DE69435048T2 - Systematische evolution von liganden durch exponentielle anreicherung: fotoselektion von nukleinsäureliganden - Google Patents

Systematische evolution von liganden durch exponentielle anreicherung: fotoselektion von nukleinsäureliganden Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäureliganden, die ein Target-Molekül binden und/oder an dieses photovernetzen und/oder dieses photodeaktivieren. Das Target-Molekül kann ein Protein, ein Pathogen oder eine toxische Substanz oder ein beliebiger biologischer Effektor sein. Die Nucleinsäure-Liganden der vorliegenden Erfindung enthalten photoreaktive oder chemisch reaktive Gruppen und sind unter anderem zur Diagnose und/oder Behandlung von Krankheiten oder pathologischen oder toxischen Zuständen von Nutzen.
  • Das zugrunde liegende Verfahren, das in dieser Erfindung verwendet wird, wird SELEX genannt, ein Akronym für „Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment". Eine Verbesserung des hierin beschriebenen SELEX-Verfahrens, genannt Solution-SELEX, ermöglicht ein wirksameres Abtrennen zwischen Oligonucleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Target-Molekül. Eine Verbesserung der Nucleinsäureprodukte hoher Affinität von SELEX ist für einen beliebigen Zweck von Nutzen, zu dem eine Bindungsreaktion verwendet werden kann, z. B. in Testverfahren, Diagnoseverfahren, Zellsortierung, als Inhibitoren der Target-Molekülfunktion, als therapeutische Mittel, als Sonden, als Maskierungsmittel und dergleichen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das SELEX-Verfahren (hierin im Folgenden SELEX genannt), beschrieben in der US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/536.428 ( WO 91/19813 ), eingereicht am 11. Juni 1990, mit dem Titel Systematic Evolution of Ligands By Exponential Enrichment, nun fallengelassen, US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/714.131 (US 5.475.096), eingereicht am 10. Juni 1991, mit dem Titel Nucleic Acids Ligands und US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/931.473, eingereicht am 17. August 1992, mit dem Titel Nucleic Acis Ligands, ausgegeben als US-Patent Nr. 5.270.163 (hierin als die SELEX-Patentanmeldungen bezeichnet), stellt eine Produktklasse bereit, bei der es sich um Nucleinsäuremoleküle handelt, wobei jedes eine einzigartige Sequenz besitzt, jedes von ihnen die Eigenschaft besitzt, spezifisch an ein(e) ge wünschte(s) Target-Verbindung oder -Molekül zu binden. Jedes Nucleinsäuremolekül ist ein spezifischer Ligand einer/eines bestimmten Target-Verbindung oder -Moleküls. SELEX basiert auf einer einzigartigen Erkenntnis, dass Nucleinsäuren ausreichend Kapazität, um eine Reihe von zwei- oder dreidimensionalen Strukturen zu bilden, sowie ausreichend chemische Vielseitigkeit innerhalb ihrer Monomere besitzen, um als Liganden zu agieren (spezifische Bindungspaare zu bilden), und zwar mit beinahe jeder chemischen Verbindung, egal, ob monomer oder polymer. Moleküle jeder Größe können als Targets fungieren.
  • Das SELEX-Verfahren umfasst die Selektion aus einem Kandidatengemisch sowie schrittweise Wiederholungen struktureller Verbesserung unter Verwendung desselben allgemeinen Themas, um beinahe jedes gewünschte Kriterium der Bindungsaffinität und -selektivität zu erhalten. Ausgehend von einem Gemisch an Nucleinsäuren, vorzugsweise umfassend ein Segment einer randomisierten Sequenz, inkludiert das Verfahren Schritte des Kontaktierens des Gemisches mit dem Target unter Bedingungen, welche die Bindung begünstigen, des Abtrennens ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die an Target-Moleküle gebunden haben, des Dissoziierens der Nucleinsäure-Target-Paare, des Amplifizierens der Nucleinsäuren, die von den Nucleinsäure-Target-Paaren dissoziiert sind, um ein ligandangereichertes Gemisch an Nucleinsäuren zu ergeben, sowie anschließendes Wiederholen der Schritte der Bindung, des Abtrennens, des Dissoziierens und Amplifizierens durch so viele Zyklen wie gewünscht.
  • Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, basiert SELEX auf der Erkenntnis der Erfinder, dass es innerhalb eines Nucleinsäuregemisches, das eine große Anzahl möglicher Sequenzen und Strukturen enthält, eine große Bandbreite von Bindungsaffinitäten für ein bestimmtes Target gibt. Ein Nucleinsäuregemisch, umfassend z. B. ein randomisiertes Segment von 20 Nucleotiden, kann 420 geeignete Möglichkeiten besitzen. Jene, welche die höheren Affinitätskonstanten für das Target besitzen, binden mit der größten Wahrscheinlichkeit an das Target. Nach dem Abtrennen, dem Dissoziieren und der Amplifikation wird ein zweites Nucleinsäuregemisch erzeugt, das an Kandidaten mit höherer Bindungsaffinität angereichert ist. Zusätzliche Selektionsrun den führen zu einer progressiven Bevorzugung der besten Liganden, bis das resultierende Nucleinsäuregemisch vorwiegend aus nur einer oder ein paar Sequenzen besteht. Diese können anschließend kloniert, sequenziert und einzeln auf die Bindungsaffinität als reine Liganden getestet werden.
  • Zyklen der Selektion, der Abtrennung und der Amplifikation werden wiederholt, bis ein gewünschtes Ziel erreicht wird. Im allgemeinsten Fall wird die Selektion/Abtrennung/Amplifikation fortgesetzt, bis bei Wiederholung des Zyklus keine signifikante Verbesserung der Bindungsstärke erreicht wird. Das Verfahren kann verwendet werden, um so viele wie etwa 1018 verschiedene Nucleinsäure-Arten zu testen. Die Nucleinsäuren des Testgemisches umfassen vorzugsweise einen Abschnitt einer randomisierten Sequenz sowie konservierte Sequenzen, die für eine wirksame Amplifikation notwendig sind. Nucleinsäuresequenzvarianten können auf eine Reihe von Arten hergestellt werden, unter anderem durch die Synthese randomisierter Nucleinsäuresequenzen und Größenselektion aus zufällig gespaltenen zellulären Nucleinsäuren. Der variable Sequenzabschnitt kann eine vollständige oder partielle Zufallssequenz enthalten; er kann ebenfalls untergeordnete Abschnitte der konservierten Sequenz enthalten, die in der randomisierten Sequenz inkorporiert sind. Die Sequenzvariation in Test-Nucleinsäuren kann durch Mutagenese vor oder während der Selektions-/Abtrennungs-/Amplifikations-Wiederholungen eingeführt oder erhöht werden.
  • Die Photovernetzung von Nucleinsäuren an Proteine wurde durch Inkorporation photoreaktiver funktionaler Gruppen in die Nucleinsäure erreicht. Photoreaktive Gruppen, die in Nucleinsäuren zum Zweck der Photovernetzung der Nucleinsäure an ein assoziiertes Protein inkorporiert wurden, umfassen 5-Bromuracil, 4-Thiouracil, 5-Azidouracil und 8-Azidoadenin (siehe 1).
  • Bromuracil wurde sowohl in DNA als auch in RNA durch Substitution von Bromdesoxyuracil (BrdU) und Bromuracil (BrU) für Thymidin bzw. Uracil inkorporiert. BrU-RNA wurde mit 5-Bromuridintriphosphat anstelle von Uracil unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase und einer DNA-Matrize hergestellt, und sowohl BrU-RNA als auch BrdU-RNA wurden mit 5-Bromuracil- bzw. 5-Bromdesoxyuracilphosphoramiditen hergestellt, und zwar in Standard-Nucleinsäure-Synthese (Talbot et al., Nucleic Acids Res. 18, 3521 (1990)). Manche Beispiele der Photovernetzung von BrdU-substituierter DNA an assoziierte Proteine sind Folgende: BrdU-substituierte DNA an Proteine in intakten Zellen (Weintraub, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38, 247 (1973)); BrdU-substituierte lac-Operator-DNA an lac-Repressor (Lin und Riggs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 947 (1974); Ogata und Wilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4973 (1977); Barbier et al., Biochemistry 23, 2933 (1984); Wick und Matthews, J. Biol. Chem. 266, 6106 (1991)); BrdU-substituierte DNA an EcoRI- und EcoRV-Restriktionsendonucleasen (Wolfes et al., Eur. J. Biochem. 159, 267 (1986)); Escherichia-coli-BrdU-substituierte DNA an zyklisches Adenosin-3',5'-Monophosphat-Rezeptorprotein (Katouzian-Safadi et al., Photochem. Photobiol. 53, 611 (1991)); BrdU-substituiertes DNA-Oligonucleotid des menschlichen Polyomavirus an Proteine aus menschlichem fötalem Hirnextrakt (Khalili et al., EMBO J. 7, 1205 (1988)); ein Hefe-BrdU-substituiertes DNA-Oligonucleotid an GCN4, einen Hefe-Transkriptionsaktivator (Blatter et al., Nature 359, 650 (1992)); sowie ein BrdU-substituiertes DNA-Oligonucleotid von Methanosarcina-Sp. CHT155 an das chromosomale Protein Mc1 (Katouzian-Safadi et al., Nucleic Acids Res. 19, 4937 (1991)). Es wurde auch über die Photovernetzung von BrU-substituierter RNA an assoziierte Proteine berichtet: BrU-substituierte Hefe-Vorläufer-tRNAPhe an Hefe-tRNA-Ligase (Tanner et al., Biochemistry 27, 8852 (1988)) sowie eine BrU-substituierte Haarnadel-RNA des R17-Bakteriophagengenoms an das R17-Hüllprotein (Gott et al., Biochemistry 30, 6290 (1991)).
  • 4-Thiouracil-substituierte RNA wurde verwendet, um insbesondere t-RNAs an verschiedene assoziierte Proteine zu photovernetzen (Favre, in: Bioorganic Photochemistry, Band 1: Photochemistry and the Nucleic Acids, 379–425, H. Morrison (Hrsg.), John Wiley & Sons, New York (1990); Tanner et al., s. o. (1988)). 4-Thiouracil wurde unter Verwendung von 4-Thiouridintriphosphat und T7-RNA-Polymerase oder unter Verwendung von Nucleinsäure-Synthese mit dem geeigneten Phosphoramidit in RNA inkorporiert; es wurde ebenfalls durch Austausch der Aminogruppe von Cytosin für eine Thiolgruppe mit Schwefelwasserstoff direkt in RNA inkorporiert. Ein weiteres Verfahren der ortsspezifischen Inkorporation photoreaktiver Gruppen in Nucleinsäu ren umfasst die Verwendung von 4-Thiouridylyl-(3'-5')-guanosin (Wyatt et al., Genes & Development 6, 2542 (1992)).
  • Beispiele von Photovernetzung von 5-Azidouracil-substituierter und 8-Azidoadenin-substituierter Nucleinsäure an assoziierte Proteine sind ebenfalls bekannt. Assoziierte Proteine, die vernetzt wurden, umfassen terminale Desoxynucleotidyltransferase (Evans et al., Biochemistry 28, 713 (1989); Farrar et al., Biochemistry 30, 3075 (1991)); Xenopus TFIIIA, ein Zink-Finger-Protein (Lee et al., J. Biol. Chem. 266, 16478 (1991)); sowie ribosomale E.-coli-Proteine (Wower et al., Biochemistry 27, 8114 (1988)). 5-Azidouracil und 8-Azidoadenin wurden in DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase oder terminaler Transferase inkorporiert. Proteine wurden auch photochemisch markiert, indem 8-Azidoadenosin-3',5'-biphosphat, gebunden an Rinder-Pankreas-Ribonuclease A (Wower et al., Biochemistry 28, 1563 (1989)), sowie 8-Azidoadenosin-5'-triphosphat, gebunden an Ribulose-Biphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Salvucci und Haley, Planta 181, 287 (1990)), angeregt wurden.
  • 8-Brom-2'-desoxyadenosin als potentielle photoreaktive Gruppe wurde durch das Phosphoramidit in DNA inkorporiert (Liu und Verdine, Tetrahedron Lett. 33, 4265 (1992)). Die photochemische Reaktivität muss erst untersucht werden.
  • Die Photovernetzung von 5-Ioduracil-substituierten Nucleinsäuren an assoziierte Proteine wurde zuvor noch nicht untersucht, wahrscheinlich da angenommen wurde, dass die Größe der Iod-Gruppe eine spezifische Bindung der Nucleinsäure an das Protein von Interesse ausschließt. Von 5-Iod-2'-desoxyuracil- und 5-Iod-2'-desoxyuridintriphosphat wurde jedoch gezeigt, dass sie eine Photobindung an Thymidinkinase aus E. coli zeigen (Chen und Prusoff, Biochemistry 16, 3310 (1977)).
  • Über mechanistische Studien der photochemischen Reaktivität des 5-Bromuracil-Chromophors wurde berichtet, umfassend Studien hinsichtlich der Photovernetzung. Am wichtigsten ist jedoch, dass BrU eine von der Wellenlänge abhängige Photochemie aufweist. Die Bestrahlung in der Region von 310 nm besetzt einen n,π*-Singulett-Zustand, der zum Grundzustand zerfällt, und das Intersystem geht in den Triplett-Zustand niedrigster Energie über (Dietz et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 1793 (1987)), am wahrscheinlichsten den π,π*-Triplett-Zustand (Rothman und Kearns, Photochem. Photobiol. 6, 775 (1967)). Der Triplett-Zustand reagiert mit elektronenreichen Aminosäure-Resten über den anfänglichen Elektronentransfer, gefolgt von Bildung einer kovalenten Bindung. Die Photovernetzung von Triplett-5-Bromuracil an die elektronenreichen aromatischen Aminosäurereste Tyrosin, Tryptophan und Histidin (Ito et al., J. Am. Chem. Soc. 102, 7535 (1980); Dietz und Koch, Photochem. Photobiol. 46, 971 (1987)) und die disulfidtragende Aminosäure Cystin (Dietz und Koch, Photochem. Photobiol. 49, 121 (1989)) wurde in Modell-Studien gezeigt. Sogar die Peptidbindung ist eine potentielle funktionale Gruppe für die Photovernetzung an Triplett-BrU (Dietz et al., s. o. (1987)). Etwas kürzere Wellenlängen als 308 nm besetzen sowohl den n,π*- als auch den π,π*-Singulett-Zustand. Das π,π*-Singulett erfährt eine Kohlenstoff-Brom-Bindungshomolyse sowie eine Intersystem-Kreuzung mit der Triplett-Kopie (Dietz et al., s. o. (1987)); es kann eine Intersystem-Kreuzung auftreten, teilweise durch interne Umwandlung in den n,π*-Singulett-Zustand.
  • Die Kohlenstoff-Brom-Bindungshomolyse führt wahrscheinlich zu Nucleinsäurestrang-Brüchen (Hutchinson und Köhnlein, Prog. Subcell. Biol. 7, 1 (1980); Shetlar, Photochem. Photobiol. Rev. 5, 105 (1980); Saito und Sugiyama, in: Bioorganic Photochemistry, Band 1: Photochemistry and the Nucleic Acids, 317–378, H. Morrison (Hrsg.), John Wiley and Sons, New York (1990)). Die von der Wellenlänge abhängige Photochemie wird in Jablonski-Diagramm in 2 skizziert, und die Modell-Photovernetzungsreaktionen werden in 3 gezeigt.
  • Die Position von Photovernetzungen aus der Bestrahlung mancher BrU-substituierter Nucleoproteinkomplexe wurde untersucht. Im lac-Repressor-BrdU-lac-Operator-Komplex wurde eine Vernetzung mit Tyrosin-17 erstellt (Allen et al., J. Biol. Chem. 266, 6113 (1991)). Im Archaebakterienchromosomen-Protein-MC1-BrdU-DNA-Komplex wurde eine Vernetzung mit Tryptophan-74 impliziert. Bei Hefe-BrdU-substituiertem DNA-GCN4-Hefe-Transkriptionsaktivator wurde von einer Vernetzung mit Alanin-238 berichtet (Blatter et al., s. o. (1992)). Bei diesem letzteren Beispiel wurde der Nucleoprotein-Komplex bei 254 nm bestrahlt, der anfänglich den π,π*-Singulett-Zustand besetzte.
  • Von den Resultaten mancher Reaktivitäts- und mechanistischer Studien bezüglich 5-Ioduracil-, 5-Iod-2'-desoxyuracil-, 5-Iod-2'-desoxyuracil-substituierter DNA sowie 5-Iod-2'-desoxycytosin-substituierter DNA wurde berichtet. 5-Ioduracil sowie 5-Iod-2'-desoxyuracil binden an der 5-Postion an Allylsilane, und zwar nach Bestrahlung in Acetonitril-Wasser mit überschüssigem Silan mit Emission aus einer Mitteldruck-Quecksilberlampe, die durch Pyrex-Glas gefiltert wird; es wurde vorgeschlagen, dass der Mechanismus durch anfängliche Kohlenstoff-Iod-Bindungshomolyse fortgeführt wird, gefolgt von radikaler Addition an die π-Bindung des Allylsilans (Saito et al., J. Org. Chem. 51, 5148 (1986)).
  • Aerobe und anaerobe Photo-Deiodierung von 5-Iod-2'-desoxyuracil-substituierter DNA wurde als eine Funktion der Anregungswellenlänge untersucht; die intrinsische Quanten-Ausbeute fällt um einen Faktor von 4 mit der Bestrahlung in der Region von 313 nm in Bezug auf die Quanten-Ausbeute mit Bestrahlung in der Region von 240 nm. Es wird vorgeschlagen, dass der Mechanismus bei allen Wellenlängen eine anfängliche Kohlenstoff-Iod-Bindungshomolyse umfasst (Rahn und Sellin, Photochem. Photobiol. 35, 459 (1982)). Auf ähnliche Art und Weise wird vorgeschlagen, dass eine Kohlenstoff-Iod-Bindungshomolyse nach Bestrahlung von 5-Iod-2'-desoxycytidin-substituierter DNA bei 313 nm auftritt (Rahn und Stafford, Photochem. Photobiol. 30, 449 (1979)). In keiner dieser Studien wurde rein monochromatisches Licht verwendet. Vor kurzem wurde gezeigt, dass eine 5-Ioduracil-substituierte Duplex-DNA einen photochemischen Einzelstrang-Bruch erfährt (Sugiyama et al., J. Am. Chem. Soc. 115, 4443 (1993)).
  • Im Hinblick auf die vorliegende Erfindung ebenfalls von Bedeutung ist die beobachtete direkte Population der Triplett-Zustände von 5-Bromuracil und 5-Ioduracil aus Bestrahlung der jeweiligen So → T-Absorptionsbanden in der Region von 350–400 nm (Rothman und Kearns, s. o. (1967)).
  • Photophysikalische Studien des 4-Thiouracil-Chromophors implizieren, dass es sich bei dem π,π*-Triplett-Zustand um den reaktiven Zustand handelt. Die Intersystem-Kreuzungs-Quantenausbeute ist eins oder liegt nahe bei eins. Obwohl eine Photovernetzung innerhalb von 4-Thiouracil-substituierten Nucleoproteinkomplexen beobachtet wurde, wurden Aminosäurereste, die mit angeregtem 4-Thiouracil reaktiv sind, nicht festgelegt (Favre, s. o. (1990)). Es wurde von der Addition der α-Aminogruppe von Lysin an angeregtes 4-Thiouracil an der 6-Position berichtet; von dieser Reaktion wird jedoch nicht erwartet, dass sie bei der Photovernetzung innerhalb von Nucleoproteinkomplexen von Bedeutung ist, da die α-Aminogruppe in eine Peptidbindung involviert ist (Ito et al., Photochem. Photobiol. 32, 683 (1980)).
  • Von der Photovernetzung von azidtragenden Nucleotiden oder Nucleinsäuren an assoziierte Proteine wird angenommen, dass sie über die Bildung des Singulett- und/oder Triplett-Nitrens fortgeführt wird (Bayley und Knowles, Methods Enzymol. 46, 69 (1977); Czarnecki et al., Methods Enzymol. 56, 642 (1979); Hanna et al., Nucleic Acids Res. 21, 2073 (1993)). Die Bildung einer kovalenten Bindung resultiert aus der Insertion des Nitrens in eine O-H-, N-H-, S-H- oder C-H-Bindung. Singulett-Nitrene insertieren sich vorzugsweise in Heteroatom-H-Bindungen und Triplett-Nitrene in C-H-Bindungen. Singulett-Nitrene können sich auch neu zu Azirinen anordnen, die zu nucleophilen Additionsreaktionen neigen. Falls eine nucleophile Stelle eines Proteins angrenzend ist, so kann eine Vernetzung auch über diesen Weg auftreten. Ein potentielles Problem bei der Verwendung einer funktionalen Azidgruppe entsteht, wenn sich diese an einer Ortho-Position zu einem Ring-Stickstoff befindet; das Azid existiert im Gleichgewicht mit einem Tetrazol, das viel weniger photoreaktiv ist.
  • Der Hüllprotein-RNA-Haarnadel-Komplex des R17-Bakteriophagen ist aufgrund der Einfachheit des Systems in vitro ein ideales System für die Studie der Nucleinsäure-Protein-Photovernetzung. Das System wurde gut beschrieben und besteht aus einem viralen Hüllprotein, das mit hoher Affinität an eine RNA-Haarnadel innerhalb des Phagengenoms bindet. In vivo spielt die Wechselwirkung des Hüllproteins mit der RNA-Haarnadel zwei Rollen während der Phagen-Infektion: das Hüllprotein dient als Translationsrepressor der Replicase-Synthese (Eggens und Nathans, J. Mol. Biol. 39, 293 (1969)), und der Komplex dient als eine Nucleationsstelle zur Enkapsidierung (Ling et al., Virology 40, 920 (1970); Beckett et al., J. Mol. Biol. 204, 939 (1988)). Viele Variationen der Wildtyp-Haarnadel-Sequenz binden auch an das Hüllprotein mit hoher Affinität (Tuerk & Gold, Science 249, 505 (1990); Gott et al., Biochemistry 30, 6290 (1991); Schneider et al., J. Mol. Biol. 228, 862 (1992)).
  • Die Selektion von Nucleinsäureliganden gemäß dem SELEX-Verfahren kann auf eine Reihe an Wegen erreicht werden, z. B. basierend auf physikalischen Merkmalen. Die Selektion auf der Grundlage physikalischer Merkmale kann die physikalische Struktur, die elektrophoretische Mobilität, die Löslichkeit sowie das Abtrennungsverhalten umfassen. Die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 07/960.093 ( WO 94/09158 ), eingereicht am 14. Oktober 1992, mit dem Titel Method for Selecting Nucleic Acids an the Basis of Structure, hierin spezifisch durch Verweis aufgenommen, beschreibt die Selektion von Nucleinsäuresequenzen auf der Basis spezifischen elektrophoretischen Verhaltens. Das SELEX-Verfahren kann auch zusammen mit anderen Selektionsverfahren, z. B. HPLC, Säulenchromatographie, chromatographischen Verfahren allgemein, Löslichkeit in einem bestimmten Lösungsmittel oder Abtrennung zwischen zwei Phasen, verwendet werden.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Selektion und Identifikation von Nucleinsäureliganden aus einem geeigneten Gemisch randomisierter Nucleinsäuresequenzen auf der Basis der Fähigkeit der randomisierten Nucleinsäuresequenzen, an ein Target-Molekül zu binden und/oder zu photovernetzen. Diese Ausführungsform wird allgemein Kovalente SELEX genannt und spezifisch PhotoSELEX, wenn Bestrahlung erforderlich ist, um eine kovalente Bindung zwischen dem Nucleinsäureliganden und dem Target zu bilden.
