JP2006129870A - 核酸リガンドの光選択と溶液selex - Google Patents
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Abstract
【課題】SELEX操作を用いた、標的分子に対する核酸リガンドの同定方法であって、候補核酸が光反応性基を含む方法によって同定されるリガンドの提供。
【解決手段】疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも1つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の診断に使用するための上記核酸リガンド。
【選択図】図22
【解決手段】疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも1つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の診断に使用するための上記核酸リガンド。
【選択図】図22
Description
本出願は、「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化」なる名称の米国特許出願第07/536,428号(1990年6月11日出願)(現在放棄)の一部継続出願である「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第07/714,131(1991年6月10日出願)の一部継続として出願された「核酸リガンドの光選択」なる名称の米国特許出願第08/123,935号(1994年9月17日出願)の一部継続出願である。本出願はまた、「指数関数的富化によるリガンドの系統的展開:溶液SELEX」なる名称の米国特許出願第08/143,564号(1993年10月25日出願)の一部継続でもある、この出願自体は米国特許出願第07/714,141号の一部継続出願であり、かつ「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第07/931,473号(1992年8月17日出願;1993年12月14日に米国特許第5,270,163号として発行)の一部継続出願である。
この研究はNational Institutes of Health から資金援助された合衆国政府からの助成金によって支援されたものである。合衆国政府は本発明にある一定の権利を有する。
本発明は、一部として、標的分子に結合及び/又は光架橋する及び/又は標的分子を光不活化する核酸リガンドを選択する方法に関する。標的分子はタンパク質、病原菌、毒性物質又は任意の生物学的エフェクターであることができる。本発明の核酸リガンドは光反応性又は化学的反応性基を含み、特に、疾患又は病的状態若しくは中毒状態の診断及び/又は治療のために有用である。
本発明に用いられた基礎的方法はSELEX(指数関数的富化によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)の頭字語)と呼ばれる。溶液SELEXと呼ばれる、本明細書に述べる、SELEX方法の改良は標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとのより効果的な分割を可能にする。SELEXの高アフィニティ核酸生成物の改良は、例えば検定方法、診断方法、細胞選別において、標的分子機能の阻害剤、治療剤、金属イオン封鎖剤等として、結合反応が適用される任意の目的に有用である。
「指数関数的増加によるリガンドの系統的進化」なる名称の米国特許出願第07/536,428号(1990年6月11日出願、現在放棄)、「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第07/714,131号(1991年6月10日出願)及び「核酸リガンド」なる名称の米国特許出願第07/931,473号(1992年8月17日出願、米国特許第5,270,163号として発行)に開示されたSELEX方法(以下では、SELEXと呼ぶ)は、各々が非反復配列(unique sequence) を有し、反復配列の各々が所望の標的化合物又は分子に特異的に結合する性質を有する核酸分子である生成物の種類を提供し、これらの出願の全ては個別的に引用することにより本明細書に取込まれる(本明細書ではSELEX特許出願と呼ぶ)。各核酸分子は所定の標的化合物又は分子の特異的リガンドである。SELEXは、核酸が多様な二次元又は三次元構造を形成する充分な容量と、ポリマーであれモノマーであれ、実際に任意の化学化合物に対してリガンドとして作用する(特異的結合対を形成する)ために利用可能な、充分な化学的多用性をそれらのモノマー内に有するという特有の洞察に基づくものである。任意のサイズの分子が標的として使用可能である。
SELEX方法は、結合アフィニティと選択性との実際に任意の所望の基準に達するために、同じ一般的選択テーマを用いた、候補物(candidate) の混合物からの選択と、構造的改良の段階的反復とを含む。好ましくはランダム化配列のセグメントを含む核酸混合物から出発して、この方法は結合のために有利な条件下で混合物を標的と接触させる工程と、標的分子に結合した核酸から非結合核酸を分割する工程と、核酸−標的対を解離させる工程と、核酸−標的対から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得る工程と、次に、必要なかぎりの多くのサイクルによって、結合、分割、解離及び増幅の工程を再び反復する工程とを含む。
理論によって縛られないが、SELEXは、多数の可能な配列と構造とを含む核酸混合物内に、所定の標的に対する広範囲な結合アフィニティが存在するという発明者の洞察に基づく。例えば20ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は420種の候補の可能性を有することができる。標的に対して大きいアフィニティ定数を有するものが標的と結合する最も大きな可能性を有する。分割、解離及び増幅後に、高い結合アフィニティの候補を多く含む、第2核酸混合物が形成される。追加の選択ラウンドが最良のリガンドの形成を促進して、ついには得られる核酸混合物が主として1種のみ又は数種の配列から構成されるまでになる。次に、これらをクローン化し、配列決定し、純粋リガンドとして結合アフィニティに関して個々に検査することができる。
選択、分割及び増幅のサイクルを、所望の目的に達するまで、繰り返す。大抵の一般的な場合には、サイクルの反復時に結合強度の有意な改良がもはや得られなくなるまで、選択/分割/増幅を続ける。この方法を用いて、約1018種ほど多くの核酸種のサンプルを形成することができる。試験混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、効果的な増幅のために必要な保存配列とを含む。ランダム化核酸配列の合成と、ランダムに開裂した細胞核酸からのサイズ選択とを含む、幾つかの方法で核酸配列変異体を製造することができる。可変配列部分は完全に又は部分的にランダムな配列を含むことができ;ランダム化配列と合体した保存配列のサブポーション(subportion)も含むことができる。選択/分割/増幅の反復の前に又は中に、突然変異生成によって、試験核酸中の配列変化が導入されるか又は増大することがある。
タンパク質への核酸の光架橋は、核酸中への光反応性官能基の組み入れによって達成されている。会合タンパク質に核酸を光架橋させる目的のために核酸中に組み入れられている光反応性基には、5−ブロモウラシル、4−チオウラシル、5−アジドウラシル、及び8−アジドアデニンがある(図1参照)。
ブロモウラシルは、ブロモデオキシウラシル(BrdU)及びブロモウラシル(BrU)を、それぞれ、チミン及びウラシルと置換することによって、DNA及びRNAの両方に組み入れられている。BrU−RNAはT7RNAポリメラーゼとDNA鋳型とを用いて、ウラシルに代わる5−ブロモウリジントリホスフェートによって製造されており、BrU−RNAとBrdU−DNAとは、標準核酸合成法(Talbot等(1990),Nucleic Acids Res.18:3521)において5−ブロモウラシルホスホラミジットと5−ブロモデオキシウラシルホスホラミジットとをそれぞれ用いて製造されている。会合タンパク質へのBrdU置換DNAの光架橋の若干の例を下記に挙げる:完全細胞におけるタンパク質へのBrdU置換DNA(Weintraub (1973),Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 38:247);lacリプレッサーへのBrdU置換lacオペレーターDNA(Lin と Riggs(1974),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:947;Ogata とWilbert (1977),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:4973;Barbier 等(1984)、Biochemistry 23:2933;WickとMatthews(1991),J. Biol. Chem.266:6106);EcoRI及びEcoRV制限エンドヌクレアーゼへのBrdU置換DNA(Wolfs 等(1986),Eur. J. Biochem. 159:267);環状アデノシン3’,5’−モノホスフェート受容体タンパク質への大腸菌BrdU置換DNA(Katouzian − Safadi等(1991),Photochem. Photobiol. 53:611);ヒト胎児脳抽出物からのタンパク質への、ヒトポリオーマウイルスのBrdU置換DNAオリゴヌクレオチド(Khalili 等(1988),EMBO J.7:1205);GCN4,酵母転写アクチベーターへの酵母BrdU置換DNAオリゴヌクレオチド(Blatter 等(1992),Nature 359:650);及び染色体タンパク質Mc1への、Methanosarcina sp CHT155のBrdU置換DNAオリゴヌクレオチド(Katouzian −Safadi 等(1991),Nucleic Acids Res. 19:4937)。会合タンパク質へのBrU置換RNAの光架橋も報告されている:酵母tRNAリガーゼへのBrU置換酵母先駆体tRNAPhe(Tanner等(1988),Biochemistry 27:8852)及びR17コートタンパク質へのR17バクテリオファージゲノムのBrU置換ヘアピンRNA(Gott等(1991),Biochemistry 30:6290)。
