JP2009232869A - 新規分子機能の進化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1つ以上の化学物質を合成する方法のための組成物であって、該方法は、以下の工程:
1つ以上のテンプレートを提供する工程であって、該1つ以上のテンプレートは、該テンプレートに会合する反応性単位を必要に応じて有する、工程;
1つ以上のアンチコドンの該テンプレートへのハイブリダイゼーションおよび反応性単位の反応を可能にする条件下で、アンチコドンを有する1つ以上の移動単位および反応性単位を、該1つ以上のテンプレートに接触させる工程、
を包含する。
【選択図】なし
Description
新たな機能を有する分子を作製するための古典的「化学アプローチ」は、薬物の発見から合成方法論まで、そして材料科学までの範囲にわたる適用において、前世紀をとおして広範に用いられている。このアプローチ(図1、黒色)では、研究者は、候補分子を合成または単離し、これらの候補を所望の特性についてアッセイし、未知の場合は活性化合物の構造を決定し、このアッセイおよび構造データに基づいて構造活性相関をまとめ、次いで改善された特性を保有するように設計された新世代の分子を合成する。コンビナトリアルケミストリーの方法(例えば、非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3を参照のこと)はこのアプローチのスループットを増大させてきたが、その基本的限界は変化していないままである。いくつかの要因は、分子機能を生じる化学的アプローチの有効性を制限している。第一に、新たな機能をもたらすのを構造変化を正確に予測する能力は、しばしば、分子のわずかなコンホメーション再配置、不測の溶媒相互作用または結合事象もしくは反応事象の未知の立体化学的必要条件に起因して不充分である。構造活性相関より得られる複雑さは、頻繁に、合理的リガンド設計もしく触媒設計の成功(ハイスループット様式で行われる試みを含む)を制限する。第二に、候補のコレクションの各メンバーを、選択するのではなく、アッセイまたはスクリーニングする必要性は、各実験において探索され得る分子数を制限する。最終的に、合成分子を増幅する方法がないことは、特徴付け、スクリーニングおよび構造解明のために産生されなければならない物質の最少量を必要条件とする。その結果、ほぼ106より多くの異なる合成化合物のライブラリーを作製することは困難であり得る。
本願は、米国仮特許出願第60/277,081号(2001年3月19日出願;発明の名称「Nucleic Acids Directed Synthesis of Chemical Compounds」);同第60/277,094号(2001年3月19日出願、発明の名称「Approaches to Generating New Molecular Function」);および同第60/306,691号(2001年7月20日;発明の名称「Approaches to Generating New Molecular Function」)(これらの出願の各々の全内容は、本明細書中に参考として援用される)に対する米国特許法119(e)条のもとでの優先権を主張する。
核酸およびタンパク質以外のクラスの分子を増幅および進化させ得る必要性の認識は、本発明をもたらし、テンプレートによって指向される、分子の合成、増幅および進化のための方法および組成物を提供した。一般に、これらの方法は、進化可能なテンプレートを用いて、化合物または化合物のライブラリーの合成を導く(すなわち、テンプレートは実際に、化合物の合成をコードする)。核酸のようなテンプレートを用いてコードまたは合成されるライブラリーに基づいて、ライブラリーを増幅、進化およびスクリーニングするための方法が提供される。特に目的の特定の実施形態では、化合物は、核酸でもそのアナログでもなく、核酸にもそのアナログにも類似していない化合物である。特定の実施形態では、テンプレートにコードされるこれらのコンビナトリアルライブラリーの化合物は高分子であり、より好ましくは非天然の高分子(すなわち、天然のペプチド、タンパク質およびポリヌクレオチドを除く)である。他の実施形態では、これらの化合物は、低分子である。
本発明は、例えば、以下を提供する:
(項目1)
1つ以上の化学物質を合成する方法であって、該方法は、以下の工程:
1つ以上のテンプレートを提供する工程であって、該1つ以上のテンプレートは、該テンプレートに会合する反応性単位を必要に応じて有する、工程;
1つ以上のアンチコドンの該テンプレートへのハイブリダイゼーションおよび反応性単位の反応を可能にする条件下で、アンチコドンを有する1つ以上の移動単位および反応性単位を、該1つ以上のテンプレートに接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目2)
項目1に記載の方法であって、前記1つ以上の化学物質の一部分が、1つ以上の核酸テンプレートにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチコドンを含有する、方法。
(項目3)
1つより多い化合物のライブラリーが合成される、項目1に記載の方法であって、該方法は、以下の工程:
所望の特性を提示する前記反応性単位の反応産物を含むライブラリーメンバーを検出するためにライブラリーを検索する工程;
該反応産物についての構造情報を検出する工程;および
反応産物の新規の産生を生じるために、1つ以上のさらなる種を用いて該方法を繰り返す工程であって、該反応産物の少なくともいくつかが該所望の特性を提示する、工程、
をさらに包含する、方法。
(項目3)
合成された前記化学物質が、核酸または核酸アナログ以外の化合物である、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記化学物質が非天然の高分子である、項目1に記載の方法。
(項目5)
前記化学物質が低分子である、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記化学物質は低分子であり、そして接触させる工程が、一連の様式で2つ以上の移動単位を接触させる工程を包含する、項目1に記載の方法。
(項目7)
前記テンプレートが核酸テンプレートである、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記テンプレートがDNAまたはRNAを含む、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記テンプレートがDNAを含む、項目1に記載の方法。
(項目10)
1つ以上の化学物質を含むライブラリーであって、該化学物質の各々は、増幅可能なテンプレートに結合され、該テンプレートのヌクレオチド配列は化学物質の構造の情報を与える、ライブラリー。
(項目11)
前記化学物質のライブラリーが、低分子のライブラリーを含む、項目10に記載のライブラリー。
(項目12)
化学物質のライブラリーの合成方法であって、該方法は、以下の工程:
1つ以上の反応性単位と、必要に応じて会合される1つ以上のテンプレートを提供する工程;
該1つ以上のテンプレートと1つ以上の移動単位とを、同時にかまたは連続して接触させる工程であって、該移動単位は、複数の異なるライブラリーメンバーを産生するために、該アンチコドンの該テンプレートへのハイブリダイゼーションおよび反応性単位の反応に適切な条件下で、1つ以上の反応単位と会合するアンチコドンを含む、工程、
を包含する、方法。
(項目13)
前記化合物の一部分が、1つ以上の核酸テンプレートとハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチコドンを含有する、項目12に記載の方法。
(項目14)
項目12の方法であって、該方法は、以下の工程:
所望の特性を提示する反応性単位の反応産物を含むライブラリーメンバーを検出するためのライブラリーを探索する工程;
該反応産物についての構造的情報を検出する工程;および
反応産物の新規の産生を生じるために、1つ以上のさらなる種を用いて該方法を繰り返す工程であって、該反応産物の少なくともいくつかが該所望の特性を提示する、工程、
をさらに包含する、方法。
(項目15)
前記所望の特性が、標的タンパク質に結合することを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記所望の特性が、化学反応を触媒することを含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
1つ以上の化学物質を単離する工程をさらに包含する、項目14に記載の方法。
(項目18)
前記合成された化学物質が、低分子である、項目14に記載の方法。
(項目19)
1つ以上の非天然の高分子の合成のための方法であって、該方法は、以下の工程:
1つ以上の核酸テンプレートを提供する工程;
ハイブリダイゼーションおよび該テンプレートに沿って並ぶ隣接するモノマー単位の間に結合を形成するための反応を可能にする条件下で、1つ以上の移動単位と、1つ以上の核酸テンプレートとを接触させる工程、
を包含する、方法。
(項目20)
