂盒。对于成功的侧流检测来说，MgCl2的浓度是一个重要因素。MgCl2浓度的优选范围是不高于约1.5mM，因为高于一定量的MgCl2就可以看到引物二聚体和假正性的(falsepositive)结果。生物素dUTP的加入增加敏感性，这或者由于更大的捕获能力或者由于更大的指示剂结合能力(表1)。通过控制标记和未标记比率以及使用过多的捕获和指示剂量来克服底物抑制。
表1示出了在用于登革热病毒血清型2检测的具有标记引物的扩增PCR结果和具有标记引物以及生物素dUTP加入的扩增PCR结果之间的比较数据。
表1登革热病毒扩增PCR结果之间的比较数据
拷贝数/试验 标记引物 标记引物以及生物素dUTP加入
1000/试验 ++ +++
200/试验 + ++
50/试验 +/- +
实施例2
侧流快速PCR产物鉴定试剂盒
试验的构造
本发明的试验试剂盒被设计成自进行装置。诸如图7中描述的侧流快速PCR产物鉴定试验试剂盒在储存垫处包含所有以精确量的试剂和组分以在样品加入后产生试验结果。在图8中描述了检测原理和构造。样品首先通过储块，其包含：优化样品pH的缓冲液、悬浮样品中所有组分的去污剂、分离未反应基质(如标记引物和生物素化dUTP)的分离柱材料(如琼脂糖珠粒等)、以及产生通过装置的适当流动的多孔储存器。样品随后在毛细管作用流动到染料区，在其中样品中的登革热病毒DNA的血清型特异性PCR产物与铕颗粒标记的抗生蛋白链菌素起反应。然后如此形成的反应复合物迁移通过埋置有抗荧光染料抗体试验区以及对照区的芯吸膜。
该试验可以由受过最低程度培训的人员在现场进行，并在将一滴或两滴DNA提取样品加到可抛弃型(可处理的，disposal)检测卡(testcard)以后的10分钟内可获得快速的结果。标记抗生蛋白链菌素和靶DNA复合物被试验区和对照区捕获。试验区可区别每一血清型特异性PCR产物，并且当铕用作信号检测标记时，该区可以通过装备有时间分辨荧光扫描装置的读数器来检测。作为内部质量对照系统，分开的对照区可检测任何扩增PCR产物。这个对照区反应确保关键试验组分正确地起作用。
捕获抗染料抗体固定化的制备
荧光染料的抗体为信号增强和二次检测用荧光染料标记的PCR产物提供了独特的机会。各种抗荧光团抗体可获自MolecularProbes,Inc.(Eugene,OR)。在0.5和2mg/ml之间的不同浓度下利用印刷机(BioDotCorp.)印刷每种抗体，其厚度为0.5至1mm。用Ponceau方法可以检查可见波段(visibleband)的质量和抗体的结合特性(Hassan,J.,etal,J.Clin.Lab.Immunol.,24:104,1987)。
抗半抗原抗体轭合微粒的制备
铕颗粒
各种粒径(50nm-300nm)的铕颗粒购买自Seradyn(Indianapolis,Indiana)和MolecularProbes(Eugene,Oregon)。用10mmol/L的N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺以及100mmol/L的N-羟基磺基琥珀酰亚胺活化铕螯合纳米颗粒的羧基30分钟。用50mMMES缓冲液(pH为6.1)洗涤活化的颗粒一次。加入5mg/L的抗体或抗生蛋白链菌素。保温2小时以后，用50mMMES缓冲液(pH为6.1)洗涤抗体或抗生蛋白链菌素涂敷的颗粒三次。
金颗粒
各种粒径(20nm-200nm)的金颗粒购买自BritishBiocellInternational(UK)。为了获得最佳的轭合，将胶体金溶液的pH调节到6.5。加入5mg/L的抗体或抗生蛋白链菌素。保温15分钟以后，加入2g/L的牛血清清蛋白。用10mM磷酸盐缓冲液(pH为7.4)洗涤抗体或抗生蛋白链菌素涂敷的颗粒两次。
轭合于抗生蛋白链菌素的微粒的最优化
在各种条件下检测了抗生蛋白链菌素浓度的影响(抑制轭合物组成(组合物)和轭合物的储存)。还确定了共价交联。在选择和优化的系统中共轭产率和按比例增加的可行性是重要的决定因素。
