CN108374052A - 用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列 - Google Patents

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黄天姿
汤薇
孙会刚
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Abstract

本发明公开了一种用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，属于食源性致病微生物检测技术领域。所述的探针组为：捕获探针CP(CP，Capture probe)、检测探针(DP，detect probe)、滚环探针(RCP，Rolling circle probe)。该套探针组序列根据GenBank上金黄色葡萄球菌的全基因组序列设计，以上述探针组开发的生物芯片RCA检测金黄色葡萄球菌方法具有灵敏度高、特异性强和准确性高等特点，可广泛适用于食品、养殖及口岸等检测。

Description

用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列
技术领域
本发明属于食源性致病微生物检测技术领域，涉及检测金黄色葡萄球菌探针序列，具体涉及一种用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有“嗜肉菌"的别称，在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33％，中国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也时有发生，中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌为侵袭性细菌，能产生毒素，对肠道破坏性大，所以金黄色葡萄球菌肠炎起病急，中毒症状严重，主要表现为呕吐、发热、腹泻。呕吐常在发热前出现，发热很高。
金黄色葡萄球菌对食品安全以及人类自身健康已构成了不容忽视的威胁。传统的检测方法包括增菌培养筛选及后续计数检测、生化反应鉴定或血清学鉴定等环节，这些传统方法仍然是目前食品卫生监管机构的主流检测方法。然而随着检验要求的提升和检验规模的扩大，传统方法的缺点也日益凸显，如检测周期长，准备和收尾工作繁重、特异性不足、灵敏度低，而且需要专业操作人员等。再加上实际检测中，大部分食品微生物检测的结果为阴性，而生物芯片技术为金黄色葡萄球菌的检测提供了良好的技术平台。因此运用生物芯片检测方法对大量样本进行检测，可大大提高食品微生物检验的执行效率。但是应用生物芯片进行金黄色葡萄球菌菌的检测就必须获得大量的特异性探针，大量的种质特异性探针是生物芯片检测技术的关键。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，每个探针组均包括捕获探针CP、检测探针DP、滚环探针RCP，其中，所述DP由DP-A、DP-B和DP-C三部分依次连接组成；所述RCP为共用探针。
进一步的，捕获探针CP、检测探针DP共有4组，序列分别如下：
CP1如5′-NH2-SEQ ID NO：1-3′所示，DP1如5′-SEQ ID NO：2～4-3′所示，其中，DP1-A如SEQ ID NO：2所示，DP1-B如SEQ ID NO：3所示，DP1-C如SEQ ID NO：4所示；
CP2如5′-NH2-SEQ ID NO：5-3′所示，DP2如5′-SEQ ID NO：6～8-3′所示，其中，DP2-A如SEQ ID NO：6所示，DP2-B如SEQ ID NO：7所示，DP2-C如SEQ ID NO：8所示；
CP3如5′-NH2-SEQ ID NO：9-3′所示，DP3如5′-SEQ ID NO：10～12-3′所示，其中，DP3-A如SEQ ID NO：10所示，DP3-B如SEQ ID NO：11所示，DP3-C如SEQ ID NO：12所示；
CP4如5′-NH2-SEQ ID NO：13-3′所示，DP4如5′-SEQ ID NO：14～16-3′所示，其中，DP4-A如SEQ ID NO：14所示，DP4-B如SEQ ID NO：15所示，DP4-C如SEQ ID NO：16所示。
进一步的，RCP序列如5′-SEQ ID NO：17-3′所示。
进一步的，每个CP和DP-A探针序列与金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列互补；CP和DP-A探针序列在金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列存在时，在T4连接酶作用下连接。
进一步的，每个CP特异性探针5′端修饰有氨基，5′端添加7个T碱基，作为探针与基片的连接区。
进一步的，DP-A序列与金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列互补，检测时DP-A和gDNA结合；DP-B是DP-A和DP-C的连接区；DP-C序列与滚环探针RCP的5′端和3′端序列互补，也是滚环探针RCP的引物和连接区。
进一步的，DP-B、DP-C及RCP不含金黄色葡萄球菌gDNA序列。