ブロモウラシルは、ブロモデオキシウラシル(BrdU)及びブロモウラシル(BrU)を、それぞれ、チミン及びウラシルと置換することによって、DNA及びRNAの両方に組み入れられている。BrU−RNAはT7RNAポリメラーゼとDNA鋳型とを用いて、ウラシルに代わる5−ブロモウリジントリホスフェートによって製造されており、BrU−RNAとBrdU−DNAとは、標準核酸合成法(Talbot等(1990),Nucleic Acids Res.18:3521)において5−ブロモウラシルホスホラミジットと5−ブロモデオキシウラシルホスホラミジットとをそれぞれ用いて製造されている。会合タンパク質へのBrdU置換DNAの光架橋の若干の例を下記に挙げる:完全細胞におけるタンパク質へのBrdU置換DNA(Weintraub (1973),Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 38:247);lacリプレッサーへのBrdU置換lacオペレーターDNA(Lin と Riggs(1974),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71:947;Ogata とWilbert (1977),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:4973;Barbier 等(1984)、Biochemistry 23:2933;WickとMatthews(1991),J. Biol. Chem.266:6106);EcoRI及びEcoRV制限エンドヌクレアーゼへのBrdU置換DNA(Wolfs 等(1986),Eur. J. Biochem. 159:267);環状アデノシン3’,5’−モノホスフェート受容体タンパク質への大腸菌BrdU置換DNA(Katouzian − Safadi等(1991),Photochem. Photobiol. 53:611);ヒト胎児脳抽出物からのタンパク質への、ヒトポリオーマウイルスのBrdU置換DNAオリゴヌクレオチド(Khalili 等(1988),EMBO J.7:1205);GCN4,酵母転写アクチベーターへの酵母BrdU置換DNAオリゴヌクレオチド(Blatter 等(1992),Nature 359:650);及び染色体タンパク質Mc1への、Methanosarcina sp CHT155のBrdU置換DNAオリゴヌクレオチド(Katouzian −Safadi 等(1991),Nucleic Acids Res. 19:4937)。会合タンパク質へのBrU置換RNAの光架橋も報告されている:酵母tRNAリガーゼへのBrU置換酵母先駆体tRNAPhe(Tanner等(1988),Biochemistry 27:8852)及びR17コートタンパク質へのR17バクテリオファージゲノムのBrU置換ヘアピンRNA(Gott等(1991),Biochemistry 30:6290)。
4−チオウラシル置換RNAは、特に、種々な会合タンパク質にt−RNAを光架橋させるために用いられている(Favre (1990),Bioorganic Photochemistry,1巻: Photochemistry and Nucleic Acids, H. Morrison編集,John Wiley & Sons :ニューヨーク,379〜425頁;Tanner等(1988),上記文献)。4−チオウラシルは4−チオウリジントリホスフェートとT7RNAポリメラーゼとを用いて、又は適当なホスホラミジットによる核酸合成を用いてRNA中に組み入れられている;これはまた、硫化水素を用いてシトシンのアミノ基をチオール基に変えることによって直接RNA中に組み入れられている。核酸への光反応性基の部位特異的組み入れのさらに他の方法は4−チオウリジリル−(3’,5’)−グアノシンの使用を含む(Wyatt 等(1992),Genes & Development 6:2542)。
会合タンパク質に光架橋する5−アジドウラシル置換及び8−アジドアデニン置換核酸の例も知られている。架橋されている会合タンパク質には、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Evans 等(1989),Biochemistry 28:713;Farrar等(1991),Biochemistry 30:3075);Xenopus TFIIIA,ジンクフィンガータンパク質(Lee 等(1991),J. Biol. Chem. 266:16478);及び大腸菌リボソームタンパク質(Wower 等(1988),Biochemistry 27:8114)がある。5−アジドウラシルと8−アジドアデニンとはDNAポリメラーゼ又は末端基トランスフェラーゼを用いてDNA中に組み入れられている。タンパク質はまた、ウシ膵臓リボヌクレアーゼAに結合した8−アジドアデノシン 3’,5’−ビホスフェート(Wower 等(1989),Biochemistry 28:1563)と、リブロースービホスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼに結合した8−アジドアデノシン 5’−トリホスフェート(SalvucciとHaley (1990),Planta 181:287)とを励起させることによって、光化学的にも標識されている。
可能な光反応性基としての8−ブロモ−2’−デオキシアデノシンはホスホラミジットを介してDNA中に組み入れられている(Liu とVerdine (1992),Tetrahedron Lett. 33:4265)。光化学反応性は今後まだ研究されなければならない。
会合タンパク質への5−ヨードウラシル置換核酸の光架橋は今までにまだ研究されていない、この理由はヨード基のサイズが問題のタンパク質への核酸の特異的な結合を妨害するからだと思われる。しかし、5−ヨード−2’−デオキシウラシル及び5−ヨード−2’−デオキシウリジン トリホスフェートは大腸菌(E. coli)からのチミジンキナーゼに光結合(photocoupling) することが判明している(ChenとPrusoff (1977),Biochemistry 16:3310)。
5−ブロモウラシル発色団の光化学反応性の機構的研究が、光架橋に関する研究を含めて、報告されている。最も重要なことには、BrUは波長依存性光化学を示す。310nm領域における照射は基底状態にまで崩壊するn,π* 一重項状態を占め、最低エネルギーの三重項状態(Dietz 等(1987),J. Am. Chem.Soc. 109:1793)、最も可能にはπ,π* 三重項(Rothman とKearns (1967),Photochem. Photobiol. 6:775)に項間交差する。三重項状態は初期電子転移とその後の共有結合形成とを介して、電子富化アミノ酸残基と反応する。電子富化芳香族アミノ酸残基チロシン、トリプトファン及びヒスチジンへ(Ito 等(1980),J. Am. Chem. Soc. 102:7535;Dietz とKoch(1987),Photochem. Photobiol. 46:971)並びにジスルフィド含有アミノ酸、シスチンへ(Dietz とKoch(1989),Photochem.Photobiol.49:121)の三重項5−ブロモウラシルの光架橋が、モデル研究において実証されている。ペプチド結合さえもが三重項BrUへの光架橋のための可能な官能基である(Dietz 等(1987),上記文献)。308nmよりも多少短い波長はn,π* 及びπ,π* 一重項状態の両方を占める。π,π* 一重項は炭素−臭素結合ホモリシス並びに三重項マニホルドへの項間交差を受ける(Dietz 等(1987),上記文献);項間交差は、一部は、n,π* 一重項状態への内部転換を介して生ずると考えられる。炭素−臭素結合ホモリシスは核酸鎖切断を生じる可能性がある(HutchinsonとKoehnlein (1980),Prog. Subcell Biol.7:1;Shetlar (1980),Photochem. Photobiol. Rev. 5:105;Saito とSugiyama(1990),Bioorganic Photochemistry,1巻:Photochemistry and Nucleic Acids, H. Morrison 編集, John Wiley & Sons,ニューヨーク,317〜378頁)。波長依存性光化学は図2のJablonski 線図に略述し、モデル光架橋反応は図3に示す。
数種のBrU置換核タンパク質複合体の照射による光架橋の位置が研究されている。lacリプレッサー−BrdU−lac−オペレーター複合体では、チロシン−17への架橋が確立されている(Allen 等(1991),J. Biol. Chem.266:6113)。古細胞染色体タンパク質MCl−BrdU−DNA複合体では、トリプトファン−74への架橋が包含されている。酵母BrdU置換DNA−GCN4酵母転写アクチベーターでは、アラニン−238への架橋が報告されている(Blatter 等(1992),上記文献)。この最後の例では、最初にπ,π* 一重項状態を占める核タンパク質を254nmにおいて照射した。
5−ヨードウラシル、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシウラシル置換DNA及び5−ヨード−2’−デオキシシトシン置換DNAについての反応性の一部の研究と機構的研究とは報告されている。5−ヨードウラシルと5−ヨード−2’−デオキシウラシルとは、過剰なシランを含むアセトニトリル−水中での、パイレックス(登録商標)ガラスを通して濾過した中圧水銀灯からの発光(emission)による照射時にアリルシランに5−位置において結合する;この機構は初期炭素−ヨウ素結合ホモリシスとその後のアリルシランのπ−結合へのラジカル添加とを経て進行することが提案された(Saito 等(1986),J. Org. Chem. 51:5148)。
5−ヨード−2’−デオキシウラシル置換DNAの好気性及び嫌気性光脱ヨウ素(photo-deiodination)は、励起波長の関数として研究されている;240nm領域における照射による量子収量に較べて、313nm領域における照射によると固有量子収量が四分の一に低下する。全ての波長において、この機構は初期炭素−ヨウ素結合ホモリシスを含むと考えられている(RahnとSellin(1982),Photochem. Photobiol. 35:459)。同様に、炭素−ヨウ素結合ホモリシスは5−ヨード−2’−デオキシウラシル置換DNAの313nmにおける照射時に生ずると考えられている(RahnとStafford(1979),Photochem.Photobiol.30:449)。これらの研究のいずれにおいても、厳密に、単色光は用いられなかった。最近、5−ヨードウラシル置換二本鎖DNAが光化学的一本鎖切断を受けることが判明した(Sugiyama等(1993),J. Am. Chem. Soc. 115:4443)。
350〜400nmの領域におけるそれぞれのS0→T吸収帯の照射から、5−ブロモウラシルと5−ヨードウラシルとの三重項状態の直接の占有(population)が観察されたことは本発明に関しても重要である(Rothman とKearns(1967),上記文献)。
4−チオウラシル発色団の光物理学研究は反応性状態としてπ,π* 三重項状態を包含する。項間交差量子収量は1又は1に近似する。4−チオウラシル置換核タンパク質複合体内の光架橋が観察されているが、励起4−チオウラシルと反応性であるアミノ酸残基はまだ同定されていない(Favre (1990),上記文献)。6−位置における励起4−チオウラシルへのリシンのα−アミノ基の付加が報告されている;しかし、α−アミノ基はペプチド結合に含まれるので、この反応が核タンパク質複合体内の光架橋に重要であるとは考えられない(Ito 等(1980),Photochem. Photobiol. 32:683)。