轭合于抗半抗原抗体的微粒的最优化
在各种条件下检测了抗半抗原抗体浓度的影响(抑制轭合物组成(组合物)和轭合物的储存)。还确定了共价交联。在选择和优化的系统中共轭产率和按比例增加的可行性是重要的决定因素。
试剂盒组成(kitformulation)
染料区
这个步骤的主要目的是找到最佳染料-抗生蛋白链菌素或半抗原-抗体轭合物的储存条件(结合有在湿检测条件下释放标记的抗生蛋白链菌素或抗体)。试验了各种化学物质(如但不限于缓冲液、去污剂、糖类和聚合物以及生物材料如蛋白质和其它生物聚合物)的各种组合以找到最佳条件。
储存区
由于样品被施加到储存区，所以利用化学物质和生物材料的各种组合将样品调节到用于检测的最佳条件。
芯吸膜
由于这个组分可促进核酸样品的毛细迁移，所以它应有效地流动核酸、使得在结合于捕获抗生蛋白链菌素的标记靶核酸之间可以进行免疫反应并提供长时间的强毛细管作用。找到具有适当稳定剂的去污剂的最佳浓度也很重要。
侧流检测
这种系统的构造类似于抗原-抗体免疫层析检测，但抗生蛋白链菌素被轭合于胶体金颗粒，并且可以通过抗生蛋白链菌素-生物素相互作用来产生信号。用荧光半抗原如若丹明红来标记血清型2特异性引物。抗若丹明红抗体被固定在硝化纤维素膜上。样品首先通过储块然后通过毛细管作用流动到染料区，在其中(那里)登革热病毒的血清型特异性PCR产物与胶体金轭合的抗生蛋白链菌素起反应。然后如此形成的反应复合物迁移通过芯吸膜，在其中是嵌入试验区和对照区的抗荧光染料抗体。
侧流登革热病毒血清型2试验成功用来检测和鉴定登革热病毒血清型2特异性PCR扩增。登革热病毒血清型2试验的检出限是<100pg/试验，其相应于<1毫微微摩尔/试验。理论上，这种敏感性足以检测来自登革热病毒cDNA的单数位(singledigit)拷贝的扩增PCR产物。
所报道的登革热病毒血清型2试验可由受过最低程度培训的人员在现场进行，并在将PCR产物加到可抛弃型的检测卡以后的10分钟内可获得快速的结果。同时，这种系统是不需要复杂和昂贵实验室条件的简单和自进行的一步方法。
实施例3
荧光素异硫氰酸盐(isothiocyanate)(FITC)轭合寡核苷酸的制备
荧光素异硫氰酸盐(FITC)购买自Sigma。为了轭合，用12碳链(C12)氨基修饰连接子(modifierlinker)修饰登革热病毒2型正向引物的5′端(图9)。利用常规方法，将FITC连接到经修饰的寡聚体。
侧流检测物的制备
将抗生蛋白链菌素轭合于胶体金颗粒，然后可以通过抗原-抗体反应来产生信号。将生物素分子轭合在反向引物(DV.L1)的5′端。将FITC分子轭合在正向引物(DV2.U)的5′端。具有那些修饰的正向和反向引物的扩增PCR产物包含生物素和FITC分子。在PCR扩增期间组合生物素dUTP。当将这个样品施加至试验条时，扩增PCR产物的生物素标签与用抗生蛋白链菌素轭合的胶体金起反应。然后PCR产物-金轭合物复合物借助于层析毛细力(chromatographiccapillarypower)迁移通过硝化纤维素膜。该复合物被固定的抗-FITC抗体捕获。取决于捕获的金或铕颗粒的量，产生可见信号(图10)。装置格式构成示于图11中。
1型、2型、以及3型的生物素标记正向引物的制备
将生物素分子轭合在登革热病毒正向引物(DV1.U、DV2.U、以及DV3.U)的5′端。在5′端用6碳链(C6)连接子修饰每种正向引物(图12)。
若丹明红标记反向引物(DV.L1)的制备
用轭合在反向引物(DV.L1)的5′端的若丹明红分子修饰反向引物(图13)。
寡肽标记反向引物(DV2.U)的制备
用轭合在引物(DV2.U)的5′端的合成寡肽分子修饰正向引物(图14)。
用于条格式检测的测定步骤(图15)
1)样品施加
将各种模板浓度的扩增PCR产物、金或铕轭合物以及缓冲液进行混和，然后接触地加到硝化纤维素膜上。
2)检测缓冲液
按照常规方法制备包含去污剂的PBS。
3)测定
在10分钟以后读出试验结果
用于装置格式检测的测定方法(图16)
1)样品施加