进一步的，探针组还包括阴性对照探针NC和阳性对照探针PC，NC和PC序列不含有与金黄色葡萄球菌gDNA序列互补的序列；NC和PC的5′端修饰氨基，PC的3′端修饰biotin；NC和PC的5′端添加11个T碱基；阴性对照探针NC和阳性对照探针PC序列分别如5′-SEQ ID NO：18-biotin-3′和5′-SEQ ID NO：19-3′所示。
上述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：在制备用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌产品中的应用。
进一步的，所述探针组序列用于金黄色葡萄球菌生物芯片检测方法，包括以下步骤：
[1]、将硅烷化处理的玻片用5％的戊二醛处理，然后依次用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗，干燥后得到醛基修饰的玻片；
[2]、将经5′-氨基修饰的CP点样在第1步制备的玻片表面，点样的微阵列经水化和NaIO4还原处理后，制备成CP微阵列；
[3]、将DP、RCP和金黄色葡萄球菌基因组gDNA混合变性后加入到制备的微阵列上退火并连接；
[4]、对退火的微阵列经洗脱后，在芯片表面的基因结构中加入滚环扩增RCA反应体系物，进行在片滚环扩增RCA并引入biotin-dUTP，经扩增和洗涤后，加入链亲和素与RCA扩增产物结合；
[5]、经洗脱，外荧光成像仪扫描芯片，获得检测结果：如果“靶”微生物存在，CP和DP通过T4DNA连接酶连接，在片滚环扩增RCA进行，则有荧光信号产生；如果“靶”微生物不存在，则无荧光信号产生。
有益效果：本发明提供的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，有益效果在于：
(1)本发明所述的金黄色葡萄球菌生物芯片检测探针组序列用于生物芯片方法检测金黄色葡萄球菌，具有高特异性、不依赖抗体等优点。
(2)本发明采用RCA技术和芯片技术相结合，且线性RCA对模板的扩增能力高达100000倍，指数RCA可达高于10的9次方倍的扩增效率，具有非常好的灵敏度，能够实现检测到单分子水平。
(3)本发明中基于RCA是一种等温核酸扩增技术，不必再使用昂贵的热循环仪便可以完成扩增，为商业化应用和推广提供了广阔的市场前景。
附图说明
图1为金黄色葡萄球菌的探针(组)序列及特征。
图2为本发明所述的检测金黄色葡萄球菌的探针组序列生物芯片制备方法原理示意图；
其中，1—连接反应，2—CP的5′端和醛基修饰的玻片基质的连接区，3—醛基修饰的玻片基质。
图3为PC、CP和NC微阵列点样布阵示意图。
其中，1—PC，2—NC，3—CP1、4—CP2、5—CP3和6—CP4。
图4为微阵列芯片探针组检测金黄色葡萄球菌效果图。
图5为微阵列芯片探针组检测金黄色葡萄球菌特异性效果图。
其中，A、B、C、D、E和F分别为微阵列探针组检测大肠杆菌、大肠埃希氏菌、黄曲霉、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和单增李斯特菌的结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，属于食源性致病微生物检测技术领域。所述的探针组为：捕获探针CP(CP，Capture probe)、检测探针(DP，detect probe)、滚环探针(RCP，Rolling circle probe)。该套探针组序列根据GenBank上金黄色葡萄球菌的全基因组序列设计，以上述探针组开发的生物芯片RCA检测金黄色葡萄球菌方法具有灵敏度高、特异性强和准确性高等特点，可广泛适用于食品、养殖及口岸等检测。
本发明提供用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的特异性探针(组)序列是根据金黄色葡萄球菌基因组序列设计的。
本发明提供用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针(组)序列为：
优选的，每个CP和DP-A探针序列与金黄色葡萄球菌基因组(gDNA)序列互补，CP和DP-A在金黄色葡萄球菌基因组(gDNA)序列存在时，可在T4连接酶作用下连接。
优选的，每个CP特异性探针5′端修饰有氨基，5′端添加6-7个T碱基，作为探针与基片的连接区。
优选的，DP由三部分组成，DP-A、DP-B和DP-C；其中，DP-A序列与金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列互补，检测时DP-A和gDNA结合；DP-B是DP-A和DP-C的连接区；DP-C序列与滚环探针RCP的5′端和3′端序列互补，也是滚环探针RCP的引物和连接区。
优选的，DP-B、DP-C及RCP不含金黄色葡萄球菌gDNA序列。阴性对照探针(NC，negative control)和阳性对照探针(PC，positive control)序列不含有与金黄色葡萄球菌gDNA序列互补的序列，NC和PC的5′端修饰氨基，PC的3′端修饰biotin。
所述探针组序列用于金黄色葡萄球菌生物芯片检测方法，包括：
[1]、将硅烷化处理的玻片用5％的戊二醛处理，然后依次用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗，干燥后得到醛基修饰的玻片。
[2]、将经5′-氨基修饰的CP点样在第1步制备的玻片表面，点样的微阵列经水化和NaIO4还原处理后，制备成CP微阵列。