  • In einer Variation dieser Ausführungsform umfasst das Verfahren die Herstellung eines geeigneten Gemisches an Nucleinsäuresequenzen, die photoreaktive Gruppen enthalten; das Kontaktieren des geeigneten Gemisches mit einem Targetmolekül, worin Nucleinsäuresequenzen mit erhöhter Affinität zum Targetmolekül das Targetmolekül binden, wodurch Nucleinsäure-Targetmolekül-Komplexe gebildet werden; das Bestrahlen des Nucleinsäure-Targetmolekül-Gemisches, worin manche in Nucleinsäure-Targetmolekül-Komplexe inkorporierte Nucleinsäuren mit dem Targetmolekül über die photoreaktiven funktionalen Gruppen eine Vernetzung eingehen; das Nutzen der kovalenten Bindung zur Teilung der vernetzten Nucleinsäure-Targetmolekül-Komplexe von freien Nucleinsäuren in dem geeigneten Gemisch; sowie das Identifizieren der Nucleinsäuresequenzen, die mit dem Targetmolekül photovernetzt wurden. Das Verfahren kann weiters den sich wiederholenden Schritt der Amplifikation der Nucleinsäuren umfassen, die eine Photovernetzung mit dem Targetmolekül eingegangen sind, um ein Gemisch an Nucleinsäuren zu ergeben, die an Sequenzen angereichert sind, die zu einer Photovernetzung an das Targetmolekül in der Lage sind.
  • In einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäureliganden für ein Targetmolekül, das durch SELEX ausgewählt wurde, weiter auf ihre Fähigkeit, eine Vernetzung mit dem Target einzugehen, selektiert. Nucleinsäureliganden für ein Targetmolekül, das keine photoreaktiven Gruppen enthält, werden anfänglich durch das SELEX-Verfahren identifiziert. Photoreaktive Gruppen werden anschließend in diese ausgewählten Nucleinsäureliganden inkorporiert, und die Liganden werden mit dem Targetmolekül in Kontakt gebracht. Die Nucleinsäure-Targetmolekül-Komplexe werden bestrahlt, und jene, die zu einer Photovernetzung mit dem Targetmolekül in der Lage sind, werden identifiziert.
  • In einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden photoreaktive Gruppen in alle möglichen Positionen in den Nucleinsäuresequenzen des geeigneten Gemisches inkorporiert. 5-Ioduracil und 5-Iodcytosin können z. B. an allen Uracil- und Cytosin-Positionen substituiert werden. Die erste Selektionsrunde wird mit Bestrahlung der Nucleinsäure-Targetmolekül-Komplexe durchgeführt, so dass die Selektion für jene Nucleinsäuresequenzen auftritt, die zu einer Photovernetzung mit dem Targetmolekül in der Lage sind. Anschließend wird SELEX mit jenen Nucleinsäuresequenzen durchgeführt, die zu einer Photovernetzung mit dem Targetmolekül in der Lage sind, um Photovernetzungssequenzen zu selektieren, die am besten in der Lage sind, das Targetmolekül zu binden.
  • In einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden mittels SELEX für eine Anzahl an Runden in Abwesenheit von Bestrahlung Nucleinsäuresequenzen selektiert, die photoreaktive Gruppen enthalten, was zu einem geeigneten Gemisch mit einer partiell verstärkten Affinität für das Targetmolekül führt. PhotoSELEX wird anschließend mit Bestrahlung durchgeführt, um Liganden zu selektieren, die zu einer Photovernetzung mit dem Targetmolekül in der Lage sind.
  • In einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird SELEX bis zur Vollendung mit Nucleinsäuresequenzen, die keine photoreaktiven Gruppen enthalten, und Nucleinsäureliganden für das ausgewählte Targetmolekül durchgeführt. Basierend auf den Sequenzen der ausgewählten Liganden wird eine Familie verwandter Nucleinsäuresequenzen erzeugt, die eine einzelne photoreaktive Gruppe an jeder Nucleotidposition enthält. PhotoSELEX wird durchgeführt, um einen Nucleinsäureliganden auszuwählen, der in der Lage ist, eine Photovernetzung mit dem Targetmolekül einzugehen.
  • In einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mittels SELEX, PhotoSELEX oder einer Kombination dieser Verfahren ein Nucleinsäureligand ausgewählt, der in der Lage ist, die Bioaktivität eines Targetmoleküls durch Bindung und/oder Vernetzung an ein Targetmolekül zu modifizieren.
  • In einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Nucleinsäureligand für ein einzigartiges Targetmolekül identifiziert, das mit einem spezifischen Krankheitsprozess assoziiert ist. In noch einer weiteren Variation dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Nucleinsäureligand für ein Targetmolekül, das mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, verwendet, um die Krankheit in vivo zu behandeln.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiters Nucleinsäuresequenzen, die photoreaktive Gruppen enthalten. Die Nucleinsäuresequenzen können einzelne oder mehrfache photoreaktive Gruppen enthalten. Weiters können die photoreaktiven Gruppen dieselben oder andere sein in einer einzelnen Nucleinsäuresequenz. Die in die Nucleinsäuren der Erfindung inkorporierten photoreaktiven Gruppen umfassen eine beliebige chemische Gruppe, die in der Lage ist, nach Bestrahlung eine Vernetzung mit einem Targetmolekül zu bilden. Trotz allem kann es sein, dass in manchen Fällen eine Bestrahlung nicht notwendig sein muss, damit es zu einer Vernetzung kommt.
  • Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen einzel- und doppelsträngige RNA und einzel- und doppelsträngige DNA. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können modifizierte Gruppen enthalten, wie z. B. 2'-Amino-(2'-NH2-) oder 2'-Fluor-(2'-F-)modifizierte Nucleotide. Die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung können weiters Hauptketten-Modifikationen umfassen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiters das Verfahren, worin geeignete Gemische, die modifizierte Nucleinsäuren enthalten, hergestellt werden und im SELEX-Verfahren verwendet werden, weiters werden Nucleinsäureliganden identifiziert, welche die Targetspezies binden oder vernetzen. In einem Beispiel dieser Ausführungsform besteht das geeignete Gemisch aus Nucleinsäuren, wobei alle Uracil-Reste durch 5-halogenierte Uracil-Reste ersetzt sind, und Nucleinsäureliganden werden identifiziert, die kovalente Bindungen mit dem ausgewählten Target bilden.
  • Ebenso offenbart und Solution-SELEX genannt werden mehrere verbesserte Verfahren zur Abtrennung zwischen Liganden mit Nucleinsäure-Target-Komplexen mit hoher und niedriger Affinität, was in Lösung und ohne oder vor Verwendung einer Abtrennungsmatrix erreicht wird. Allgemein ist ein zentrales Thema des Verfahrens von Solution-SELEX, dass das geeignete Nucleinsäuregemisch in Lösung behandelt wird und während der PCR zu einer bevorzugten Amplifikation der Nucleinsäureliganden der höchsten Affinität oder katalytischer RNAs führt. Das Solution-SELEX-Verfahren erreicht eine Abtrennung zwischen Nucleinsäure-Target-Komplexen hoher und niedriger Affinität durch eine Reihe von Verfahren, umfassend (1) die Primer-Extensions inhibierung, die zu differenzierbaren cDNA-Produkten führt, so dass die Liganden mit der höchsten Affinität während der PCR selektiv amplifiziert werden können. Die Primer-Extensionsinhibierung wird mit der Verwendung von Nucleinsäure-Polymerasen erreicht, umfassend DNA- oder RNA-Polymerasen, reverse Transkriptase und Qβ-Replicase. (2) Exonuclease-Hydrolyse-Inhibierung, die ebenfalls nur zu den Liganden mit der höchsten Affinität führt, die während der PCR amplifizieren. Dies wird durch die Verwendung einer beliebigen doppelsträngigen 3' → 5'-Exonuclease erreicht. (3) Linear-zu-Kreis-Bildung zur Erzeugung differenzierbarer cDNA-Moleküle, die während der PCR zur Amplifikation nur der Liganden mit der höchsten Affinität führen.
  • In einer Ausführungsform des Solution-SELEX-Verfahrens wird die Synthese von cDNAs, die Oligonucleotiden mit geringer Affinität entsprechen, vorzugsweise blockiert und dadurch mittels PCR nicht amplifizierbar gemacht. In einer weiteren Ausführungsform werden Oligonucleotide mit geringer Affinität vor der PCR-Amplifikation vorzugsweise mittels Affinitätssäulenchromatographie entfernt. Alternativ dazu können Oligonucleotide mit hoher Affinität vorzugsweise mittels Affinitätssäulenchromatographie entfernt werden. In einer weiteren Ausführungsform des SELEX-Verfahrens werden cDNAs, die den Oligonucleotiden hoher Affinität entsprechen, vorzugsweise resistent gegen Nucleaseenzymverdau gemacht. In einer weiteren Ausführungsform werden cDNAs, die den Oligonucleotiden niedriger Affinität entsprechen, vorzugsweise enzymatisch oder chemisch abbaubar gemacht.
  • Solution-SELEX ist eine Verbesserung gegenüber Abtrennungs-Schemata nach dem Stand der Technik. Die Abtrennung wird erreicht, ohne irrtümlicherweise auch Liganden auszuwählen, die nur Affinität für die Abteilungsmatrix besitzen, die Geschwindigkeit und die Genauigkeit der Abtrennung wird erhöht, und das Verfahren kann leicht automatisiert werden.
  • Die vorliegende Offenbarung stellt nicht einschränkende Beispiele bereit, die der Veranschaulichung und als Beispiel der Erfindung dienen. Andere Abtrennungs- Schemata und Verfahren der Selektion von Nucleinsäureliganden durch Bindung und Photovernetzung an ein Targetmolekül werden für den Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt Strukturen photoreaktiver Chromophore, die in Nucleinsäuren inkorporiert wurden.
  • 2 zeigt ein Jablonski-Energieniveau-Diagramm für den 5-Bromuracil-Chromophor und die Reaktivität der verschiedenen angeregten Zustände.
  • 3 zeigt die Modellreaktionen für die Photovernetzung des 5-Bromuracil-Chromophors an Aminosäurereste, wie z. B. Tyrosin, Tryptophan, Histidin und Cystin.
  • 4 vergleicht die UV-Absorption durch Thymidin, 5-Bromuracil, 5-Ioduracil und L-Tryptophan in TMK-Puffer, pH 8,5 (100 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, 10 mM Magnesiumacetat und 80 mM Kaliumchlorid). Die Emissionswellenlängen der XeCl- und HeCd-Laser sind ebenfalls angegeben. Von besonderer Bedeutung ist die Absorption durch 5-Ioduracil bei 325 nm ohne Absorption durch Tryptophan oder Thymidin. Der molare Extinktionskoeffizient für 5-Ioduracil bei 325 nm liegt bei 163 l/mol·cm.
  • 5 zeigt Strukturen photoreaktiver Chromophore, die in randomisierte Nucleinsäuresequenzen inkorporiert werden können.
  • 6 zeigt die Strukturen von Haarnadel-RNA-Sequenzen, und zwar von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1), RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) und RNA-3 (Seq.-ID Nr. 3), enthaltend 5-Bromuracil, 5-Ioduracil bzw. Uracil. Dies sind Varianten der Wildtyp-Haarnadel des R17-Bakteriophagen-Genoms, die eng an das R17-Hüllprotein binden.
  • 7 zeigt Bindungskurven für RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1), RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) und RNA-3 (Seq.-ID Nr. 3) an R17-Hüllprotein. Die von den Bindungskurven berechneten Bindungskonstanten werden ebenfalls dargestellt.
  • 8 zeigt den Prozentsatz von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) und RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2), photovernetzt an R17-Hüllprotein, mit monochromatischer Bestrahlung bei 308 nm aus einem XeCl-Excimer-Laser als eine Funktion der Zeit. Die Photovernetzung von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) wies aufgrund von kompetitivem Photoschaden des Hüllproteins während der Bestrahlungsperiode bei 40% ein Maximum auf. Weniger Photoschaden des Hüllproteins trat aufgrund der kürzeren Bestrahlungszeit bei RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) auf.
  • 9 zeigt den Prozentsatz von RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2), photovernetzt an R17-Hüllprotein, mit monochromatischer Bestrahlung bei 325 nm aus einem HeCd-Laser als eine Funktion der Zeit. Die Daten sind auch im ursprünglichen elektrophoretischen Gelformat dargestellt. Das Symbol IU XL markiert RNA, die mit Protein vernetzt ist. Eine beinahe quantitative Ausbeute der Photovernetzung wurde erhalten.
  • 10 zeigt den Prozentsatz von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) und RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2), photovernetzt mit R17-Hüllprotein, mit Breitbandbestrahlung in der Region von 312 nm aus einem Transilluminator als eine Funktion der Zeit. Es wurden aufgrund des Photoschadens des Proteins und möglicherweise der RNA-Sequenzen weniger als quantitative Ausmaße an Photovernetzung erhalten.
  • 11 zeigt die Bildung desselben Produkts, Struktur 6, aus Bestrahlung bei 308 nm von 5-Ioduracil und 5-Bromuracil in Gegenwart von überschüssigem N-Acetyltyrosin-N-ethylamid (Struktur 5).
  • 12 zeigt die Photovernetzung von RNA-7 (Seq.-ID Nr. 4) an R17-Hüllprotein mit 308 nm Licht, gefolgt von enzymatischem Verdau des größten Teils des Hüllproteins.
  • 13 zeigt die Bildung einer komplementären DNA aus der RNA-Matrize nach enzymatischem Verdau des Hüllproteins aus 12 (Seq.-ID Nr. 4).
  • 14 zeigt das Polyacrylamidgel aus Beispiel 8, welches die Produktion einer cDNA aus einer RNA-Matrize darstellt, die modifizierte Nucleotide trägt, wie in 12 und 13 dargestellt. Die modifizierten Nucleotide waren 5-Ioduracil und Uracil, das an der 5-Position mit einem kleinen Peptid substituiert war. Basierend auf Modellstudien, die in 11 dargestellt sind, band das Peptid über den Phenolring eines Tyrosinrests mit der größten Wahrscheinlichkeit an das Uracil.
  • 15 zeigt die Photovernetzung von [α-32P]-GTP-markierter Pool-RNA an HIV-1-Rev-Protein unter Verwendung von tRNA-Konkurrenz.
  • 16 (Seq.-ID Nr. 5–55) zeigt die Sequenz des zuvor identifizierten RNA-Liganden zu HIV-1-Rev-Protein, die hierin als 6a (Seq.-ID Nr. 5) bezeichnet wird. Es werden auch 52 Sequenzen aus Runde 13 gezeigt, die zur Photovernetzung an HIV-1-Rev-Protein ausgewählt wurden.
  • 17 (Seq.-ID Nr. 56–57) zeigt den Konsensus für Klasse-1-Liganden und Klasse-2-Liganden. Klasse 1: sekundäre Konsensus-Struktur für Klasse-1- und Klasse-2-Moleküle. N1-N1' zeigt 1–2 komplementäre Basenpaare; N2-N2' zeigt 1–4 komplementäre Basenpaare, D-H' ist ein A-U-, U-A- oder G-C-Basenpaar; K-M' ist ein G-C- oder U-A-Basenpaar (16). Klasse 2: Fettgedruckte Sequenzen zeigen die hochgradig konservierten 10 Nucleotide, die Klasse-2-Moleküle beschreiben; die Basenpaarung erfolgt mit dem fixierten 5'-Ende des Moleküls.
  • 18 (Seq.-ID Nr. 58) zeigt die Sequenz und die prognostizierte Sekundärstruktur von trunc2 (A). Es wird auch (B) ein Gel gezeigt, das die Spezifität der trunc2-Photovernetzung an ARM-Proteine zeigt.
  • 19 zeigt die Sequenz und die prognostizierte Sekundärstruktur von trunc24 (Seq.-ID Nr. 59) (A). Es wird auch (B) ein Gel gezeigt, das die Spezifität der laserunabhängigen Vernetzung an ARM-Proteine zeigt.
  • 20 zeigt die photounabhängige trunc24-Vernetzung (Seq.-ID Nr. 59) mit HIV-1-Rev in Gegenwart menschlicher Kern-Extrakte.
  • 21 zeigt das zyklische Verhältnis zwischen SELEX-Schritten. Ein einzelsträngiges Nucleinsäure-Repertoire an geeigneten Oligonucleotiden wird durch etablierte Verfahren auf einem Nucleinsäure-Synthesegerät erzeugt und mittels PCR amplifiziert, um eine Population doppelsträngiger DNA-Moleküle zu erzeugen. Geeignete DNA- oder RNA-Moleküle werden durch asymmetrische PCR bzw. Transkription erzeugt, gereinigt, und es wird ihnen ermöglicht, mit einem Targetmolekül zu komplexieren. Darauf folgt das Abtrennen von gebundenen und ungebundenen Nucleinsäuren, Synthese von cDNA und PCR-Amplifikation, um doppelsträngige DNA zu erzeugen.
  • 22 zeigt eine Ausführungsform des Solution-SELEX-Verfahrens, bei der die Primer-Extensionsinhibierung verwendet wird, um differenzierbare cDNA-Pools zu erzeugen – ein amplifizierbarer Oligonucleotid-cDNA-Pool hoher Affinität und ein nicht amplifizierbarer Oligonucleotid-cDNA-Pool niedriger Affinität. In dieser Ausführungsform wird die erste cDNA-Extension in Gegenwart von Kettenabbruch-Nucleotiden, wie z. B. ddG, durchgeführt. Nach der Entfernung des Targetmoleküls und der Didesoxynucleotide wird die zweite cDNA-Extension in Gegenwart von vier dNTPs durchgeführt. cDNA voller Länge wird vorzugsweise aus den Oligonucleotiden hoher Affinität synthetisiert, und dadurch wird der cDNA-Pool hoher Affinität im darauf folgenden PCR-Schritt amplifiziert.
  • 23 zeigt den zyklischen Solution-SELEX-Prozess für die in 22 dargestellte Ausführungsform.
  • 24 zeigt eine Ausführungsform des zyklischen Solution-SELEX-Prozesses, worin das Trennen von Oligonucleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Targetmolekül mittels Restriktionsenzymverdau erreicht wird. In dieser Ausführungsform wird die erste cDNA-Extension mit vier dNTPs erreicht und führt zu cDNAs, die den Oligonucleotiden geringer Affinität entsprechen. Das Target wird anschließend entfernt, und eine zweite cDNA-Extension wird in Gegenwart modifizierter Nucleotide durchgeführt, die gegenüber enzymatischem Verdau resistent sind. Die cDNA-Pools werden anschließend mit Restriktionsenzym inkubiert, und nur der cDNA-Pool, der den Oligonucleotiden hoher Affinität entspricht, ist im darauf folgenden PCR-Schritt amplifizierbar.
  • 25 zeigt eine Ausführungsform des zyklischen Solution-SELEX-Prozesses, worin das Trennen von Oligonucleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Targetmolekül mittels Affinitätschromatographie erreicht wird. Die erste cDNA-Extension wird in Gegenwart eines modifizierten Nucleotids, wie z. B. eines biotinylierten Nucleotids, durchgeführt, das es dem cDNA-Pool, der dem Oligonucleotid niedriger Affinität entspricht, ermöglicht, auf einer Affinitätssäule zurückgehalten zu werden.
  • 26 zeigt eine Ausführungsform des Solution-SELEX-Prozesses, worin das Trennen von Oligonucleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Targetmolekül mittels Exonuclease-Inhibierung erreicht wird und zur Bildung einer doppelsträngigen Nucleinsäure-Population mit hoher Affinität für das Targetmolekül führt.
  • 27 zeigt eine Ausführungsform des Solution-SELEX-Prozesses, worin katalytische Nucleinsäuren ausgewählt und isoliert werden.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine Variation des SELEX-Verfahrens zur Auswahl von Nucleinsäureliganden. Das Verfahren einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, genannt Kovalente SELEX oder PhotoSELEX, identifiziert und se lektiert Nucleinsäureliganden, die in der Lage sind, Targetmoleküle zu binden und/oder zu photovernetzen.
  • Diese Anmeldung stellt auch ein Verfahren zur verbesserten Abtrennung von Nucleinsäureliganden bereit, die mittels SELEX-Verfahren identifiziert wurden.
  • In seiner grundlegendsten Form kann das SELEX-Verfahren durch die folgende Serie an Schritten definiert werden:
    • 1) Ein geeignetes Nucleinsäuregemisch mit sich unterscheidender Sequenz wird hergestellt. Das geeignete Gemisch umfasst im Allgemeinen Regionen fixierter Sequenzen (d. h. jedes der Mitglieder des geeigneten Gemisches enthält dieselben Sequenzen an derselben Position) sowie Regionen randomisierter Sequenzen. Die Regionen fixierter Sequenzen werden entweder selektiert: a) um die unten stehend beschriebenen Amplifikationsschritte zu unterstützen; b) um eine Sequenz zu imitieren, von der bekannt ist, dass sie an das Target bindet; oder c) um das Potential einer gegebenen strukturellen Anordnung der Nucleinsäuren in dem geeigneten Gemisch zu verstärken. Die randomisierten Sequenzen können vollständig randomisiert werden (d. h. die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer beliebigen Position zu finden, liegt bei eins zu vier) oder nur partiell randomisiert werden (z. B. kann die Wahrscheinlichkeit, eine Base an einer beliebigen Position zu finden, in einem beliebigen Ausmaß zwischen 0 und 100 Prozent ausgewählt werden).
    • 2) Das geeignete Gemisch wird mit dem ausgewählten Target unter Bedingungen kontaktiert, die für die Bindung zwischen dem Target und Mitgliedern des Kandidatengemisches günstig sind. Unter diesen Umständen kann die Wechselwirkung zwischen dem Target und den Nucleinsäuren des geeigneten Gemisches als Bildung von Nucleinsäure-Target-Paaren zwischen dem Target und den Nucleinsäuren mit der stärksten Affinität für das Target angesehen werden.
    • 3) Die Nucleinsäuren mit der höchsten Affinität für das Target werden von jenen Nucleinsäuren mit geringerer Affinität für das Target abgetrennt. Da nur eine besonders kleine Anzahl an Sequenzen (und möglicherweise nur ein Nucleinsäuremolekül), die den Nucleinsäuren höchster Affinität entspricht, im geeigneten Gemisch existiert, ist es im Allgemeinen wünschenswert, die Abtrennungskriterien so festzulegen, dass eine signifikante Menge der Nucleinsäuren im geeigneten Gemisch (etwa 5–10%) während der Abtrennung zurückbehalten wird.
    • 4) Jene Nucleinsäuren, die während der Abtrennung als die relativ gesehen höhere Affinität an das Target aufweisenden ausgewählt werden, werden anschließend amplifiziert, um ein neues geeignetes Gemisch zu erzeugen, das bezüglich der Nucleinsäuren mit einer relativ gesehen höheren Affinität für das Target angereichert ist.