非天然の高分子を単離する工程をさらに包含する、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記非天然の高分子の一部分が、1つ以上の核酸テンプレートにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチコドンを含有する、項目19に記載の方法。
(項目22)
項目19に記載の方法であって、該方法は、以下の工程:
所望の特性を提示する反応性単位の反応産物を含むライブラリーメンバーを検出するためにライブラリーを探索する工程;
反応産物についての構造情報を検出する工程;
反応産物の新規の産生を生じるために、1つ以上のさらなる種を用いて該方法を繰り返す工程であって、該反応産物の少なくともいくつかが該所望の特性を提示する、工程、
をさらに包含する、方法。
(項目24)
前記所望の特性が化学反応を触媒することを含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記核酸テンプレートがDNAである、項目12または19に記載の方法。
(項目26)
前記核酸テンプレートが一本鎖である、項目12または19に記載の方法。
(項目27)
前記核酸テンプレートが二本鎖である、項目12または19に記載の方法。
(項目28)
前記核酸テンプレートがDNA、RNA、DNAとRNAのハイブリッド、DNA誘導体、およびRNA誘導体からなる群より選択される、項目12または19に記載の方法。
(項目29)
前記アンチセンスコドンが、2、3、4、5、6、7、8、9または10塩基を含む、項目12または19に記載の方法。
(項目30)
前記アンチコドンがフレームシフトし得ない、項目12または19に記載の方法。
(項目31)
前記アンチコドンがDNA、RNA、DNAとRNAのハイブリッド、DNA誘導体、およびRNA誘導体からなる群より選択される、項目12または19に記載の方法。
(項目32)
前記アンチコドンが共有結合を介して、モノマー単位と会合される、項目12または19に記載の方法。
(項目33)
化合物のライブラリーを進化させる方法であって、該方法は、以下の工程:
所望の活性を有する化合物を単離する工程であって、該化合物が、該化合物の合成がコードされる核酸テンプレートに結合されている、工程;
核酸テンプレートを変異および増幅させる工程;ならびに
変異および増幅された核酸テンプレートを用いて、関連する化合物の新規のライブラリーを合成する工程、
を包含する、方法。
(項目34)
項目33に記載の方法であって、該方法は、以下の工程:
所望の活性について化合物をアッセイする工程;および
所望の活性を有する高分子のテンプレートに基づいて、項目33に記載の工程を繰り返す工程、
をさらに包含する、方法。
(項目35)
前記所望の活性が、触媒活性および結合活性からなる群より選択される、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記変異および増幅の工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実行される、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記変異および増幅の工程が、エラープローンPCRを用いて実行される、項目34に記載の方法。
(項目38)
前記変異および増幅の工程が、インビトロ相同的組み換え(DNAシャフリング)を用いて実行される、項目34に記載の方法。
(項目39)
1つ以上の化学物質を含む、化学物質のライブラリーであって、ここで、該化学物質の各々は増幅可能なテンプレートに結合され、該テンプレートのヌクレオチド配列は化学物質の構造の情報を与え、そして該ライブラリーは項目1、12または19に従って合成される、ライブラリー。
(項目40)
前記ライブラリーが、低分子または非天然の高分子のライブラリーである、項目39に記載のライブラリー。
(項目41)
1位以上の核酸テンプレートおよび1つ以上の移動単位を備える、キット。
(項目42)
緩衝液、熱安定性DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および制限エンドヌクレアーゼをさらに備える、項目41に記載のキット。
(項目43)
前記核酸テンプレートが、低分子の骨格と会合される、項目41に記載のキット。
(項目44)
複数の核酸テンプレートを備える、項目41に記載のキット。
(項目45)
前記移動単位が、モノマー単位を含む、項目41に記載のキット。
(項目46)
前記移動単位が、低分子の骨格を改変するために使用される反応物を備える、項目41に記載のキット。
用語抗体とは、天然であるか、または完全もしくは部分的に合成によって生成されたかによらず、免疫グロブリンをいう。特異的結合能力を保持するその全ての誘導体もまた、この用語に含まれる。この用語はまた、免疫グロブリン結合ドメインに相同であるかまたは大部分相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を包含する。これらのタンパク質は、天然の供給源から誘導され得るか、または部分的もしくは完全に合成によって生成され得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。抗体は、ヒトの以下のクラスのいずれかを含め、任意の免疫グロブリンクラスのメンバーであり得る:IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgE。しかし、IgGクラスの誘導体は、本発明において好ましい。
及し得る。タンパク質は、全長タンパク質またはタンパク質のフラグメントを言及し得る。本発明のタンパク質は好ましくは、天然のアミノ酸のみを含むが、当該分野で公知のような非天然のアミノ酸(すなわち、天然では生じないが、ポリペプチド鎖に取り込まれ得る化合物;例えば、http://www.cco.caltech.edu/〜dadgrp/Unnatstruct.gif(これは、機能的イオンチャネルに好首尾に取り込まれた非天然のアミノ酸の構造を提示する)を参照のこと)および/またはアミノ酸アナログは、代替的に用いられ得る。また、本発明のタンパク質における1以上のアミノ酸は、例えば、化学存在(糖基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合体化、官能化または他の改変のためのリンカーなど)の付加によって改変され得る。タンパク質はまた、単一分子であり得るか、または多分子複合体であり得る。タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはペプチドの単なるフラグメントであり得る。タンパク質は、天然に存在するか、組換えか、もしくは合成、またはこれらの任意の組合せであり得る。
上記に議論されるように、化学物質(限定されないが低分子および高分子を含む)が、生体高分子(例えば、ポリヌクレオチドおよびタンパク質)増幅し、そして進化し得るのと同じ方法で、成長および増幅し得ることが所望される。DNAテンプレート合成は、DNA配列における情報を合成的低分子へと翻訳する可能な手段を提供することが証明された。一般的に、1つの反応物に結合されるDNAテンプレートは、産物を得るために、相補的なDNA分子に結合される第2の反応基を補充され得る。DNAハイブリダイゼーションは、配列特異的であるので、DNAテンプレート反応の結果は、対応する反応産物への特定のDNA配列の翻訳である。図2に示されるように、相補的なオリゴヌクレオチド(T.Inoueら J.Am.Chem.Soc.1981,103,7666;L.Inouら J.Mol.Biol.1984,178,669−76)の配列特異的オリゴマー形成を触媒するような一本鎖核酸テンプレートの能力が、示された。この発見のすぐ後に、DNAテンプレートまたはRNAテンプレートが相補的なDNAまたはRNAの、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの重合を触媒し得ることが見出された(T.Inoueら J.Am.Chem.Soc.1981,103,7666;L.E.Orgelら Acc.Chem.Res.1995,28,109−118;H.Remboldら J.Mol.Evol.1994,38,205;L.Rodriguezら J.Mol.Evol.1991,33,
477;C.B.Chenら J.Mol.Biol.1985,181,271)。DNAテンプレートまたはRNAテンプレートは、種々の非天然核酸アナログ(ペプチド核酸(C.Bohlerら Nature 1995,376,578)、ホスホロチオネート含有核酸(M.K.Herrleinら J.Am.Chem.Soc.1995,117,10151−10152)、ホスホロセレネート含有核酸(Y.Xuら J.Am.Chem.Soc.2000,122,9040−9041;Y.Xuら Nat.Biotechnol.2001,19,148−152)、およびホスホロアミデート含有核酸(A.Lutherら Nature 1998,396,245−8)核酸、非リボース核酸(M.Bolliら Chem.Biol.1997,4,309−20)およびリン酸結合がアミノエチル基(Y.Gatら Biopolymers 1998,48,19−28)で置き変えられたDNAアナログを含む)の形成を加速することを示した。核酸テンプレートはまた、ヌクレオチドアナログの間のアミンのアシル化を触媒し得る(R.K.Bruickら Chem.Biol.1996,3,49−56)。