[3]、将DP、RCP和金黄色葡萄球菌基因组gDNA混合变性后加入到制备的微阵列上退火并连接。
[4]、对退火的微阵列经洗脱后，在芯片表面的基因结构中加入滚环扩增RCA反应体系物，进行在片滚环扩增RCA并引入biotin-dUTP，经扩增和洗涤后，加入链亲和素与RCA扩增产物结合。
[5]、在一定的条件下洗脱，用近红外荧光成像仪扫描芯片，获得检测结果。如果“靶”微生物存在，CP和DP可通过T4DNA连接酶连接，在片滚环扩增(RCA)可以进行，则有荧光信号产生，如果“靶”微生物不存在，则无荧光信号产生。
下面结合附图和实施例对本发明的上述内容作更进一步的详细说明。
本发明实施例中所用标准黄曲霉(Aspergillus flavus Link GIM3.475)菌株、大肠埃希氏菌(Escherichia coli CMCC44102冻干粉)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus subsp.aureus CMCC26003，冻干粉)、沙门氏菌(Salmonella sp.CICC21490)和单增李斯特菌(Listeria Monocytohenes GIM1.298)均购自中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)。
实施例1：用于检测金黄色葡萄球菌的探针组序列的生物芯片检测方法
(1)将硅烷化处理的玻片置于含5％的戊二醛(50％水溶液，Amresco)磷酸缓冲液(0.1M PH7.4)中浸泡2小时，用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗各两次，氮气吹干，4℃保存备用；
(2)按照权利要求书中所述序列及特征合成探针。
(3)使用TE缓冲液将CP、PC和NC配置为100μM的贮存液，保存于-20℃。点样前，使用TE缓冲液将100μM CP、PC和NC稀释为20μM，再用50％点样液稀释至2μM，瞬时离心混匀，然后取至少35μL至384微孔板中，将384微孔板置于点样仪中的吸样位置准备点样。
(4)将点样完毕的玻片置于密闭的湿盒中，湿盒中铺有PBS溶液浸湿的滤纸，37℃水浴过夜(大于12h)，去离子水洗涤2min、0.2％SDS洗涤5min、去离子水洗涤2min、0.15％～0.3％硼氢化钠溶液处理5min、去离子水洗涤3遍，2min/遍、玻片离心机离心甩干，储存于4℃备用。
(5)将金黄色葡萄球菌gDNA、DP(终浓度0.05μM)与RCP(5μL)加入EP管杂交液中，加热95℃，变性5min，将EP管中的25μL杂交反应体系迅速转移到贴于醛基基片的25μL GeneFrame中，盖好盖玻片，置于杂交炉中开始杂交反应，50℃杂交4h。
(6)杂交反应结束后，去离子水洗涤1min，吹干。按照如下连接反应体系，进行连接，将连接反应体系25μL贴于基因结构(Gene Frame)中。
组分 反应1
T4DNA连接酶(14U/μL) 1μL
10×T4缓冲液 2.5μL
灭菌水 21.5μL
总体积 25μL
(7)连接反应条件37℃ 30min，之后去离子水洗涤1min，吹干。
(8)醛基基片的固相RCA体系，反应体系如下：
将EP管中的25μL RCA扩增反应体系转移到上述Gene Frame中，将玻片置于30℃杂交炉的密闭湿盒中，扩增2h。
(9)RCA反应结束后，揭掉Gene Frame，去离子水洗涤玻片2min。
(10)瞬时离心玻片，加入1×封闭液浸没玻片，室温，摇床慢速摇动，封闭30min。
(11)按照链亲和素(streptavidin-IRDye800):PBS＝1:15000的比例，配置streptavidin-IRDye800的PBS溶液，浸没玻片，室温，摇床慢速摇动，结合30min。
(12)去离子水洗涤玻片10min，瞬时离心玻片，使用Odyssey 800nm激光通道扫描信号。
检测结果如图4所示。阳性探针(PC)荧光信号正常，金黄色葡萄球菌的5组探针实现滚环扩增，出现了荧光信号，检测到了靶标。而阴性探针(NC)不能进行连接反应，不能进行滚环扩增，说明本发明的5组探针可以进行金黄色葡萄球菌菌检测。
实施例2：使用本发明的探针组进行金黄色葡萄球菌检测的特异性测定
(1)将PC、NC和CP使用点样仪点样至醛基基片上，探针浓度2μM。
(2)探针固定过程与实施例1中(1)-(4)相同。
(3)分别培养大肠杆菌、大肠埃希氏菌、黄曲霉、沙门氏菌和单增李斯特菌，并分别提取其gDNA。
(4)将上述提取的gDNA、DP(终浓度0.05μM)与RCP(5μL)分别加入EP管杂交液中，加热95℃，变性5min，分别将EP管中的25μL杂交反应体系迅速转移到贴于醛基基片的25μLGene Frame中，盖好盖玻片，置于杂交炉中开始杂交反应，50℃杂交4h。
(5)连接、RCA、洗涤和扫描，步骤与实例1的(6)-(12)相同。
检测结果如图5所示。除阳性探针(PC)荧光信号正常外，只有金黄色葡萄球菌成功实现滚环扩增，出现了荧光信号，检测到了靶标。而阴性探针(NC)和其它的菌株未检测到荧光信号，说明不能进行连接反应，不能进行滚环扩增，说明本发明的探针组进行金黄色葡萄球菌菌检测具有较高的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110>徐州工程学院