    • 5) Durch Wiederholen der oben genannten Abtrennungs- und Amplifikationsschritte enthält das neu gebildete geeignete Gemisch weniger und weniger einzigartige Sequenzen, und das durchschnittliche Ausmaß der Affinität des Nucleinsäuregemisches für das Target nimmt im Allgemeinen zu. Im Extremfall ergibt das SELEX-Verfahren ein geeignetes Gemisch, das eine oder eine kleine Anzahl einzigartiger Nucleinsäuren enthält, welche jene Nucleinsäuren aus dem ursprünglichen geeigneten Gemisch mit der höchsten Affinität zum Targetmolekül darstellen.
  • Die SELEX-Patentanmeldungen beschreiben und erklären dieses Verfahren sehr ausführlich. Inkludiert sind Targets, die in diesem Verfahren verwendet werden können; Verfahren zur Herstellung des anfänglichen geeigneten Gemisches; Verfahren zur Abtrennung von Nucleinsäuren innerhalb eines geeigneten Gemisches; sowie Verfahren zur Amplifikation abgetrennter Nucleinsäuren, um angereicherte geeignete Gemische zu erzeugen. Die SELEX-Patentanmeldungen beschreiben auch Ligandenlösungen, die für eine Reihe von Target-Spezies erhalten wurden, unter anderem beide Protein-Targets, worin das Protein ein Nucleinsäurebindungsprotein ist und nicht ist.
  • Abtrennung bedeutet einen beliebigen Prozess, worin Liganden, die an Targetmoleküle gebunden sind, von Nucleinsäuren getrennt werden können, die nicht an Targetmoleküle gebunden sind. Noch weiter gefasst, ermöglicht die Abtrennung die Trennung aller Nucleinsäuren in einem geeigneten Gemisch in zumindest zwei Pools, basierend auf ihrer relativen Affinität zum Targetmolekül.
  • Die Abtrennung kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Nucleinsäure-Protein-Paare können an Nitrocellulosefilter gebunden werden, während dies bei ungebundenen Nucleinsäuren nicht der Fall ist. Säulen, die spezifisch Nucleinsäure-Target-Komplexe zurückbehalten, können zur Abtrennung verwendet werden. Oligonucleotide, die in der Lage sind, mit einem Targetmolekül zu assoziieren, das auf einer Säule gebunden ist, ermöglichen z. B. die Verwendung einer Säulenchromatographie zur Abtrennung und Isolation der Nucleinsäureliganden mit der höchsten Affinität. Die Flüssig-Flüssig-Abtrennung kann ebenso wie auch die Filtrationsgel-Retardation und die Dichtegradienten-Zentrifugierung verwendet werden.
  • I. PhotoSELEX
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Nucleinsäureliganden, die Targetmoleküle binden, photovernetzen und/oder photodeaktivieren. Die Bindung, wie hierin beschrieben, bezieht sich im Allgemeinen auf die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Liganden und dem Target, obwohl eine solche Bindung nicht notwendigerweise irreversibel ist. Gewisse Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung enthalten photoreaktive Gruppen, die in der Lage sind, mit dem Targetmolekül nach Bestrahlung mit Licht eine Photovernetzung einzugehen. Zusätzliche Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung sind zu einer Bindungsbildung mit dem Target in Abwesenheit von Bestrahlung in der Lage.
  • In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung Nucleinsäureliganden, die einzel- oder doppelsträngige RNA- oder DNA-Oligonucleotide sind. Die Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung können photoreaktive Gruppen enthalten, die zu einer Vernetzung mit dem ausgewählten Targetmolekül bei Bestrahlung mit Licht in der Lage sind. Weiters umfasst die vorliegende Erfindung Nucleinsäureliganden, die eine beliebige Modifikation davon enthalten. Ein Verweis auf eine photoreak tive Gruppe hierin kann einfach auf eine relativ einfache Modifikation eines natürlichen Nucleinsäurerests verweisen, die dem Nucleinsäurerest eine erhöhte Reaktivität oder Photoreaktivität verleiht. Solche Modifikationen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Modifikationen an exozyklischen Cytosin-Aminen, Substitution mit halogenierten Gruppen, z. B. 5'-Brom- oder 5'-Iod-Uracil, Modifikation an der 2'-Position, z. B. 2'-Amino-(2'-NH2-) und 2'-Fluor-(2'-F-)Hauptkettenmodifikationen, Methylierungen, ungewöhnliche Basenpaarungskombinationen und dergleichen. Die Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung können z. B. modifizierte Nucleotide umfassen, wie z. B. 2'-NH2-Ioduracil, 2'-NH2-Iodcytosin, 2'-NH2-Iodadenin, 2'-NH2-Bromuracil, 2'-NH2-Bromcytosin und 2'-NH2-Bromadenin.
  • In einer Ausführungsform des PhotoSELEX-Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird eine randomisierte Gruppe an Nucleinsäuresequenzen, die photoreaktive Gruppen enthalten, genannt geeignetes Gemisch, mit einer Menge des Targetmoleküls gemischt, und es wird ihr ermöglicht, eine Gleichgewichtsbindung mit dem Targetmolekül aufzubauen. Das Nucleinsäure-Targetmolekül-Gemisch wird anschließend mit Licht bestrahlt, bis die Photovernetzung abgeschlossen ist, wie mittels Polyacrylamidgelelektrophorese angezeigt. Nur manche jener Nucleinsäuren, die eng an die Targetmoleküle binden, gehen eine wirksame Vernetzung mit dem Target ein.
  • Das geeignete Gemisch der vorliegenden Erfindung besteht aus Nucleinsäuresequenzen mit randomisierten Regionen, umfassend chemisch reaktive oder eine photoreaktive Gruppe oder Gruppen. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich vorzugsweise um modifizierte Nucleinsäuren. Die Nucleinsäuren des geeigneten Gemisches umfassen vorzugsweise einen randomisierten Sequenzabschnitt sowie konservierte Sequenzen, die für eine wirksame Amplifikation notwendig sind. Der variable Sequenzabschnitt kann eine vollständige oder teilweise Zufallssequenz enthalten, er kann auch Unter-Abschnitte einer konservierten Sequenz enthalten, die in die randomisierten Sequenzregionen inkorporiert sind.
  • Jedes Oligonucleotidmitglied des geeigneten Gemisches enthält vorzugsweise zumindest eine chemisch reaktive oder photoreaktive Gruppe. Weiters kann jedes Oli gonucleotidmitglied des geeigneten Gemisches an jeder Position partiell oder vollständig durch modifizierte Nucleotide substituiert sein, die reaktive Gruppen enthalten. Das geeignete Gemisch kann auch aus Oligonucleotiden bestehen, die mehr als einen Typ einer reaktiven Gruppe enthalten.
  • Die durch die Nucleinsäureliganden der vorliegenden Erfindung gebundenen und/oder photovernetzten Targetmoleküle sind normalerweise Proteine und werden basierend auf ihrer Rolle bei Krankheit und/oder Toxizität ausgewählt. Beispiele sind Enzyme, für die ein Inhibitor gewünscht wird, oder Proteine, deren Detektion gewünscht wird. Das Targetmolekül kann jedoch eine beliebige Verbindung von Interesse sein, für die ein Ligand gewünscht wird. Ein Targetmolekül kann ohne Einschränkung ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glykoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Virus, Substrat, Metabolit, Übergangszustand-Analogon, Cofaktor, Inhibitor, Arzneimittel, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor etc. sein.
  • Eine photoreaktive Gruppe für den Zweck dieser Anmeldung ist vorzugsweise ein modifiziertes Nucleotid, das einen Photochromophor enthält und in der Lage ist, mit einer Target-Spezies zu photovernetzen. Obwohl hierin als photoreaktive Gruppen bezeichnet, ist in manchen Fällen, wie unten stehend beschrieben, Bestrahlung nicht notwendig, damit es zu einer kovalenten Bindung zwischen dem Nucleinsäureliganden und dem Target kommt. Die photoreaktive Gruppe absorbiert vorzugsweise Licht in einem Spektrum der Wellenlänge, das nicht vom Target oder den nicht-modifizierten Abschnitten des Oligonucleotids absorbiert wird. Diese Erfindung umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, Oligonucleotide, die eine photoreaktive Gruppe enthalten, die aus Folgendem ausgewählt ist: 5-Bromuracil (BrU), 5-Ioduracil (IU), 5-Bromvinyluracil, 5-Iodvinyluracil, 5-Azidouracil, 4-Thiouracil, 5-Bromcytosin, 5-Iodcytosin, 5-Bromvinylcytosin, 5-Iodvinylcytosin, 5-Azidocytosin, 8-Azidoadenin, 8-Bromadenin, 8-Iodadenin, 8-Azidoguanin, 8-Bromguanin, 8-Iodguanin, 8-Azidohypoxanthin, 8-Bromhypoxanthin, 8-Iodhypoxanthin, 8-Azidoxanthin, 8-Bromxanthin, 8-Iodxanthin, 5-Bromdesoxyuridin, 8-Brom-2'-desoxyadenin, 5-Iod-2'-desoxyuracil, 5-Iod-2'-desoxycytosin, 5-[(4-Azidophenacyl)thio]cytosin, 5-[(4-Azidophenacyl)thio]uracil, 7- Deaza-7-iodadenin, 7-Deaza-7-iodguanin, 7-Deaza-7-bromadenin und 7-Deaza-7-bromguanin (5). In einer Ausführungsform sind die photoreaktiven Gruppen 5-Bromuracil (BrU) und 5-Ioduracil (IU).
  • Die photoreaktiven Gruppen der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, bei Bestrahlung eines assoziierten Nucleinsäure-Target-Paars Bindungen mit den Target-Spezies zu bilden. Das assoziierte Paar wird hierin als ein Nucleoprotein-Komplex bezeichnet, und in manchen Fällen ist eine Bestrahlung für das Auftreten einer Bindungsbildung nicht erforderlich. Die Photovernetzung, die typischerweise auftritt, besteht in der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der assoziierten Nucleinsäure und dem Target. Es kann jedoch bei Bestrahlung auch eine enge ionische Wechselwirkung zwischen der Nucleinsäure und dem Target auftreten.
  • In einer Ausführungsform tritt die Photovernetzung aufgrund von elektromagnetischer Bestrahlung auf. Elektromagnetische Bestrahlung umfasst ultraviolettes Licht, sichtbares Licht, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen. 5-Halogen-substituierte Desoxyuracile und Desoxycytosine sensibilisieren Zellen bekanntermaßen für ionisierende Strahlung (Szybalski, Cancer Chemother. Rep. 58, 539 (1974)).
  • Vernetzungsexperimente haben gezeigt, dass eine genaue Nebeneinanderstellung von entweder IU oder BrU und einem Tyrosin, Tryptophan oder Histidin für eine hohe Ausbeute an Vernetzung erforderlich ist. Die vorliegende Erfindung profitiert von dieser Erkenntnis mit einer Selektion für Vernetzungsmoleküle mit zufällig inkorporierten photoreaktiven Gruppen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die photoreaktiven Gruppen 5-Bromuracil (BrU) oder 5-Ioduracil (IU) mittels T7-Polymerase-Transkription in RNA inkorporiert, wobei das 5-Halogenuridintriphosphat anstelle von Uridintriphosphat vorhanden ist. Die Inkorporation wird unter Verwendung eines Gemisches aus 5-Halogenuridintriphosphat und Uridintriphosphat oder nur 5-Halogenuridintriphosphat erhalten. Eine randomisierte Reihe 32P- oder 33P-markierter oder unmarkierter RNA-Sequenzen wird aus einer randomisierten Reihe an DNA-Matrizen erhalten, synthetisiert unter Verwendung von Standardverfahren.
  • Die randomisierte Reihe an RNA-Oligonucleotiden, die BrU oder IU enthalten, wird mit einer Menge eines Targetproteins gemischt. Der photoreaktive Chromophor wird zufällig als BrU oder IU anstelle von Uracil unter Verwendung von Standardverfahren in RNA inkorporiert. Das RNA-Targetprotein-Gemisch wird mit nahem ultraviolettem Licht im Bereich von 300 bis 325 nm bestrahlt, bis die Photovernetzung beendet ist. Nur jene photoreaktiven Gruppen neben einem reaktiven Aminosäurerest in einem Nucleoprotein-Komplex bilden eine kovalente Bindung mit dem Protein. Angeregtes BrU oder IU kehrt in den Grundzustand zurück, es sei denn, es befindet sich in der Nähe einer reaktiven funktionalen Gruppe, wie z. B. einem oxidierbaren Aminosäure-Rest. Aminosäurereste, von denen gefunden wurde, dass sie reaktiv mit dem niedrigsten Triplett-Zustand von 5-Bromuracil sind, umfassen Tyrosin, Tryptophan, Histidin und Cystin (siehe 3). Andere mit potentieller Reaktivität, basierend auf mechanistischen Studien, sind Phenylalanin, Methionin, Cystein, Lysin und Arginin.
  • Nucleoprotein-Komplexe, die keine Vernetzungen bilden, können durch Anpassen des Reaktionsmediums, wie z. B. durch Denaturierung mit Hitze und/oder Salz, leicht zerstört werden. Nucleinsäuren, die kovalent an das Protein gebunden sind, können von anderen freien Nucleinsäuren auf einem Nitrocellulosefilter oder durch andere Abtrennungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, getrennt werden. Alternativverfahren zur Trennung von Nucleinsäuren, die kovalent an Targets gebunden sind, von freien Nucleinsäuren umfassen Gelelektrophorese gefolgt von Elektroelution, Präzipitation, differentieller Löslichkeit und Chromatographie. Für einen Fachmann hängt das ausgewählte Verfahren zumindest teilweise vom Targetmolekül von Interesse ab. Die vernetzten Nucleinsäuren werden aus dem Nitrocellulose-Filter durch Verdau des Proteinmaterials mit Enzymen, wie z. B. Proteinase K, freigesetzt. Zu diesem Zeitpunkt werden 5-Halogenuracilgruppen, die eine Vernetzung mit dem Targetprotein eingegangen sind, an eine einzelne Aminosäure oder an ein kurzes Peptid gebunden. Die Fähigkeit zum Hindurchlesen von reverser Transkriptase wird durch die Inkorporation eines Substituenten an der 5-Position von Uracil nicht beeinflusst, da die reverse Transkriptase (RT) die 5-Position von Uracil von jener von Thymin nicht unterscheidet. Die Derivatisierung der 5-Position wurde verwendet, um Gruppen, die so groß wie Biotin sind, in RNA-Moleküle zu inkorporieren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Target aus der selektierten photovernetzten Nucleinsäure mittels Photo- oder chemischer Dissoziation entfernt.
  • Komplementäre Nucleinsäurekopien der selektierten RNA-Sequenzen werden mit einem geeigneten Primer hergestellt. Die cDNA wird mit einer DNA-Polymerase und einem zweiten Primer amplifiziert. 5-Halogen-2'-desoxyuracil wird in den DNA-Synthese- und Amplifikationsschritten nicht verwendet. Die amplifizierten DNAs werden anschließend unter Verwendung von 5-Halogenuridintriphosphat anstelle von Uridintriphosphat in demselben oder einem anderen Verhältnis von 5-Halogenuridin zu Uridin im geeigneten Gemisch zu RNA-Sequenzen transkribiert.
  • Für die darauf folgende Runde von PhotoSELEX wird es den partiell ausgewählten RNA-Sequenzen erneut ermöglicht, mit einer Menge des Targetproteins zu komplexieren.
  • Anschließend werden die Nucleoprotein-Komplexe im Bereich von 300–325 nm bestrahlt. RNA-Sequenzen, die eine Vernetzung mit dem Protein eingegangen sind, werden erneut von RNA-Sequenzen getrennt, die keine Vernetzung eingegangen sind. cDNAs werden hergestellt und amplifiziert, und eine dritte Reihe an RNA-Sequenzen, die 5-Halogenuracil enthält, wird hergestellt. Der Zyklus wird fortgesetzt, bis er mit einem oder mehreren RNA-Liganden konvergiert, die mit hoher Affinität binden und eine Photovernetzung mit dem Targetprotein eingehen. Eine Verkürzung der Bestrahlungszeit in späteren Zyklen kann die Selektion weiter verbessern. Die cDNAs der ausgewählten RNA-Liganden werden amplifiziert, gelgereinigt und sequenziert. Alternativ dazu können die RNA-Sequenzen direkt sequenziert werden. Die selektierten RNA-Sequenzen werden anschließend aus der auf geeignete Art und Weise synthetisierten DNA-Matrize transkribiert, erneut unter Verwendung von 5-Halogenuridintriphosphat anstelle von Uridintriphosphat (Beispiel 11).
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird PhotoSELEX auf Oligonucleotidsequenzen durchgeführt, die aufgrund ihrer Fähigkeit, das Target-Molekül zu binden, vorselektiert wurden (Beispiel 12). SELEX wird anfänglich mit O ligonucleotiden durchgeführt, die keine photoreaktiven Gruppen enthalten. Der RNA-Ligand wird durch Substitution photoreaktiver Nucleinsäure-Nucleotide an spezifischen Stellen im Liganden in einen photoreaktiven Liganden transformiert. Die photochemisch aktiven Permutationen des anfänglichen Liganden können durch eine Reihe von Ansätzen entwickelt werden, wie z. B. spezifische Substitution oder partielle Zufallsinkorporation der photoreaktiven Nucleotide. Die spezifische Substitution umfasst die Synthese einer Reihe von Oligonucleotiden, wobei die Position des photoreaktiven Nucleotids händisch verändert wird. Die Position der Substitution wird basierend auf den erhältlichen Daten bezüglich der Bindung des Liganden an das Targetmolekül gesteuert. Substitutionen werden z. B. am anfänglichen Liganden in Gebieten des Moleküls durchgeführt, von denen bekannt ist, dass sie mit dem Targetmolekül Wechselwirken. Für anschließende Selektionsrunden wird das PhotoSELEX-Verfahren verwendet, um auf die Fähigkeit zu selektieren, nach Bestrahlung mit dem Targetmolekül zu vernetzen.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäureliganden mittels PhotoSELEX gefolgt von SELEX ausgewählt. PhotoSELEX wird anfänglich mit Oligonucleotidsequenzen durchgeführt, die photoreaktive Gruppen enthalten. Sequenzen, die auf ihre Fähigkeit, eine Vernetzung mit dem Targetmolekül einzugehen, selektiert werden, werden anschließend auf ihre Fähigkeit selektiert, das Targetmolekül durch das SELEX-Verfahren zu binden (Beispiel 13).
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine eingeschränkte Selektion von Oligonucleotiden durch SELEX von einer Selektion durch PhotoSELEX gefolgt (Beispiel 14). Die anfänglichen SELEX-Selektionsrunden werden mit Oligonucleotiden durchgeführt, die photoreaktive Gruppen enthalten. Nach einer Reihe von SELEX-Runden wird PhotoSELEX durchgeführt, um Oligonucleotide auszuwählen, die in der Lage sind, das Targetmolekül zu binden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäureliganden, die durch SELEX identifiziert werden, einer eingeschränkten Randomisierung unterzogen, gefolgt von einer Selektion durch PhotoSELEX (Beispiel 15). SELEX wird zuerst bis zur Vollendung mit Nucleinsäuresequenzen durchgeführt, die keine photoreaktiven Gruppen enthalten. Die Sequenz des Nucleinsäureliganden wird verwendet, um eine Familie an Oligonucleotiden durch eingeschränkte Randomisierung zu erzeugen. PhotoSELEX wird anschließend durchgeführt, um einen Nucleinsäureliganden zu selektieren, der in der Lage ist, an das Targetmolekül zu photovernetzen.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird PhotoSELEX verwendet, um einen Nucleinsäureliganden zu identifizieren, der in der Lage ist, die biologische Aktivität eines Targetmoleküls zu modifizieren (Beispiel 16).
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das PhotoSELEX-Verfahren diagnostisch angewandt, um einzigartige Proteine zu identifizieren, die mit spezifischen Erkrankungszuständen assoziiert sind (Beispiel 17). In noch einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in vivo Nucleinsäureliganden, die in der Lage sind, ein Targetmolekül, das mit einem spezifischen Krankheitszustand assoziiert ist, zu vernetzen, um an das Targetmolekül zu vernetzen, als ein Verfahren zur Behandlung des Krankheitszustandes verwendet (Beispiel 18 und 19).
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden RNA-Liganden, die von PhotoSELEX identifiziert werden, verwendet, um die Gegenwart des Targetproteins durch Bindung des Proteins und anschließendes Photovernetzen an das Protein zu detektieren. Die Detektion kann durch Inkorporieren von 32P- oder 33P-Markierungen erreicht werden sowie durch Detektion von Material, das von einem Nitrocellulosefilter durch Szintillationszählung zurückbehalten wird, oder durch Detektion von Material, das korrekt auf einem elektrophoretischen Gel mit einem photographischem Film migriert. Alternativ dazu erzeugt PhotoSELEX einen fluoreszierenden Chromophor, der mittels Fluoreszenzemissionsspektroskopie detektiert wird. Die Fluoreszenzemission der Reaktionsprodukte von 5-Bromuracil an Modellpeptide (wie in 3 gezeigt) wurde von Dietz und Koch, s. o. (1987), beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine fluoreszierende Markierung kovalent an die RNA gebunden und mittels Fluoreszenzemissionsspektroskopie detektiert. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden RNA-Liganden, die mittels Photo-SELEX ausgewählt werden, verwendet, um das Targetprotein durch denselben Prozess zu inhibieren. In noch einer weiteren Ausführungsform wird der photoselektierte Ligand an einen Träger gebunden und verwendet, um ein Target kovalent einzufangen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird 5-Ioduracil in die RNA-Sequenzen des geeigneten Gemisches inkorporiert, und Licht im Bereich von 320–325 nm wird für die Bestrahlung verwendet. Diese Kombination stellt eine regionselektive Photovernetzung des 5-Halogenuracil-Chromophors an das Targetprotein ohne andere nicht spezifische Photoreaktionen sicher. Insbesondere Tryptophan-Reste von Protein und Thymin- und Uracil-Basen von Nucleinsäuren sind bekanntermaßen photoreaktiv. Wie in 4 dargestellt, absorbiert 5-Ioduracil bei 325 nm, Tryptophan und die Standard-Nucleinsäurebasen tun dies jedoch nicht. Der molare Extinktionskoeffizient für 5-Ioduracil bei 325 nm liegt bei 163 l/mol·cm. Monochromatisches Licht im Bereich von 320–325 nm wird vorzugsweise von einem frequenzverdoppelten abstimmbaren Farbstofflaser bereitgestellt, der bei 320 nm emittiert, oder einem Helium-Cadmium-Laser, der bei 325 nm emittiert.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Xenonchlorid-(XeCl-)Excimer-Laser, der bei 308 nm emittiert, für die Photovernetzung von 5-Ioduracil-tragenden RNA-Sequenzen an ein Targetprotein verwendet. Bei diesem Laser wird innerhalb ein paar Minuten Bestrahlungszeit eine hohe Ausbeute der Photovernetzung von Nucleoprotein-Komplexen erreicht.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Photovernetzung von 5-Ioduracil-tragenden RNA-Sequenzen an ein Targetprotein mit wellenlängengefilterter 313-nm-Hochdruck-Quecksilberlampenemission oder mit Niederdruck-Quecksilberlampen-Emission bei 254 nm erreicht, die von einem Leuchtstoff absorbiert wird und im Bereich von 300–325 nm erneut emittiert wird. Die letztere Emission wird ebenfalls vorsichtig einer Wellenlängenfilterung unterzogen, um Licht mit 254 nm, das vom Leuchtstoff nicht absorbiert wird, sowie Licht im Bereich von 290–305 nm zu entfernen, welches das Protein beschädigen könnte.