会合タンパク質へのアジド含有ヌクレオチド又は核酸の光架橋は一重項及び/又は三重項ニトレンの形成を介して進行すると考えられる(BayleyとKnowles (1977),Methods Enzymol. 46:69;Czarnecki 等(1979),Methods Enzymol. 56:642;Hanna 等(1993),Nucleic Acids Res.21:2073)。共有結合形成はO−H、N−H又はC−H結合におけるニトレンの挿入から生ずる。一重項ニトレンは優先的にヘテロ原子−H結合に入り、三重項ニトレンはC−H結合に入る。一重項ニトレンは求核付加反応を受けやすいアジリンに転位することもできる。タンパク質の求核性部位が隣接する場合には、この経路を介して架橋が生ずることも可能である。アジド官能基が環窒素に対してオルトに存在する場合には、アジド官能基の使用によって可能な問題が生ずる;アジドは非常に低光反応性であるテトラゾールと平衡して存在する。
R17バクテリオファージのコートタンパク質−RNAヘアピン複合体は、インビトロにおけるこの系の簡単さのために、核酸−タンパク質光架橋の研究のために理想的な系である。この系は充分に特徴づけられており、ファージゲノム内のRNAヘアピンに高アフィニティで結合するウイルスコートタンパク質から成る。インビボにおいて、コートタンパク質とRNAヘアピンとの相互作用はファージ感染中に2つの役割を果たす:コートタンパク質はレプリカーゼ合成の翻訳リプレッサーとして役立ち(EggensとNathans (1969),J. Mol. Biol. 39:293)、この複合体はキャプシド封入(encapsidation) のための核形成部位としても役立つ(Ling等(1970)Virology 40:920;Beckett 等(1988),J. Mol. Biol. 204:939)。野生型ヘアピン配列の多くの変形も高アフィニティでコートタンパク質に結合する(Tuerk とGold(1990),Science 249:505;Gott等(1991),Biochemistry 30:6290;Schneider 等(1992),J. Mol. Biol. 228:862)。SELEX方法による核酸リガンドの選択は、例えば物理的特徴に基づくような、種々な方法で達成することができる。物理的特徴に基づく選択は物理的構造、電気泳動移動度、溶解度及び分割挙動(partitioning behavier )を含むことができる。特に本明細書に引用により取込まれる、「構造に基づく核酸の選択方法」なる名称の米国特許出願第07/960,093号(1992年10月14日出願)は、特異的な電気泳動挙動に基づく核酸配列の選択を開示する。SELEX手法は、例えばHPLC、カラムクロマトグラフィー、一般的なクロマトグラフィー方法、特定溶剤中の溶解度又は2相間の分割のような、他の選択方法と組合せて用いることもできる。
本発明は、1実施態様において、標的分子に結合及び/又は光架橋するランダム化核酸配列の能力に基づいて、ランダム化核酸配列の候補混合物から核酸リガンドを選択し、同定する方法を含む。この実施態様は一般に共有SELEXと呼ばれ、特に、核酸リガンドと標的との間に共有結合を形成するために照射が必要である場合には、光SELEXと呼ばれる。
この実施態様の1変形では、この方法は光反応性基を含む核酸配列の候補混合物を調製し;候補混合物を標的分子と接触させて、標的分子に対して高いアフィニティを有する核酸配列を標的分子と結合させ、核酸−標的分子複合体を形成し;核酸−標的分子複合体を照射して、核酸−標的分子複合体に組み入れられた一部の核酸を光反応性官能基を介して標的分子に架橋させ;この共有結合を利用して、候補混合物中の遊離核酸から架橋核酸−標的分子複合体を分割し;標的分子に光架橋した核酸配列を同定することを含む。このプロセスは標的分子に光架橋した核酸を増幅して、標的分子に光架橋することができる配列に富化した核酸混合物を得る反復工程をさらに含むことができる。
本発明のこの実施態様の他の変形では、SELEXによって選択した、標的分子に対する核酸リガンドを、標的に架橋するそれらの能力に関して、さらに選択する。光反応性基を含まない、標的分子に対する核酸リガンドを最初にSELEX方法によって同定する。次に、これらの選択した核酸リガンドに光反応性基を組み入れて、リガンドを標的分子に接触させる。核酸−標的分子複合体を照射し、標的分子に光架橋することができる核酸を同定する。
本発明のこの実施態様の他の変形では、候補混合物の核酸配列におけるあらゆる可能な位置に光反応性基を組み入れる。例えば、5−ヨードウラシルと5−ヨードシトシンとを全てのウラシル位置とシトシン位置とに置換代入することができる。標的分子に光架橋することができるような核酸配列に関して選択が生ずるように、核酸−標的分子複合体の照射によって第1回選択ラウンドを実施する。次に、標的分子に光架橋することができる核酸配列によってSELEXを実施して、標的分子に最良に結合することができる架橋配列を選択する。
本発明のこの実施態様の他の変形では、光反応性基を含む核酸配列を照射なしの数回のラウンドでSELEXによって選択して、標的分子に対して部分的に強化したアフィニティを有する候補混合物を得る。次に、光SELEXを照射によって実施して、標的分子に光架橋することができるリガンドを選択する。
本発明のこの実施態様の他の変形では、光反応性基を含まない核酸配列によってSELEXを完成するまで実施して、標的分子に対する核酸リガンドを選択する。選択したリガンドの配列に基づいて、各ヌクレオチド位置に単一光反応性基を含む関連核酸配列のファミリーを形成する。光SELEXを実施して、標的分子に光架橋することができる核酸リガンドを選択する。
本発明のこの実施態様の他の変形では、標的分子への結合及び/又は架橋によって標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドをSELEX、光SELEX、又はこれらの方法の組合せによって選択する。
本発明のこの実施態様の他の変形では、特定疾患の経過に関連した固有標的分子に対する核酸リガンドを同定する。本発明のこの実施態様のさらに他の変形では、疾患状態に関連した標的分子に対する核酸リガンドを用いて、インビボにおける疾患を治療する。
本発明はさらに、光反応性基を含む核酸配列を包含する。この核酸配列は単一又は多重の光反応性基を含むことができる。さらに、これらの光反応性基は単一核酸配列において同一でも異なるものでもよい。本発明の核酸中に組み入れられる光反応性基は、照射時に標的分子と架橋を形成することができる任意の化学基を含む。但し、場合によっては、架橋の生成のために照射が不要であることもある。
本発明の核酸は一本鎖及び二本鎖RNAと一本鎖及び二本鎖DNAとを含む。本発明の核酸は2’−アミノ(2’−NH2)又は2’−フロロ(2’−F)−修飾ヌクレオチドのような修飾基を含むことができる。本発明の核酸はさらにバックボーン修飾を含むことができる。
本発明はさらに、修飾核酸を含む候補混合物を調製し、SELEXプロセスに用いて、標的種に結合又は架橋する核酸リガンドを同定する方法を含む。この実施態様の1実施例では、候補混合物は全てのウラシル残基が5−ハロゲン化ウラシル残基によって置換された核酸から構成され、選択された標的に共有結合を形成する核酸リガンドが同定される。
溶液SELEXと呼ばれる、本発明の付加的実施態様は、溶液中で、分割マトリックスを用いずに又は用いる前に達成される、高アフィニティ核酸−標的複合体と低アフィニティ核酸−標的複合体とを有するリガンドを分割する幾つかの改良方法を提供する。一般に、溶液SELEX方法の重要なテーマは、核酸候補混合物を溶液中で処理して、最高アフィニティ核酸リガンド又は触媒RNAのPCR中の優先的増幅を生じることである。溶液SELEX方法は下記方法を含めた、幾つかの方法を介して高アフィニティ核酸−標的複合体と低アフィニティ核酸−標的複合体との分割を達成する:(1)最高アフィニティリガンドがPCR中に選択的に増幅されるように、識別可能なcDNA生成物を生じるプライマー伸長抑制。プライマー伸長抑制はDNA又はRNAポリメラーゼを含む核酸ポリメラーゼ、逆転写酵素及びQβ−レプリカーゼの使用によって達成される。(2)この場合も、PCR中に最高アフィニティリガンド増幅のみを生じるエンドヌクレアーゼ加水分解抑制。これは任意の3’→5’二本鎖エキソヌクレアーゼの使用によって達成される。(3)PCR中に最高アフィニティリガンドのみの増幅を生じる識別可能なcDNA分子を得るための線状〜環状形成。
溶液SELEX方法の1実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドに相当するcDNA合成が優先的にブロックされ、PCRによる増幅が不能になる。他の実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドをPCR増幅の前にアフィニティカラムクロマトグラフィーによって選択的に除去する。或いは、高アフィニティオリゴヌクレオチドをアフィニティカラムクロマトグラフィーによって選択的に取り出すことができる。SELEX方法のさらに他の実施態様では、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するcDNAを選択的にヌクレアーゼ酵素消化に耐性にする。他の実施態様では、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するcDNAを選択的に酵素的又は化学的に分解可能にする。
溶液SELEXは先行技術の分割スキームを凌駕する改良である。本発明の方法によると、分割マトリックスに対するアフィニティのみを有するリガンドを偶発的に選択することなく分割を達成し、分割の速度及び精度を増強し、この手順を容易に自動化することができる。
本発明の開示は本発明を具体化し、例示する非限定的実施例を提供する。標的分子への結合及び光架橋によって核酸リガンドを選択する他の分割スキーム及び方法は、本発明の開示から、当業者に明らかになるであろう。
本発明は核酸リガンドを選択するためのSELEX方法の変形を含む。本出願は、初期SELEX特許出願に記載された定義、特に米国特許出願第07/536,428号(1990年6月11日出願、現在放棄)及び第07/714,131号(1991年6月10日出願)に記載された定義を含む明細書全体を引用によって個別的に取込んでいる。共有結合SELEX又は光SELEXと呼ばれる、本発明の1実施態様の方法は標的分子に結合及び/又は光架橋することができる核酸リガンドを同定し、選択する。
本出願はまた、SELEX方法によって同定される核酸リガンドの改良分割方法を提供する。
SELEX方法は、その最も基本的な形式で、次の一連の工程によって定義されることができる:
(1)異なる配列の核酸から成る候補混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列領域(すなわち、候補混合物の各要素が同じ位置に同じ配列を含む)とランダム化配列領域とを含む。固定配列領域は(a)下記増幅工程を容易にするように;(b)標的に結合すると判明した配列を模倣するように;又は(c)候補混合物中で核酸が所定の構造配置を占める可能性を強化するように選択される。ランダム化配列は全体的にランダム化することができる(すなわち、任意の位置に塩基を発見する確率は四分の一である)又は一部のみをランダム化することができる(例えば、任意の位置に塩基を発見する確率は0〜100%の任意のレベルで選択することができる)。
(2)標的と候補混合物の要素との結合に有利な条件下で、候補混合物を特定標的と接触させる。これらの状況下で、標的と候補混合物の核酸との相互作用が、標的と、標的に対して最強アフィニティを有する核酸との間に核酸−標的対を形成すると考えられる。
(3)標的に対して最高アフィニティを有する核酸を標的に対して最低アフィニティを有する核酸から分割する。最高アフィニティ核酸に対応するごく少数の配列(及び恐らくは1分子のみの核酸)が候補混合物中に存在するので、候補混合物中の有意な量(約5〜10%)が分割中に保持されるように分割基準を設定することが一般に望ましい。
(4)次に、標的に対して比較的高いアフィニティを有するものとして分割中に選択される核酸を増幅して、標的に対して比較的高いアフィニティを有する核酸に富化した、新しい候補混合物を形成する。
(5)上記分割工程と増補工程とを繰り返すことによって、新たに形成される候補混合物はますます少ない非反復配列(unique sequence) を含むようになり、標的に対する核酸混合物の平均アフィニティ度は一般に上昇する。SELEXプロセスは、その究極まで推し進めると、標的分子に対して最高アフィニティを有する、オリジナル候補混合物からの核酸である非反復核酸を1種類又は少ない種類含む候補混合物を生じることになる。
(1)異なる配列の核酸から成る候補混合物を調製する。候補混合物は一般に固定配列領域(すなわち、候補混合物の各要素が同じ位置に同じ配列を含む)とランダム化配列領域とを含む。固定配列領域は(a)下記増幅工程を容易にするように;(b)標的に結合すると判明した配列を模倣するように;又は(c)候補混合物中で核酸が所定の構造配置を占める可能性を強化するように選択される。ランダム化配列は全体的にランダム化することができる(すなわち、任意の位置に塩基を発見する確率は四分の一である)又は一部のみをランダム化することができる(例えば、任意の位置に塩基を発見する確率は0〜100%の任意のレベルで選択することができる)。
(2)標的と候補混合物の要素との結合に有利な条件下で、候補混合物を特定標的と接触させる。これらの状況下で、標的と候補混合物の核酸との相互作用が、標的と、標的に対して最強アフィニティを有する核酸との間に核酸−標的対を形成すると考えられる。
(3)標的に対して最高アフィニティを有する核酸を標的に対して最低アフィニティを有する核酸から分割する。最高アフィニティ核酸に対応するごく少数の配列(及び恐らくは1分子のみの核酸)が候補混合物中に存在するので、候補混合物中の有意な量(約5〜10%)が分割中に保持されるように分割基準を設定することが一般に望ましい。
(4)次に、標的に対して比較的高いアフィニティを有するものとして分割中に選択される核酸を増幅して、標的に対して比較的高いアフィニティを有する核酸に富化した、新しい候補混合物を形成する。
(5)上記分割工程と増補工程とを繰り返すことによって、新たに形成される候補混合物はますます少ない非反復配列(unique sequence) を含むようになり、標的に対する核酸混合物の平均アフィニティ度は一般に上昇する。SELEXプロセスは、その究極まで推し進めると、標的分子に対して最高アフィニティを有する、オリジナル候補混合物からの核酸である非反復核酸を1種類又は少ない種類含む候補混合物を生じることになる。
SELEX特許出願はこの方法を開示し、さらに非常に詳しく説明する。この方法に使用可能な標的;初期候補混合物の調製方法;候補混合物内の核酸の分割方法;及び分割済み核酸を増幅して、富化候補混合物を形成する方法が含まれる。SELEX特許出願はまた、タンパク質が核酸結合タンパク質である又は核酸結合タンパク質ではない、両方のタンパク質標的を含む、幾つかの標的種に対して得られたリガンド溶液を述べる。
分割は、標的分子に結合したリガンドを標的分子に結合しない核酸から分離することができる任意のプロセスを意味する。より大ざっぱに述べると、分割は候補混合物中のあらゆる核酸を、標的分子に対するそれらの相対的アフィニティに基づいて、少なくとも2つのプールに分離することを可能にする。当該技術分野に周知の種々な方法によって、分割を達成することができる。核酸−タンパク質対はニトロセルロースフィルターに結合することができるが、非結合核酸はこのフィルターに結合することができない。特異的に核酸−標的複合体を保持するカラムを分割に用いることができる。例えば、カラムに結合した標的分子に会合することができるオリゴヌクレオチドは、最高アフィニティ核酸リガンドを分離し、単離するためにカラムクロマトグラフィーの使用を可能にする。リガンド−リガンド分割は濾過ゲル遅延(filtration gel retardation)、及び密度勾配遠心分離と同様に用いることができる。
I.光SELEX
本発明は、標的分子を結合、光架橋及び/又は光不活化する核酸リガンドを包含する。本明細書に記載する結合とは、一般的に、リガンドと標的との間の共有結合形成を意味するが、このような結合は必ずしも不可逆的ではない。本発明のある一定の核酸リガンドは、光線による照射時に、標的分子に光架橋することができる光反応性基を含む。本発明の付加的な核酸リガンドは照射の不存在下でも標的との結合を形成することができる。
本発明は、標的分子を結合、光架橋及び/又は光不活化する核酸リガンドを包含する。本明細書に記載する結合とは、一般的に、リガンドと標的との間の共有結合形成を意味するが、このような結合は必ずしも不可逆的ではない。本発明のある一定の核酸リガンドは、光線による照射時に、標的分子に光架橋することができる光反応性基を含む。本発明の付加的な核酸リガンドは照射の不存在下でも標的との結合を形成することができる。
1実施態様では、本発明は一本鎖又は二本鎖RNA又はDNAオリゴヌクレオチドである核酸リガンドを包含する。本発明の核酸リガンドは、光線による照射時に、特定標的分子に架橋することができる光反応性基を含むことができる。さらに、本発明は核酸リガンドをその任意の修飾を含めて包含する。本明細書における光反応性基への言及は、核酸残基に大きな反応性又は光反応性を与える、天然核酸残基への比較的簡単な修飾を単純に意味する。このような修飾は、限定する訳ではなく、シトシン環外アミンにおける修飾、ハロゲン化基(例えば、5’−ブロモ−ウラシル若しくは5’−ヨード−ウラシル)による置換、2’−位置における修飾(例えば2’−アミノ(2’−NH2)又は2’−フルオロ(2’−F))、バックボーン修飾、メチル化、異常な塩基対組合せ等を含む。例えば、本発明の核酸リガンドは例えば2’−NH2−ヨードウラシル、2’−NH2−ヨードシトシン、2’−NH2−ヨードアデニン、2’−NH2−ブロモウラシル、2’−NH2−ブロモシトシン及び2’−NH2−ブロモアデニンのような修飾ヌクレオチドを含むことができる。
本発明の光SELEX方法の1実施態様では、候補混合物と呼ばれる、光反応性基を含む核酸配列のランダム化セットをある量の標的分子と混合して、標的分子との平衡結合を確立させる。この核酸−標的分子混合物に、光架橋がポリアクリルアミドゲル電気泳動によって実証されるように完成するまで、光線を照射する。標的分子に緊密に結合する核酸の一部のみが標的と有効に架橋する。
本発明の候補混合物は1つ以上の化学的反応性基又は光反応性基を含むランダム化領域を有する核酸配列から成る。好ましくは反応性基は修飾核酸である。候補混合物の核酸は好ましくはランダム化配列部分と、有効な増幅のために必要な保存配列とを含む。可変な配列部分はランダム配列を完全に又は部分的に含むことができる;可変な配列部分はランダム化配列領域内に組み入れられた保存配列のサブポーションを含むこともできる。
好ましくは、候補混合物の各オリゴヌクレオチド要素は少なくとも1つの化学的反応性基又は光反応性基を含む。さらに、候補混合物の各オリゴヌクレオチド要素は、各位置において、反応性基を含む修飾ヌクレオチドによって部分的に又は完全に置換されることができる。候補混合物は1種類を越える反応性基を含むオリゴヌクレオチドから構成することもできる。
本発明の核酸リガンドによって結合及び/又は光架橋される標的分子は一般にタンパク質であり、疾患及び/又は中毒におけるそれらの役割に基づいて選択される。例は、それらに対して阻害剤が好ましい酵素又はそれらの検出が望ましいタンパク質である。しかし、標的分子は、それらに対してリガンドが望ましい任意の重要な化合物であることができる。標的分子は、限定する訳ではなく、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子等であることができる。
本出願の目的のための光反応性基は好ましくは、光発色団を含み、標的種と光架橋することができる修飾ヌクレオチドである。本明細書において以下に述べる幾つかの場合に光反応性基を挙げるとしても、核酸リガンドと標的との間に共有結合が生ずるために照射は必ずしも必要ではない。光反応性基は選択的に、標的又はオリゴヌクレオチドの非修飾部分によって吸収されない波長のスペクトルの光線を吸収する。本発明は、限定する訳ではなく、下記要素:5−ブロモウラシル(BrU)、5−ヨードウラシル(IU)、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラニル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、8−ブロモデオキシウリジン、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシシトシン、5−〔(4−アジドフェナシル)チオ〕シトシン、5−〔(4−アジドフェナシル)チオ〕ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン及び7−デアザ−7−ブロモグアニンから選択される光反応性基を含むオリゴヌクレオチドを包含する(図5)。1実施態様では、光反応性基は5−ブロモウラシル(BrU)と5−ヨードウラシル(IU)である。
本発明の光反応性基は会合核酸−標的対の照射時に標的種と結合を形成することができる。この会合対を本明細書では核タンパク質複合体と呼び、場合によっては、結合形成が生ずるために照射は必要ではない。典型的に生ずる光架橋は会合核酸と標的との間の共有結合の形成である。しかし、核酸と標的との間の緊密なイオン相互作用も照射時に生ずると考えられる。
1実施態様では、電磁線照射によって光架橋が生ずる。電磁線照射は紫外光線、可視光線、X線及びガンマー線を含む。5−ハロ置換デオキシウラシル及びデオキシシトシンは電離線に細胞を感作させることが知られる(Szybalski (1974),Cancer Chemother. Rep. 58:539)。