ば、蛍光、スピン標識化または感光性を有する、人工的な触媒の全く新しいファミリーの発見を可能にする。同様に、変異および選択の繰り返されたサイクルによって合成低分子を増幅し、そして直接成長するような発達方法は、伝統的な合理的な設計またはコンビナトリアルスクリーニング薬物発見方法によって単離されたもおのより優れた特性を有する、新規のリガンドまたは薬物の精製を可能にする。さらに、本明細書中に記載されるアプローチを材料科学において有意な高分子にまで拡大することは、新たなプラスチックの成長を可能にする。
上記に議論されるように、1つ以上のテンプレートが、本発明の方法において使用され、そして移動単位にハイブリダイズして化学物質の合成を指示する。当業者に理解されるように、任意のテンプレートは、本発明の方法および組成物に使用され得る。変異されそしてそれによって成長したテンプレートを使用して、本明細書中に記載されるような別の化学物質または化学物質のライブラリーの合成を導き得る。本明細書中により詳細に記載されるように、成長可能なテンプレートは、化学物質の合成をコードし、そして化学物質の合成履歴を後にデコードするために、化学物質を間接的に増幅するために、そして/ま
たは化学物質を進化する(すなわち、多様化、選択および増幅)ために使用され得る。特定の実施形態において、成長可能なテンプレートは、核酸である。本発明の特定の実施形態において、テンプレートは、核酸に基づく。
上記のように、本発明の方法において、アンチコドンおよび反応性単位を含む移動単位はまた提供される。本発明において使用されるアンチコドンは、核酸テンプレート内に存在するコドンに相補的であるように設計され、そしてその中で使用される核酸テンプレートおよびコドンを考慮して設計されるべきであることが理解される。例えば、テンプレートに使用される配列ならびにコドンの長さは、アンチコドンの設計において考慮する必要がある。テンプレートに使用されるコドンに相補的である任意の分子が、本発明の方法において使用され得る(例えば、ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド)。特定の他の実
施形態において、コドンは、自然界で見出される1つ以上の塩基(すなわち、チミジン、ウラシル、グアニジン、シトシン、アデニン)を含む。特定の他の実施形態において、アンチコドンは、塩基、糖および任意のリン酸基を有する通常自然界で見出される1つ以上のヌクレオチドを含む。なお他の実施形態において、塩基は、通常自然界で見出される糖−リン酸骨格(例えば、非天然ヌクレオチド)でない骨格に沿って延長される。
種々の化合物および/またはライブラリーが、本発明の方法を用いて調製され得ることが理解される。上記のように、特別な目的の特定の実施形態において、核酸でもそのアナログでもなく、それらに似てもいない化合物が、本発明の方法に従って合成される。
される。発明の方法および系を用いて作製され得る非天然の高分子は、任意の非天然の高分子を含む。例示的な非天然の高分子としては、ポリカルバメート、ポリウレア、ポリエステル、ポリアクリレート、ポリアルキレン(例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン)、ポリカルボネート、非天然の立体化学を有するポリペプチド、非天然のアミノ酸を有するポリペプチド、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、高分子は、少なくとも10モノマー単位を含む。特定の他の実施形態において、高分子は、少なくとも50モノマー単位を含む。なお他の実施形態において、高分子は、少なくとも100モノマー単位を含む。発明の系を用いて合成される高分子は、触媒、製薬、金属キレート剤、物質などとして使用され得る。
され得るか、または非天然の高分子を増幅し、そして展開するために使用され得る。以下により詳細に記載されるように、本発明の方法は、非天然の高分子のライブライーを調製するために使用され得る。例えば、特定の実施形態において、本明細書中の実施例9により詳細に記載されるように、DNAテンプレートのライブラリーは、非天然の高分子を調製するために利用され得る。一般に、この方法は、特定のDNAポリメラーゼが特定の改変されたヌクレオチド三リン酸基質を受容し得るという事実、ならびにワトソン−クリック結合に関連しない改変された基を保有するいくつかのデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドが、天然のDNAテンプレートに対して高い配列特異性を伴なって挿入されることが知られている事実を利用する。従って、改変されたヌクレオチドを含む一本鎖DNAは、天然のヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドのDNAポリメラーゼで触媒された組込みのための有効なテンプレートとして役立ち得る。
の実施例2および4に記載されるような水性媒体および有機媒体中の反応を参照のこと。移動単位は、ヒドリド化(hydridizing)条件下でテンプレートを接触させ、そして接着させられた反応物または構築ブロックは、低分子骨格の部位と反応させられる。特定の実施形態において、低分子テンプレート上の保護基は、機能付与される部位から1つずつ除去され、移動単位の反応物は、骨格上の所望の位置のみで反応する。当業者によって理解されるように、アンチコドンは、リンカー部分を介して反応物と結合され得る(実施例3を参照のこと)。リンカーは、反応物と低分子骨格との接触を容易にし、そして特定の実施形態において、所望の反応に依存して、脱離基としてDNAを位置づける(「オートクレーブ可能な」ストラテジー)、または「瘢痕なしの」リンカーストラテジー(これは、さらなる化学機能を残すことなく産物を産出する)、もしくは「有用な瘢痕」ストラテジー(ここで、リンカーが残され、そしてリンカーの切断後の実質的な工程で機能付与され得る)を介してテンプレートに反応基を連結し得る。反応条件、リンカー、反応物、および機能付与される部位は、分子間反応を避け、そして分子内反応を促進するように選択される。本発明の方法が、合成される特定の化合物に依存して、テンプレートと
移動単位とを連続的に接触および同時に接触させることの両方を企図することがまた、理解される。特別な目的の特定の実施形態において、化学物質の多工程合成が提供され、ここで、テンプレートは、2つ以上の移動単位と連続的に接触されて複雑な化学物質の多工程合成を容易にする。
本発明の方法において、上述のような核酸テンプレートは、非天然の高分子、低分子、または任意の他の型の目的の分子の合成を指向するように提供される。一般に、複数の核酸テンプレートが提供され、ここで、提供される異なる配列の数の範囲は、2〜1015である。本発明の1つの実施形態において、複数の核酸テンプレートが提供され、好ましくは少なくとも100個の異なる核酸テンプレート、より好ましくは少なくとも10000個の異なる核酸テンプレート、そして最も好ましくは少なくとも1000000個の異なる核酸テンプレートが提供される。提供される各テンプレートは、特定の非天然の高分子または低分子の合成をコードするために使用される特有の核酸配列を含む。上述のように、テンプレートはまた、重合化が開始される第1級アミンのような機能性を有し得るか、または低分子骨格であり得る。特定の実施形態において、核酸テンプレートは、1つの「ポット(pot)」に提供される。特定の実施形態において、テンプレートは、水性媒体中に提供され、そしてこれに続く反応が、水性媒体中で実行される。
c Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins(編)1984);学術論文、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.);Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,Inc.,New York,1999)、を参照のこと;これらはそれぞれ本明細書中で参考として援用される)。
本発明の方法および組成物は、所望の特性を有する分子を生成するための新しい方法を提供する。このアプローチは、非常に強力な遺伝的方法と一緒になり、分子生物学者は、有機化学の柔軟性および力を数十年間利用してきた。遺伝的選択による非天然の高分子の調製、増幅および展開の能力は、活性、バイオアベイラビリティ、安定性、蛍光、感光、またはタンパク質および核酸中に見出される制限された1組の構築ブロックを用いて達成することが困難であるか、もしくは不可能である他の特性を保有する、新しいクラスの触媒を導き得る。同様に、変異および選択の反復する周期によって低分子を調製、増幅、および展開するために開発された新しいシステムは、より遅い従来の薬物送達方法によって単離されたものよりも優れた特性を有する新規リガンドまたは薬物の単離を導き得る(実施例7を参照のこと)。