  • In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Photovernetzung von BrU- oder IU-tragenden RNA-Sequenzen an ein Targetprotein mit Licht im Bereich von 350–400 nm erreicht, welches den Triplett-Zustand vom Grundzustand direkt besetzt. Monochromatisches Licht aus der dritten Harmonischen eines Neodymium-YAG-Lasers bei 355 nm oder der ersten Harmonischen eines Xenonfluorid-(XeF-)Excimer-Lasers bei 351 nm können diesbezüglich besonders nützlich sein.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden die photoreaktiven Nucleotide in einzelsträngige DNAs inkorporiert und direkt mit dem oder ohne das photoreaktive(n) Nucleotidtriphosphat amplifiziert.
  • A. Kovalente SELEX und Nucleinsäureliganden, die mit und ohne Bestrahlung an HIV-1-Rev-Protein binden.
  • Das zur Veranschaulichung von PhotoSELEX ausgewählte Targetprotein ist Rev von HIV-1. Die Rev-Aktivität in vivo stammt von seiner Assoziation mit dem Rev-reagierenden Element (RRE), einer hochgradig strukturierten Region in der viralen HIV-1-RNA. Vorangehende RNA-SELEX-Experimente mit Rev haben die Isolierung von RNA-Liganden mit sehr hoher Affinität ermöglicht. Der Ligand mit der höchsten Affinität, der als „6a" (Seq.-ID Nr. 5) bekannt ist, besitzt einen Kd-Wert von etwa 1 nM und ist in 16 dargestellt. Die Sekundärstruktur von 6a und seine Wechselwirkung mit Rev wurden bereits ausführlich beschrieben.
  • Die Konstruktion der Nucleinsäure-Bibliothek für PhotoSELEX basierte auf der Rev-6a-Sequenz (Seq.-ID Nr. 5). Während der Synthese der Desoxyoligonucleotid-Matrizen für SELEX wurde die Zufallsregion der Matrize durch eine Region „beeinflusster Randomisierung" substituiert, in der das Verhältnis der vier Eingabe-Basen positiv für die entsprechende Base in der 6a-Sequenz beeinflusst war. (Die tatsächlichen Verhältnisse lagen bei 62,5:12,5:12,5:12,5.) Falls die 6a-Base für eine be stimmte Position z. B. G ist, so liegt das Basen-Eingabe-Gemisch für diesen Syntheseschritt bei 62,5% G und 12,5% der anderen drei Basen.
  • Das photoreaktive Uracil-Analogon 5-Ioduracil (iU), das verwendet wurde, um regionsspezifische Vernetzungen mit hoher Ausbeute zwischen einzeln substituierten iU-Nucleinsäuren und Proteintargets zu erzeugen (Willis et al., Science 262, 1255 (1993)), wurde für dieses Beispiel verwendet. Der iU-Chromophor ist unter langwelliger ultravioletter Strahlung reaktiv und kann durch denselben Mechanismus wie 5-Bromuracil eine Photobindung mit den aromatischen Aminosäuren von Proteintargets eingehen (Dietz et al., J. Am. Chem. Soc. 109, 1793 (1987)). Wie oben stehend beschrieben, ist das Target dieser Studie das HIV-1-Rev-Protein, das für die produktive Infektion des Virus (Feinberg et al., Cell 46, 807 (1986)) und die Expression der viralen Strukturgene gag, pol und env (Emerman et al., Cell 57, 1155 (1989)) erforderlich ist. Die Wechselwirkung von Rev mit RNA-Liganden hoher Affinität wurde ausführlich beschrieben. Eine einzige Stelle hoher Affinität innerhalb des RRE (der IIB-Stamm) wurde identifiziert (Heaphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7366 (1991)). In vitro durchgeführte Experimente genetischer Selektion haben RNA-Liganden erzeugt, die mit hoher Affinität an Rev binden, und haben bei der Bestimmung der strukturellen RNA-Elemente geholfen, die für Rev:RNA-Wechselwirkungen notwendig sind (Bartel et al., Cell 67, 529 (1991); Tuerk et al., In the Polymerase Chain Reaction (1993); Jensen et al., J. Mol. Biol. 235, 237 (1994)).
  • Eine DNA-Oligonucleotid-Bibliothek „beeinflusster Randomisierung", basierend auf der Rev-Ligand-Sequenz hoher Affinität 6a (Seq.-ID Nr. 5), enthält etwa 1014 einzigartige Sequenzen. Diese Matrize wurde für die In-vitro-T7-Transkription mit 5-iUTP verwendet, um vollständig substituierte iU-RNA für die Selektion zu erzeugen. Das PhotoSELEX-Verfahren wechselte zwischen Affinitätsselektion für Rev unter Verwendung von Nitrocellulose-Abtrennung und monochromatischer UV-Bestrahlung der Nucleoprotein-Komplexe mit denaturierender Polyacrylamidgel-Abtrennung der vernetzten Komplexe weg von nicht vernetzten RNA-Sequenzen. Das letzte Verfahren verwendete eine gleichzeitig erfolgende Selektion auf Affinität und Vernetzung unter Verwendung von Konkurrenten-tRNA. Jede Runde stellt eine Selektion dar, ge folgt von der Umwandlung gewonnener RNA in cDNA, Polymerase-Kettenreaktion-(PCR-)Amplifikation der DNA und In-vitro-Transkription zur Erzeugung eines neuen Pools an iU-RNA. Um RNAs zu amplifizieren, die als kovalente Nucleoprotein-Komplexe gewonnen wurden, wurde das geeignete Gel-Stück isoliert und mit Proteinase K behandelt.
  • Der RNA-Pool wurde zuerst drei Runden an Affinitätsselektion mit Rev-Protein mit Abtrennung der Sequenzen höherer Affinität durch Nitrocellulose-Filter unterzogen. Als Nächstes wurde der sich entwickelnde RNA-Pool einer UV-Laser-Bestrahlung in Gegenwart von überschüssigem Rev-Protein unterzogen, um jenen RNA-Sequenzen mit der Fähigkeit, mit dem Protein zu vernetzen, die Möglichkeit zu geben, dies zu tun. Vernetzte RNA-Sequenzen wurden anschließend unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) abgetrennt. Diese vernetzten RNAs wurden aus dem Gelmaterial gewonnen, das gebundene Rev-Protein wurde durch Verdau entfernt, und die RNAs wurden für die cDNA-Synthese und für die weitere Amplifikation für die nächste Runde PhotoSELEX verwendet. Ein 308-nm-XeCl-Excimer-Laser wurde für die erste Runde der Photovernetzung verwendet; danach wurde ein 325-nm-HeCd-Laser verwendet.
  • Nach vier Runden an Selektion auf laserinduzierte Vernetzung wurde der RNA-Pool erneut drei Runden Affinitätsselektion unterzogen. Schließlich wurde der RNA-Pool zur selben Zeit auf seine Fähigkeit selektiert, Rev mit hoher Affinität zu binden und das Protein zu vernetzen. Dies wurde unter Verwendung hoher Konzentrationen eines nicht spezifischen Nucleinsäure-Konkurrenten in der Photovernetzungsreaktion erreicht.
  • Das vernetzte Produkt nahm vom Ausgangs-Pool bis zu Runde 13 etwa um das 30fache zu (15). Unter diesen Bedingungen wird die größte Zunahme der Vernetzung mit der größten Zunahme der Affinität, und zwar von Runde 7 bis Runde 10, in Korrelation gebracht.
  • Nach 13 Selektionsrunden wurden die PCR-Produkte kloniert, und 52 Isolate wurden sequenziert (16, Seq.-ID Nr. 5–55). Klasse-1-Moleküle, die 77% der Gesamtsequenzen umfassen, enthalten ein besonders hochgradig konserviertes Motiv, 5'KDAACAN...N'UGUUH'M'3' (Seq.-ID Nr. 56) (17). Computerfaltungs-Algorithmen prognostizieren, dass dieses konservierte Motiv basengepaart ist und in einer Stamm-Schleifen-Struktur liegt. Die Unterklassen a–d (16, Seq.-ID Nr. 5–43) zeigen unterschiedliche Strategien, die in dem Pool „beeinflusster Randomisierung" verwendet werden, um das Konsensus-Motiv zu erhalten. Klasse-2-Moleküle zeigen eine hochgradig konservierte 10-Basen-Sequenz (17, Seq.-ID Nr. 57), von der prognostiziert wird, dass sie sich mit der fixierten 5'-Region der RNA faltet und eine Struktur bildet, die sich entweder vom Klasse-1- oder vom 6a-Motiv (Seq.-ID Nr. 5) unterscheidet. Alle Klasse-1-Sequenzen zeigen eine zweiphasige Bindung an Rev, wobei die Dissoziationskonstanten hoher Affinität (Kds) von 1–10 nM reichen. Klasse-2-Sequenzen zeigen eine einphasige Bindung an Rev, wobei die Kds etwa von 30–50 nM reichen. Eine Analyse von Runde-13-Sequenzen zeigt, dass die Häufigkeit der Konsensus-Motive für Klasse-1- und Klasse-2-Populationen im Ausgangspool sehr gering war, und manche einzelnen Sequenzen kamen nur durch Mutationsdruck des PhotoSELEX-Verfahrens zustande.
  • Das Vernetzungsverhalten weist zwischen den beiden Klassen Unterschiede auf. Bei hohen Rev-Konzentrationen (500 nM) und einer Bestrahlung von 325 nm von 4 min produzieren Klasse-2-Moleküle eine höhere Vernetzungsausbeute und -wirksamkeit als Klasse-1-Moleküle (Daten nicht dargestellt); dieses Verhalten ermöglicht es den Klasse-2-Molekülen wahrscheinlich, mit relativ geringer Affinität für Rev im Rahmen der PhotoSELEX-Verfahren zu konkurrieren. Bei Klasse-1-Molekülen führen längere Bestrahlungszeiten zu vernetzten Spezies mit höherem Molekulargewicht. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass die RNAs, die sowohl eine entwickelte Bindungsdomäne für Rev als auch die fixierten Regionen, die für die Amplifikation in SELEX erforderlich sind, enthalten, in der Lage sind, mehr als ein Rev-Molekül pro RNA zu binden. Da jede RNA durchschnittlich 21 iU-Basen enthält (RNA-Länge – 86 Basen), wird angenommen, dass es eine gewisse Wahllosigkeit der Photoreaktion gibt, die bei hohen Proteinkonzentrationen eine Vernetzung einer einzelnen RNA mit mehr als einem Rev-Molekül ermöglicht. Klasse-2-Moleküle produzieren nach der Photovernetzung weniger Spezies mit hohem Molekulargewicht; sie weisen durchschnittlicherweise geringe iU-Werte auf und können Strukturen enthalten, die keine Bindung/Vernetzung an zusätzliche Rev-Moleküle ermöglichen.
  • Die Analyse einzelner Runde-13-RNAs zeigte, dass eine Subpopulation ohne Laser-Bestrahlung an Rev vernetzen konnte. Daher zeigte die einzige Reihe an Experimenten, dass sowohl kovalente SELEX ohne Bestrahlung als auch PhotoSELEX mit Bestrahlung in demselben System angetroffen werden können. 4 von 15 analysierten Runde-13-Sequenzen vernetzen ohne Laser-Bestrahlung (16). Von diesen wenigen Sequenzen war es nicht leicht möglich, ein Sequenzmotiv zu identifizieren, das eine laserunabhängige Vernetzung verleiht, obwohl alle bis heute in Betracht gezogenen Moleküle zu der 1a-Unterklasse gehören.
  • Um die laserabhängige und die laserunabhängige Vernetzung (LD-XL bzw. LI-XL) weiter zu untersuchen und um die sekundären Photoprodukte zu vermeiden, die mit Klasse-1-Molekülen voller Länge gebildet werden, wurden mehrere kleine RNAs konstruiert, die nur die weiterentwickelten Sequenzen enthielten. Trunc2 und trunc24 (18 und 19) (Seq.-ID Nr. 58 und 59) basieren auf den Klonen Nr. 3 bzw. Nr. 24 und zeigen eine einphasige Bindung an Rev mit Kds von 0,5 nM (trunc2) und 20 nM (trunc24). Trunc2 (18) zeigt LD-XL-Verhalten, und trunc24 (19) ist sowohl zu LI-XL als auch zu LD-XL in der Lage.
  • Um die Konformation und die chemischen Erfordernisse für LD-XL und LI-XL zu erforschen, wurden Vernetzungsreaktionen mit trunc2 (Seq.-ID Nr. 58) und trunc24 (Seq.-ID Nr. 59) und mehreren Proteinen des argininreichen Motivs (ARM) durchgeführt. Die Klasse an RNA-Bindungsproteinen umfasst das Targetprotein, HIV-1-Rev, sowie auch HIV-1-Tat und das hochgradig ähnliche HIV-2-Rev. LD-XL-Reaktionen mit trunc2 (18, Seq.-ID Nr. 58) zeigen, dass trunc2 in der Lage ist, sowohl an HIV-1- als auch an HIV-2-Rev-Proteine spezifisch zu vernetzen, jedoch nicht an HIV-1-Tat. Die zwei leicht unterschiedlich migrierenden Nucleoprotein-Komplexe vertreten wahrscheinlich die Fähigkeit von trunc2, eines von zwei iU-Nucleotiden zu ver wenden, um die Rev-Proteine zu vernetzen. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, wird vorgeschlagen, dass ein in den hochgradig ähnlichen ARMs beider Rev-Proteine vorhandener Tryptophanrest jene Aminosäure ist, die für die spezifische Photovernetzung RNA-Liganden hoher Affinität der Erfinder notwendig ist.
  • Trunc24-LI-XL (19, Seq.-ID Nr. 59), durchgeführt mit denselben Proteinen, zeigt nur mit HIV-1-Rev eine Vernetzung. Wie trunc3 kann trunc24 mit HIV-2-Rev photovernetzen (Daten nicht dargestellt). Es wurde ebenfalls beobachtet, dass diese LI-Vernetzung unter hochgradig denaturierenden Bedingungen oder mit einer hohen Konzentration an Nucleinsäure-Konkurrenten reversibel ist. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, führen diese Beobachtungen zu der Postulierung, dass LI-XL durch ein Michael-Addukt zwischen der 6-Position eines IU- und eines Cystein-Rests oder möglicherweise eine 5-Positions-Substitutionsreaktion fortschreitet. Diese Postulierung stimmt sowohl mit der Beobachtung überein, dass iU leichter als U einer Michael-Addukt-Bildung unterzogen wird, als auch mit der Tatsache, dass HIV-1-Rev drei Cysteine enthält, während HIV-2-Rev keines enthält.
  • Um auf die Fähigkeit von trunc24 (Seq.-ID Nr. 59) zu testen, um HIV-1-Rev in einem komplexen Gemisch zu unterscheiden, wurden trunc24 und 10 μg menschlicher Fibroblasten-Kernextrakt zusammen mit abnehmenden Mengen an HIV-1-Rev (20) gemischt. Bei 50 nM Rev und einem 1:100-Gewichtsverhältnis von Rev zu Kernextrakt war es möglich, ein sehr signifikantes vernetztes Produkt zwischen trunc24 und Rev zu sehen. Kernextrakte und trunc24 alleine führten zu keinen vernetzten Produkten.
  • Beispiel 1 beschreibt die Synthese von Haarnadel-RNA-Oligonucleotiden RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1), RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) und RNA-3 (Seq.-ID Nr. 3) unter Verwendung von 5-Bromuridintriphosphat, 5-Ioduridintriphosphat bzw. Uridintriphosphat. Experimente, welche die RNA-Protein-Bindungskurven für RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1), RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) und RNA-3 (Seq.-ID Nr. 3) an das Bakteriophagen-R17-Hüllprotein bestimmen, werden in Beispiel 2 beschrieben. Beispiel 3 beschreibt die Photovernetzung der RNA-Oligonucleotide an das R17-Hüllprotein. Der Aminosäurerest des R17-Hüllproteins, das durch RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) nach der Beleuchtung durch einen Xenonchlorid-(XeCl-)Excimer-Laser bei 308 nm photovernetzt ist, wird in Beispiel 4 beschrieben. Beispiel 5 beschreibt die Photovernetzung von ioduracilsubstituierter RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) an das R17-Hüllprotein durch monochromatische Emission bei 325 nm. Beispiel 6 beschreibt die Photovernetzung von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) und RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) an das R17-Hüllprotein, die nach Breitbandemissionsbeleuchtung mit einem Transilluminator erreicht wird. Beispiel 7 beschreibt die Photoreaktion von 5-Ioduracil mit N-Acetyltyrosin-N-ethylamid, das eine Photovernetzung zu ergeben schien, die jener ähnelte, die mit 5-bromuracil-substituierten Nucleinsäuren an assoziierte Proteine erreicht wurde. Die Herstellung einer cDNA aus einer RNA, die mit dem R17-Hüllprotein photovernetzt ist, wird in Beispiel 8 beschrieben. Beispiel 9 beschreibt die Photovernetzung eines IC-substituierten RNA-Liganden an das R17-Hüllprotein.
  • Beispiel 10 beschreibt die Inkorporation von halogenierten Nucleotiden in DNA. Beispiele 11–15 beschreiben PhotoSELEX-Arbeitsvorschriften, die verwendet werden können, um spezifische photoreaktive Nucleinsäureliganden herzustellen. Beispiel 11 beschreibt ein kontinuierliches PhotoSELEX-Verfahren. Beispiel 12 beschreibt ein Verfahren, bei dem Nucleinsäureliganden, die anfänglich durch SELEX ausgewählt wurden, anschließend durch PhotoSELEX auf die Fähigkeit selektiert wurden, an das Targetmolekül zu vernetzen. Beispiel 13 beschreibt eine Ausführungsform, in der Nucleinsäureliganden, die durch PhotoSELEX identifiziert wurden, anschließend einer Selektion durch SELEX unterzogen werden und auf die Fähigkeit, das Targetmolekül zu binden, selektiert werden. Beispiel 14 beschreibt eine weitere Ausführungsform, worin eine eingeschränkte SELEX-Selektion von einer Selektion durch Photo-SELEX gefolgt wird. Beispiel 15 beschreibt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der Nucleinsäureliganden, die durch SELEX identifiziert wurden, einer eingeschränkten Randomisierung unterzogen werden, gefolgt von einer Selektion durch PhotoSELEX. Beispiel 16 beschreibt ein Verfahren zur Selektion eines Nucleinsäureliganden, der in der Lage ist, die biologische Aktivität eines Targetmoleküls zu modifizieren. Beispiel 17 beschreibt ein Diagnoseverfahren, das die SELEX- und PhotoSELEX-Verfahren verwendet, um Proteine zu identifizieren, die mit spezifischen Krankheitsprozessen assoziiert sind.
  • Beispiel 18 beschreibt ein Verfahren zur In-vivo-Behandlung von Krankheiten durch PhotoSELEX. Ein PhotoSELEX-selektierter Nucleinsäureligand, der in der Lage ist, an ein Targetmolekül zu binden und zu vernetzen, das mit einem Krankheitszustand assoziiert ist, wird auf eine Vielzahl an Wegen, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, in einen Patienten eingeführt. Der PhotoSELEX-Ligand kann z. B. vorübergehend oder konstitutiv in den geeigneten Zellen eines Patienten mit der Krankheit exprimiert werden. Alternativ dazu kann der PhotoSELEX-Ligand in die Zellen eines Patienten als eine doppelsträngige DNA eingebracht werden, die in der Zelle in Gegenwart von iodiertem Cytosin transkribiert wird. Iodiertes Cytosin kann dem Patienten verabreicht werden, gefolgt von einer Bestrahlung mit Röntgenstrahlen. IC, das in den in den geeigneten Zellen synthetisierten Nucleinsäureliganden inkorporiert ist, ermöglicht es dem Liganden, das Targetmolekül zu vernetzen und zu deaktivieren. Weitere Verfahren zur Einführung des PhotoSELEX-Liganden in einen Patienten umfassen die Liposomenanlieferung des halogenierten Liganden in die Zellen eines Patienten.
  • Beispiel 20 beschreibt die Produktion von modifizierten Nucleinsäureliganden, die mit oder ohne Bestrahlung mit dem HIV-1-Rev-Protein vernetzen. 15 zeigt die Resultate der Vernetzung mit dem Großteil des geeigneten Gemisches bei verschiedenen SELEX-Runden. rd1 – Runde-1-Pool-RNA; rd7 – Runde-7-Pool-RNA; rd10 – Runde-10-Pool-RNA; rd13 – Runde-13-Pool-RNA; rd13/PK, photovernetzte Runde-13-Pool-RNA, proteinase-K-behandelt (35 μl einer 100-μl-Reaktion wurden in 0,5% SDS, 50 μg/ml Proteinase K und 1 mM EDTA bei 65°C eine Stunde lang inkubiert); rd13/no-iU – Runde-13-Pool-RNA, transkribiert mit UTP (kein iU). R – freie RNA; XL – vernetzter Nucleoprotein-Komplex.
  • 16 zeigt die Sequenzen, die nach 13 Runden SELEX sequenziert sind (Seq.-ID Nr. 5–55). Die Sequenzen werden angeordnet, um eine maximale Homologie mit der 6a-Sequenz zu erreichen (Seq.-ID Nr. 5). Unterstreichungen stellen eine potentielle Basenpaarung dar, wie von Computer-RNA-Faltungsalgorithmen angegeben. Strichlierte Unterstreichungen stellen das 6a-Liganden-„Bubble"-Motiv dar. Sequenzen, die von Unterstreichungen flankiert sind, stellen entweder Schleifen- oder Ausbuchtungsregionen dar. Gedankenstriche werden gesetzt, um die Anordnung mit 6a zu maximieren. * gibt an, dass zwei Isolate erhalten wurden. + zeigt eine laserunabhängige Vernetzung an, und – zeigt das Fehlen laserunabhängiger Vernetzung an HIV-1-Rev. 17 (Seq.-ID Nr. 56–57) zeigt den Konsensus für Klasse-1- und Klasse-2-Liganden. 18 und 19 zeigen die Sequenz von Trunc2 (Seq.-ID Nr. 58) und Trunc24 (Seq.-ID Nr. 59) sowie die Spezifitäts-Resultate. 500 nM Protein, 20 μg tRNA und etwa 1 nM kinasierte trunc2-RNA wurden 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert und 4 Minuten lang bei 325 nm bestrahlt. t2 – trunc2-RNA bestrahlt ohne hinzugefügtes Protein; t2Rev1/O' – trunc2-RNA, HIV-1-Rev-Protein und 0 min Bestrahlung; t2/Rev1/4' – trunc2-RNA, HIV-1-Rev-Protein und 4 min Bestrahlung; t2/Rev1/4'/PK – trunc2-RNA, HIV-1-Rev-Protein, 4 min Bestrahlung und Proteinase K, behandelt wie in 1; t2/Rev2/4' – trunc2-RNA, HIV-2-Rev-Protein und 4 min Bestrahlung; t2/Tat/4' – trunc2-RNA, HIV-1-Tat-Protein und 4 min Bestrahlung; R – freie RNA; XL – vernetzter Nucleoprotein-Komplex. 20 zeigt die photounabhängige trunc24-Vernetzung mit HIV-1-Rev in Gegenwart von menschlichem Kernextrakt.