架橋実験は、IU又はBrUのいずれかと、チロシン、トリプトファン又はヒスチジンとが正確に並列することが高収量架橋が生ずるために必要であることを示している。本発明は、ランダムに組み入れられた光反応性基を有する分子を架橋する選択に関して、この発見を利用する。本発明の1実施態様では、光反応性基5−ブロモウラシル(BrU)又は5−ヨードウラシル(IU)を、ウリジントリホスフェートの代わりに存在する5−ハロウリジントリホスフェートと共にT7ポリメラーゼによって、RNA中に組み入れる。5−ハロウリジントリホスフェートとウリジントリホスフェートとの混合物又は全ての5−ハロウリジントリホスフェートを用いることによって、組み入れ(incorporation) が達成される。32P若しくは33P標識RNA又は非標識RNA配列のランダム化セットは、標準方法を用いて合成される、DNA鋳型のランダム化セットから得られる。
BrU又はIUを含むRNAオリゴヌクレオチドのランダム化セットにある量の標的分子を混合する。光反応性発色団は、ウラシルの代わりにBrU又はIUとして、標準方法を用いてRNA中にランダムに組み入れる。このRNA−標的タンパク質混合物に300〜325nmの範囲内の近紫外光線を、光架橋が完成するまで、照射する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基のみがタンパク質への共有結合を形成する。励起BrU又はIUは、例えば酸化可能なアミノ酸残基のような反応性官能基の近くに存在しないかぎり、基底状態に戻る。5−ブロモウラシルの最低三重項状態と反応性であると確認されているアミノ酸残基には、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン及びシスチンを含む(図3)。機構的研究に基づいて可能な反応性を有する他の残基はフェニルアラニン、メチオニン、システイン、リシン及びアルギニンである。
架橋を形成しない核タンパク質複合体は、例えば熱及び/又は塩を用いる変性によるような、反応性媒質の調節によって容易に破壊されうる。タンパク質に共有結合した核酸はニトロセルロースフィルター上で、又は当業者に周知の他の分割方法によって遊離核酸から分離することができる。標的に共有結合した核酸を遊離核酸から分離するための代替方法には、ゲル電気泳動とその後の電気溶離(electroelution)、沈殿、示差溶解(differential solubility)、及びクロマトグラフィーがある。当業者にとって、選択すべき方法は少なくとも部分的に問題の標的分子に依存する。架橋した核酸は、例えばプロテイナーゼKのような酵素によるタンパク質物質の消化によって、ニトロセルロースフィルターから放出される。この時点において、標的タンパク質に光架橋した5−ハロウラシル基は単一アミノ酸又は短ペプチドに結合する。逆転写酵素の読み取り能力(read−through ability)はウラシルの5−位置における置換基の組み入れによって影響されない、この理由は逆転写酵素(RT)がウラシルの5−位置をチミンの5−位置から識別しないからである。ビオチンほど大きい基をRNA分子中に組み入れるために、5−位置の誘導体化が利用されている。本発明の1実施態様では、標的を選択された光架橋した核酸から光解離又は化学的解離によって除去する。
特定RNA配列の相補的核酸コピーを適当なプライマーによって製造する。cDNAをDNAポリメラーゼと第2プライマーとによって増幅する。DNA合成工程及び増幅工程には、5−ハロ−2’−デオキシウラシルは用いられない。次に、候補混合物中の5−ハロウリジン対ウリジンと同じ比又は異なる比でウリジントリホスフェートの代わりに5−ハロウリジントリホスフェートを用いて、増幅済みDNAをRNA配列中に転写する。
その後の光SELEXラウンドでは、部分的に選択したRNA配列を再びある量の標的タンパク質と複合体化させる。続いて、核タンパク質複合体に300〜325nmの領域において照射する。タンパク質に光架橋したRNA配列を再び、架橋していないRNA配列から分離する。cDNAを調製し、増幅し、5−ハロウラシルを含むRNA配列の第3セットを調製する。標的タンパク質に高アフィニティで結合し、光架橋するRNAリガンドが1種又は数種に収束するまで、このサイクルを続ける。後のサイクルにおける照射時間の短縮はさらに選択を強化することができる。特定RNAリガンドのcDNAを増幅し、ゲル精製し、配列決定する。或いは、RNA配列を直接、配列決定することができる。次に、ウリジントリホスフェートの代わりに5−ハロウリジントリホスフェートを再び用いて、特定RNA配列を適当な合成DNA鋳型から転写する(実施例11)。
本発明の他の実施態様では、それらの標的分子結合能力に関して予め選択したオリゴヌクレオチド配列に対して光SELEXを実施する(実施例12)。最初に、光反応性基を含まないオリゴヌクレオチドによってSELEXを実施する。リガンド中の特異的部位における光反応性核酸ヌクレオチドの置換によって、RNAリガンドを光反応性リガンドに転換する。初期リガンドの光化学活性な置換を幾つかのアプローチ(例えば、光反応性ヌクレオチドの特異的置換又は部分的なランダム取り込み)によって展開させることができる。特異的置換は光反応性オリゴヌクレオチドの位置をマニュアルで変化させる種々なオリゴヌクレオチドの合成に関係する。置換の位置は標的分子へのリガンドの結合に関する入手可能なデータに基づいて指示される。例えば、標的分子と相互作用すると知られる、分子の部分における初期リガンドに置換を実施する。その後の選択ラウンドでは、照射時の標的分子架橋能力に関して選択するために、光SELEXを用いる。
本発明の他の実施態様では、光SELEXとその後のSELEXとによって核酸リガンドを選択する。光SELEXは光反応性基を含むオリゴヌクレオチド配列によって最初に実施する。それらの標的分子架橋能力に関して選択した配列を次に標的分子結合能力に関してSELEX方法に関して選択する(実施例13)。
本発明の他の実施態様では、SELEXによるオリゴヌクレオチドの限定選択に続いて、光SELEXによって核酸リガンドを選択する(実施例14)。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドによって初期SELEX選択ラウンドを実施する。数回のSELEX選択ラウンド後に、光SELEXを実施して、標的分子に結合することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
本発明のさらに他の実施態様では、SELEXによって同定された核酸リガンドに対して限定ランダム化と、その後の光SELEXによる選択とを実施する(実施例15)。SELEXを最初に、光反応性基を含まない核酸配列によって完成するまで実施する。この核酸リガンドの配列を用いて、限定ランダム化を介してオリゴヌクレオチドファミリーを形成する。その後に、光SELEXを実施して、標的分子に光架橋することができる核酸リガンドを選択する。
本発明の他の実施態様では、光SELEXを用いて、標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドを同定する(実施例16)。
本発明のさらに他の実施態様では、光SELEXを診断的に適用して、特定の疾患状態に関連した固有(unique)タンパク質を同定する(実施例17)。本発明のさらに他の実施態様では、特定の疾患状態に関連した標的分子を架橋することができる核酸リガンドをインビボで用いて、疾患状態を治療する方法として標的分子に架橋させる(実施例18と19)。
本発明の1実施態様では、光SELEXによって同定されるRNAリガンドを用いて、タンパク質に結合させ、次にタンパク質に光架橋させることによって、そのタンパク質の存在を検出する。この検出は、32P又は33P標識を組み入れて、ニトロセルロースフィルターによって保持される物質をシンチレーション計測によって検出するか、又は電気泳動ゲル上で正確に移動する物質を写真フィルムを用いて検出することによって、達成することができる。或いは、光SELEXは蛍光発光分光法によって検出される蛍光発色団を生成する。モデルペプチドに対する5−ブロモウラシルの反応の生成物(図3に示す)に関する蛍光発光は、Dietz とKoch(1987)(上記文献)によって報告されている。本発明の他の実施態様では、蛍光標識をRNAに共有結合させて、蛍光発光分光法によって検出する。本発明の他の実施態様では、光SELEXによって選択されるRNAリガンドを用いて、標的タンパク質を同じプロセスによって阻害する。さらに他の実施態様では、光選択した(photoselected) リガンドを担体に結合させ、これを用いて、標的を共有結合的に捕捉する。
本発明の1実施態様では、5−ヨードウラシルを候補混合物のRNA配列に組み入れ、320〜325nmの範囲内の光線を用いて照射する。この組合せは、他の非特異的な光反応なしに、標的タンパク質への5−ハロウラシル発色団の領域選択性光架橋を保証する。特に、タンパク質のトリプトファン残基と、核酸のチミン塩基及びウラシル塩基とは光反応性であると知られている。図4に示すように、5−ヨードウラシルは325nmにおいて吸光するが、トリプトファンと標準核酸塩基とは吸光しない。325nmにおける5−ヨードウラシルのモル吸光係数は163L/mol ・cmである。320nmにおいて発光する周波数倍加チューナブル色素レーザー又は325nmにおいて発光するヘリウムカドミウムレーザーによって、320〜325nmの領域における単色光を供給することが好ましい。
本発明の1実施態様では、標的タンパク質に対する5−ヨードウラシル含有RNA配列の光架橋のために308nmにおいて発光する塩化キセノン(XeCl)エキシマーレーザーを用いる。このレーザーによって、核タンパク質複合体の高収量の光架橋が数分間の照射時間内に達成される。
本発明の他の実施態様では、標的タンパク質に対する5−ヨードウラシル含有RNA配列の光架橋が、波長濾過313nm高圧水銀灯発光によって又は254nmにおいてはリンによって吸収され、300〜325nmの領域において再発光する低圧水銀灯発光によって達成される。後者の発光をまた、細心に波長濾過して、リンによって吸収されない254nm光線と、タンパク質を損傷する可能性がある290〜305nm領域の光線とを除去する。
本発明の他の実施態様では、標的タンパク質に対するBrU−又はIU−含有RNA配列の光架橋が、基底状態から三重項状態を直接に占める350〜400nmの領域内の光線によって達成される。355nmにおけるネオジミウムYAGレーザーの第3次高調波から又は351nmにおけるフッ化キセノン(XeF)エキシマーレーザーからの第1次高調波からの単色光線が、これに関して、特に有用である。
本発明のさらに他の実施態様では、光反応性ヌクレオチドを一本鎖DNAに組み入れて、光反応性ヌクレオチドトリホスフェートを用いて又は用いずに、直接増幅する。
A.共有結合SELEXと、照射によって又は照射なしでHIV−1 Revタンパク質に結合する核酸リガンド
光SELEXを説明するために選択した標的タンパク質はHIV−1からのRevである。インビボにおけるRevの活性はRev反応性要素(RRE)(HIV−1ウイルスRNAの高度構造化領域)との会合に起因する。Revの予備RNA SELEX実験は非常に高いアフィニティのRNAリガンドの単離を可能にした。“6a”として知られる最高アフィニティリガンド(配列番号:5)は約1nMのKdを有する、これは図16に示す。6aの二次構造と、Revとのその相互作用とは充分に特徴づけられている。