将各种模板浓度的扩增PCR产物(如2μl的PCR产物)加入样品孔。
2)检测缓冲液
利用常规方法制备包含去污剂的PBS，然后将特定用于信号检测标记的两滴显影液与硝化纤维上的装置进行接触。
3)测定
在10分钟以后读出试验结果
图17、图18、以及图19给出用于登革热血清型1、2、以及3的实时PCR和快速PCR产物分析试剂盒的比较结果。
实施例4
利用电导率和铕标记寡核苷酸的侧流检测
光寻址直接电子读出(LADER)的原理是基于单链(“绝缘的”)和双链(“导电的”)形式的寡核苷酸的电导率差异。这个电导率差异可以被认为是开关。通过将捕获探针连接于电极、连接电子供体/电子受体复合物(DA)以及加入溶解的活性组分就可构建分子电路。电子供体/电子受体复合物充当另外的、光诱导开关。如果探针被杂交的话，入射光可诱导电荷从D转移到A并且电子可以从这里被传送到电极。通过活性组分的DA复合物的电荷再充装(chargerefilling)可闭合电路，而连续循环产生高度放大的读出信号。LADER原理描述在EP1144685B1中，其描述了保护光合反应中心和类似的作为用于LADER技术的电化学复合物的系统，而DE19921940C2(其披露的内容以引用方式结合于本文作为参考)则论及电导率技术的操作。
供体/受体复合物很好地适用于颜料/蛋白质复合物(已知其在光合成作用中是反应中心)，能够在光诱导后的100ps内将电子从卟啉供体传递到醌受体(chinon-acceptor)。这种颜料/蛋白质复合物可以容易地被分成醌受体和剩余的(脱辅基)蛋白质。以下面的方式修饰醌受体：一方面它可以共价连接于寡核苷酸捕获探针并且在另一方面可在(脱辅基)蛋白质重新组成至探针结合醌受体以后连接于(脱辅基)蛋白质。
该方式描述在图20的反应图解中。将耗尽光合成反应中心的辅酶Q(UQ)进行重组并交联至结合于双链DNA的UQ。供体由卟啉系统P表示而辅酶Q部分形成受体A。第一步骤(1)中的照射产生激发态P*-UQ，其在进一步的步骤(2)中进行到暂时稳定的电荷分离状态P+-UQ-。在这种状态电子从DNA(3)吸引到电极(4)，从而将P+-UQ-氧化成P+-UQ并产生可测量的阳极光电流。回到初始状态的循环通过还原剂细胞色素c2+(X)来闭合，而还原剂本身通过还原(5)体系而被氧化为P-UQ。
通过在每个独立斑点的参考和测量信号之间的自动比较，可以读出和解释读数并进行定性和定量鉴定。图21图解说明了读数装置的简图以及用于CBT芯片(以EDDA格式)的接触头的放大示图。读数器被部分开发并且能够对通过简单的“压底(pressbottom)”方式进行所必要的所有液体处理步骤。将条形码芯片的参考测量数据(杂交前)存储在内部缓冲器中，并与杂交后的实际测量数据进行比较。每个电极的差值被显示在外部计算机屏幕上并可以进一步加以处理。
利用电化学阻抗光谱术，通过确定用于变化长度的DNA单链和双链的电子转移速率常数进一步探测了双链DNA与单链DNA的电导率以及相关的隧道参数(tunnellingparameter)β。图22示出了在与匹配靶(其本身用铁铈(FcAc)标记加以修饰)进行杂交作用的前后，用20个核苷酸长的捕获探针加以修饰并共价连接于Os标记的电极的电化学性能。如所预期的，在单链情况下，存在电化学响应，其可归因于在捕获探针远端的Os-标记。在杂交后出现另外的峰，其由于铁铈标记(FcAc-峰)。这不仅证明可以电化学地扫描在捕获探针远端的Os-标记，而且证明杂交的效率接近100％(代表捕获探针和靶的标记的两个峰的高度几乎相同)。
利用电导率检测器的层析检测
自进行快速核酸检测系统的构造(图23)包括以精确量的所有试剂和组分以在加入样品后产生试验结果。该系统还具有内置加热垫以精确匹配基于探针寡核苷酸组成的核苷酸靶序列鉴定。检测原理描述在图24的示意图中。样品首先通过储存垫，其包含：优化样品pH的缓冲液，悬浮样品中所有组分的去污剂，以及产生通过装置的适当流动的多孔过滤材料。样品其后通过毛细管作用流动到染料区，在其中样品中生物病原体的靶DNA与铕颗粒标记的寡核苷酸起反应。然后如此形成的反应复合物迁移通过芯吸膜，在其中埋置有捕获寡核苷酸，适用于导电试验和对照区。最初的铕标记探针反应使得可以打开靶核苷酸序列。