  • II. Solution-SELEX
  • Die folgende Beschreibung von „Solution-SELEX" stellt keinen Teil der von diesem Patent beanspruchten Erfindung dar, ist jedoch für das Verständnis der beanspruchten Erfindung von Nutzen.
  • Diese Offenbarung stellt mehrere verbesserte Verfahren zur Trennung von Oligonucleotiden mit hoher und niedriger Affinität für ein Targetmolekül dar. Das Verfahren besitzt mehrere Vorteile gegenüber Abtrennungsverfahren nach dem Stand der Technik: (1) es ermöglicht die Isolation von Nucleinsäureliganden für das Target ohne ebenfalls Nucleinsäureliganden für die Abtrennungsmatrix zu isolieren; (2) es er höht die Geschwindigkeit und die Genauigkeit, mit der das geeignete Oligonucleotidgemisch gescreent wird; und (3) das Solution-SELEX-Verfahren kann in einem einzigen Teströhrchen durchgeführt werden, wodurch eine Automatisierung des Abtrennungsschritts ermöglicht wird.
  • Die für das Verfahren erforderlichen Materialien und Techniken werden allgemein in molekularbiologischen Laboratorien verwendet. Sie umfassen die Polymerasekettenreaktion (PCR), RNA- oder DNA-Transkription, Zweitstrang-DNA-Synthese sowie Nuclease-Verdau. In der Praxis stehen die Verfahren miteinander auf zyklische Art und Weise in Verbindung, wie in 21 dargestellt.
  • Im SELEX-Verfahren, beschrieben von Tuerk und Gold, Science 249, 1155 (1990), und veranschaulicht in 21, wird ein einzelsträngiges geeignetes Nucleinsäuregemisch durch etablierte Verfahren auf einem Nucleinsäure-Synthesegerät erzeugt und mit dNTP und Klenow-Fragment inkubiert, um eine Population doppelsträngiger DNA-Matrizen zu erzeugen. Die doppelsträngige DNA oder die RNA, die daraus transkribiert wird, wird gereinigt und mit einem Targetmolekül in Kontakt gebracht. RNA-Sequenzen mit erhöhter Affinität zum Targetmolekül bilden Nucleinsäure-Target-Komplexe. Dies wird von der Abtrennung gebundener und ungebundener Nucleinsäuren gefolgt sowie von der Trennung des Targetmoleküls von den gebundenen Nucleinsäuren. cDNA wird von den Nucleinsäuren mit verstärkter Affinität und doppelsträngiger DNA, die durch PCR-Amplifikation erzeugt wurde, synthetisiert. Der Zyklus wird wiederholt, bis die Komplexität des geeigneten Gemisches verringert wurde und seine Affinität sowie die Spezifität zum Target maximiert wurde.
  • Ein neues Merkmal des Solution-SELEX-Verfahrens ist jenes Mittel, durch das die gebundenen und freien Mitglieder des geeigneten Nucleinsäuregemisches abgetrennt werden. In einer Ausführungsform des Verfahrens wird die Erzeugung von zwei physikalisch unterschiedlichen cDNA-Pools durch die Verwendung einer Primer-Extensionsinhibierung erreicht. Ein cDNA-Extensionsschritt wird zur grundlegenden SELEX-Arbeitsvorschrift zwischen den oben genannten Schritten 2 und 3 hinzugefügt, das die Erzeugung von zwei physikalisch unterschiedlichen cDNA-Pools ermöglicht – wobei einer eine hohe Affinität für das Target aufweist und einer eine geringe Affinität für das Target aufweist –, die leicht voneinander zu unterscheiden und zu trennen sind. Die Primer-Extensions-Inhibierungsanalyse ist ein häufig verwendetes Verfahren zur Untersuchung ortsgebundener Proteine, die an Nucleinsäuren komplexiert sind (Hartz et al., Methods Enzymol. 164, 419 (1988)), und basiert auf der Fähigkeit von Komplexen hoher Affinität, die cDNA-Synthese zu inhibieren. Beispiele von Protein-Nucleinsäure-Wechselwirkungen, die durch Primer-Extensions-Inhibierung untersucht wurden, umfassen die Ribosomenbindung an die mRNA-Ribosomen-Bindungsstelle (Hartz et al., Methods Enzymol. 164, 419 (1988)) sowie die Bindung des einzigartigen E.-coli-Translationsfaktors, SELB-Protein, an die mRNA-Selenocystein-Insertionssequenz (Baron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4181 (1993)).
  • In einer Ausführungsform des Solution-SELEX-Schemas wird die erste cDNA-Extension in Gegenwart kettenabbrechender Nucleotidtriphosphate durchgeführt. Unter diesen Bedingungen werden Oligonucleotide mit geringer Affinität für das Target, die schnell dissoziierende Komplexe mit dem Target bilden, in trunkierte cDNAs mit einem 3'-Ende umgewandelt, das mit einem nicht verlängerbaren Nucleotid beendet ist. Die trunkierte cDNA-Kette ist nicht in der Lage, an die PCR-Primer zu annellieren, und ist daher nicht amplifizierbar. Im Gegensatz dazu inhibieren enge Komplexe, die zwischen Oligonucleotiden hoher Affinität und dem Targetmolekül gebildet werden, charakterisiert durch langsame Dissoziationsraten, die cDNA-Extension. Die Ketten-Terminatoren sind nicht in die entstehende cDNA-Kette inkorporiert, die aus dem Oligonucleotid hoher Affinität synthetisiert wurde, da die cDNA-Synthese durch das eng gebundene Targetmolekül blockiert wird. cDNA voller Länge aus den Komplexen hoher Affinität wird während einer zweiten Runde an cDNA-Extension erhalten, bei der das Target und die Ketten-Terminatoren aus dem System entfernt wurden. Daher werden Komplexe schwacher Affinität in trunkierte cDNA umgewandelt, welcher die Primer-Anellierungsstelle fehlt, während enge Komplexe in cDNA voller Länge umgewandelt und mittels PCR amplifiziert werden (22). Die Stringenz dieses Verfahrens wird leicht modifiziert, indem das molare Verhältnis von Ketten-Terminatoren und dNTPs oder die Konzentration der Polymerase variiert wird, da die Primer-Extensions-Inhibierung auf die Polymerasekonzentration empfindlich ist (Ringquist et al., Biochemistry (1993), in Druck). Wie in der vorliegenden Offenbarung verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Stringenz" auf die Menge freier RNA, die in PCR-Produkt konvertiert wird.
  • Daher ist ein essentielles Merkmal die Fähigkeit, Komplexe starker und schwacher Affinität in amplifizierbare und nicht amplifizierbare Nucleinsäure-Pools zu trennen, ohne eine Abtrennungsmatrix zu benötigen. Es sind die einzigartigen Eigenschaften dieser cDNA-Pools, die eine selektive Amplifikation des Liganden hoher Affinität ermöglichen.
  • Das Targetmolekül kann ein Protein sein (entweder ein Nucleinsäure- oder ein Nicht-Nucleinsäure-Bindungsprotein), eine Nucleinsäure, ein kleines Molekül oder ein Metallion. Das Solution-SELEX-Verfahren ermöglicht eine Auflösung von Enantiomeren sowie die Isolierung neuer katalytischer Nucleinsäuren.
  • Die Primer-Extensions-Inhibierung kann durch die Verwendung einer beliebigen einer Anzahl von Nucleinsäure-Polymerasen erreicht werden, unter anderem DNA- oder RNA-Polymerasen, reverse Transkriptase und Qβ-Replicase.
  • Das geeignete Gemisch an Nucleinsäuren umfasst ein(e) beliebige(s) Nucleinsäure oder Nucleinsäure-Derivat, aus der/dem ein komplementärer Strang synthetisiert werden kann.
  • Die Abtrennung nach dem Stand der Technik umfasste die Verwendung von Nitrocellulose oder einer Affinitätssäule. Ein Nachteil der Abtrennung nach dem Stand der Technik war das Phänomen der Matrixbinder, bei dem Nucleinsäuren, welche die Abtrennungsmatrix spezifisch binden, zusammen mit jenen selektiert werden, die das Target spezifisch binden. Ein Vorteil des Verfahrens ist daher, dass es ungewollten selektiven Druck überwindet, der aus der Verwendung einer Abtrennungsmatrix hervorgeht, indem solche Matrizen nur nach der Abtrennung von Nucleinsäuren mit hoher Affinität für das Target in Lösung und nach der Amplifikation verwendet werden.
  • Weiters führt die Fähigkeit zur Abtrennung von Komplexen starker und schwacher Affinität während der cDNA-Synthese, basierend auf der Fähigkeit nur der stärksten Komplexe, die Extension durch eine Polymerase zu inhibieren, zu der Selektion nur jener Nucleinsäureliganden der höchsten Affinität. Es wird geschätzt, dass Komplexe mit Dissoziationskonstanten im nanomolaren oder noch weiter darunter liegenden Bereich die cDNA-Synthese wirksam blockieren. Von dem Verfahren wird erwartet, dass es geeignete Nucleinsäuregemische vorzugsweise auf Mitglieder screent, die das Target an diesem Limit binden.
  • Die Verwendung der Primer-Extensions-Inhibierung ermöglicht die Abtrennung des geeigneten Oligonucleotidgemisches in zwei Pools – jene Oligonucleotide mit hoher Target-Affinität (amplifizierbar) und jene mit geringer Target-Affinität (nicht amplifizierbar). Wie oben stehend beschrieben, können Ketten-Terminatoren verwendet werden, um das erste Extensionsprodukt zu vergiften, wodurch die cDNAs niedriger Affinität nicht amplifizierbar werden.
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens werden Restriktionsenzyme verwendet, um die cDNA, die aus den Nucleinsäuren niedriger Affinität erzeugt wurde, selektiv zu verdauen. Es wurde eine Reihe von Restriktionsenzymen identifiziert, die einzelsträngige DNA spalten. Diese Enzyme spalten an spezifischen Sequenzen, jedoch mit variierender Wirksamkeit. Die Abtrennung von Nucleinsäuren mit schwacher und starker Affinität wird durch Primer-Extension in Gegenwart der vier dNTPs erreicht, gefolgt von der Entfernung des Targets und einer zweiten Extension mit modifizierten Nucleotiden, die gegen enzymatische Spaltung resistent sind. Die cDNA-Pools können anschließend mit dem geeigneten Restriktionsenzym inkubiert werden, und die cDNA, die während der ersten Extension synthetisiert wurde, kann gespalten werden, um die Primer-Anellierungsstelle zu entfernen und einen nicht amplifizierbaren Pool zu ergeben. Eine erhöhte Spaltungswirksamkeit wird unter Verwendung einer Haarnadel an der Restriktionsstelle (RS) erhalten, um eine lokalisierte doppelsträngige Region zu schaffen (24).
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens werden cDNA-Sequenzen, die Nucleinsäuren niedriger Affinität entsprechen, durch Inkorporation eines modifizierten Nucleotids in das erste cDNA-Extensionsprodukt selektiv abbaubar gemacht, so dass die resultierende cDNA vorzugsweise enzymatisch oder chemisch abgebaut wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens kann das erste Extensionsprodukt aus dem System durch eine Affinitätsmatrix entfernt werden. Alternativ dazu konnte die Matrix verwendet werden, um das zweite Extensionsprodukt zu binden, z. B. die cDNAs, die Nucleinsäuren hoher Affinität entsprechen. Diese Strategie beruht auf der Inkorporierung modifizierter Nucleotide während der cDNA-Synthese. Die erste cDNA-Extension konnte z. B. in Gegenwart modifizierter Nucleotide (z. B. biotinyliert, iodiert, thiomarkiert oder eines beliebigen anderen Nucleotids) durchgeführt werden, die eine Retention auf einer Affinitätsmatrix ermöglichen (25). In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens kann eine spezielle Sequenz auch zum Anellieren an eine Affinitätsmatrix inkorporiert werden. Daher können cDNAs der ersten Synthese auf im Handel erhältlichen Matrizen zurückgehalten werden und von cDNA der zweiten Synthese getrennt werden, die in Abwesenheit der modifizierten Nucleotide und des Targets synthetisiert wird.
  • In einer anderen Ausführungsform wird Exonuclease-Hydrolyse-Inhibierung verwendet, um einen Pool doppelsträngiger Nucleinsäureliganden hoher Affinität zu erzeugen.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Solution-SELEX-Verfahren verwendet, um katalytische Nucleinsäuren zu isolieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird Solution-SELEX verwendet, um vorzugsweise einzelsträngige Nucleinsäuren zu amplifizieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist das Solution-SELEX-Verfahren automatisiert.
  • Die Entfernung des Targets, um die cDNA-Synthese aus den Nucleinsäuren hoher Affinität zu ermöglichen, kann auch durch eine Reihe an Wegen erreicht werden. Das Target kann z. B. durch organische Extraktion entfernt werden oder durch Temperatur denaturiert werden sowie durch Veränderungen des Elektrolytgehalts des Lösungsmittels. Zusätzlich dazu kann das molekulare Repertoire des geeigneten Gemisches, das für die Erfindung verwendet werden kann, ein beliebiges umfassen, aus dem ein zweiter komplementärer Strang synthetisiert werden kann. Einzelsträngige DNA sowie RNA sowie auch eine Reihe anderer modifizierter Nucleotide und ihre Derivate können verwendet werden.
  • Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele 1–20 zeigen das Verfahren der vorliegenden Erfindung. Beispiel 21 beschreibt das Solution-SELEX-Verfahren, worin die Abtrennung von Nucleinsäuren hoher und niedriger Affinität durch Primer-Extensions-Inhibierung erreicht wird. Beispiel 22 veranschaulicht das Solution-SELEX-Verfahren, worin die Abtrennung durch Restriktionsenzymverdau von RNA mit niedriger Affinität erreicht wird. Beispiel 23 beschreibt das Solution-SELEX-Verfahren, worin Nucleinsäuren niedriger Affinität von Nucleinsäuren hoher Affinität mittels Affinitätschromatographie getrennt werden. Beispiel 24 beschreibt die Isolierung doppelsträngiger Nucleinsäureliganden hoher Affinität bei der Verwendung der Exonuclease-Inhibierung. Beispiel 25 beschreibt die Isolierung katalytischer Nucleinsäuren. Beispiel 26 beschreibt ein automatisiertes Solution-SELEX-Verfahren.
  • Beispiele 1–20 sind nicht einschränkende Veranschaulichungen von Verfahren zur Verwendung der vorliegenden Erfindung. Andere Verfahren der Verwendung der Erfindung werden für den Fachmann aus den Lehren der vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
  • Beispiel 1: Synthese von RNA-Sequenzen RNA-1, RNA-2, RNA-3 und RNA-7 sowie R17-Hüllprotein
  • RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1), RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) und RNA-3 (Seq.-ID Nr. 3), gezeigt in 6, sowie RNA-7 (Seq.-ID Nr. 4), gezeigt in 12, wurden durch In-vitro- Transkription aus synthetischen DNA-Matrizen oder Plasmiden unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die von Milligan und Mitarbeitern beschrieben wurden (Milligan et al., Nucleic Acids Res. 15, 8783 (1987)). Transkriptionsreaktionen enthielten 40 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl, pH 8,1, bei 37°C), 1 mM Spermidin, 5 mM Dithiothreit (DTT), 50 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 0,1 Vol.-% Triton X-100, 80 mg/ml Polyethylenglykol (mr 8000) und 0,1 mg/ml T7-RNA-Polymerase. Größere Mengen an RNA wurden mit 3–5 mM von jedem der Nucleotidtriphosphate (NTPs), 25 mM Magnesiumchlorid und 1 μM DNA-Matrize oder 0,1 μg/ml Plasmid hergestellt. Körpermarkierte RNAs wurden in 100 μM Reaktionen mit je 1 mM der drei NTPs, 0,25 mM des entsprechenden radiomarkierten NTP ([α-32P]-NTP, 5 μCi), 15 mM MgCl2 und 0,1 mg/ml T7-RNA-Polymerase hergestellt. Nucleotide, unter anderem 5-Ioduridintriphosphat und 5-Bromuridintriphosphat, wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, erhalten. RNA-Fragmente wurden durch 20% denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) gereinigt. Das gewünschte Fragment wurde aus dem Polyacrylamid eluiert und in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat ethanolpräzipitiert. Der R17-Bakteriophage wurde im Escherichia-coli-Stamm S26 vermehrt, und das Hüllprotein wurde unter Verwendung des von Carey und Mitarbeiter beschriebenen Verfahrens gereinigt (Carey et al., Biochemistry 22, 4723 (1983)).
  • Beispiel 2: Bindungskonstanten von RNA-1 und RNA-2 an R17-Hüllprotein
  • RNA-Proteinbindungskurven von Haarnadel-Varianten RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1), RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) und RNA-3 (Seq.-ID Nr. 3) an das Bakteriophagen-R17-Hüllprotein sind in 7 dargestellt. Die Assoziationskonstanten zwischen Hüllprotein und den RNA-Haarnadel-Varianten wurden mit einem Nitrocellulosefilter-Retentionstest bestimmt, der von Carey und Mitarbeitern beschrieben wurde (Carey et al., s. o. (1983)). Eine konstante, niedrige Konzentration an 32P-markierter RNA wurde mit einer Reihe an Hüllprotein-Konzentrationen zwischen 0,06 nM und 1 μM in 10 mM Magnesiumacetat, 80 mM KCl, 80 μg/ml BSA und 100 mM Tris-HCl (pH 8,5 bei 4°C) (TMK-Puffer) gemischt. Diese waren dieselben Lösungsbedingungen, die in den Vernet zungsexperimenten verwendet wurden. Nach der Inkubation bei 4°C für 45–60 min wurde das Gemisch durch einen Nitrocellulosefilter filtriert, und die Menge an auf dem Filter zurückbehaltenem Komplex wurde durch Flüssigkeits-Szintillationszählung bestimmt. Für jedes Experiment wurden die Datenpunkte auf eine nicht kooperative Bindungskurve angepasst, und der in 7 dargestellt Kd-Wert wurde berechnet.
  • Beispiel 3: Photovernetzung von RNA-1 und RNA-2 an R17-Hüllprotein bei 308 nm
  • 32P-markierte RNA-Sequenzen RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) und RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) (5 nM) und R17-Hüllprotein (120 nM) wurden jeweils auf Eis in 100 mM Tris-HCl (pH 8,5 bei 4°C), 80 mM KCl, 10 mM Magnesiumacetat, 80 μg/ml BSA 15–25 Minuten lang vor Bestrahlungen inkubiert. Dies sind Bedingungen, bei denen RNA vollständig an das Hüllprotein gebunden wird. Die RNAs wurden in Wasser auf 85°C 3 Minuten lang erhitzt und vor der Verwendung schnell auf Eis gekühlt, um sicherzustellen, dass die RNAs eine Haarnadel-Konformation aufwiesen (Groebe und Uhlenbeck, Nucleic Acids Res. 16, 11725 (1988)). Ein λ-Physik-EMG-101-Excimer-Laser, geladen mit 60 mbar Xenon, 80 mbar 5-%-HCl in Helium und 2360 mbar Helium, wurde für 308-nm-Bestrahlungen verwendet. Die Leistung des XeCl-Lasers wurde unfokussiert auf eine Quarz-Küvette mit einer Breite von 4 mm und einer Weglänge von 1 cm, enthaltend den RNA-Protein-Komplex, gerichtet. Der Laser wurde im Bereich von 60 mJ/Puls bei 10 Hz betrieben; es fielen jedoch nur 25% des Laserstrahls auf die Reaktionszelle ein. Die Photovernetzungsausbeute-Werte von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) und RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) an das R17-Bakteriophagen-Hüllprotein als Funktion der Bestrahlungszeit sind in 8 dargestellt. Vernetzte RNA wurde von unvernetzter RNA mittels PAGE getrennt, und die Ausbeute wurde mittels Autoradiographie bestimmt. Die Vernetzung von 5-Bromuracil-enhaltender RNA-1-Variante (Seq.-ID Nr. 1) führte bei etwa 40% zu einem Maximum aufgrund des konkurrierenden Photoschadens des Hüllproteins, das die Bindung an die RNA inhibiert (Gott et al., s. o. (1991)). Weniger Photoschaden des Hüllproteins trat bei RNA-2 aufgrund der kürzeren Bestrahlungszeit auf.
  • Die Vernetzung als eine Funktion von absorbierten Photonen zeigte, dass die Quantenausbeute für die Vernetzung von BrU-RNA-1 0,014 und für die Vernetzung von IU-RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) 0,006 beträgt mit einer Bestrahlung bei 308 nm. Trotz der geringeren Quantenausbeute wurde aufgrund der sieben Mal höheren Absorptionswahrscheinlichkeit des IU-Chromophors bei 308 nm eine höhere Vernetzungsausbeute mit IU-RNA-2 erhalten. BrU und IU absorbieren bei 308 nm mit molaren Extinktionskoeffizienten von 385 bzw. 2640 l/mol·cm. Daher wurde vor dem Proteinschaden ein hohes Ausmaß an Photovernetzung der IU-RNA erreicht.
  • Beispiel 4: Identifikation des in die Vernetzung von RNA-1 an R17-Hüllprotein involvierten Aminosäurerests
  • Vernetzung von RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) an R17-Hüllprotein in großem Maßstab. Eine 10-ml-Lösung, enthaltend 300 nM 5'-endmarkierte RNA und 500 nM Hüllprotein, wurde auf Eis in Gegenwart von 100 mM Tris-HCl (pH 8,5 bei 4°C), 10 mM Mg(OAc)2, 80 mM KCl, 80 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 5 mM Dithiothreit (DTT) 10–90 Minuten lang inkubiert. Ein λ-Physik-EMG-101-Excimer-Laser wurde bei 308 nm zur monochromatischen Bestrahlung verwendet. Die Strahlen-Leistung wurde mit 69 ± 5 mJ/Puls bei 10 Hz gemessen. Etwa 50% des Strahls wurden durch eine runde 7-mm-Durchmesser-Strahlmaske in eine Quarz-Küvette mit einer Weglänge von 1 cm in einem thermostatisierten Küvettenhalter fokussiert. Die Laserleistung wurde mit einem Scientech-360-001-Disk-Calorimeter-Leistungsmessgeräts gemessen. Die Temperatur wurde bei 4 ± 2°C mit einem Laude-RC3-Umlaufwasserbad reguliert.
  • Die 10-ml-Reaktonsgemische wurden kurz vor den Bestrahlungen hergestellt, die in 2-ml-Fraktionen durchgeführt wurden. Nach 5 Minuten Bestrahlung wurde die Proteinkonzentration auf 1 μM gebracht. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 3 Minuten lang inkubiert, um den Austausch von photogeschädigtem Protein gegen frisches Protein in dem Nucleoproteinkomplex zu ermöglichen, und für weitere 5 Minuten bestrahlt. Dieser Schritt wurde neun Mal wiederholt, um 90 ml bestrahlter Probe zu ergeben. Die Vernetzung, analysiert durch 20% denaturierende PAGE und auf einem Molecular-Dynamics-Phosphoimager quantifiziert, ergab 22% Vernetzung.