<120>用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列
<160>19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
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Claims (10)

1.一种用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：每个探针组均包括捕获探针CP、检测探针DP、滚环探针RCP，其中，所述DP由DP-A、DP-B和DP-C三部分依次连接组成；所述RCP为共用探针。
2.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：捕获探针CP、检测探针DP共有4组，序列分别如下：
CP1如5′-NH2-SEQ ID NO：1-3′所示，DP1如5′-SEQ ID NO：2～4-3′所示，其中，DP1-A如SEQ ID NO：2所示，DP1-B如SEQ ID NO：3所示，DP1-C如SEQ ID NO：4所示；
CP2如5′-NH2-SEQ ID NO：5-3′所示，DP2如5′-SEQ ID NO：6～8-3′所示，其中，DP2-A如SEQ ID NO：6所示，DP2-B如SEQ ID NO：7所示，DP2-C如SEQ ID NO：8所示；
CP3如5′-NH2-SEQ ID NO：9-3′所示，DP3如5′-SEQ ID NO：10～12-3′所示，其中，DP3-A如SEQ ID NO：10所示，DP3-B如SEQ ID NO：11所示，DP3-C如SEQ ID NO：12所示；
CP4如5′-NH2-SEQ ID NO：13-3′所示，DP4如5′-SEQ ID NO：14～16-3′所示，其中，DP4-A如SEQ ID NO：14所示，DP4-B如SEQ ID NO：15所示，DP4-C如SEQ ID NO：16所示。
3.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：RCP序列如5′-SEQ ID NO：17-3′所示。
4.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：每个CP和DP-A探针序列与金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列互补；CP和DP-A探针序列在金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列存在时，在T4连接酶作用下连接。
5.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：每个CP特异性探针5′端修饰有氨基，5′端添加7个T碱基，作为探针与基片的连接区。
6.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：DP-A序列与金黄色葡萄球菌基因组gDNA序列互补，检测时DP-A和gDNA结合；DP-B是DP-A和DP-C的连接区；DP-C序列与滚环探针RCP的5′端和3′端序列互补，也是滚环探针RCP的引物和连接区。
7.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：DP-B、DP-C及RCP不含金黄色葡萄球菌gDNA序列。
8.根据权利要求1所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：探针组还包括阴性对照探针NC和阳性对照探针PC，NC和PC序列不含有与金黄色葡萄球菌gDNA序列互补的序列；NC和PC的5′端修饰氨基，PC的3′端修饰biotin；NC和PC的5′端添加11个T碱基；阴性对照探针NC和阳性对照探针PC序列分别如5′-SEQ ID NO：18-biotin-3′和5′-SEQ ID NO：19-3′所示。
9.根据权利要求1至8任一所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：在制备用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的用于生物芯片检测金黄色葡萄球菌的探针组序列，其特征在于：所述探针组序列用于金黄色葡萄球菌生物芯片检测方法，包括以下步骤：
[1]、将硅烷化处理的玻片用5％的戊二醛处理，然后依次用丙酮、乙醇、去离子蒸馏水彻底清洗，干燥后得到醛基修饰的玻片；
[2]、将经5′-氨基修饰的CP点样在第1步制备的玻片表面，点样的微阵列经水化和NaIO4还原处理后，制备成CP微阵列；
[3]、将DP、RCP和金黄色葡萄球菌基因组gDNA混合变性后加入到制备的微阵列上退火并连接；
[4]、对退火的微阵列经洗脱后，在芯片表面的基因结构中加入滚环扩增RCA反应体系物，进行在片滚环扩增RCA并引入biotin-dUTP，经扩增和洗涤后，加入链亲和素与RCA扩增产物结合；
[5]、经洗脱，外荧光成像仪扫描芯片，获得检测结果：如果“靶”微生物存在，CP和DP通过T4DNA连接酶连接，在片滚环扩增RCA进行，则有荧光信号产生；如果“靶”微生物不存在，则无荧光信号产生。
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