提出的试验可以由受过最低程度培训的人员在现场进行，并在将一滴或两滴DNA提取样品加到可抛弃型检测卡以后的30分钟内可获得快速的结果。标记寡核苷酸探针和靶DNA复合物由电导率标记的试验区和对照区捕获。试验区显示靶序列，并且该区可以通过装备有时间分辨荧光扫描装置和/或电导率读数器的读数器来检测。分开的对照区显示铕标记寡核苷酸的反寡核苷酸序列。该对照区反应确保关键试验组分正确地起作用。
层析侧流检测是一种放大系统。当液体样品中的靶DNA借助毛细力通过膜时，透明通过电亲合力不断地集中到膜上的带电荷试验区。甚至在分子的浓度非常低的情况下，在试验区中的实际分子浓度也比样品中的分子浓度高得多。
内置加热垫(builtinheatingpad)
侧流检测物可以安装在加热PCB/PCP(印刷电路纸)上，其在基线板(baseboard)上印刷的高电阻金属(例如，镍/铬合金可用于加热目的)。该系统可以具有相对精确的温度监测器以及低成本控制。样品构造示在图25-A至25-C、图26-A至26-B、以及图27-A至27-B中。
试验装置的示意图
试验试剂盒(testkit)由具有两个窗口的可处理的塑料壳(塑料盒，plasticcase)制成，其中一个窗口用来观察对照区和试验区，而另一个窗口提供接收样品的孔，如图28所示。
在装置内部是具有两个垫片的试验条。第一个垫片包含确保一致试验结果的缓冲液、去污剂、以及化学物质，同时它还包含在特定配制的缓冲系统中的靶寡核苷酸轭合铕颗粒。第二个垫片用于除去已通过反应膜的过量液体。将两种类型的寡核苷酸作为细线(thinline)分别固定在硝化纤维素膜的试验区和对照区。将对于靶生物病原体特异性的寡核苷酸固定在试验区，同时将对铕标记探针特异性的另一种寡核苷酸固定在对照区。还包括仪器连接器，以使用来测量时间分辨荧光或电导率(在使用电导率标记的情况下)的仪器可以连接于装置。
实施例5
利用铕标记肽核酸(PNA)的电导率的侧流检测
在实施例4(将核酸用作检测靶DNA的探针)中描述的所有方法和步骤也适用于使用肽核酸作为探针，包括使用其中所描述的各种加热垫和试验装置。
实施例6
HLA-DQα序列多形态性的检测
HLA-DQα2遗传基因座(geneticlocus)可以作为遗传标记(geneticmarker)用于个体鉴定的法医检定法。各种各样的分析技术已用来检测PCR扩增DNA中的遗传变异。
可以在引物和探针处标记各种半抗原或荧光半抗原。因此，各种序列和大小的寡肽可以用作半抗原；可以作为抗原决定基(表位，epitope)的其它小分子可以用作半抗原，并且可以使用各种荧光半抗原如那些列在表2中的半抗原。
表2
抗半抗原抗体用作上述半抗原的配对物(counterpart)。许多抗半抗原抗体可商业上获自这样的公司如MolecularProbes,Inc。此外，可以将抗半抗原抗体固定在固体基质上或轭合于各种颗粒。“各种颗粒”是指胶体金、胶乳颗粒、磁性或顺磁性颗粒、铕嵌入胶乳颗粒等。
实施例7
基因现场检验
在本发明的另一种具体实施方式中，本发明涉及基因现场检验装置(GPOCT)，其目的是提供一步或简单步骤组合的基因分析系统。吸收垫(absorbentpad)连接于基质(连接于反应垫(reactionpad))，其中捕获的抗体或抗原被固定在基质上作为用于基因现场检验装置的线或点侧流检测。在反应垫上是试剂区，其中施加反应样品(扩增样品)然后反应样品迁移到下一种介质。
具体实施方式1－样品提取系统。
参照图29，一种提取系统的非限制性实例可以包括：
用来除去溶液的储存系统和用来浓缩DNA或RNA样品的缓冲组分，并且可以包括经特殊处理的多层吸收剂，以及包含但不限于去污剂和碱性缓冲液的提取溶液。