  • Die 90-ml-Probe enthielt 5,9 nmol vernetzte RNA, 21 nmol freie RNA, 97 nmol freies Hüllprotein und 7,2 mg BSA. Das Gesamtvolumen wurde auf 20 ml reduziert und zu gleichen Teilen zwischen zwei 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel (Nalgene) aufgeteilt und über Nacht bei –20°C ethanolpräzipitiert. Die RNA und Proteine wurden bei 13.000 U/min in einem J-20-Festwinkelrotor mit einer Beckman-J2-21-Zentrifuge zu einem Pellet herabzentrifugiert. Jedes Pellet wurde in 1 ml an 0,5 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, und 0,2% SDS 48 h lang bei 4°C durch Schütteln resuspendiert. Die Fraktionen wurden kombiniert, und anschließend wurde das SDS durch Präzipitation entfernt, um die Aktivität von Trypsin nicht zu verringern. Dies wurde unter Verwendung von 40 mM KCl erreicht, und das Präzipitat wurde durch Drehen durch einen 0,22-μm-Celluloseacetat-Drehfilter entfernt. Die Trypsinbedingungen wurden unter Verwendung von 500 μl der Lösung optimiert.
  • Proteolytischer Verdau. Die verbleibenden 1,5 ml vernetzter RNA-Lösung, die freie(s) RNA und Protein enthalten, wurden auf 6 ml gebracht, um 1 M Harnstoff, 20 mM CaCl2 und 6 mM DTT zu enthalten, und anschließend wurden 1,61 mg (1:5 Gew./Gew.) Trypsin-TPCK (251 Einheiten/mg) hinzugefügt. Die Reaktion wurde bei 36°C 2 Stunden lang fortgesetzt, wonach weitere 1,61 mg Trypsin hinzugefügt wurden. Nach 4 Stunden wurde ein aliquoter Anteil von 100 μl entfernt, und die Reaktion wurde durch schnelles Frieren gestoppt. Die Reaktion wurde durch 20% Polyacrylamid, 19:1 vernetzt, 7 M Harnstoff, 90 mM Tris-Borat/2 mM EDTA-(TBE-)Gelelektrophorese (denaturierende 20% Harnstoff PAGE) analysiert.
  • Reinigung der verdauten, vernetzten RNA. Das Trypsin-Reaktionsgemisch wurde auf 10 ml gebracht, um die molare Salzkonzentration zu reduzieren, und durch eine 240-μl-DEAE-Ionenaustausch-Zentrifugensäule laufen gelassen. Die Säule wurde mit 100 mM NaCl gewaschen und in einer Labor-Zentrifuge trocken zentrifugiert, um freies Peptid zu entfernen. Das säulengebundene Material, das die RNA und das vernetzte tryptische Fragment enthielt, wurde mit 1 ml 600 mM NaCl aus der Säule eluiert, und die Säule wurde trocken zentrifugiert. Zusätzliche 200 μl 600 mM NaCl wurden durch die Säule zentrifugiert. Die zwei Fraktionen wurden gepoolt, ethanolpräzipitiert und bei 10.000 U/min 35 Minuten lang bei 4°C pelletiert. Das Pellet wurde in 25 μl 7-M-Harnstoff-TBE-Puffer, 10 Mm DTT, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylolcylanol resuspendiert und bei 85°C 4 Minuten lang erhitzt und durch 20% denaturierende PAGE gereinigt. Das Gel wurde für 3,5 Stunden bei 600 V laufen gelassen. Eine 5-min-Phosphoimage-Aussetzung wurde von dem Gel gemacht. Die verdaute Protein-RNA-Vernetzung wurde anschließend elektrolytisch von dem Gel auf eine PVDF-Proteinsequenzierungsmembran (0,1 μm) von Bio-RAD geblottet. Die Membran wurde luftgetrocknet, 1 Minute lang coomassie-gefärbt, 2 Minuten lang in 50% MeOH:50% H2O entfärbt und zwei Mal mit entionisiertem H2O gespült. Ein Autoradiogramm wurde aus der Membran hergestellt, um die verdaute Protein-RNA-Vernetzung sichtbar zu machen, die aus der Membran ausgeschnitten wurde und einem Edman-Abbau unterzogen wurde. Das immobilisierte Peptid wurde durch automatisierten Edman-Abbau sequenziert, durchgeführt auf einem Applied-Biosystems-470A-Sequenzierungsgerät unter Verwendung der Verfahren und Arbeitsvorschriften des Herstellers (Clive Slaughter, Howard Hughes Medical Institute, University of Texas, Southwestern). Die Edman-Analyse zeigte, dass die Position der Vernetzung tyrosin-85-basiert war, und zwar auf der bekannten Aminosäuresequenz (Weber, Biochemistry 6, 3144 (1983)).
  • Beispiel 5: Photovernetzung von RNA-2 an R17-Hüllprotein bei 325 nm
  • In einem Experiment, das analog zu jenem ist, das in Beispiel 3 beschrieben wird, wurde IU-substituierte RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) an R17-Hüllprotein mit monochromatischer Emission bei 325 nm aus einem Omnichrome-HeCd-Laser (Modell 3074-40M325) photovernetzt. Die Ausgangsleistung des HeCd-Laser lag bei 37 mW, und der gesamte Strahl mit einem Durchmesser von 3 mm war auf die Probe gerichtet. Um die Anregung pro Zeiteinheit zu erhöhen, wurde der Strahl mit einem konkaven dielektrisch-beschichteten Spiegel zurück durch die Probe reflektiert. Vernetzte RNA wurde von nicht vernetzter RNA durch PAGE getrennt, und die Ausbeute wurde mit einem Phospholmager bestimmt. Der Prozentsatz der mit dem Protein vernetzten RNA als Funktion der Bestrahlungszeit ist in 9 dargestellt. Vernetzung mit hoher Ausbeute trat ohne Photoschaden des R17-Hüllproteins auf. In einem separaten Experiment führte analoge Bestrahlung des Hüllproteins alleine bei 325 nm mit noch einer höheren Dosis zu Protein, das dieselbe Bindungskonstante an R17-Hüllprotein aufwies. Bestrahlung bei 325 nm von BrU-enthaltendem RNA-1-R17-Hüllprotein-Komplex führte nicht zu einer Vernetzung, da der BrU-Chromophor bei 325 nm transparent ist.
  • Beispiel 6: Photovernetzung von RNA-1 und RNA-2 an R17-Hüllprotein mit einem Transilluminator
  • In einem Experiment, das zu jenem, das in Beispiel 3 beschrieben ist, analog ist, wurden RNA-1 (Seq.-ID Nr. 1) und RNA-2 (Seq.-ID Nr. 2) mit Breitbandemission im Bereich von 312 nm aus einem Fisher-Biotech-Transilluminator (Modell FBTIV-816), mit Polystyrol gefiltert, an das R17-Hüllprotein photovernetzt. Vernetzte RNA wurde von nicht vernetzter RNA mittels PAGE getrennt, und die Ausbeute wurde mittels Autoradiographie bestimmt. Prozentsätze von RNAs, die an das Protein vernetzt sind, als eine Funktion der Bestrahlungszeit sind in 10 dargestellt.
  • Beispiel 7: Photoreaktion von 5-Ioduracil mit N-Acetyltyrosin-N-ethylamid
  • N-Acetyltyrosin-N-ethylamid wurde hergestellt, wie von Dietz und Koch, s. o. (1987), beschrieben. Bestrahlung einer wässrigen Lösung von Ioduracil mit einem pH von 7 und 10 mol äquivalentem Überschuss von N-Acetyltyrosin-N-ethylamid bei 308 nm mit einem XeCl-Excimer-Laser ergab ein Photoaddukt, das mit dem Photoaddukt (Struktur 6) aus der Bestrahlung von Bromuracil und N-Acetyltyrosin-N-ethylamid identisch war (Dietz und Koch, s. o. (1987)), wie in 11 dargestellt. Der Produktvergleich wurde mittels C-18-Umkehrphasen-HPLC und mittels 1H-NMR-Spektroskopie durchgeführt. Obwohl wenig über den Mechanismus der Photovernetzung von IU-substituierten Nucleinsäuren an assoziierte Proteine bekannt ist, deutet dieses Resultat darauf hin, dass er jenem der Photovernetzung von BrU-substituierten Nucleinsäuren an assoziierte Proteine ähnelt.
  • Beispiel 8: Herstellung einer cDNA aus einer RNA, die an ein Protein photovernetzt ist
  • RNA-7 (Seq.-ID Nr. 4) (11) wurde unter Verwendung von Verfahren hergestellt, über die in Beispiel 1 berichtet wurde, und zwar unter Verwendung eines Plasmids anstelle einer DNA-Matrize. Die Photovernetzung wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Ein 4-ml-Reaktionsgemisch, bestehend aus 6,75 nM RNA und 120 nM R17-Hüllprotein, wurde, jeweils zu 2 ml, bei 308 nm mit unfokussierter Emission aus einem XeCl-Excimer-Laser bestrahlt. Der Laser produzierte 50 mJ/Puls und wurde bei 10 Hz betrieben. Die Reaktion wurde beinahe bis zur quantitativen Vernetzung, 85–90%, in 5 Minuten Bestrahlung fortgeführt. Nach der Vernetzung wurde 1 ml des gesamten Reaktionsgemisches entfernt; EDTA (80 mM), SDS (0,1%) und CaCl2 (0,1 mM) wurden hinzugefügt; die freie (ungebundene) RNA, die vorhanden war, wurde weggereinigt; anschließend wurde das Protein mit Proteinase K bei 60°C 30 Minuten lang verdaut. Die RNA, die an Restprotein gebunden war, wurde ethanolpräzipitiert, um Salze zu entfernen, und zu einem Pellet zentrifugiert. Das Pellet wurde drei Mal mit 70% Ethanol gewaschen, um etwaige Restsalze zu entfernen. Eine Umkehrtranskriptionsreaktion wurde verwendet, um eine komplementäre DNA-Kopie der RNA-Matrize zu erstellen. Ein 13-Basen-Promotor wurde an die RNA anelliert, und die Umkehrtranskriptionsreaktion wurde unter den Standardbedingungen des Herstellers, Gibco (Gaithersburg, MD), durchgeführt und nach 1 Stunde beendet. Die cDNA wurde mit 32P-markiertem Desoxycytidintriphosphat körpermarkiert. Die RNA-Matrize wurde anschließend durch 5-minütiges Hydrolysieren mit 0,2 M Natriumhydroxid bei 100°C entfernt. Die Bildung der cDNA wurde von PAGE gefolgt. Eine Hydrolyse-Leiter und Marker wurden zu dem Gel hinzugefügt, um die Länge der cDNA zu bestimmen. Die cDNA co-migrierte mit der 44-Nucleotid-RNA-Matrize. Falls es als Resultat einer Vernetzungsmodifikation einen Stopp in der cDNA gegeben hätte, wäre ein verkürztes Produkt von 31 Nucleotiden beobachtet worden. Eine kleine Menge eines Stopp-Produkts wurde in der 22-25-Nucleotidregion des Gels beobachtet, dies kann jedoch das Resultat der sekundären Haarnadel-Struktur sein, die an Position 25 der cDNA auf der RNA-Matrize beginnt. Es trat kein Stopp in der 31-Nucleotidregion des Gels auf; dies legte fest, dass die reverse Transkriptase durch die Position der Vernetzung gelesen hatte. Ein Diagramm des Gels ist in 14 zu finden.
  • Beispiel 9: Iodcytosin-Photovernetzung
  • 5-Iodcytosin (IC) wurde in eine Haarnadel-RNA (RNA 8) inkorporiert, die Cytosin an der -5-Position enthielt und das R17-Hüllprotein mit hoher Affinität band. Die IC-tragende RNA wird RNA 9 genannt. RNA 9 (5 nM) und R17-Hüllprotein (120 nM) wurden auf Eis in 100 mM Tris-HCl (pH 8,5 bei 4°C)/80 mM KCl/10 mM Magnesiumacetat/80 μg/ml BSA 15–25 min lang vor der Bestrahlung inkubiert. Die RNA in Wasser wurde 3 Minuten lang auf 85°C erhitzt und vor der Verwendung schnell auf Eis gekühlt, um sicherzustellen, dass sie sich in einer Konformation befand, die das Hüllprotein band (Groebe und Uhlenbeck, s. o. (1988)). Der Komplex wurde 5 Minuten lang bei 4°C bestrahlt, und das Experiment wurde mit Kontrollbestrahlungen von RNA-2- und RNA-8-Hüllprotein-Komplexen verglichen. Die Bestrahlung von RNA-8-Hüllprotein-Komplex führte zu keinem vernetzten Produkt. Die Bestrahlung von RNA-9-Hüllprotein-Komplex führte zu der Bildung einer Vernetzung, die sich in hoher Ausbeute bildete (70–80%), ähnlich der Ausbeute der Kontrollbestrahlung von RNA-2-Hüllprotein-Komplex (80–90%). Es wird angenommen, dass die Vernetzung von RNA 9 durch einen ähnlichen Mechanismus wie RNAs auftritt, die IU an Position -5 der Schleifen-Haarnadel enthalten (6 und 12). Diese Annahme basiert auf der Spezifität der Vernetzung, da RNA 8 nicht photovernetzte.
  • Beispiel 10: Inkorporation von halogenierten Nucleotiden in DNA-Liganden
  • Photoreaktive Nucleotide können in einen DNA-Liganden inkorporiert werden, der in der Lage ist, nach Bestrahlung durch die oben stehenden beschriebenen Verfahren an ein Target-Molekül zu vernetzen. 5-Bromdesoxyuracil (BrdU), 8-Brom-2'-desoxyadenin und 5-Iod-2'-desoxyuracil sind Beispiele solcher photoreaktiver Nucleotide.
  • Beispiel 11: PhotoSELEX
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das PhotoSELEX-Verfahren auf die Vollendung der Selektion eines Nucleinsäureliganden angewandt, der an ein Targetmolekül bindet und photovernetzt.
  • Eine randomisierte Gruppe von Nucleinsäure-Oligonucleotiden wird synthetisiert, wobei diese photoreaktive Gruppen enthalten. Die Oligonucleotide des geeigneten Gemisches können an jeder verfügbaren Position mit einer photoreaktiven Gruppe teilweise oder vollständig gesättigt sein. Das geeignete Gemisch wird mit dem Targetmolekül in Kontakt gebracht und mit der geeigneten Licht-Wellenlänge bestrahlt. Oligonucleotide, die mit dem Targetmolekül vernetzt sind, werden aus den verbleibenden Oligonucleotiden isoliert, und das Targetmolekül wird entfernt. cDNA-Kopien der isolierten RNA-Sequenzen werden hergestellt und amplifiziert. Diese amplifizierten cDNA-Sequenzen werden in Gegenwart photoreaktiver Gruppen in RNA-Sequenzen transkribiert, und das PhotoSELEX-Verfahren wird je nach Notwendigkeit wiederholt.
  • Beispiel 12: Selektion von Liganden mit verstärkter Photovernetzung: SELEX gefolgt von PhotoSELEX
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die Selektion von Nucleinsäureliganden durch SELEX von einer Selektion durch PhotoSELEX auf Liganden gefolgt, die in der Lage sind, das Targetmolekül zu vernetzen. Dieses Protokoll führt zu Liganden mit hoher Bindungsaffinität für das Targetmolekül, die auch in der Lage sind, an das Target zu photovernetzen.
  • Photoreaktive Nucleotide werden in RNA durch T7-Polymerase-Transkription mit dem reaktiven Nucleotidtriphosphat anstelle eines spezifizierten Triphosphats inkorporiert. Uridintriphosphat wird z. B. durch 5-Bromuridintriphosphat ersetzt, oder Ade nosintriphosphat wird durch 8-Bromadenosintriphosphat ersetzt. Es wird eine randomisierte Gruppe von RNA-Sequenzen, die photoreaktive Nucleotide enthalten, erzeugt, und es wird das SELEX-Verfahren angewandt. Die anfänglichen SELEX-Runden werden verwendet, um an sich schlechte Binder zu eliminieren und den Pool an Molekülen, die konvergieren, zu verstärken, um einen Pool an RNAs zu bilden, welche die photoreaktive(n) Gruppe(n) enthalten und an das Targetmolekül binden. Aliquote Anteile aus den anfänglichen SELEX-Runden werden bestrahlt, und die Verstärkung der Photovernetzung wird mit dem Fortschreiten der Runden durch PAGE verfolgt. Als eine langsamer migrierende Bande erkenntlich wird, die vernetzte Produkte darstellt, wird der Pool an RNAs in Runden von PhotoSELEX eingeführt. RNAs, die eine photoreaktive Gruppe neben einem reaktiven Aminosäurerest in den Nucleoprotein-Komplexen besitzen, bilden eine Vernetzung und werden selektiert, und RNAs, die keine reaktiven Nucleotide in der Nähe von reaktiven Target-Resten besitzen, werden eliminiert.
  • Dieses Protokoll verwendet die PhotoSELEX-Selektion selektiv auf zuvor identifizierte Liganden für ein Targetmolekül.
  • Beispiel 13: PhotoSELEX gefolgt von SELEX
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird ein RNA-Ligand, der in der Lage ist, ein Targetmolekül zu photovernetzen, durch das PhotoSELEX-Verfahren präselektiert. Anschließend wird SELEX durchgeführt, um ein vernetzendes Oligonucleotid für die Fähigkeit zu selektieren, das Targetmolekül zu binden.
  • Beispiel 14: Limitierte SELEX gefolgt von PhotoSELEX
  • In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Nucleinsäureliganden durch das SELEX-Verfahren für eine eingeschränkte Anzahl an Selektionsrunden selektiert. SELEX wird nicht wie in Beispiel 12 bis zur Vollendung angewandt. Statt dessen wird das geeignete Gemisch partiell auf Oligonucleotide mit relativ verstärkter Affinität für das Targetmolekül selektiert. Die Zufalls-Oligonucleotide des geeigneten Gemisches enthalten photoreaktive Gruppen, und die anfängliche SELEX-Selektion wird in Abwesenheit von Bestrahlung durchgeführt. PhotoSELEX wird anschließend durchgeführt, um Oligonucleotide zu selektieren, die in der Lage sind, an das Targetmolekül zu vernetzen.
  • Diese Arbeitsvorschrift ermöglicht die Selektion von vernetzenden Liganden aus einem Pool an Oligonucleotiden mit einer etwas verbesserten Fähigkeit, das Targetmolekül zu binden, und kann bei Umständen von Nutzen sein, in denen die Selektion bis zur Vollendung mittels SELEX keine vernetzenden Liganden ergibt.
  • Beispiel 15: Limitierte gerichtete PhotoSELEX
  • In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, in der Nucleinsäureliganden, die durch SELEX identifiziert wurden, einer limitierten Randomisierung unterzogen werden, gefolgt von einer Selektion durch PhotoSELEX.
  • Die Konstruktion der DNA-Matrize, die verwendet wurde, um die partiell randomisierte RNA zu transkribieren, basiert auf der Sequenz des anfänglich selektierten Liganden und enthält an jeder Position hauptsächlich das Nucleotid, das komplementär zu jener Position der anfänglich selektierten RNA-Sequenz ist. Jede Position wird jedoch auch partiell randomisiert durch die Verwendung geringer Mengen jeder der anderen drei Nucleotide in dem Sequenziergerät, wodurch die ursprüngliche Sequenz an dieser Position variiert wird. Ein limitierter RNA-Pool wird anschließend aus dieser Gruppe an DNA-Molekülen mit einem photoreaktiven Triphosphat transkribiert, wodurch ein spezifisches Triphosphat in dem Reaktionsgemisch ersetzt wird (d. h. BrU statt U). Die partiell randomisierte Gruppe an RNA-Molekülen, welche die photoreaktiven Nucleotide enthält, wird mit einer Menge des Target-Proteins gemischt. Gebundene RNAs, die eine photoreaktive Gruppe neben einem reaktiven Aminosäurerest in dem Nucleoprotein-Komplex besitzen, bilden bei Bestrahlung kovalente Vernetzungen. RNAs, die binden und vernetzen, werden durch mehrere Runden an PhotoSELEX selektiert und von RNAs getrennt, die binden, jedoch keine Vernetzung eingehen.
  • Beispiel 16: Verfahren zur Modifikation eines Target-Moleküls
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird PhotoSELEX angewandt, um einen Liganden zu entwickeln, der in der Lage ist, ein Target-Molekül zu modifizieren. Unter diesen Umständen kann die Inkorporation einer photoreaktiven Gruppe auf oder in einen Liganden, der durch PhotoSELEX oder SELEX selektiert wurde, das Target auf mehrere Arten modifizieren, so dass die biologische Aktivität des Target-Moleküls modifiziert wird. Das Target-Molekül kann z. B. durch den photovernetzten Liganden deaktiviert werden. Mechanismen der Deaktivierung umfassen Elektronen- oder Wasserstoff-Entziehung vom Target-Molekül oder eine radikale Addition zum Target-Molekül, wobei durch diese eine chemische Modifikation hervorgerufen wird. Diese unterschiedlichen Mechanismen können durch das Verändern des Bestrahlungsmodus erreicht werden.
  • Ein Ligand, der durch PhotoSELEX selektiert wurde, das als Diagnosemittel für ein Target-Molekül mit ultraviolettem (UV) Licht verwendet wurde, kann auch dasselbe Target in vivo deaktivieren, falls die Bestrahlungsquelle auf Röntgenstrahlen oder Gammastrahlen geändert wird. Der resultierende Vinyl-Rest kann auf ähnliche Art und Weise wie ein Hydroxyl-Rest arbeiten, d. h. durch Entziehung von Wasserstoffatomen aus der Bindungsdomäne des Target-Moleküls.
  • Röntgen-Bestrahlung des R17-Hüllproteins, das an radiomarkierte IU- oder BrU-substituierte RNA-Haarnadel-Sequenzen gebunden ist, kann zu der Bildung einer Vernetzung führen. Der BrU- oder IU-Chromophor kann durch Röntgenbestrahlung auch zu einem höheren Energie-Zustand angeregt werden, was zu der Bildung eines Vinyl-Rests führt (Mee, in: Radiation Chemistry: Principles and Applications, 477–499, VCH Publishers, Farhataziz und Rodgers (Hrsg.), New York (1987)). Der Rest entzieht einen Wasserstoff aus der Bindungsdomäne des R17-Hüllproteins, wodurch seine Fähigkeit, den RNA-Liganden zu binden, reduziert oder inhibiert wird. Die De aktivierung wird durch Röntgen-Bestrahlung des R17-Hüllproteins in Gegenwart und Abwesenheit substituierter RNAs getestet. Die Bildung vernetzter Komplexe wird durch PAGE analysiert. Die Wirkung der Röntgen-Bestrahlung der RNA, die zu der Modifikation der Bindung durch Modifikation der Protein-Domäne führte, wird von einem Nitrocellulose-Bindungstest gefolgt.