光SELEXを説明するために選択した標的タンパク質はHIV−1からのRevである。インビボにおけるRevの活性はRev反応性要素(RRE)(HIV−1ウイルスRNAの高度構造化領域)との会合に起因する。Revの予備RNA SELEX実験は非常に高いアフィニティのRNAリガンドの単離を可能にした。“6a”として知られる最高アフィニティリガンド(配列番号:5)は約1nMのKdを有する、これは図16に示す。6aの二次構造と、Revとのその相互作用とは充分に特徴づけられている。
光SELEXのための核酸ライブラリーの構成はRev6a配列(配列番号:5)に基づくものであった。SELEXのためのデオキシオリゴヌクレオチド鋳型の合成中に、鋳型のランダム領域を、4投入(input) 塩基の比が6a配列中の対応塩基を支持するようにバイアスされる“バイアスランダム化”領域によって置換した(実際の比は62.5:12.5:12.5:12.5であった)。例えば、特定の位置の6a塩基がGである場合には、この合成工程の塩基投入混合物はG62.5%、他の3種の塩基の12.5%である。
単置換iU核酸とタンパク質標的との間の高収量の領域特異的架橋の形成に用いられている光反応性ウラシル類似体5−ヨードウラシル(iU)(Willis等(1993),Science 262:1255)をこの実施例のために用いた。iU発色団は長波長紫外光線下で反応性であり、5−ブロモウラシルと同じ機構によって芳香族アミノ酸に光結合することができる(Dietz 等(1987),J. Am.Chem. Soc.109:1793)。上述したように、この研究のための標的はHIV−1 Revタンパク質であり、これはウイルスの生産性感染(productive infection)のために(Feinberg等(1986)Cell 46:807)及びウイルス構造遺伝子gag,polとenvの発現のために(Emerman 等(1989),Cell 57:1155)必要である。Revと高アフィニティRNAリガンドとの相互作用は充分に特徴づけられている。RRE内の単一高アフィニティ部位(IIBステム)は同定されている(Heaphy等(1991),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7366)。インビトロの遺伝的選択実験は、Revに高アフィニティで結合するRNAリガンドを形成して、Rev:RNA相互作用のために必要なRNA構造要素の決定を容易にしている(Bartel等(1991),Cell67:529;Tuerk 等,In the Polymerase Chain Reaction(1993);Jansen等(1994),J. Mol. Biol. 235:237)。
高アフィニティRevリガンド配列6a(配列番号:5)に基づく、“バイアスランダム化”DNAオリゴヌクレオチドライブラリーは約1014の非反復配列を含む。この鋳型を5−iUTPによるインビトロT7転写に用いて、選択のための全置換iU RNAを形成した。光SELEX手順はニトロセルロース分割を用いるRevのアフィニティ選択と、非架橋RNA配列から架橋済み複合体を変性ポリアクリルアミドゲル分割する、核タンパク質複合体の単色UV照射とを交互に行った。最終操作は、競合体tRNAを用いて、アフィニティと架橋とに関する同時選択を利用した。各ラウンドは選択と、その後の回収RNAからcDNAへの転化と、DNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅と、iU−RNAの新たなプールを得るためのインビトロ転写を構成する。共有結合核タンパク質複合体として回収されたRNAを増幅するために、適当なゲルスライスを単離し、プロテイナーゼK処理した。
RNAプールに対して最初にRevタンパク質による3ラウンドのアフィニティ選択を実施し、高アフィニティ配列をニトロセルロースフィルターによって分離した。次に、進化RNAプールに対して、過剰なRevタンパク質の存在下でUVレーザー照射を実施して、タンパク質架橋能力を有するRNA配列にタンパク質架橋させた。次に、架橋したRNA配列をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を用いて分割した。これらの架橋したRNAをゲル物質から回収し、結合したRevタンパク質を消化させ、このRNAをcDNA合成に用いて、光SELEXの次のラウンドでさらに増幅した。光架橋の第1ラウンドには、308nmXeClエキシマーレーザーを用いた;その後に、325nmHeCdレーザーを用いた。
レーザー誘導架橋に対する4回選択ラウンド後に、RNAプールを再びアフィニティ選択の3ラウンドに通した。最後に、RNAプールを高アフィニティでのそのRev結合能力と、このタンパク質架橋能力とに関して同時に選択した。これは光架橋反応において高濃度の非特異的核酸競合体を用いることによって達成された。
架橋した生成物は第13回ラウンドまでに出発プールから約30倍に増加した(図15)。これらの条件下で、架橋の最大の増加はアフィニティの最大増強と相関する(第7ラウンドから第10ラウンドまで)。
選択の13ラウンド後に、PCR生成物をクローン化し、52種の単離物を配列決定した(図16、配列番号:5〜55)。全配列の77%を占めるクラス1分子は非常に高度に保存されたモチーフ(5’KDAACAN・・・N’UGUUH’M’3’)(配列番号:56)を含む(図17)。コンピュータ折り畳みアルゴリズム(computer folding algorithm)の予測によれば、この保存モチーフは塩基対から成り、ステム−ループ構造中に存在する。サブクラスa〜d(図16、配列番号:5〜43)は共通モチーフを得るために“バイアスランダム化”プールに用いた種々な手法を説明する。クラス2分子は非常に高度に保存された10塩基配列(図17,配列番号57)を含み、この配列はRNAの5’固定領域と折り重なって、クラス1又は6a(配列番号:5)モチーフとは異なる構造を形成すると予測される。全てのクラス1配列は、1〜10nMの範囲の高アフィニティ解離定数(Kd)によって、Revへの二相結合を示す。クラス2配列は、30〜50nMのKdによって、Revへの一相結合を示す。ラウンド13配列の分析は、クラス1群とクラス2群との共通モチーフの頻度が出発プールでは非常に小さく、幾つかの個別配列が光SELEX操作の突然変異的圧力によってのみ生じることを明らかにする。
選択の13ラウンド後に、PCR生成物をクローン化し、52種の単離物を配列決定した(図16、配列番号:5〜55)。全配列の77%を占めるクラス1分子は非常に高度に保存されたモチーフ(5’KDAACAN・・・N’UGUUH’M’3’)(配列番号:56)を含む(図17)。コンピュータ折り畳みアルゴリズム(computer folding algorithm)の予測によれば、この保存モチーフは塩基対から成り、ステム−ループ構造中に存在する。サブクラスa〜d(図16、配列番号:5〜43)は共通モチーフを得るために“バイアスランダム化”プールに用いた種々な手法を説明する。クラス2分子は非常に高度に保存された10塩基配列(図17,配列番号57)を含み、この配列はRNAの5’固定領域と折り重なって、クラス1又は6a(配列番号:5)モチーフとは異なる構造を形成すると予測される。全てのクラス1配列は、1〜10nMの範囲の高アフィニティ解離定数(Kd)によって、Revへの二相結合を示す。クラス2配列は、30〜50nMのKdによって、Revへの一相結合を示す。ラウンド13配列の分析は、クラス1群とクラス2群との共通モチーフの頻度が出発プールでは非常に小さく、幾つかの個別配列が光SELEX操作の突然変異的圧力によってのみ生じることを明らかにする。
架橋挙動は2クラスの間では異なる。高いRev濃度(500nM)と4分間の325nm照射下では、クラス2分子はクラス1分子よりも大きい架橋収量と効率を生じる(データは示さず);恐らく、この挙動はRevに対して比較的低いアフィニティを有するクラス2分子を光SELEX操作下で競合させると考えられる。クラス1分子に関しては、長い照射時間が高分子量架橋種を生じると思われる。理論によって縛られる訳ではないが、Revに対する進化結合ドメインとSELEXにおける増幅のために必要な固定領域との両方を含むRNAがRNA1分子につき1分子より多いRevを結合させることができると提案される。各RNAは平均して21個のiU塩基を含む(RNA長さ−86塩基)ので、高いタンパク質濃度において1分子より多いRevへの単一RNAの架橋を可能にする、光架橋のある種の混乱(promiscuity) が存在することが考えられる。クラス2分子は光架橋時に高分子量種をあまり生じない;これらは平均してiUをあまり含まず、付加的なRev分子への架橋及び/又は光架橋を可能にしない構造を含むと考えられる。
ラウンド13RNAの分析は、亜群(subpopulation) がレーザー照射なしにRevに架橋することができることを明らかにする。したがって、この単一実験セットは、照射なしの共有結合SELEXと照射を用いる光SELEXとの両方が同じ系において見い出されうることを実証した。分析したラウンド13配列15種の中の4配列はレーザー照射なしで架橋する(図16)。これらの少ない配列から、レーザー独立性架橋を与える配列モチーフを同定することは容易に可能ではなかったが、全ての配列は今のところ1aサブクラスに属すると見なされた。
レーザー依存性及びレーザー独立性架橋(それぞれ、LD−XL及びLI−XL)をさらに研究して、全長クラス1分子と共に形成された第2照射生成物を回避するために、進化した配列のみを含む幾つかの小RNAを構成した。Trunc 2及びTrunc 24(図18及び19)(配列番号:58及び59)は、それぞれ、クローン#3と#24に基づき、0.5nM(trunc 2)及び20nM(trunc 24)のKdによってRevへの一相結合を示す。Trunc 2(図18)はLd−XL挙動を示し、Trunc 24(図19)はLI−XLとLD−XLの両方が可能である。
LD−XLとLI−XLに関するコンホメーションと化学的必要条件とを調べるために、Trunc 2(配列番号:58)及びTrunc 24(配列番号:59)と、幾つかのアルギニン富化モチーフ(ARM)タンパク質とによって架橋反応を実施した。RNA結合タンパク質のクラスは標的タンパク質、HIV−1 Rev、並びにHIV−1 Tat及び非常に類似したHIV−2 Revをも含む。trunc 2(図18、配列番号:58)とのLD−XL反応は、trunc 2がHIV−1とHIV−2 Revタンパク質の両方に特異的に結合することができるが、HIV−1 Tatには結合しないことを示す。僅かに異なる、2種類の移動核タンパク質複合体(migrating nucleoprotein complex) はtrunc 2が2個のiUヌクレオチドの1個を用いて、Revタンパク質に架橋する能力を表すと思われる。理論によって縛られる訳ではないが、両Revタンパク質の非常に類似したARM中に存在するトリプトファン残基が本発明の高アフィニティRNAリガンドの特異的光架橋のために必要なアミノ酸であることが提案される。