这种缓冲液可以破坏细胞壁或细胞膜并将基因样品如DNA或RNA暴露在溶液中。可以设想，可以加入蛋白酶以除去组蛋白类蛋白质和细胞壁。可替换地，可以使用分开的溶液型被膜(solutioncapsule)或多层膜。
另外，可以使用各种储存器、活性炭过滤器、离子交换过滤器。此外，过滤器可以是分子截断范围为60,000至300,000D或更高的半透膜以及可以是非粘性涂布的。
该过滤器系统除去所有潜在的抑制剂、小分子、离子、以及蛋白质。因此，样品可以从最初的提取溶液被浓缩10至1000倍。
具体实施方式2－用于粗样品或提取DNA样品的集成系统(integratedsystem)。
如图29所示，集成系统包括样品输入区，其连接于多层过滤器系统，其中过滤器单元吸收大多数离子和小分子以及蛋白质。这部分相当于功能性过滤和浓缩器。过滤器系统进一步连接于非常细的用于快速热传递的管，正如毛细管一样。为了容易和快速控制温度，印刷在管表面上的内置金属可以起加热线圈的作用。在细管内可以是用于放置某些埋置在固体基质中并被冷冻干燥的组分的区域。细管连接于反应垫，其进一步连接于硝化纤维素膜，并且其进一步连接于吸收垫。
具体实施方式3－扩增和检测部分概述。
施加纯化样品，而在一种可替换的具体实施方式中，施加样品并通过滚柱系统(rollersystem)，其控制样品的流动速率。然后样品通过热传感器和热控制电路，并通过扩增室，其可以由下述组成：1)包含所有所需试剂的垫片；2)冷冻干燥的预配制试剂垫；以及3)PCR反应。该室(垫)包含Taq聚合酶、dNTP、引物(标记的)、其它标记单体等等。
当样品从扩增室出来时，它与侧流检测的反应垫接触。在进行侧流检测的同时，样品流过结果窗，其中结果可以用斑点或线或任何种类的可检测信号来显示，然后流到吸收垫上。
下文详细描述本发明的装置的部件。
1.热传感器和热控制电路单元。
各种导电墨料(conductiveink)可以在柔性基质(如聚酯、聚碳酸酯或聚苯乙烯)的表面上印刷出来。可替换地，可以将各种导电墨料，如碳、碳/银混合物、银、银/氯化银、金、铂、紫外线固化电介质、热固化电介质的导电墨料，印刷在基质上并产生适当的热量以进行温度变化范围为30℃至100℃的热循环。因此，通过检测和控制它们的电流和电阻就可以实现温度传感器和温度控制。
可以通过设置两个或三个不同的温度并在该温度下重复循环20－40次来实现热循环。热循环条件需要被优化，这取决于它们的引物序列。
2.扩增垫(amplificationpad)
扩增垫包含用于等温扩增如PCR或RFPCR的所有试剂。可以将所有试剂进行预混合并最佳地进行配制和冷冻干燥。所有试剂，是指用于扩增反应的基本组分。这样的试剂可以包含但不限于下述组分：反转录酶、DNA聚合酶、Taq聚合酶、PNA引物、标记引物、dNTP、标记dUTP、缓冲液、以及稳定剂如蛋白质、BSA(牛血清清蛋白)、以及EDTA。扩增垫可以进一步借助于施加特定容积的样品来重新组成。可以用玻璃珠或胶乳珠粒来固定引物以增强扩增反应并阻止底物抑制。“底物抑制”是指未反应的引物可以抑制抗标记抗体(anti-tagantibody)和聚合的引物之间的反应。“引物”是指寡核苷酸或PNA(肽核酸)以及寡核苷酸杂交物。“玻璃珠”或“胶乳珠”是指微颗粒。可以获得直径大小范围为0.01-10.0μm的微颗粒。优选地，用于本发明的这个具体实施方式的直径可以在0.1-10.0μm的范围内。
美国专利第6,153,425号披露了一种检测系统，然而，该‘425’专利没有披露或提示在扩增垫中的微粒可以用于防止底物抑制。
基因芯片
在基因现场检验装置的另一方面，本发明涉及蛋白质芯片和基因芯片。关于基因芯片，在描述基因现场检验装置时已描述了的具体实施方式。在一种优选的具体实施方式中，该装置可以包括连接于DNA或RNA纯化室的核酸提取器，其进一步连接于扩增或杂交室，而扩增或杂交室连接于结果窗以观察产生的信号(图30)。基因现场检验装置可以组合以上描述的试验条。
在本发明的一个具体实施方式中，将样品加入到提取缓冲液容器中。可以将提取的DNA样品进一步加到GenePOCT，然后可以在30分钟内通过肉眼或信号读出器读出结果(图31)。GenePOCT方法是快速和高度敏感的。