移状態を模倣し、そして選択された化学物質は、化学反応のための触媒として役立ち得る。各分子の合成をコードする情報は、1端の分子に共有結合しているので、全体のライブラリーは、直ちにスクリーニングされ得、そしてなおそれぞれの分子が、個々に基づいて選択される。
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットおよび組成物を提供する。このキットは、本発明の実施において有用な、任意の物品または組成物を備え得る。このキットは、テンプレート、アンチコドン、移動単位、モノマー単位、構築ブロック、反応物、低分子骨格、緩衝液、溶媒、酵素(例えば、熱安定ポリメラーゼ、逆転写酵素、リガーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、クレノウフラグメント、ポリメラーゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ)、リンカー、保護基、ポリヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、塩、酸、塩基、固体支持体、または任意のこれらの組み合わせを備え得るが、これらに限定されない。
書中に記載される本発明の方法を用いて非天然の高分子を調製するために必要な物品を備える。このようなキットは、テンプレート、アンチコドン、移動単位、モノマー単位、またはこれらの組み合わせを備え得る。低分子を合成するためのキットは、テンプレート、アンチコドン、移動単位、構築ブロック、低分子骨格、またはこれらの組み合わせを備え得る。
以下に示される代表的な実施例は、発明の例示を助けることを意図し、本発明の範囲を制限することを意図せず、またそのように解釈すべきでない。確かに、本明細書中に示され、そして記載されるものに加えて、本発明の種々の改変および多くのさらなるその実施形態は、この文書の全部の内容から当業者に理解され、この文書は、本明細書中で引用される科学文献および特許文献に従い、そしてこれらを参照する例を含む。引用された参照の内容が、当該分野の状態の例示を助けるために、本明細書中で参考として援用されることが、さらに理解される。
明瞭に、上述の低分子展開アプローチを実行するために、DNAテンプレート化合成の普遍性の確立が必要とされる。第1に、本発明は、このアプローチに対する普遍性を確立し、従ってDNAテンプレート化合成を用いた種々の化学的化合物の合成を可能にする。図6aに示されるように、液相DNAテンプレート化合成を支持する2つのDNA構成の能力を確立した。求電子マレイミド基を有するヘアピン(H)テンプレートおよびエンドオブヘリックス(E)テンプレートは、相補的DNAオリゴヌクレオチドに連結した1当量のチオール試薬と効果的に反応して、−25℃でチオエーテル生成物を生じた。DNAテンプレート化反応速度(κapp=約105M−1s−1)は、HおよびEの構造に類似していた一方で、その反応基の相対的な方向とは有意に異なっていた。反対に、配列不適合を含む試薬を用いた場合、または過剰のβ−メルカプトエタノールで予めクエンチされたテンプレートを用いた場合、生成物は観察されなかった(図6a)。故に、両方のテンプレートは、たとえ生じた産物の構造が、天然のDNA骨格の構造と著しく異なっていたとしても、マレイミドへのチオールの配列特異的DNAテンプレート化添加を支持する。反応条件(pH7.5、25℃、250mM NaCl、60nM テンプレートおよび試薬)下でテンプレートの分子間反応物は、ほとんどまたは全く観察されない。
適合したが不適合でない試薬は、それらの遷移状態ジオメトリー、立体障害、およびコンフォメーションの柔軟性におけるかなりの変化にも関わらず効率的に生成物を与えた。全体的に、これらの知見は、DNAテンプレート合成が、様々な反応型を支持し得る一般的な現象であり、そして既に記載されるように核酸骨格が似ている構造の生成に限らないことを示す。
した(図10)。この観察は、DNAテンプレート合成における近接効果が、DNAアニーリングが律速になるまで結合形成速度を増強し得ることを示唆する。
(DNA合成) DNAオリゴヌクレオチドを、標準的なプロトコルを用いてPerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA合成機で合成し、そして逆相HPLCによって精製した。オリゴヌクレオチドを、分光光度的および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に続くエチジウムブロマイドまたはSYBR Green(Molecular Probes)を用いる染色およびStratagene Eagle Eye II濃度計を用いる定量化によって定量化した。ホスホルアミダイト(5’−NH2−dT基、5’テトラクロロフルオレセイン基、無塩基の骨格スペーサー基、C3骨格スペーサー基、9−結合ポリエチレングリコールスペーサー基、12−結合飽和炭化水素スペーサー基、および5’ビオチン基の合成を可能にする)は、Glen Researchから購入された。チオール連結オリゴヌクレオチド試薬を、C3ジスルフィドコントロールドポアガラス(Glen Research)上で合成した。
SIAB反応およびSBAP反応において適合した試薬:5’−CCCGAGTCGAAGTCGTACC−SH;図6b SIAB反応およびSBAP反応において不適合な試薬:5’−GGGCTCAGCTTCCCCATAA−SH;図6b、図6c、図6d、および図8aにおける他の反応についての不適合な試薬;5’−FAAATCTTCCC−SH(F=テトラクロロフルオレセイン);1つのミスマッチを含む図6cおよび図6dにおける試薬:5’−FAATTCTTACC−SH;図6a、図6b、および図8
a SMCC反応、GMBS反応、BMPS反応、およびSVSB反応におけるEテンプレート:5’−(NH2dT)−CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTCGACTCGGGAATACCACCTTCGACTCGAGG;図6b SIAB反応、SBAP反応、およびSIA反応におけるHテンプレート:5’−(NH2dT)−CGCGAGCGTACGCTCGCGATGGTACGAATTC;図8bにおけるクランプオリゴヌクレオチド:5’−ATTCGTACCA。
上記されるように、DNAテンプレート合成化学の一般性を、試験した(Liuら、J.Am.Chem.Soc.2001,123,6961を参照のこと)。詳細には、DNA様コンフォメーションへの反応性基の正確な整列化を必要とせずに、化学反応の適度な収集に関するDNAテンプレート合成の能力を実証した。実際に、DNAテンプレート合成の距離非依存性および配列の正確さは、1,000を越えるテンプレートのモデルライブラリを、対応するチオエステル生成物へと同時にワンポット変換させ、これらの1つを、タンパク質ストレプトアビジンへの結合についてインビトロでの選択によって濃縮し、そしてPCRによって増幅した。
ト合成における魅力的な候補にする。
官能化したテンプレートおよび試薬を、代表的には、5’−NH2末端化オリゴヌクレオチド(テンプレート1について)、5’−NH2−(CH2O)2末端化オリゴヌクレオチド(他の全てのテンプレートについて)または3’−OPO3−CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2末端化ヌクレオチド(全ての試薬について)を、0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中の適切なNHSエステル(DMF中20mg/mL
溶液の0.1容量)と25℃で1時間、反応させることによって調製して、図13および図15に示される構造のテンプレートおよび試薬を提供した。アミノ酸連結試薬6〜9について、0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中の3’−OPO3CH2CH(CH2OH)(CH2)4NH2末端化オリゴヌクレオチドを、DMF中100mMビス[2−(スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES,Pierce)溶液の0.1容量と25℃で10分間、続いて300mM NaOH中の300mMアミノ酸の0.3容量と25℃で30分間反応させた。
(例示的なリンカーの開発)
当業者に理解されるように、ゲル電気泳動による分析を容易にすることは、反応の進行の間、生成物に結合する試薬のDNA部分を除去するためにしばしば有用である。しかし、インビトロ選択に適当な合成小分子の対応するライブラリーへ、DNAのライブラリーを翻訳するためにDNAテンプレート合成を使用することは、試薬の反応性基をそれらの解読DNAオリゴヌクレオチドと結合する切断可能なリンカーの開発を必要とする。以下および本明細書中に記載されるように、3つの例示的な型のリンカーが、開発されてきた(図18を参照のこと)。1つの反応性基を有する試薬について、反応部分へ脱離基としてのDNAを位置決めすることが望ましい。この「自己切断可能な」リンカーの戦略下で、DNA反応性基の結合が、反応の自然な結果として切断される。しかし、このアプローチの1つの例として、蛍光Wittigホスホラン試薬(14、図19を参照しながら)を合成し、ここで解読DNAオリゴヌクレオチドは、アリールホスフィン基の1つに結合される(図19左を参照のこと)。アルデヒド結合テンプレートを用いたDNAテンプレートWittig反応は、蛍光基の、Wittig試薬からテンプレートへのほとんど定