同じタンパク質によって実施したtrunc 24 LI−XL(図19、配列番号:59)は、HIV−1 Revに対してのみの架橋を示す。trunc 3と同様にtrunc 24もHIV−2 Revに光架橋することができる(データは図示せず)。このLI−架橋が高度の変性条件下では、又は高濃度の核酸競合体によって可逆的であることも観察された。理論によって縛られる訳ではないが、これらの観察から、LI−XLがIUの6位置とシステイン残基との間のMichael アダクツによって進行する、又は5位置置換反応が可能であることが仮定される。この仮定は、iUがUよりも容易にMichael アダクツを形成するという観察と、HIV−1 Revが3個のシステインを含むが、HIV−2 Revはシステインを全く含まないという事実との両方に一致する。trunc 24(配列番号:59)とヒト繊維芽細胞核抽出物(10μg)を、漸減する量のHIV−1 Revと共に含む複雑な混合物中でのtrunc 24のHIV−1 Rev識別能力を試験する(図20)。50nMRevと、1:100の重量比のRev:核抽出物とにおいて、trunc 24とRevとの間に非常に有意な架橋生成物を見ることが可能であった。核抽出物とtrunc 24のみでは架橋生成物を生じなかった。
実施例1は、それぞれ、5−ブロモウリジントリホスフェート、5−ヨードウリジントリホスフェート及びウリジントリホスフェートを用いた、ヘアピンRNAオリゴヌクレオチドRNA−1(配列番号:1)、RNA−2(配列番号:2)及びRNA−3(配列番号:3)の合成を説明する。バクテリオファージR17コートタンパク質へのRNA−1(配列番号:1)、RNA−2(配列番号:2)及びRNA−3(配列番号:3)に関するRNAタンパク質結合曲線を決定する実験を実施例2において説明する。実施例3はR17コートタンパク質へのRNAオリゴヌクレオチドの光架橋を述べる。308nmにおける塩化キセノン(XeCl)エキシマーレーザーによる照射後にRNA−1(配列番号:1)によって光架橋したR17コートタンパク質のアミノ酸残基は実施例4において説明する。実施例5は325nmにおける単色発光によるR17コートタンパク質へのRNA−2(配列番号:2)の光架橋を述べる。実施例6はトランスイルミネーターによる広帯域発光照射後に得られるR17コートタンパク質へのRNA−1(配列番号:1)とRNA−2(配列番号:2)との光架橋を説明する。実施例7は会合タンパク質への5−ブロモウラシル置換核酸によって達成された光架橋と同様な光架橋を生じるように思われる、5−ヨードウラシルとN−アセチルチロシン N−エチルアミドとの光反応を述べる。R17コートタンパク質に光架橋したRNAからのcDNAの調製は実施例8に述べる。実施例9はR17コートタンパク質へのIC置換RNAリガンドの光架橋を説明する。
実施例10はDNA中へのハロゲン化ヌクレオチドの組み入れを説明する。実施例11〜15は特異的光反応性核酸リガンドの製造に用いられる光SELEXプロトコールを説明する。実施例11は連続的光SELEX方法を述べる。実施例12は、SELEXによって最初に選択した核酸リガンドを続いて、標的分子架橋能力に関して光SELEXによって選択する方法を述べる。実施例13は、光SELEXによって同定した核酸リガンドに対して、次に、SELEXによる選択を実施して、これらの核酸リガンドを標的分子結合能力に関して選択する。実施例14は、限定SELEX選択を実施した後に、光SELEXによる選択を実施する他の実施態様を説明する。実施例15は、SELEXによって同定された核酸リガンドに対して限定ランダム化を実施し、その後に光SELEXによる選択を実施する、本発明の実施態様を説明する。実施例16は標的分子の生物学的活性を改良することができる核酸リガンドの選択方法を説明する。実施例17は、SELEX方法と光SELEX方法とを用いて、特定疾患の経過に関連したタンパク質を同定する診断手順を説明する。
実施例18は光SELEXによる疾患のインビボ治療方法を説明する。疾患状態に関連した標的分子に結合及び架橋することができるように光SELEX選択した核酸リガンドを当該技術分野に周知の幾つかの方法によって患者に導入する。例えば、光SELEXリガンドは疾患を有する患者の適当な細胞に一時的に又は本質的に発現されることができる。或いは、光SELEXリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖DNAとして患者の細胞に取り入れることができる。ヨウ素化シトシンを患者に投与した後に、X線を照射することができる。適当な細胞中で合成される核酸リガンド中に導入されるICはリガンドを標的分子に架橋させて、標的分子を不活化させる。光SELEXリガンドを患者中に導入する他の方法は、ハロゲン化リガンドの患者の細胞中へのリポソーム投与を含む。
実施例20は、照射によって又は照射なしで、HIV−1 Revタンパク質に架橋する修飾核酸リガンドの製造を説明する。図15は種々な選択ラウンドにおけるバルク候補混合物への架橋の結果を示す。rD1−ラウンド 1プールRNA;rD7−ラウンド7 プールRNA;rD10−ラウンド 10プールRNA;rD13−ラウンド 13プールRNA;rD13/PK,光架橋ラウンド13プールRNAプロテイナーゼK処理(100μl反応の中の35μlを0.5%SDS、50μg/mlプロテイナーゼK及び1mM EDTA中で65℃において1時間インキュベートした);rD13/無iU−ラウンド13プールRNA UTP(iUなし)による転写。R−遊離RNA;XL−架橋核タンパク質複合体。
図16は、13ラウンドのSELEX後に配列決定した配列を示す(配列番号:5〜55)。配列を6a配列に対して最大相同を示すように整列させる。下線はコンピューターRNA折り畳みアルゴリズムによって提起される可能な塩基対合を表す。ダッシュ下線は6aリガンド“バブル”モチーフを表す。下線によってフランクされる配列はループ領域又はバルジ領域のいずれかを表す。ダッシュは6aとの整列(alignment) を最大にするように配置する。* は2単離物が得られたことを意味する。+はレーザー独立性架橋を意味し、−はHIV−1Revに対するレーザー独立性架橋の欠損を意味する。図17(配列番号:56〜57)はクラス1リガンドとクラス2リガンドとの共通配列を示す。図18と19はTrunc 2(配列番号:58)及びTrunc 24(配列番号:59)の配列と特異性結果とを示す。500nM タンパク質と、tRNA 20μgと、約1nMのキナーゼ処理trunc 2 RNAとを37℃において10分間インキュベートし、325nmにおいて4分間照射した。t2−trunc 2 RNA タンパク質を添加せずに照射;t2Rev1/0’−trunc 2 RNA、HIV−1 Revタンパク質及び照射0分間;t2Rev1/4’−trunc 2 RNA、HIV−1Revタンパク質及び照射4分間;t2/Rev1/4’/PK−trunc 2 RNA、HIV−1 Revタンパク質、照射4分間及び図1におけるようなプロキナーゼK処理;t2/Rev2/4’−trunc 2 RNA、HIV−2 Revタンパク質、及び照射4分間;t2/Tat/4’−trunc 2 RNA、HIV−1 Tatタンパク質、及び照射4分間。R−遊離RNA;XL−架橋核タンパク質複合体。図20はヒト核抽出物の存在下でのHIV−1 Revとのtrunc 24光独立性架橋を示す。
II.溶液SELEX.
本発明のこの実施態様は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとを分割する幾つかの改良方法を提供する。本発明の方法は先行技術の分割方法を凌駕する幾つかの利点を有する:(1)この方法は、分割マトリックスに対する核酸リガンドを単離することなく、標的に対する核酸リガンドの単離を可能にする;(2)オリゴヌクレオチド候補混合物をスクリーニングする速度と精度とを高める;及び(3)溶液SELEX操作を単一試験管中で実施することができ、それによって分割工程を自動化することができる。
本発明のこの実施態様は、標的分子に対して高アフィニティを有するオリゴヌクレオチドと低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドとを分割する幾つかの改良方法を提供する。本発明の方法は先行技術の分割方法を凌駕する幾つかの利点を有する:(1)この方法は、分割マトリックスに対する核酸リガンドを単離することなく、標的に対する核酸リガンドの単離を可能にする;(2)オリゴヌクレオチド候補混合物をスクリーニングする速度と精度とを高める;及び(3)溶液SELEX操作を単一試験管中で実施することができ、それによって分割工程を自動化することができる。
本発明の方法によって必要とされる材料及び方法は一般に、分子生物学実験室で用いられている。これらはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、RNA又はDNA転写、第2鎖DNA合成、及びヌクレアーゼ消化を含む。実際に、これらの方法は図21に図示するようにサイクル式に相互に関係する。
Tuerk とGold(1990),Science 249:1155によって開示され、図21に示されるSELEX方法では、一本鎖核酸候補混合物を核酸合成装置において確立された手順を用いて形成し、dNTP及びKlenowフラグメントと共にインキュベートして、二本鎖DNA鋳型の群を形成した。これらの二本鎖DNAと、これらから転写されたRNAとを精製して、標的分子と接触させる。標的分子に対して強化されたアフィニティを有するRNA配列が核酸−標的複合体を形成する。この後に結合核酸と非結合核酸とを分割し、標的分子を結合核酸から分離する。cDNAを強化アフィニティ核酸から合成し、PCR増幅によって二本鎖DNAを形成する。候補混合物のコンプレキシティ(complexity)が減少し、標的に対するそのアフィニティ及び特異性が最大になるまで、このサイクルを繰り返す。
溶液SELEX方法の新規な特徴は、核酸候補混合物の結合要素と遊離要素とを分割する手段である。本発明の方法の1実施態様では、2つの物理的に異なるcDNAプールの形成がプライマー伸長抑制の使用によって達成される。上記工程2と3の間で基本的SELEXプロトコールに1つのcDNA伸長工程を加え、2つの物理的に異なるcDNAプール・・・1つは標的に対して高アフィニティを有し、1つは標的に対して低アフィニティを有する・・・の形成を可能にし、これらのプールは相互から容易に区別され、分離される。プライマー伸長抑制分析は核酸に複合体化した部位結合タンパク質を試験するための一般的な方法であり(Hartz 等(1988)、Methods Enzymol. 164:419)、高アフィニティ複合体のcDNA合成抑制能力に基づく。プライマー伸長抑制によって研究されるタンパク質−核酸相互作用の例はmRNAリボソーム結合部位に対するリボソーム結合(Hartz 等(1988),Meth. Enzym. 164:419)並びに非反復大腸菌翻訳因子(SELBタンパク質)のmRNAセレノシステイン挿入配列への結合(Baron 等(1993),Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4181)を含む。