将本文中引用的所有参考文献全部结合于此作为参考。
＊＊＊＊＊
本领域技术人员将认识到、或仅利用常规实验就能够确定本文具体描述的本发明的特定具体实施方式的许多等效变换。这样的等效变换也包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (20)

1.一种用于检测靶核酸的系统，包括：
容器，包括核酸扩增混合物，其包括在其5′和3′端用不同半抗原标记的引物，和可选的用半抗原标记的dNTP以形成核酸复合物；以及
侧流试验装置，所述装置包括储存区，其包括适合于特异性结合配体与所述核酸复合物进行结合的试剂条件；染料区，其包括所述核酸复合物的特异性结合配体，其中所述特异性结合配体被连接或轭合至报道染料或另一种半抗原；以及试验区，其包括对所述核酸复合物的不同部分是特异性的不同特异性结合配体。
2.根据权利要求1所述的系统，其中，所述核酸扩增混合物被干燥或冷冻干燥，并且适合于等温扩增、PCR和/或实时PCR。
3.根据权利要求1所述的系统，其中，所述预混合物包括多种类型的半抗原，其中多种形式的所述靶核酸被检测。
4.根据权利要求1所述的系统，其中，所述用于特异性结合的核酸复合物包括在所述核酸上的半抗原或所述核酸。
5.根据权利要求4所述的系统，其中，所述半抗原是生物素、荧光团或寡肽。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，所述特异性结合配体是抗生蛋白链菌素、半抗原特异性抗体或与所述靶核酸互补的寡核苷酸。
7.根据权利要求6所述的系统，其中，所述报道染料是铕、金或荧光团。
8.根据权利要求3所述的系统，其中，所述多种类型的半抗原是多种类型的荧光团或寡肽。
9.根据权利要求1所述的系统，其中，固定在所述试验区的是与在所述染料区的特异性结合配体不同的特异性结合配体。
10.根据权利要求9所述的系统，其中，固定在所述试验区的所述特异性配体是半抗原的抗体和/或与所述靶核酸互补的寡核苷酸或PNA。
11.根据权利要求10所述的系统，其中，固定在所述试验区上的所述特异性结合配体是DNA。
12.根据权利要求11所述的系统，包括用于电导率检测读数的连接器。
13.根据权利要求1所述的系统，其中，所述靶核酸的来源是病原体。
14.根据权利要求13所述的系统，其中，所述病原体是属于黄病毒科的病毒。
15.根据权利要求14所述的系统，其中，所述病毒是登革热病毒。
16.根据权利要求15所述的系统，其中，所述登革热病毒颗粒的血清型通过为了区别它们而用多种不同的半抗原标记的引物加以检测。
17.根据权利要求1所述的系统，其中，所述引物在一端用荧光团进行标记而在另一端用猝灭剂进行标记，以及所述可选的标记dNTP用生物素加以标记。
18.一种用于检测样品中存在靶核酸的方法，包括：使所述样品接触包含预混合物的容器，其中所述预混合物包括靶核酸特异性标记的引物和根据权利要求1所述的可选标记dNTP；使由此获得的所述扩增核酸接触所述侧流装置的所述储存区；以及检测所述核酸复合物与在所述试验区上的所述特异性结合配体的结合。
19.一种用于检测样品中存在靶核酸的方法，包括使所述样品接触根据权利要求1所述的侧流装置的所述储存区，其中所述染料区包括用报道染料标记的靶核酸特异性寡核苷酸，并且所述标记的寡核苷酸结合于形成核酸复合物的所述靶核酸，并且其中所述核酸复合物流动到所述试验区，其中所述试验区固定寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸与固定的寡核苷酸的结合产生用于所述靶核酸存在的正信号。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述信号通过报道染料或电导率读出。
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