量的な移動および試薬のDNA部分からのアルケン生成物の同時の遊離が生じる。さらに、1つを超える反応性基を有する試薬は、2つのさらなるリンカー戦略の1つを介して、それらの解読DNAオリゴヌクレオチドに結合され得る。「スカーレス(scarless)」リンカー戦略において、1つの反応性基のDNAテンプレート反応の後、第2の反応性基を介して結合されるリンカーの切断が生じ、あとにさらなる化学官能基を残さずに生成物を生じる。例えば、解読DNAオリゴヌクレオチドにカルバモイルエチルスルホンリンカーを介して結合された一連のアミノ酸試薬を、合成した(図19、中央)。これらのアミノ酸試薬を使用するDNAテンプレートアミド結合形成の生成物を、水性アルカリ緩衝液で処理し、カルバモイル基の定量的な脱離および自発的な脱炭酸を行った。従って、このスカーレスリンカーの脱離の生成物は、完全に移行されたアミノ酸部分である。本発明のなお他の実施形態において、第3のリンカー戦略(「有用なスカー(scar)」)は、有用な化学基を誘導することが、リンカー切断の結果として有利であり得る戦略において使用され得る。特に、「有用なスカー」は、以後の工程において、官能化され得、リンカー切断後に残される。例えば、1,2−ジオールを介して解読DNAオリゴヌクレオチドへと連結されるアミノ酸試薬を、作製した。アミド結合生成に続いて、このリンカーを、NaIO4を用いた酸化によって定量的に切断し、有用なアルデヒド基を保持する生成物を得た(図19、右を参照のこと)。すぐ上に記載されるリンカーに加えて、種々のリンカーを使用し得る。例えば、図20に示されるように、チオエステルリンカーを、チオール末端化DNAとカルボン酸含有試薬とのカルボジイミド媒介性カップリングによって、生成し得、水性塩基で切断し得る。カルボキシレート基が、上記に記載されるDNAテンプレートアミド結合形成反応への入り口を提供するために、このリンカーは、切断されたとき、「有用なスカー」を遊離する(図20を参照のこと)。あるいは、チオエステルリンカーを、Ag(I)カチオンの存在下で、アミンアシル化反応の間、自己切断可能なリンカーとして使用し得る(Zhangら、J.Am.Chem.Soc.1999,121,3311−3320を参照のこと)。なぜならこの試薬のチオールDNA部分が、反応の自然の結果として遊離されるからである。pH11で酸化され除去され、ビニルスルホンを遊離し得るチオエステルリンカーが、「有用なスカー」リンカーとして使用され得ることは、理解される。本明細書中に示されるように、このビニルスルホン基は、続いてのDNAテンプレート反応の多くにおいて基質として作用する。
(有機溶媒中の例示的な反応:)
本明細書中に示されるように、種々のDNAテンプレート反応は、水性溶媒中で生じ得る。以下に考察されるように、DNAテンプレート反応が、有機溶媒中で生じ得、従って、DNAテンプレート合成の範囲を大いに拡大することもまた示されてきた。具体的には、DNAテンプレートおよびDNA試薬は、長鎖のテトラアルキルアンモニウムカチオンと複合体を形成し得(Jostら、Nucleic Acids Res.1989,17,2143;Mel’nikovら、Langmuir,1999,15,1923−1928を参照のこと)、CH2Cl2、CHCl3、DMFおよびMeOHを含む無水有機溶媒中の反応成分の定量的な溶解を可能にする。驚いたことに、DNAテンプレート合成が、実は、高い配列選択性を有する無水有機溶媒において生じ得ることが見出された。DNAテンプレートアミド形成反応(reacation)が、図2に示され、ここで、試薬およびテンプレートが、別々の容器中または前もってアニーリングされた後、水中のいずれかにおいて、ジメチルジドデシルアンモニウムカチオンと複合体を形成し、乾燥状態まで凍結乾燥され、CH2Cl2に溶解され、そして一緒に混合される。マッチした反応は、反応物を水溶液中で前もってアニーリングした場合およびこれらの反応物をCH2Cl2中で最初に混合した場合に、生成物を提供したが、ミスマッチの反応は、生成物を提供しなかった(図21を参照のこと)。無水DMF中でのDNAテンプレートアミド形成およびPd媒介性Heckカップリングもまた、配列特異的に進行した。明らかに、有機溶媒中での配列特異的DNAテンプレート合成のこれらの観察は、有機媒体中のテト
ラアルキルアンモニウム複合体化DNA中の少なくともいくつかの二次構造の存在を意味し、DNAレセプターおよびDNA触媒を、有機溶媒中での立体選択的結合特性および立体選択的触媒特性の方へ進化させることを可能にするはずである。具体的には、共役付加、付加環化、置換反応、およびPd媒介性カップリングを含む、水性媒体中で生じることが公知であるDNAテンプレート反応は、有機溶媒中でもまた実施され得る。特定の他の実施形態において、水中で実施することが非効率または不可能な有機溶媒中の反応が使用され得る。例えば、水中でのRu触媒オレフィン置換が、Grubbsおよびその共同研究者らによって報告されているのに対して(Lynnら、J.Am.Chem.Soc.1998,120,1627−1628;Lynnら、J.Am.Chem.Soc.2000,122,6601−6609;Mohrら、Organometallics 1996,15,4317−4325を参照のこと)、水性置換系は、極端に官能基感受性である。しかし、有機溶媒におけるRu触媒オレフィン置換の耐性官能基は、有意に、より強靭である。有機溶媒中で使用するためのいくつかの例示的な反応としては、基底状態の出発物質よりも極性ではない遷移状態を通って進行し得る、ニトロンとオレフィンとの間の1,3−双極子環状付加が挙げられるがこれに限定されない。
(例示的な化合物および化合物のライブラリーの合成:)
(A)ポリカルバメートライブラリーの合成:)
上記に記載される戦略の1つの実施形態は、増幅可能なポリカルバメートライブラリーの作製である。ライブラリーをコードするために使用される16の可能なジヌクレオチドのうち、1つは、開始コドンの機能を割り当てられ、そして1つは、終始コドンとして作用するよう割り当てられる。次いで、異なるモノマーに対して14までの残された各ジヌクレオチドを割り当てる、人工的な遺伝コードを作製する。幾何学的な理由のために、1つのモノマーは、実際に2つの側鎖を含むジカルバメートを含む。各モノマー中で、ジカルバメートは、フッ素を用いた処理の際に、ネイティブなDNAおよび遊離カルバメートを遊離するシリルエノールエーテルリンカーを介して、対応するジヌクレオチド(tRNAアンチコドンに類似)へと結合される。このジヌクレオチド部分は、活性化された5’−2−メチルイミダゾールホスフェートとして存在することが示され(Inoueら、J.Mol.Biol.162:201,1982;Remboldら、J.Mol.Evol.38:205,1994;Chenら、J.Mol.Biol.181:271,1985;Acevedoら、J.Mol.Biol.197:187,1987;Inoueら、J.Am.Chem.Soc.103:7666,1981;各々は、参考として本明細書中に援用される)、ヌクレオチドのテンプレート指向性オリゴマー化のための優れた脱離基として作用するが、この脱離基は、中性水性条件下または塩基性水性条件下で、比較的安定である(Schwartzら、Science 228:585,1985;参考として本明細書中に援用される)。ジカルバメート部分は、ビニルオキシカー
ボネート(vinyloxycarbonate)リンカーを介して結合された環状形態で存在する。ビニルカーボネート基は、中性水性条件下または塩基性水性条件下で、安定であることが示され(Olofsonら、Tetrahedron Lett.18:1563,1977;Olofsonら、Tetrahedron Lett.18:1567,1977;Olofsonら、Tetrahedron Lett.18:1571,1977;各々は、参考として本明細書中に援用される)、さらに、アミンの添加の際に、非常に高収率でカルバメートを提供することが示された(Olofsonら、Tetrahedron Lett.18:1563,1977;参考として本明細書中に援用される)。
新生ポリカルバメート鎖からのアミンによって攻撃される場合、m−クレゾールの芳香族化によって推進されるビニルカルボネートリンカーは、遊離アミンを遊離する。この遊離アミンは、続いてのビニルオキシカーボネートを攻撃するための求核試薬として作用し、成長するカルバメート鎖の重合を増大させる。このような戦略は、ただ1つの求核試薬が、重合の間の任意の時点で存在することを保証することによって、交差反応および二方向性重合の可能性を最小化する。
ng)を生じる。「停止」モノマーの攻撃は、アミンよりむしろアセトアミドを遊離し、それによって、重合を終始する(図23)。この段階でDNAが、安定な二本鎖形態で存在するので、変数(例えば、温度およびpH)は、重合効率を最適化するために探査され得る。