  • Beispiel 17: Diagnostische Verwendung von PhotoSELEX zur Identifikation einzigartiger Proteine, die mit spezifischen Krankheitsvorgängen assoziiert sind
  • Ein Ziel diagnostischer Verfahren ist es, das Auftreten einzigartiger Proteine mit spezifischen Krankheitsvorgängen in Korrelation zu bringen. Manche dieser Korrelationen sind offensichtlich, z. B. können nach bakteriellen oder viralen Infektionen Antigene detektiert werden, die antigenspezifisch sind, oder Antikörper zu solchen Antigenen, die nicht im Blut von nicht infizierten Individuen zu finden sind. Weniger offensichtliche Korrelationen umfassen das Auftreten von α-Fetoprotein, das direkt in Korrelation steht mit der Gegenwart der häufigsten Form von Hodenkrebs, im Serum.
  • Das PhotoSELEX-Verfahren kann auf die Entdeckung von vordem unbekannten Korrelationen zwischen biologischen Proteinen und wichtigen menschlichen Erkrankungen angewandt werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird einem Patienten mit einer Erkrankung Serum entnommen, es werden RNA-Liganden für alle Proteine im Serum hergestellt und zu normalen Sera absorbiert. RNA-Liganden für Serumproteine können durch das SELEX-Verfahren identifiziert werden, mit darauf folgender Inkorporation photoreaktiver Gruppen, oder sie können durch PhotoSELEX identifiziert werden, anfänglich aus einem geeigneten Gemisch an Oligonucleotiden selektiert, die eine oder mehrere photoreaktive Gruppe(n) enthalten. RNA-Liganden, die ungebunden bleiben, sind jene, die spezifisch nur einzigartige Proteine in dem Serum von Patienten mit dieser Erkrankung binden. RNA-Liganden werden z. B. anfänglich für eine eingeschränkte Anzahl an Serumproteinen (z. B. 11) identifiziert. Die identifizierten RNA-Liganden enthalten ein modifiziertes NTP mit einer reversiblen oder photoreaktiven funktionalen Gruppe, die in der Lage ist, reversibel oder irreversibel eine Vernetzung mit dem Target-Protein einzugehen. Gegebe nenfalls kann die Gegenwart eines vernetzten Liganden für jedes Protein verifiziert werden. Die RNA-Liganden werden anschließend entfernt und amplifiziert. Anschließend wird die RNA für eine zweite SELEX-Runde transkribiert. Die RNA ist nun an einen großen Überschuss von 10 der ursprünglich 11 Proteine gebunden, was einen RNA-Liganden überlässt, der für das einzigartige (11.) Protein spezifisch ist. Diese RNA wird nun amplifiziert. Dies ist ein Subtraktivverfahren.
  • In einer Ausführungsform des diagnostischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird das oben stehend beschriebene Verfahren verwendet, um einen Liganden für ein abnormales Protein, z. B. ein α-Fetoprotein, zu identifizieren. Sera von Patienten mit wichtigen Erkrankungen werden erhalten, und RNA-Liganden für alle vorliegenden Proteine werden identifiziert. Die RNA-Liganden werden an normale Sera absorbiert, wodurch ein ungebundener Ligand übrig gelassen wird. Der ungebundene Ligand ist sowohl ein potentielles diagnostisches Mittel als auch ein Werkzeug zur Identifikation von Serumproteinen, die spezifisch mit einer Erkrankung assoziiert sind.
  • Beispiel 18: Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung durch die In-vivo-Verwendung eines photovernetzenden Nucleinsäureliganden
  • Ein Nucleinsäureligand für ein Target-Molekül, das mit einem Erkrankungszustand assoziiert ist, wird durch das PhotoSELEX-Verfahren selektiert (Beispiel 11). Der PhotoSELEX-selektierte Nucleinsäureligand kann in einen Patienten auf eine Reihe an Arten, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, eingeführt werden. Der nicht-halogenierte PhotoSELEX-Ligand wird in Stammzellen kloniert, die in einen Patienten transferiert werden. Der Ligand kann vorübergehend oder konstitutiv in den Zellen des Patienten exprimiert werden. Dem Patienten verabreichtes IC wird in das Oligonucleotidprodukt der klonierten Sequenz inkorporiert. Nach der Bestrahlung ist der Ligand in der Lage, an das Target-Molekül zu vernetzen. Die Bestrahlung kann sichtbares, 325-nm-, 308-nm-, Röntgenstrahlen-, ultraviolettes und Infrarot-Licht umfassen.
  • Alternativ dazu kann der PhotoSELEX-Ligand als doppelsträngige DNA, die in der Zelle in Gegenwart von iodiertem Cytosin transkribiert wird, in die Zellen eines Patienten aufgenommen werden. Weitere Verfahren zur Einführung des PhotoSELEX-Liganden in einen Patienten umfassen die Liposomen-Anlieferung des halogenierten Liganden in die Zellen des Patienten.
  • Beispiel 19: PhotoSELEX-Liganden zur Verwendung in der In-vitro-Diagnose, der In-vivo-Bildgebung und der therapeutischen Zufuhr
  • PhotoSELEX kann verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren, die spezifisch mit einem Erkrankungszustand und/oder abnormalen Zellen, wie z. B. Tumor-Zellen, assoziiert sind. Es können PhotoSELEX-identifizierte Oligonucleotide hergestellt werden, die kovalent mit solchen Marker-Molekülen reagieren.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Target für PhotoSELEX das abnormale Serum oder die Tumor-Zelle (z. B. das Target-Gemisch). Ein geeignetes Bibliotheksgemisch an Oligonucleotiden wird erzeugt, enthaltend photoreaktive Gruppen. Unter Verwendung einer der oben beschriebenen PhotoSELEX-Arbeitsvorschriften werden Oligonucleotide identifiziert, die in der Lage sind, an die einzigartigen Proteine in dem abnormalen Serum oder auf den Tumor-Zellen zu photovernetzen. Oligonucleotide, die in der Lage sind, an ein Marker-Protein auf einer Tumor-Zelle zu vernetzen, sind als In-vitro-Diagnosemittel oder bei Kopplung an Verstärkugnsmittel für die In-vitro-Bildgebung von Nutzen. Weiters können Oligonucleotide, die in der Lage sind, an ein Marker-Protein auf einer Tumor-Zelle zu vernetzen, therapeutisch verwendet werden, z. B. als ein Verfahren zur Immunaktivierung, als ein Verfahren zur Deaktivierung oder als ein Verfahren zur Anlieferung spezifischer targetaktiver pharmazeutischer Verbindungen.
  • Beispiel 20: PhotoSELEX und HIV-1-Rev
  • An jeder Position der Matrizen-Desoxyoligonucleotid-Synthese war das Verhältnis des Nucleotid-Reagens 62,5:12,5:12,5:12,5. Das in größerer Menge an jeder Positi on hinzugefügte Nucleotid entspricht dem Nucleotid, das in der 6a-Sequenz (Seq.-ID Nr. 5) an derselben Position gefunden wurde.
  • Klonierungs- und Sequenzierungs-Verfahren: RNAs, die aus jeder Runde isoliert wurden, wurden umkehrtranskribiert, um cDNA zu produzieren, und PCR-amplifiziert, wodurch ein 111-bp-Fragment mit einzigartigen BamHI- und HindIII-Restriktionsstellen an den Enden produziert wurde. Das Phenol/CHCl3-behandelte Fragment und ein pUC18-Vektor wurden über Nacht zusammen mit BamHI und HindIII bei 37°C verdaut, Phenol/ChCl3-behandelt und präzipitiert. Der verdaute Vektor und das PCR-Produkt wurden bei Raumtemperatur 4 Stunden lang und mit T4-DNA-Ligase ligiert und in kompetente DH5α-F'-Zellen transformiert, die anschließend auf ampicillinhältigen LB-Platten wachsen gelassen wurden. Einzelne Kolonien wurden über Nacht in LB-Ampicillin-Medien wachsen gelassen, und Plasmid wurde unter Verwendung eines Wizard-Plasmid-Herstellungssets (Promega) hergestellt. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung eines Sequenase-Sets (USB) durchgeführt.
  • Bedingungen für Nitrocellulosefilter-Eindungs-Selektionen: Alle Runden verwendeten etwa 20 nM RNA. Runde 1 und 2: 6 nM Rev. Runde 3: 3 nM Rev. Runde 8: 1 nM Rev. Runde 9–10: 3 nM Rev. Die Bindungsreaktions-Volumenmengen lagen in einem Bereich von 5 ml bis 1 ml.
  • Bedingungen für Vernetzungs-Selektionen: Etwa 50–100 nM gefaltete Pool-RNA wurden zu 0,2 (Runden 4–6) oder 0,5 (Runde 7) μM Rev, 1 μM BSA in 1 × BB (50 mM TrisAc, pH 7,7, 200 mM KOAc, 10 mM DTT) auf Eis hinzugefügt und 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden anschließend bei 37°C bestrahlt, und zwar für 3 Minuten bei 308 nm von einem XeCl-Excimer-Laser (Runde 4), 30 Minuten bei 325 nm von einem HeCd-Laser (Runde 5), 10 Minuten bei 325 nm (Runde 6) oder 1 Minute bei 325 nm (Runde 7). Etwa die Hälfte der Probe wurde in 50% Formamid, 40 μg tRNA bei 90°C 4 Minuten lang erhitzt und mittels Elektrophorese in einem 8-%-Polyacrylamid/8-M-Harnstoff-Gel getrennt.
  • Das folgende Verfahren wurde verwendet, um vernetzte RNAs aus Acrylamidgelen mit etwa 80% Gewinnung zu verwenden: Das Nucleoprotein enthaltende Gel-Stück wurde zu einer homogenen Aufschlämmung in einem 1 × PK-Puffer (100 mM Tris-Cl, pH 7,7, 50 mM NaCl und 10 mM EDTA) zerkleinert. Proteinase K wurde zu 1 mg/ml Konzentration hinzugefügt und bei 42°C 30 Minuten lang inkubiert. 15-Minuten-Inkubationen bei 42°C mit ansteigenden Harnstoff-Konzentrationen von etwa 0,7 M, 1,9 M und 3,3 M wurden durchgeführt. Die resultierende Lösung wurde durch DMCS-behandelte Glaswolle und 0,2-μm-Celluloseacetatfilter laufen gelassen. Die filtrierte Lösung wurde zwei Mal mit Phenol/CHCl3 extrahiert und anschließend mit einem 1:1-Gemisches (Vol.) an EtOH:Isopropanol präzipitiert.
  • Die vernetzte Bande aus jeder Runde wurde in Szintillationsflüssigkeit platziert und in einem Beckman-LS-133-Flüssigkeits-Szintillationssystem gezählt. Der vernetzte Prozentsatz = cpm des vernetzten Produkts aus RNA + Rev nach 4 Minuten Bestrahlung bei 325 nm minus cpm in der vernetzten Region für RNA, die nur bestrahlt wurde, geteilt durch Gesamt-cpm. Die Zunahme der Vernetzung ist der % an vernetztem R13, geteilt durch % an vernetztem D37.
  • Die simultane Selektion auf Affinität sowie die Vernetzung unter Verwendung von tRNA wurde folgendermaßen durchgeführt. 10 μM Hefe-tRNA wurden zu 0,5 μM Rev, 1 μM BSA in 1 × BB (50 mM TrisAc (pH 7,7), 200 mM KOAc, 10 mM DTT) hinzugefügt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. 200.000 cpm (etwa 50–100 nM Endkonzentration RNA) wurden hinzugefügt und zusätzliche 15 bis 60 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von 5 Minuten bei 37°C. Anschließend wurden die Proben 4 Minuten bei 325 nm durch einen HeCd-Laser bei 37°C bestrahlt. Etwa ein Drittel der Probe wurde in 50% Formamid, 40 μg tRNA bei 90°C 4 Minuten lang erhitzt und mittels Elektrophorese in einem 8-%-Polyacrylamid/8-M-Harnstoff-Gel getrennt.
  • Die LI-vernetzenden RNA-Liganden bilden ein zusätzliches vernetztes Produkt mit einer 325-nm-Laser-Bestrahlung von 4 Minuten.
  • Die Matrizen-Oligos, die verwendet werden, um die trunkierten RNAs zu produzieren, sind: PTS-1, 5'-TAATACGACTCACTATA-3' (Seq.-ID Nr. 60), DNA-2, 5'-GAGTGGAAACACACGTGGTGTTT-CATACACCCTATAGTGAGTCGTATTA-3' (Seq.-ID Nr. 61), und DNA-24, 5'-AGGGTTAACAGGTGTGCCTGTTAATCCCCTATAGT-GAGTCGTATTA-3' (Seq.-ID Nr. 62). PTS-1 wurde mit DNA-2 oder DNA-24 anelliert, um eine Matrize zur T7-Transkription zu produzieren.
  • Um die Anzahl der Veränderungen für einzelne Moleküle im Vergleich zu 6a (Seq.-ID Nr. 5) zu berechnen, wurde jedes zur maximalen Ähnlichkeit an 6a angeordnet. Lücken wurden als eine Veränderung berechnet, und trunkierte Moleküle wurden als unverändert gezählt. Um die durchschnittliche Wahrscheinlichkeit des Findens von Molekülen innerhalb jeder Klasse zu berechnen, wurde die durchschnittliche Anzahl spezifischer (s) und nicht spezifischer (ns) Veränderungen und unveränderter (u) Moleküle berechnet und in der Gleichung verwendet:
    (P) = (0,125)s(0,375)ns(0,625)u; Klasse Ia (P) = 9 × 10–15; Ib (P) = 3 × 10–15; Ic (P) = 7 × 10–13; Id (P) = 3 × 10–15; Klasse II (P) = 2 × 10–14. Da die Ausgangspopulation aus 1014 Molekülen besteht, sind Sequenzen mit (P) < 10–14 nicht vorhanden. (s) sind jene Veränderungen, die erforderlich sind, um den oberen Fall zu erreichen, Konsensus-Nucleotide und (ns) sind zusätzliche Veränderungen.
  • Photounabhängige Trunc24-Vernetzung (Seq.-ID Nr. 59) mit HIV-1-Rev in Gegenwart menschlicher Kernextrakte wurde folgendermaßen bestimmt: Trunc24-RNA, Kernextrakte und Rev-Protein wurden kombiniert und auf Eis 10 Minuten lang inkubiert. Die Proben wurden 1:1 mit 8 M Harnstoff-Ladungspuffer gemischt und auf einem 7-M-Harnstoff/8-%-Polyacrylamid-Gel zur Analyse platziert, wobei XL den Nucleoprotein-Komplex angibt und RNA freie trunc24-RNA angibt.
  • Die unten stehend beschriebenen Beispiele 21–26 sind keine Ausführungsformen, die Teil der von diesem Patent beanspruchten Erfindung sind, sind jedoch zum Verständnis der beanspruchten Erfindung von Nutzen.
  • Beispiel 21: Primerextensionsinhibierungs-Solution-SELEX
  • Die Primer-Extensions-Inhibierung beruht auf der Fähigkeit eines eng gebundenen Target-Moleküls, die cDNA-Synthese von Oligonucleotiden hoher Affinität zu inhibieren, und führt zur Bildung eines amplifizierbaren cDNA-Pools entsprechend Oligonucleotiden hoher Affinität und eines nicht amplifizierbaren cDNA-Pools entsprechend Oligonucleotiden niedriger Affinität. Daher dient der PCR-Schritt von Solution-SELEX als ein Abtrennungsscreen zwischen zwei cDNA-Pools. Allgemeine Arbeitsvorschriften für die Nucleinsäuresynthese, die Primer-Extensions-Inhibierung und PCR werden hierin bereitgestellt. Weiters werden elektrophoretische N-Acryloylaminophenylquecksilber-Gel-Bedingungen zur Trennung ausgewählter Nucleinsäureliganden beschrieben. Die Verfahren zum Klonieren und Sequenzieren von Nucleinsäureliganden sind wie von Tuerk und Gold, s. o. (1990) beschrieben.
  • RNA-Synthese. Das geeignete RNA-Gemisch wurde durch Inkubieren von RNA-Polymerase und DNA-Matrizen erzeugt. Die Reaktionsbedingungen bestehen aus 8% Polyethylenglykol 8000, 5 mM Dithiothreit, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12 mM MgCl2, 1 mM Spermidin, 0,002% Triton-X-100, 2 mM Nucleotidtriphosphaten und 1 Einheit/μl RNA-Polymerase. Die Reaktionen wurden bei 37°C 2 Stunden lang inkubiert.
  • Die Transkriptions-Arbeitsvorschrift kann verwendet werden, um RNAs mit modifizierten Nucleotiden zu erzeugen. Die Transkriptionsreaktion kann entweder mit einem Nucleotidtriphosphat-Derivat geprimt werden (um ein modifiziertes 5'-Ende zu erzeugen), modifizierte Nucleotide können zufällig in die entstehende RNA-Kette inkorporiert werden, oder Oligonucleotide oder ihre Derivate können auf die 5'- oder 3'-Enden des RNA-Produkts ligiert werden.
  • Primer-Extensions-Inhibierung. Die Primer-Extensions-Inhibierung wird wie von Hartz et al., s. o. (1988), beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wird ein Oligonucleotid-Primer an das 3'-Ende der Oligonucleotide des geeigneten Gemisches anelliert, in dem diese mit einem 2fachen molaren Überschuss des Primers bei 65°C 3 Minuten lang in destilliertem Wasser inkubiert werden. Die Anellierungsreaktion wird auf Eis gekühlt, gefolgt von der Addition von 1/10 Volumeneinheiten an 10X-konzentriertem Extensionspuffer (z. B. 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 60 mM NH4Cl, 10 mM Mg-Acetat, 6 mM β-Mercaptoethanol und 0,4 mM Nucleotidtriphosphaten). Die Primer-Extension wird durch die Addition von Polymerase und die Inkubation bei einer beliebigen einer Reihe von Temperaturen initiiert, die von zwischen 0–80°C reichen, und für Zeitspannen, die von ein paar Sekunden bis zu mehreren Stunden reichen. In einer Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird die Primer-Extension zuerst in der Gegenwart von kettenabbrechenden Nucleotidtriphosphaten durchgeführt, so dass Nucleinsäuren niedriger Affinität vorzugsweise diese Ketten-Terminatoren inkorporieren. Eine zweite Primer-Extension wird anschließend durchgeführt, nachdem das Target von Nucleinsäuren hoher Affinität und die kettenabbrechenden Nucleotidtriphosphate entfernt wurden.
  • Polymerase-Kettenreaktion. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird durch Inkubieren einer Oligonucleotid-Matrize, entweder einzel- oder doppelsträngig, mit 1 Einheit/μl thermisch stabiler Polymerase in Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,6), 2,5 mM MgCl2, 1,7 mg/ml BSA, 1 mM Desoxynucleotidtriphosphate und 1 μM Primer) erreicht. Thermische Standard-Zyklen liegen bei 95°C 30 Sekunden, 55°C 30 Sekunden und 72°C 1 Minute, wiederholt je nach Notwendigkeit. Eine Modifikation des PCR-Protokolls erzeugt einzelsträngige DNA durch Inkubieren einer entweder einzel- oder doppelsträngigen Matrize mit einem einzelnen verlängerten Primer-Oligonucleotid und führt zu einem verlängerten Produkt. Die PCR amplifiziert vorzugsweise die in den oben beschriebenen Primer-Extensionsschritten amplifizierbar gemachten Oligonucleotide.
  • (N-Acrloylamino)phenylquecksilber-Gelelektrophorese. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von N-Acryloylaminphenylquecksilber (APM) wurde durchgeführt wie von Igloi, Biochemistry 27, 3842 (1988), beschrieben. APM wurde durch Mischen von 8 ml Acetonitril mit 0,35 g (p-Aminophenyl)quecksilberacetat bei 0°C, gefolgt von 2 ml 1,2 M NaHCO3 synthetisiert. Eine Gesamtmenge von 0,2 ml Acryloylchlorid wurde anschließend unter heftigem Rühren hinzugefügt, und die Reaktion wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Festphase wurde mittels Zentrifugierung gesammelt und mit Wasser gewaschen, durch Erwärmen auf 50°C in 8,5 ml Dioxan aufgelöst, gefolgt von einer Filtrierung zur Entfernung nicht aufgelöster Verunreinigungen. APM-Kristalle wurden nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur gebildet, und der Feststoff wurde erneut mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. APM wurde bei 4°C gelagert. APM-Polyacrylamidgele wurden durch die Addition eines geeigneten aliquoten Anteils einer 1-mg/ml-Lösung von APM in Formamid zu einer Lösung hergestellt, die eine bestimmte Menge an Acrylamid, Bis(acrylamid), einen Harnstoff in 0,1 M Tris-Borat/EDTA (pH 8,3) enthielt. Die Polymerisation wurde durch die Addition von 0,5 ml 1-%-Ammoniumpersulfat und 7 μl TEMED pro 10 ml Gellösung initiiert.
  • Beispiel 22: Enzymatische oder chemische Abbau-Solution-SELEX
  • Enzyme oder Chemikalien können verwendet werden, um den cDNA-Pool entsprechend Oligonucleotiden geringer Affinität selektiv abzubauen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Restriktionsenzyme verwendet, um den cDNA-Pool entsprechend Oligonucleotiden geringer Affinität selektiv abzubauen. Es wurde eine Reihe an Restriktionsenzymen identifiziert, die einzelsträngige DNA spalten. Diese Enzyme spalten an spezifischen Sequenzen, jedoch mit variierender Wirksamkeit.
  • Der Restriktionsenzym-Verdau kann mit einer Reihe sequenzspezifischer Restriktionsendonucleasen durchgeführt werden. Endonucleasen, die einzelsträngige DNA spalten, umfassen DdeI, HaeIII, HgaI, HinfI, HinPI, MnlI, PstI und RsaI. Diese Enzyme werden bei Standardbedingungen verwendet, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt sind. Doppelsträngige Nucleinsäuren können auch unter Verwendung der geeigneten Kombination von Nucleinsäure-Restriktionssequenzen und ortsspezifischer Restriktionsnucleasen gespalten werden.
  • Dem grundlegenden Solution-SELEX-Verfahren wird wie in den SELEX-Patentanmeldungen beschrieben gefolgt Die erste cDNA-Extension wird in Gegenwart von vier dNTPs durchgeführt, gefolgt von der Entfernung des Targets. Die zweite cDNA-Extension wird mit modifizierten Nucleotiden durchgeführt, die gegenüber enzymatischer Spaltung durch Restriktionsendonucleasen resistent sind. Das Gemisch an cDNA-Extensionsprodukten wird mit dem geeigneten Restriktionsenzym inkubiert. Das Produkt der ersten cDNA-Extension aus freier Nucleinsäure wird gespalten, um die Primer-Anellierungsstelle zu entfernen, wodurch dieser cDNA-Pool durch PCR nicht amplifizierbar wird. Die Wirksamkeit der Spaltung durch Restriktionsendonucleasen kann unter Verwendung einer Haarnadel an der Restriktionsstelle (RS) verbessert werden, um eine lokalisierte doppelsträngige Region zu schaffen, wie in 24 dargestellt.
  • Alternativ dazu wird das erste cDNA-Extensionsprodukt durch andere Klassen an Enzymen durch Inkorporation modifizierter Nucleotide selektiv abbaubar gemacht. cDNA, die Liganden niedriger Affinität entspricht, kann z. B. mit Nucleotiden synthetisiert werden, die auf Uracil-DNA-Glycosylase empfindlich sind, während cDNA, die Liganden hoher Affinität entspricht, resistente Nucleotide inkorporieren kann.