モノマーを合成した後、DNA骨格(scaffold)上のモノマーのアセンブリおよび重合が、自発的に生じるはずである。市販入手可能で、生合成され(Davis Adv.Enzymol.16:287,1955;参考として本明細書中に援用される)、またはD−マンノースから簡単に合成することによる(Fleetら、J.Chem.Soc.,Perkins Trans.I 905,1984;Harveyら、Tetrahedron Lett.32:4111,1991;各々は、参考として本明細書中に援用される)、シキミ酸1は、モノマー合成のための便利な開始点として作用する。synヒドロキシル基を、p−メトキシベンジリデンとして保護し、残りのヒドロキシル基を、tert−ブチルジメチルシリルエーテルとして保護して、2を得る。次いで、保護されたシキミ酸のカルボキシレート部分は、LAH還元、得られるアルコールのトシル化、そしてさらにLAHを用いた還元によって完全に還元され、3を提供する。
市販の合成可能なN−保護アミノ酸は、各モノマーのジカルバメート部分に対する出発物質として作用する。反応性側鎖を、光分解性エーテル、エステル、アセタール、カルバメート、またはチオエーテルとして保護する。以前に開発された化学(Choら、Science 261:1303、1993;参考として本明細書中に援用される)に従って、所望のアミノ酸4を、イソブチルクロロホルメートを用いる混合アルデヒド形成、続く水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって、対応するアミノアルコール5に転換する。
次いで、このアミノアルコールを、p−ニトロフェニルクロロホルメートでの処理によって活性化カーボネートに転換し、6を生成し、次いで、この6を、第2のアミノアルコール7とカップリングし、ヒドロキシル基のシリル化およびFMOC脱保護の後に、カルバメート8を得る。
シキミ酸誘導性リンカーへのカルバメート8のカップリングは、以下のように進行する。3のアリルヒドロキシル基を、TBAFで脱保護し、トリフラート(triflic)無水物で処理し、第2のトリフラートを形成し、次いでアミノカルバメート8で置換し、9を得る。3中のビニルメチル基の存在は、SN2’付加から生じる所望されない生成物の量を最小化することを補助するはずである(Magid Tetrahedron 36:1901,1980;参考として本明細書中に援用される)。α,β−不飽和エステルへの脱プロトン化されたカルバメートのMichael付加は、十分に示されてきた(Colladoら、Tetrahedron Lett.35:8037,1994;Hiramaら、J.Am.Chem.Soc.107:1797,1985;Nagasakaら、Heterocycles 29:155,1989;Shishidoら、J.Chem.Soc.Perkins Trans.I 993,1987;Hiramaら、Heterocycles 28:1229,1989;各々は、参考として本明細書中に援用される)。類推によって、二級アミンを、o−ニトロベンジルカルバメート(NBOC)として保護し、得られた化合物を、カルバメート窒素上で脱プロトン化する。この脱プロトン化を、代表的には、水素化ナトリウムまたはカリウムtert−ブチルオキシドのいずれかを用いて実施し得るが(Colladoら、Tetrahedron Lett.35:8037,1994;Hiramaら、J.Am.Chem.Soc.107:1797,1985;Nagasakaら、Heterocycles 29:155,1989;Shishidoら、J.Chem.Soc.Perkins Trans.I 993,1987;Hiramaら、Heterocycles 28:1229,1989;各々は、参考として本明細書中に援用される)、他の塩基を、ニトロベンジルプロトンの脱プロトン化を最小にするために使用し得る。脱プロトン化カルバメートを、α,β−不飽和ケトン10に付加し、続いて得られたエノラートをTBSCIでトラップすることによって、シリルエノールエーテル11を生じるはずである。以前に見出された、5−置換エノン(例えば、10)への共役付加の立体選択性(Houseら、J.Org.Chem.33:949,1968;Stillら、Tetrahedron 37:3981,1981;各々は、参考として本明細書中に援用される)は、そのジアステレオマー上の11の優先的な形成を示唆する。ケトン10(フッ素切断カルバメートホスフェートリンカーに対する前駆体)を、ワンポットでの脱炭酸(Bartonら、Tetrahedron 41:3901,1985;参考として本明細書中に援用される)、続いて、TBAFで処理し、得られたアルコールをSwern酸化し、12を得、DDQで脱プロトン化し、低障害性アルコールを選択的ニトロベンジルエーテル形成し、そしてヨウ化サマリウムでα−ヒドロキシル基の還元することによって得る(Mo
lander In Organic Reactions,Paquette,編.46:211,1994;参考として本明細書中に援用される)。
11のp−メトキシベンジリデン基を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムおよびTMSクロリドを使用して、α−ヒドロキシPMBエーテルに変換し(Johanssonら、J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 2371,1984;参考として本明細書中に援用される)、TES基を、2%のHFを用いて脱プロトン化し(TBSエーテルに影響しないはずの条件(Boschelliら、Tetrahedron Lett.26:5239,1985;参考として本明細書中に援用される))、13を得る。先例に従って(Johanssonら、J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 2371,1984;Sutherlinら、Tetrahedron Lett.34:4897,1993;各々は、参考として本明細書中に援用される)、PMB基は、より障害性の二級アルコール上に残るはずである。2つの遊離ヒドロキシル基を、クロロ蟻酸p−ニトロフェノール(または、別のホスゲンアナログ)の溶液への非常にゆっくりとした13の添加により、大環状化し得、14を得る。PMBエーテルを、脱プロトン化し、得られたアルコールを、トリフラートに転換し、立体障害性の塩基を用いて反応動力学的条件下で、除去して、ビニルオキシカルボネート15を得る。ニトロベンジルエーテルおよびニトロベンジルカルバメートの光脱プロトン化は、アルコール16を生じる。
モノマー合成を、3つの成分の連続的なカップリングによって完了する。クロロジイソプロピルアミノホスフィン17を、PCl3とジイソプロピルアミンとの反応によって合成する(Kingら、J.Org.Chem.49:1784,1984;参考として本明細書中に援用される)。樹脂結合ヌクレオシド(または、3’−o−ニトロベンジルエーテル保護ヌクレオシド)18を、17とカップリングして、ホスホルアミダイト19を得る。19とヌクレオシド20との続いてのカップリング(Inoueら、J.Am.Chem.Soc.103:7666,1981;参考として本明細書中に援用される)は、21を提供する。次いで、アルコール16を、21と反応させ、MCPBAまたはI2を使用した慎重な酸化、続いての樹脂からの切断(または光脱プロトン化)の後に、完成したモノマー22を生じる。17とアルコールとの連続的なカップリングのこの戦略を、連続的に使用し、良好な収率で3つの異なるアルコキシ置換基を保有するホスフェートを生成する(Bannwarthら、Helv.Chim.Acta 70:175,1987;参考として本明細書中に援用される)。
別の実施形態において、増幅可能なペプチド核酸ライブラリーを作製する。Orgelおよびその共同研究者らは、ペプチド核酸(PNA)オリゴマーを、相補的DNAテンプレートまたは相補的RNAテンプレート上で効率的に重合し得ることを示した(Boehlerら、Nature 376:578,1995;Schmidtら、Nucl.Acids Res.25:4792,1997;各々は、参考として本明細書中に援用される)。この知見ならびにアミノ酸側鎖を保有するキラルなペプチド核酸の最近の合成および特徴付け(Haaimaら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35:1939−1942,1996;Puschlら、Tetrahedron Lett.39:4707,1998;各々は、参考として本明細書中に援用される)は、高分子骨格および成長する核酸鎖を単一の構造に結合することを可能にする。この例において、各テンプレートは、5’アミノ基で終了するDNAヘアピンからなり;このような分子の固相合成および溶液合成は、以前に記載されている(Uhlmannら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35:2632,1996;参考として本明細書中に援用される)。各伸長モノマーは、目的の官能基を含有する側鎖を有するPNAトリマー(またはもっと長い)からなる。人工的な遺伝コードは、各トリヌクレオチドを異なるセットの側鎖へと割り当てるために書かれる。カルボキシ末端からアミノ末端の方向での相補的DNAテンプレートに沿った、PNAダイマーのアセンブリ、活性化(例えば、カルボジイミドおよび適切な脱離基を用いる)、および重合は、非天然の高分子与える(図20)。ビオチン化されたN末端を有する「停止」モノマーを選択することは、伸長終結および全長高分子の精製の都合の良い方法を提供する。得られた高分子(これらをコードするDNAに共有結合された)は、選択、配列決定、または変異の準備ができている。
DNAヘアピンテンプレートと共有結合した固体相合成ビーズを、各々のウェル中に配置して、テンプレートに相補的な、蛍光ラベルしたPNAモノマーを一緒にする。首尾よいカップリング事象の結果、ビーズへのフルオロフォアの共有結合が生じ(図26);所望されない非テンプレート型のカップリングを、ミスマッチのモノマーとのコントロール反応によって識別し得る。ビーズの洗浄および固相からの生成物の切断の後、各々のウェルを蛍光プレートリーダーを用いてアッセイする。
選択された側鎖が一緒に組み合ってNi2+レセプターを形成し得ることを明らかにする。さらに、PNA Ni2+キレート剤の単離は、その後の非天然高分子の精製に有用であることが分かり得るヒスチジンタグのPNA等価物を示す。最近の尽力は、より野心的な選択に関する。例えば、特定のリガンド存在下で蛍光発光するPNAを、高分子のDNAテンプレートを介してビーズに連結された、翻訳された高分子の分別を行うFACSによって選択し得る。標的リガンドの存在下で発光するが非存在下では発光しないそれらのビーズを、単離してそして特徴付けを行う。最終的に、上記のようにビオチン化された「ストップ」モノマーの使用により、多くの結合形成反応または結合切断反応の触媒についての直接的な選択が可能となる。図28に記載される2つの例は、解糖における本質的な工程である、グリセルアルデヒド3−リン酸およびジヒドロキシアセトンリン酸へのフルクトース1,6−二リン酸の古典的なアルドール切断を触媒する、官能化されたPNAについての選択、ならびにアルドール転移反応を触媒するPNAについての選択の概要を示す。
本発明のなお別の実施形態において、合成薬物の骨格を含む、増幅可能かつ進化可能な非天然非高分子性分子の調製において、革新的な方法を使用する。求核性基または求電子基のそれぞれは、単結合の連結によって接着される低分子骨格上か、またはコードするオリゴヌクレオチドテンプレートに対する通常の固体支持体を介して、マスクが外される。短い核酸配列に連結された求電子試薬または求核試薬は、対応するテンプレートにハイブリダイズされる。適切な試薬との配列特異的な反応が、近接触媒によって起こる(図29)。
びにコドンの性質(より大きな枠はより長いコドンを必要とする)を決定する(図32)。
分子進化は、進化する分子の構造中に増幅可能な情報担体の配列特異的な翻訳を必要とする。この要件により、直接的に進化する分子型が、2種(つまり、タンパク質および核酸)に限定される。なぜなら、これらのクラスの分子のみが核酸配列から翻訳され得るからである。一般的に上記のように、タンパク質および核酸以外に分子進化に対する有望なアプローチは、DNA配列を合成低分子に翻訳する方法として、DNAテンプレートの合成を使用する。DNAテンプレートの合成は、高い配列特異性を有し、かつDNA骨格の構造的模倣物を必要とはしない、広範な種々の強力な化学反応へと方向付け得る。しかし、このアプローチの、利用的に複雑なものの合成分子への適用は、DNAテンプレート反応の生成物がその後DNAテンプレートの変換を受けることを可能とする一般的な方法の開発を必要とする。第1のDNAテンプレート多段階低分子合成は、本明細書中で詳細に記載される。DNAテンプレート合成の反応範囲における最近の伸展を併せると、これらの知見は、合成低分子ライブラリーのインビトロ進化のための段階を設置する。
1980,124,913)。この試薬およびアミン末端のテンプレート(5)を使用するDNAテンプレートアミド結合の形成(本明細書中に記載される)の生成物(8)は、塩基性水溶液で処理されてリンカーの量的排除および自発性の脱カルボキシル化をもたらし、上手く転換されるアミノ酸基を含む生成物9を提供する(図33)。このスルホンリンカーは、pH7.5以下の緩衝液中で25℃で24時間より長く安定であるが、pH11.8の緩衝液に37℃で2時間曝される場合に量的切断を受ける。
,268−73;Schaffitzelら、J.Immunol Methods 1999,231,119−35)、または細胞内ペプチドライブラリー(Normanら、Science 1999,285,591−5)のようなタンパク質生合成機構を使用して作製されたペプチドライブラリーとは異なり、非タンパク遺伝性の(non−proteinogenic)側鎖、非天然側鎖の空間的配置、または非ペプチド性の骨格を有するアミノ酸は全て、このライブラリー中に含まれ得る。さらに、多くの市販のジペプチド、トリペプチドおよびオリゴペプチドをまた、より長いライブラリーのメンバーを作製するための構築ブロックとして、使用し得る。このライブラリー中の非天然ペプチドの存在は、リボソーム的に作製されたペプチドと比較して、プロテアーゼ耐性のような増強された薬理学的特性を付与し得る。同様に、巨大な環状ライブラリーのメンバーは、より高いアフィニティーのリガンドを作製し得る。なぜなら、これらの標的を結合する際のエントロピー喪失が可撓性のより高い直鎖状対応物より低いからである。この記載に合てはまる非常に多種の市販のアミノ酸を基に、この非天然環状テトラペプチドおよび非天然直鎖テトラペプチドのライブラリーの最大の多様性は、100×100×100×100=108メンバーを超え得る。
ンドのDNAテンプレート型アミド形成およびリンカー切断に処して、ジペプチド15およびトリペプチド16を得た(図39)。
各々の反応工程、精製工程およびスルホンリンカー切断工程の進行の後に、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を続けた。テンプレート(16)に連結した最終トリペプチドを、制限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し、そしてトリペプチドを含む消化フラグメントをMALDI質量分析によって特徴付けた。2nmol(約20μg)の出発材料より開始し、十分なトリペプチド生成物を生成して、106より多くのインビトロ選択およびPCR反応に対するテンプレートとして扱った(Kramerら、Current Protocols in Molecular Biology、第3巻(編者:F.M.Ausubel)、Wiely、1999、15.1頁)(推定で1/10,000の分子が残る選択)。出発材料テンプレートを無水酢酸でキャップした場合も、配列ミスマッチを含むコントロール試薬を相補的な試薬の代わりに使用した場合も、有効な生成物を全く生成しなかった(図39)。
.Scott,Tetrahedron Lett.1997,38,4961;Liら.Nature 1994,369,218;Tamuraら.Proc.Natl.Acad.Sci USA 2001,98,1393)に必要とされる。これらの知見は、試薬が、増殖分子からの広範囲に変化する距離(上記の例において、0〜20塩基)でアニールする場合でさえ、核酸テンプレートが、反復性または非反復性の多段階低分子合成を確かに指向し得ることを実証する。次いで、下記により詳細に記載するように、合成分子のライブラリは、翻訳、選択、増殖および変異誘発のサイクルを通して、活性リガンドおよび活性触媒に進化し得る。
本発明のなお別の実施形態において、核酸(例えば、DNA、RNA、これらの誘導体)は、重合化触媒に結合される。核酸が、複合体構造に折りたたまれ得るために、その核酸は成長する高分子鎖の重合化を指向するおよび/またはその重合化に影響を与えるために使用され得る。例えば、核酸は、重合化されるモノマー単位の選択、およびどのような重合化反応がおこるか(例えば、立体化学、立体規則性、活性)に影響し得る。この合成高分子は、分子量、密度、疎水性、立体規則性、立体選択性などのような特定の特性について選択され得、そしてその合成を指向する触媒の不可欠な部分を形成する核酸は、増幅され、そして進化され得る(図41)。リガンドの多様化、選択、および増幅の繰り返しサイクルは、所望の特性への、触媒および高分子の真の進化を可能にする。
上記の非天然ペプチドおよび二環式のライブラリは、種々の段階で特徴付けられる。各候補試薬は、その翻訳DNAオリゴヌクレオチドに結合体化され、次いでマッチテンプレートおよびミスマッチテンプレートでのモデル反応に供される。これらの反応物からの生成物を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析し、反応効率を評価し、そして質量分析によって予測された生成物構造を裏付けた。一旦強固(robust)な試薬の完全なセットが同定されると、大スケールでの代表的な単一ライブラリの完全多段階DNAテンプレート合成が実施され、そして最終生成物が質量分析によって特徴付けられる。