  • Chemischer Abbau von cDNA, die Liganden niedriger Affinität entspricht, kann durch Inkorporation von 7-Methylguanosin, 5-Bromuracil oder 5-Ioduracil erreicht werden, wie unter Verwendung von Piperidin oder Photoabbau beschrieben wird (Sasse-Dwight und Gralla, Methods Enzymol. 208, 146 (1991); Aigen und Gumport, Methods Enzymol. 208, 433 (1991); Hockensmith et al., Methods Enzymol. 208, 211 (1991)).
  • Beispiel 23: Solution-SELEX gefolgt von Affinitätschromatographie
  • Die selektive Entfernung entweder der ersten oder zweiten cDNA-Extensionsprodukte kann durch Affinitätschromatographie erreicht werden. Die Entfernung des ersten cDNA-Extensionsprodukts entfernt vorzugsweise den cDNA-Pool, der freien oder Nucleinsäureliganden niedriger Affinität entspricht. Die Entfernung des zweiten cDNA-Extensionsprodukts behält vorzugsweise cDNA bei, die dem Liganden hoher Affinität entspricht. Diese Strategie beruht auf der Inkorporierung der modifizierten Nucleotide während der cDNA-Synthese.
  • Selektive Entfernung des ersten Extensionsprodukts
  • Nach dem grundlegenden Solution-SELEX-Protokoll wird die erste cDNA-Extension in Gegenwart modifizierter Nucleotide durchgeführt (z. B. biotinyliert, iodiert, thiomarkiert oder ein beliebiges anderes modifiziertes Nucleotid), die eine Retention des ersten cDNA-Pools auf einer Affinitätsmatrix ermöglichen (25). Das Target wird anschließend entfernt, und die zweite cDNA-Extension wird in Gegenwart nicht modifizierter Nucleotide durchgeführt. Die cDNAs, welche die modifizierten Nucleotide inkorporiert haben, können mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Säule entfernt werden, die den entsprechenden Affinitätsliganden enthält. Der cDNA-Pool, der Nucleinsäuren mit hoher Affinität für das Target entspricht, wird beibehalten und anschließend mittels PCR amplifiziert.
  • Selektive Entfernung des zweiten Extensionsprodukts
  • Nach dem grundlegenden Protokoll wird die erste cDNA-Extension in Gegenwart von vier dNTPs durchgeführt, und die zweite cDNA-Extension wird in Gegenwart modifizierter Nucleotide durchgeführt (z. B. biotinyliert, iodiert, thiomarkiert oder ein beliebiges anderes modifiziertes Nucleotid), die eine Retention des zweiten cDNA-Pools auf einer Affinitätsmatrix ermöglichen, wie oben stehend beschrieben ist.
  • Inkorporation spezifischer Sequenzen zum Anellieren an eine Affinitätsmatrix
  • In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann eine spezielle Sequenz auch selektiv zum Anellieren an eine Affinitätsmatrix inkorporiert werden. Daher können entweder cDNAs der ersten oder der zweiten Synthese zurückbehalten werden und wie gewünscht auf im Handel erhältlichen Matrizen gereinigt werden.
  • Beispiel 24: Exonucleaseinhibierungs-Solution-SELEX
  • Die Exonuclease-Inhibierung kann verwendet werden, um doppelsträngige Liganden zu isolieren. Doppelsträngige Nucleinsäureliganden, die eng an das Target-Molekül gebunden sind, inhibieren die Exonuclease-Hydrolyse am 3'-Ende der Bindungsstelle. Dies führt zu einer Population an Nucleinsäure-Molekülen, die gegen Hydrolyse resistent sind, die auch einen langen einzelsträngigen 5'-Überhang und eine zentrale basengepaarte Region enthalten (siehe 26). Dieses Nucleinsäuremolekül ist ein Substrat für eine beliebige Polymerase, und die Inkubierung mit Polymerase erzeugt das doppelsträngige Ausgangsmaterial. Dieses Molekül wird mittels PCR amplifiziert. Mitglieder des geeigneten Nucleinsäure-Gemisches, die nicht eng an das Target-Molekül gebunden sind, werden während des anfänglichen Exonuclease-Schritts verdaut.
  • Die 3' → 5'-Hydrolyse doppelsträngiger Nucleinsäure wird durch Inkubation mit einer beliebigen doppelsträngigen spezifischen 3' → 5'-Exonuclease erreicht. Exonuclease III hydrolyisiert spezifisch doppelsträngige DNA 3' → 5' und ist in einer Reihe von Puffern aktiv, unter anderem 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM MgCl2, 10 mM β-Mercaptoethanol bei 37°C.
  • Beispiel 25: Solution-SELEX-Verfahren zur Isolation katalytischer Nucleinsäuren
  • Solution-SELEX kann verwendet werden, um katalytische Nucleinsäuresequenzen zu isolieren. Diese Ausführungsform der Erfindung nutzt eine lineare bis zirkuläre Transformation, um nicht katalytische Nucleinsäuren von katalytischen Nucleinsäuren auszusortieren.
  • Wie in 27 dargestellt, kann der PCR-Schritt ausgenutzt werden, um das geeignete Nucleinsäure-Gemisch auf katalytische Mitglieder zu screenen. Katalytische Nucleinsäuren, die entweder selbst zirkularisieren oder ihre 5'- oder 3'-Enden verändern, um eine Zirkularisierung mit Ligase zu ermöglichen, amplifizieren während der PCR.
  • Die Fig. zeigt die Ringbildung durch katalytische Mitglieder des geeigneten Gemisches; die nicht katalytischen Oligonucleotid-Mitglieder des geeigneten Gemisches bleiben linear. Nach der Zirkularisation wird das geeignete Gemisch mit einem Primer inkubiert, der an das äußerste 5'-Ende anelliert. In dieser Ausführungsform der Erfindung erzeugen nur die zirkulären Oligonucleotid-Mitglieder cDNA und werden während des PCR-Schritts amplifiziert.
  • Diese Strategie isoliert Nucleinsäuren, die entweder die Selbst-Zirkularisation direkt katalysieren oder die ihre eigenen Enden modifizieren, so dass die amplifizierbare Form durch Inkubation mit Ligase erzeugt werden kann. Wie in 27 dargestellt, ermöglicht die ungewöhnliche Wechselwirkung des cDNA-Primers mit dem 5'-Ende der Oligonucleotide des geeigneten Gemisches die Amplifikation lediglich der zirkulären Moleküle. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird diese Strategie modifiziert, um die Isolation katalytischer Nucleinsäuren zu modifizieren, die neue Reaktionen katalysieren.
  • Beispiel 26: Automatisierung von Solution-SELEX
  • Das automatisierte Solution-SELEX-Protokoll stellt eine Modifikation des in dem automatisierten DNA-Synthesegerät verwendeten Verfahrens dar. Das geeignete Nucleinsäure-Gemisch wird an einen festen Träger gebunden, und zwar entweder durch die Biotin/Avidin-Wechselwirkung oder durch eine Reihe von kovalenten chromatographischen Verfahren (z. B. die Kondensation modifizierter Nucleotide auf Maleinimid- oder Citraconsäureanhydrid-Träger). Das geeignete gebundene Nucleinsäure-Gemisch stellt ein gutes Substrat für das Targeting der Bindung bereit, und die Säule ermöglicht die Verwendung eines einzelnen Reaktionsgefäßes für das SELEX-Verfahren. Die Primer-Extensions-Inhibierung wird verwendet, um Liganden niedriger und hoher Affinität physikalisch zu sortieren. Nucleinsäuren niedriger Affinität können durch Inkorporation modifizierter Nucleotide während des ersten cDNA-Extensionsschritts abgebaut werden, der die cDNA abbaubar macht, wie in Beispiel 22 beschrieben, während Liganden hoher Affinität in nicht abbaubare cDNA kopiert werden und mittels PCR amplifiziert werden. Für zusätzliche Runden an Solution-SELEX wird das PCR-erzeugte geeignete Gemisch gereinigt oder in RNA transkribiert und in demselben oder einem neuen Reaktionsgefäß, je nach Wunsch, erneut auf einen zweiten festen Träger gebunden. Der Vorgang wird je nach Notwendigkeit wiederholt.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (47)

  1. Verfahren zur Identifikation von Nucleinsäureliganden, die bei Bestrahlung zur kovalenten Bindung eines Zielmoleküls in der Lage sind, aus einem geeigneten Nucleinsäuregemisch, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Herstellen eines geeigneten Nucleinsäuregemischs, wobei jede Nucleinsäure zumindest eine photoreaktive Gruppe enthält; (b) das Kontaktieren des geeigneten Gemischs mit dem Zielmolekül, worin die Nucleinsäuresequenzen mit erhöhter Affinität zum Zielmolekül im Vergleich zum geeigneten Gemisch Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe bilden; (c) das Bestrahlen des geeigneten Gemischs, worin sich einige der Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe kovalent photovernetzen; (d) das Abtrennen der vernetzten Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe von freien Nucleinsäuren im geeigneten Gemisch; und (e) das Identifizieren der Nucleinsäuresequenzen, die sich mit dem Zielmolekül photovernetzten.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Nucleinsäuregemisch hergestellt wird und das nach Schritt (d) weiters Folgendes umfasst: I. das Amplifizieren der Nucleinsäuren, die sich mit dem Zielmolekül photovernetzten, um ein Nucleinsäuregemisch zu erhalten, das mit Sequenzen angereichert ist, die zur Photovernetzung mit dem Zielmolekül in der Lage sind; und II. das Wiederholen der Schritte (b)–(d) unter Verwendung des angereicherten Gemischs der einzelnen aufeinander folgenden Wiederholungen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Nucleinsäuregemisch hergestellt wird und das nach Schritt (d) weiters Folgendes umfasst: I. das Amplifizieren der Nucleinsäuren, die sich mit dem Zielmolekül photovernetzten, um ein Nucleinsäuregemisch zu erhalten, das mit Sequenzen angereichert ist, die zur Photovernetzung mit dem Zielmolekül in der Lage sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Zielmolekül ein Protein ist und das weiters das Entfernen des Protein-Zielmoleküls aus den Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexen durch proteolytischen Verdau des Proteins nach Schritt (d) umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin das Zielmolekül ein Protein ist und das weiters das Entfernen des Protein-Zielmoleküls aus den Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexen durch proteolytischen Verdau des Proteins vor der Amplifikation der Nucleinsäuren, die sich mit dem Zielmolekül photovernetzen, umfasst.
  6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Zielmolekül eine biologische Aktivität aufweist, die zu einer Modifikation durch den Nucleinsäureliganden in der Lage ist.
  7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das geeignete Nucleinsäuregemisch aus Schritt (a) durch ein Verfahren hergestellt wurde, das Folgendes umfasst: (a') das Herstellen eines geeigneten Gemischs von Nucleinsäuren, die photoreaktive Gruppen enthalten; (b') das Kontaktieren des geeigneten Gemischs mit dem Zielmolekül, worin Nucleinsäuresequenzen mit erhöhter Affinität zum Zielmolekül im Vergleich zum geeigneten Gemisch Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe bilden; (c') das Bestrahlen des geeigneten Gemischs, worin sich die Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe photovernetzen; (d') das Abtrennen der Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität vom Rest des geeigneten Gemischs oder, wenn eine Vernetzung gemäß Schritt (c') stattgefunden hat, der vernetzten Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe von freien Nucleinsäuren im geeigneten Gemisch; und (e') das Amplifizieren der Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität, um ein mit Liganden angereichertes Nucleinsäuregemisch zu erhalten.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Bestrahlungsdauer in späteren Durchgängen kürzer ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das geeignete Nucleinsäuregemisch aus Schritt (a) durch ein Verfahren hergestellt ist, das Folgendes umfasst: (i) das Herstellen eines geeigneten Gemischs von Nucleinsäuren mit unterschiedlicher Sequenz, wobei jede Nucleinsäure zumindest eine photoreaktive Gruppe umfasst; (ii) das Kontaktieren des geeigneten Gemischs mit dem gewählten Ziel unter Bedingungen, die für die Bindung zwischen dem Ziel und Elementen des geeigneten Gemischs vorteilhaft sind; (iii) das Abtrennen ungebundener Nucleinsäuren von jenen Nucleinsäuren, die an das Ziel gebunden haben; (iv) das Amplifizieren der in (iii) als solche mit vergleichsweise höherer Affinität zum Ziel ausgewählten Nucleinsäuren, um ein neues geeignetes Gemisch herzustellen, das mit Nucleinsäuren mit vergleichsweise höherer Affinität für das Ziel angereichert ist; (v) das Wiederholen der Schritte (ii)–(iv) für eine gewünschte Anzahl an Durchgängen.
  10. Verfahren zur Identifikation von Nucleinsäureliganden, die bei Bestrahlung zur kovalenten Bindung eines Zielmoleküls in der Lage sind, aus einem geeigneten Nucleinsäuregemisch, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Herstellen eines geeigneten Nucleinsäuregemischs; (b) das Kontaktieren des geeigneten Gemischs mit dem Zielmolekül, worin die Nucleinsäuresequenzen mit erhöhter Affinität zum Zielmolekül im Vergleich zum geeigneten Gemisch Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe bilden; (c) das Abtrennen der Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität vom Rest des geeigneten Gemischs; und (d) das Amplifizieren der Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität, um ein mit Liganden angereichertes Nucleinsäuregemisch zu erhalten, wodurch Nucleinsäureliganden des Zielmoleküls identifiziert werden können; (e) das Inkorporieren zumindest einer photoreaktiven Gruppe in die Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität; (f) das Wiederholen von Schritt (b); (g) das Bestrahlen der Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität, worin sich einige der Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe kovalent photovernetzen; (h) das Wiederholen der Schritte (d) und (e).
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin Schritt (e) weiters eine begrenzte Randomisierung der Nucleinsäuren mit erhöhter Affinität umfasst.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, worin Schritt (e) weiters die Substitution von photoreaktiven Nucleinsäure-Nucleotiden an bestimmten Stellen im Liganden umfasst.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Substitutionen am Liganden in Bereichen des Moleküls durchgeführt werden, die bekannterweise mit dem Zielmolekül Wechselwirken.
  14. Verfahren nach Anspruch 10, worin Schritt (e) weiters eine partielle Zufallsinkorporation der photoreaktiven Nucleotide umfasst.
  15. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus: 5-Bromuracil, 5-Ioduracil, 5-Bromvinyluracil, 5-Iodvinyluracil, 5-Azidouracil, 4-Thiouracil, 5-Bromcytosin, 5-Iodcytosin, 5-Bromvinylcytosin, 5-Iodvinylcytosin, 5-Azidocytosin, 8-Azidoadenin, 8-Bromadenin, 8-Iodadenin, 8-Azidoguanin, 8-Bromguanin, 8-Iodguanin, 8-Azidohypoxanthin, 8-Bromhypoxanthin, 8-Iodhypoxanthin, 8-Azidoxanthin, 8-Bromxanthin, 8-Iodxanthin, 5-Bromdesoxyuracil, 8-Brom-2'-desoxyadenin, 5-Iod-2'-desoxyuracil, 5-Iod-2'-desoxycytosin, 5-[(4-Azidophenacyl)thio]cytosin, 5-[(4-Azidophenacyl)thio]uracil, 7-Deaza-7-iodadenin, 7-Deaza-7-iodguanin, 7-Deaza-7-bromadenin und 7-Deaza-7-bromguanin.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die photoreaktive Gruppe Licht mit einer Wellenlänge absorbiert, die vom Ziel nicht absorbiert wird.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die photoreaktive Gruppe Licht mit einer Wellenlänge absorbiert, die von den nichtmodifizierten Abschnitten der Nucleinsäure nicht absorbiert werden.
  18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Bestrahlung Ultraviolettlicht, sichtbares Licht, Röntgenstrahlen oder Gamma-Strahlen umfasst.
  19. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die photoreaktive Gruppe 5-Ioduracil ist und die Nucleinsäure RNA ist und worin Licht im Bereich von 320–325 nm für die Bestrahlung verwendet wird.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin die photoreaktive Gruppe 5-Ioduracil ist, die Nucleinsäure RNA ist und das Ziel ein Protein ist, worin Licht mit 308 nm für die Bestrahlung verwendet wird.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin die photoreaktive Gruppe 5-Bromuracil oder 5-Ioduracil ist, die Nucleinsäure RNA ist und das Ziel ein Protein ist, worin Licht im Bereich von 350–400 nm für die Bestrahlung verwendet wird.
  22. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Zielmolekül kein Nucleinsäure bindendes Protein ist.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Zielmolekül aus einem Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glykoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Virus, Substrat, Metabolit, Übergangszustandsanalogon, Cofaktor, Inhibitor, Arzneimittel, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor, Pathogen, toxischen Stoff oder biologischen Effektor ausgewählt ist.
  24. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Zielmolekül spezifisch mit einer Krankheit assoziiert ist.
  25. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das geeignete Gemisch einzel- oder doppelsträngige RNA umfasst.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das geeignete Gemisch einzel- oder doppelsträngige DNA umfasst.
  27. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin jede Nucleinsäure des geeigneten Gemischs mit Nucleotiden, die eine der genannten photoreaktiven Gruppen enthalten, teilweise substituiert oder an jeder Position vollständig substituiert ist.
  28. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das geeignete Gemisch aus Oligonucleotiden besteht, die mehr als einen Typ photoreaktiver Gruppen enthalten.
  29. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die photoreaktive Gruppe 5-Halogenuridin ist, wobei das Verfahren weiters das Transkribieren ausgewählter RNA-Sequenzen, die durch das Verfahren identifiziert wurden, aus einer synthetisierten DNA-Matrize unter Verwendung von 5-Halogenuridintrisphosphat anstelle von Uridintrisphosphat umfasst.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, worin das Verfahren weiters das Herstellen und Amplifizieren von cDNA-Kopien der identifizierten RNA-Sequenzen umfasst.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, worin das Verfahren weiters das Transkribieren der amplifizierten cDNA-Sequenzen in RNA-Sequenzen in Gegenwart von photoreaktiven Gruppen umfasst.
  32. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin Nucleinsäuren des geeigneten Gemisches modifizierte Nucleotide umfassen.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, worin die Modifikation aus Rückgrat-Modifikationen, Methylierung, Modifikation von exozyklischen Cytosinaminen, Modifikation an der 2'-Position oder Substitution mit halogenierten Gruppen ausgewählt ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 32, worin die Modifikation aus 2'-NH2, 2'-F, 5-Bromuracil, 5-Ioduracil, 2'-NH2-Ioduracil, 2'-NH2-Iodcytosin, 2'-NH2-Iodadenin, 2'-NH2-Bromuracil, 2'-NH2-Bromcytosin und 2'-NH2-Bromadenin ausgewählt ist.
  35. In-vitro-Diagnoseverfahren, das die kovalente Photovernetzung eines Nucleinsäureliganden, der zumindest eine photoreaktive Gruppe enthält, in vitro an ein Zielmolekül umfasst, worin das Zielmolekül kein Nucleinsäure bindendes Protein ist und worin der Nucleinsäureligand die Fähigkeit aufweist, spezifisch an das Zielmolekül zu binden und das Zielmolekül bei Bestrahlung kovalent zu binden, und durch ein Verfahren identifiziert wurde, das folgende Schritte umfasst: (a) das Herstellen eines geeigneten Nucleinsäuregemischs, wobei jede Nucleinsäure zumindest eine photoreaktive Gruppe enthält; (b) das Kontaktieren des geeigneten Gemischs mit dem Zielmolekül, worin die Nucleinsäuresequenzen mit erhöhter Affinität zum Zielmolekül im Vergleich zum geeigneten Gemisch Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe bilden; (c) das Bestrahlen des geeigneten Gemischs, worin sich einige der Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe kovalent photovernetzen; (d) das Abtrennen der vernetzten Nucleinsäure-Zielmolekül-Komplexe von freien Nucleinsäuren im geeigneten Gemisch; und (e) das Identifizieren der Nucleinsäuresequenzen, die sich mit dem Zielmolekül photovernetzten.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, worin das Diagnoseverfahren die Diagnose einer Krankheit, eines pathologischen Zustands oder eines toxischen Zustands umfasst.
  37. Verfahren nach Anspruch 35 oder 36, worin das Diagnoseverfahren den Schritt des Bestrahlens des Nucleinsäureliganden umfasst.
  38. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, worin das Diagnoseverfahren den Schritt des Nachweisens der Gegenwart eines Zielproteins durch Bindung eines der genannten RNA-Nucleinsäureliganden an das Protein und dann Photovernetzung des RNA-Nucleinsäureliganden mit dem Protein umfasst.
  39. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 38, worin der Ligand an einen Träger gebunden ist und verwendet wird, um ein Zielmolekül kovalent einzufangen.
  40. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 37, das die Verwendung des Nucleinsäureliganden für In-vitro-Bildgebung umfasst, worin der Nucleinsäureligand in der Lage ist, sich mit einem Markerprotein auf einer Tumorzelle zu vernetzen, und an einen Verstärker gebunden ist.
  41. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 40, worin das Zielmolekül aus einem Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Polysaccharid, Glykoprotein, Hormon, Rezeptor, Antigen, Antikörper, Virus, Substrat, Metabolit, Übergangszustandsanalogon, Cofaktor, Inhibitor, Arzneimittel, Farbstoff, Nährstoff, Wachstumsfaktor, Pathogen, toxischen Stoff oder biologischen Effektor ausgewählt ist.
  42. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 41, worin die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus: 5-Bromuracil, 5-Ioduracil, 5-Bromvinyluracil, 5-Iodvinyluracil, 5-Azidouracil, 4-Thiouracil, 5-Bromcytosin, 5-Iodcytosin, 5-Bromvinylcytosin, 5-Iodvinylcytosin, 5-Azidocytosin, 8-Azidoadenin, 8-Bromadenin, 8-Iodadenin, 8-Azidoguanin, 8-Bromguanin, 8-Iodguanin, 8-Azidohypoxanthin, 8-Bromhypoxanthin, 8-Iodhypoxanthin, 8-Azidoxanthin, 8-Bromxanthin, 8-Iodxanthin, 5-Bromdesoxyuracil, 8-Brom-2'-desoxyadenin, 5-Iod-2'-desoxyuracil, 5-Iod-2'-desoxycytosin, 5-[(4-Azidophenacyl)thio]cytosin, 5-[(4-Azidophenacyl)thio]uracil, 7-Deaza-7-iodadenin, 7-Deaza-7-iodguanin, 7-Deaza-7-bromadenin und 7-Deaza-7-bromguanin.
  43. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 42, worin der Ligand einzel- oder doppelsträngige RNA umfasst.
  44. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 42, worin der Ligand einzel- oder doppelsträngige DNA umfasst.
  45. Verfahren nach einem der Ansprüche 35 bis 44, worin der Ligand modifizierte Nucleotide umfasst.
  46. Verfahren nach Anspruch 45, worin die Modifikation aus Rückgrat-Modifikationen, Methylierung, Modifikation von exozyklischen Cytosinaminen, Modifikation an der 2'-Position oder Substitution mit halogenierten Gruppen ausgewählt ist.
  47. Verfahren nach Anspruch 45, worin die Modifikation aus 2'-NH2, 2'-F, 5-Bromuracil, 5-Ioduracil, 2'-NH2-Ioduracil, 2'-NH2-Iodcytosin, 2'-NH2-Iodadenin, 2'-NH2-Bromuracil, 2'-NH2-Bromcytosin und 2'-NH2-Bromadenin ausgewählt ist.
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