1994,79,1157−64)(新たな血管の生成)を含む)を媒介する。腫瘍誘発性血管新生の間、侵襲性内皮細胞は、それらのαVβ3インテグリンレセプターによって、細胞外マトリクス成分へと結合する。いくつかの研究(Brooksら、Cell 1994,79,1157−64;Brooksら、Cell 1998,92,391−400;Friedlanderら、Science 1995,270,1500−2;Varnerら、Cell Adhes Commun 1995,3,367−74;Brooksら、J.Clin Invest 1995,96,1815−22)
は、抗体または低分子合成ペプチドを用いてのこのインテグリン結合事象の阻害が、増殖性脈管形成性血管細胞のアポトーシスを誘導し、そして腫瘍転移を阻害し得ることを実証した。
能基についての一般情報を獲得するために、テンプレート集団を、プールとして配列決定して、あらゆるコドン位置でのA、G、T、およびCの分布を明らかにする。各官能基の遺伝暗号の賢明な設計は、集団の配列決定からかなりの情報が集められるのを可能にする。例えば、コドンの第1位でのGは、荷電した基を指定し得、一方、この位置でのCは、疎水性置換基をコードし得る。
kら、Nature 2001、411、498−501)。従って、DNA塩基にさらなるブロンステッド酸性基およびブロンステッド塩基性基を備え付けることは、DNA触媒の範囲を大いに拡張しないかもしれない。
プローチを使用して、直接選択され得る(以下を参照のこと)。
1999、18、377−91;J.A.Lathamら、Nucleic Acids Res.1994、22、2817−22;T.Gourlainら、Nucleic Acids Res.2001、29、1898−1905;S.E.Leeら、Nucleic Acids Res.2001、29、1565−73;K.Sakthivelら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1998、37、2872−2875)。この収束性アプローチは、幅広い種類の金属結合配位子を、いずれかのヌクレオチドアナログに迅速に取り組むことを可能にする。以前に報告された(K.Sakthivelら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1998、37、2872−2875)経路(図48、Phillips、Chorba、Liu、未公開結果)に従い、7の合成が完成されている。N−アリルトリフルオロアセトアミドとの市販の5−ヨード−2’−デオキシウリジン(22)のHeckカップリングは23を生成した。トリメチルホスフェート、POCl3、およびプロトンスポンジ(proton sponge)(1,8−ビス(ジメチルアミノ)−ナフタレン)、その後のトリ−n−ブチルアンモニウムピロホスフェートでの23の処理により、5’−三リン酸基が導入され、次いでトリフルオロアセトアミド基が水性アンモニアで除去され、7を生成した。
た。メチルアデノシン(32)、エチルアデノシン(33)およびビニルアデノシン(34)は、対応するアルキルスズ試薬および31のPd−媒介性Stilleカップリングによって合成された(P.Mamosら、Tetrahedron Lett. 1992、33、2413−2416)。メチルアミノアデノシン(35)(E.Nandananら、J.Med.Chem.1999、42、1625−1638)、エチルアミノアデノシン(36)、およびヒスタミノアデノシン(37)が、水またはエタノール中の対応するアミンでの23の処理により調製された。上記のように、32〜37の5’−ヌクレオチド三リン酸が合成された。
DNAポリメラーゼによる7の受容に関するこれまでの知見は、報告された非受容(K.Sakthivelら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1998、37、2872−2875)および受容(S.E.Leeら、Nucleic Acids Res.2001、29、1565−73)の両方で矛盾がある。
は、5’末端にビオチアン化Tを含み、非コード鎖になる。PCR反応は、1つまたは2つの非天然金属結合デオキシリボヌクレオチド三リン酸、3つまたは2つの天然デオキシリボヌクレオチド三リン酸、および非天然ヌクレオチドと適合するDNAポリメラーゼを含む。2本鎖形態のライブラリを生成するPCR反応および、未使用プライマーを除去するゲル精製の後に、ライブラリメンバー二重鎖は、化学的に変性される。非コード鎖を、ストレプトアビジン結合磁気ビーズで何回か洗浄することにより除去して、ライブラリ内にビオチン化鎖が残存していないことを確認する。従来のコンビナトリアル触媒の試みを合わせた多様性を大きく上回り、1015までの異なるメンバーのライブラリがこの方法により生成される。
場合、結合形成を触媒するこれらのライブラリメンバーは、ビオチン基をそれら自体に共有結合させる。次に、活性な結合形成触媒は、固定化したストレプトアビジンで基質ビオチン結合体を捕らえ、不活性高分子を洗い流すことにより、不活性ライブラリメンバーから単離され得る(図55)。
それぞれの選択ラウンドの後に、活性なライブラリメンバーは、非天然ヌクレオチドを用いるPCRによって増幅され、所望の触媒についてライブラリを富化するために、さらなる選択ラウンドに供される。これらのライブラリは、それぞれの選択ラウンド前に多様化工程を導入することにより、真に進化される。ライブラリは、エラープローンPCRを使用する、ランダム変異誘発による(Caldwellら、PCR Methods A
pplic.1992、2、28−33)か、もしくは小さな非相同核酸フラグメントを組み換える、改変DNAシャッフリング方法を使用する組換えにより多様化される。エラープローンPCRは、本質的に通常のPCRよりも効率が低いので、エラープローンPCR多様化は、天然のdATP、dTTP、dCTPおよびdGTPのみと共に、そして化学的ハンドルまたはビオチン基を欠くプライマーを使用して行なわれる。次に、得られる変異化産物は、非天然ヌクレオチド、ビオチン化プライマー、およびアミノ終端プライマーまたはチオール終端プライマーを含む、標準PCR反応物を使用して、非天然核酸高分子へのPCR翻訳に供される。
数回の進化に供されたライブラリーは、混合された配列のプールまたは個々のライブラリーメンバーの両方として、目的の反応を触媒する能力について特徴付けられる。個々のメンバーを、DNAベクター中にPCR増幅した配列を連結すること、コンピテントな細菌細胞内に連結したベクターの希釈溶液を形質転換すること、および形質転換体の単一コロニーを選択することによって、進化したプールから取り出す。プールまたは個々の配列に関するアッセイを、単一の代謝回転形態と本質的に複数の代謝回転触媒性形態の両方において実行する。単一代謝回転アッセイについて、遊離のビオチン化基質の存在下で、基質に連結した結合形成触媒がそれ自体のビオチン化をもたらす速度を測定するか、またはビオチン化結合破壊触媒がそのビオチン基の欠損をもたらす速度を測定する。複数代謝回転アッセイを、低分子型の基質と共に進化した触媒をインキュベートし、そしてtlc、NMR、質量分析、HPLCまたは分光分析によって産物形成速度を分析することによって実施する。
にする。金属の選択を、多様な金属カチオンを用いて触媒を金属化すること(metalating)、および活性において生じた変化を測定することによって評価する。基質特異性およびこれらの触媒の立体選択性を、一連の基質アナログの代謝回転速度を測定することによって評価する。産物形成のジアステレオ選択性およびエナンチオ選択性を、反応産物を既知の立体化学の産物と比較することによって明らかにする。先の研究は、大きなキラル環境によって隠された活性部位が、高程度の立体選択性をしばしば有することを示唆する。例えば、コンビナトリアルアプローチにおいて生じるペプチドベースの触媒は、ペプチドリガンドのサイズと関連する卓越した立体選択性に乏しいことを実証するが(Jarvoら、J.Am.Chem.Soc.1999,121,11638−11643)、RNAベースの触媒および抗体ベースの触媒は、しばしば、卓越した立体選択性を実証する(Jaschkeら、Curr.Opin.Chem.Biol.2000,4,257−262;Seelingら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2000,39,4576−4579;Hilvert,D.Annu.Rev.Biochem.2000,69,751−93;Barbasら、Science 1997,278,2085−92;Zhongら、Angew.Chem.Int.Ed.Engle.1999,38,3738−3741;Zhongら、J.Am.Chem.Soc.1997,119,8131−8132;Listら、Org.Lett.1999,1,59−61)。上記の基質立体選択性に対する直接的な選択は、進化した触媒に共通してこの特性をさらに増大させるはずである。
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