溶液SELEXスキームの1実施態様では、第1cDNA伸長は鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートの存在下で実施する。これらの条件下で、標的と迅速に解離する複合体を形成する、標的に対して低アフィニティを有するオリゴヌクレオチドを、伸長不能なヌクレオチドによって終結した3’−末端を有する切頭cDNAに転化させる。切頭cDNA鎖はPCRプライマーにアニールすることができず、それ故、増殖不能である。これに反して、高アフィニティオリゴヌクレオチドと標的分子との間に形成される緊密な複合体は、緩慢な解離速度を特徴とし、cDNA伸長を抑制する。緊密に結合した標的分子によってcDNA合成がブロックされるので、高アフィニティオリゴヌクレオチドから合成された新生(nascent) cDNA鎖に連鎖ターミネーターを組み入れない。標的と連鎖ターミネーターとが系から除去された、第2ラウンドのcDNA伸長中に高アフィニティ複合体からの全長cDNAが得られる。したがって、低アフィニティ複合体をプライマーアニーリング部位を欠いた切頭cDNAに転化し、緊密な複合体は全長cDNAに転化し、PCRによって増幅される(図22)。この方法の厳しさは連鎖ターミネーター及びdNTPのモル比を変えることによって又は、プライマー伸長抑制はポリメラーゼ濃度に敏感であるので、ポリメラーゼの濃度を変えることによって、容易に調節される(Ringguist 等(1993),Biochemistry印刷中)。本明細書で用いるかぎり、“厳しさ”なる用語は、PCR生成物に転化される遊離RNAの量を意味する。
それ故、本発明の1つの決定的な特徴は、強アフィニティ複合体と弱アフィニティ複合体とを増幅可能な核酸プールと増幅不能な核酸プールとに、分割マトリックスを必要とせずに、分割するその可能性である。高アフィニティリガンドの選択的な増幅を可能にするのは、これらのcDNAプールの固有の性質である。
標的分子はタンパク質(核酸結合性タンパク質又は非核酸結合性タンパク質)、核酸、小分子又は金属イオンである。溶液SELEXは鏡像異性体の分割並びに新たな触媒核酸の単離を可能にする。
プライマー伸長抑制は、DNA又はRNAポリメラーゼ、逆転写酵素及びQβ−レプリカーゼを含めた、幾つかの核酸ポリメラーゼのいずれかを用いて達成することができる。
核酸の候補混合物は、それから相補的鎖を合成することができる、核酸又は核酸誘導体を含む。
先行技術の分割方法はニトロセルロース又はアフィニティカラムの使用を含む。先行技術の分割方法の欠点の1つは、分割マトリックスに特異的に結合する核酸が標的に特異的に結合する核酸と共に選択されるマトリックスバインダーの現象であった。したがって、本発明の方法の利点の1つは、分割マトリックスの使用によって生ずる、好ましくない選択的圧力を、標的に高アフィニティを有する核酸が溶液中で選択され、増幅された後にこのようなマトリックスを初めて用いることによって克服することである。さらに、ポリメラーゼによる伸長を最強複合体のみが抑制可能であることに基づいて、cDNA合成中に強アフィニティ複合体と弱アフィニティ複合体とを分割できることが最高アフィニティ核酸リガンドのみの選択を生じる。ナノモル以下の範囲内の解離定数を有する複合体が効果的にcDNA合成をブロックすることが想定される。本発明の方法はこの限界で標的と結合する要素に関して核酸候補混合物を選択的にスクリーニングすると考えられる。
プライマー伸長抑制の利用はオリゴヌクレオチド候補混合物を2プール:高い標的アフィニティを有するオリゴヌクレオチド(増幅可能)及び低い標的アフィニティを有するオリゴヌクレオチド(増幅不能)への分割を可能にする。上述したように、連鎖ターミネーターを用いて、第1伸長生成物を無効にして(poison)、低アフィニティcDNAを増幅不能にすることができる。
本発明の方法の他の実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティ核酸から生ずるcDNAを選択的に消化する。一本鎖DNAを切断する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的配列において、異なる効率で切断する。弱アフィニティ核酸と強アフィニティ核酸との分割は、4種類のdNTPの存在下でのプライマー伸長と、その後の標的の除去と、酵素切断に耐性である修飾ヌクレオチドによる第2伸長とによって達成される。この場合に、cDNAプールを適当な制限酵素と共にインキュベートすると、第1伸長中に合成されたcDNAがプライマーアニーリング部位を除去するように切断されて、増幅不能なプールが得られる。制限部位(RS)においてヘアピンを用いて大きい効率の切断が達成されて、局部的な二本鎖領域が得られる(図24)。
本発明の方法の他の実施態様では、生成cDNAが酵素的又は化学的に選択的に分解されるように、第1伸長生成物中に修飾ヌクレオチドを組み入れることによって、低アフィニティ核酸に対応するcDNA配列を選択的に分解可能にする。
本発明の方法の他の実施態様では、第1伸長生成物をアフィニティマトリックスによって系から除去することができる。或いは、マトリックスを用いて、第2伸長生成物、例えば高アフィニティ核酸に対応するcDNAを結合させることができる。この手法はcDNA合成中の修飾塩基の組み入れに基づく。例えば、第1cDNA伸長をアフィニティマトリックス上での保持を可能にする修飾塩基(例えば、ビオチニル化ヌクレオチド、ヨウ素化ヌクレオチド、チオ標識ヌクレオチド又は任意の他の修飾ヌクレオチド)の存在下で実施することができる(図25)。本発明の方法の代替実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特定の配列を組み入れることもできる。したがって、第1合成cDNAを商業的に入手可能なマトリックス上で遅延させて、修飾ヌクレオチドと標的との不存在下で合成される第2合成cDNAから分離することができる。
本発明の他の実施態様では、エキソヌクレアーゼ加水分解阻害を用いて、高アフィニティ二本鎖核酸リガンドのプールを形成する。
本発明のさらに他の実施態様では、溶液SELEX方法を用いて、触媒核酸リガンドを単離する。
本発明の他の実施態様では、溶液SELEXを用いて、一本鎖核酸を優先的に増幅させる。
本発明の他の実施態様では、溶液SELEX方法を自動化する。
高アフィニティ核酸からのcDNA合成を可能にする標的の除去も、多様な方法で達成することができる。例えば、標的を有機抽出によって除去するか、又は温度によって並びに溶媒の電解質含量の変化によって変性させることができる。さらに、本発明によって使用可能である候補混合物の分子レパートリーは、それから第2相補的鎖を合成することができる任意の分子を含む。一本鎖DNA並びにRNAを、多様な他の修飾ヌクレオチド及びそれらの誘導体が使用可能であると同様に、用いることができる。
次の非限定的実施例は本発明の方法を説明する。実施例21は、高アフィニティ核酸と低アフィニティ核酸との分割がプライマー伸長抑制によって達成される溶液SELEX方法を説明する。実施例22は、分割が低アフィニティRNAの制限酵素消化によって達成される溶液SELEX方法を説明する。実施例23は、低アフィニティ核酸が高アフィニティ核酸から、アフィニティクロマトグラフィーによって分離される溶液SELEX方法を説明する。実施例24はエンドヌクレアーゼ阻害の利用による高アフィニティ二本鎖核酸リガンドの単離を説明する。実施例25は触媒核酸の単離を説明する。実施例26は自動化溶液SELEX方法を説明する。
提供する実施例は、本発明を用いる方法を非限定的に説明する。本発明を用いる他の方法は本明細書の開示から当業者に明らかであろう。
実施例1. RNA配列 RNA−1、RNA−2、RNA−3、RNA−7及びR−17コートタンパク質の合成.
図6に示した、RNA−1(配列番号:1)、RNA−2(配列番号:2)及びRNA−3(配列番号:3)並びに図12に示したRNA−7(配列番号:4)を合成DNA鋳型又はプラスミドからのインビトロ転写によって、Milliganと共同研究者が述べている方法(Milligan等(1987),Nucleic Acids Res.15:8783)を用いて調製した。転写反応は40mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris−HCl,pH8.1,37℃)と、1mMスペルミジンと、5mMジチオトレイトール(DTT)と、ウシ血清アルブミン(BSA)50μg /mlと、0.1%(V/V)Triton X−100と、ポリエチレングリコール(mr8000)80mg/mlと、T7RNAポリメラーゼ0.1mg/mlとを用いた。3〜5mM 各ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)と、25mM塩化マグネシウムと、1μM DNA鋳型又はプラスミド0.1μg /mlとを用いて、さらに多量のRNAを調製した。ボディ標識(body-labeled)RNAを、100μl 反応において1mM3種NTPの各々と、0.25mM同等の放射標識NTP(〔α−32P〕NTP,5μCi)と、15mM MgCl2と、T7RNAポリメラーゼ0.1mg/mlとを用いて調製した。5−ヨードウリジントリホスフェートと5−ブロモウリジントリホスフェートを含むヌクレオチドはSigma Chemical Co.(ミズリー州,セントルイス)から得た。RNAフラグメントは20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって精製した。所望のフラグメントをポリアクリルアミドゲルから溶離させ、0.3M酢酸ナトリウムの存在下でエタノール沈殿させた。R17バクテリオファージを大腸菌(Escherichia coli) 菌株S26中で増殖させ、コートタンパク質をCarey と共同研究者が述べている方法(Carey 等(1983),Biochemistry 22:4723)を用いて精製した。
図6に示した、RNA−1(配列番号:1)、RNA−2(配列番号:2)及びRNA−3(配列番号:3)並びに図12に示したRNA−7(配列番号:4)を合成DNA鋳型又はプラスミドからのインビトロ転写によって、Milliganと共同研究者が述べている方法(Milligan等(1987),Nucleic Acids Res.15:8783)を用いて調製した。転写反応は40mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris−HCl,pH8.1,37℃)と、1mMスペルミジンと、5mMジチオトレイトール(DTT)と、ウシ血清アルブミン(BSA)50μg /mlと、0.1%(V/V)Triton X−100と、ポリエチレングリコール(mr8000)80mg/mlと、T7RNAポリメラーゼ0.1mg/mlとを用いた。3〜5mM 各ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)と、25mM塩化マグネシウムと、1μM DNA鋳型又はプラスミド0.1μg /mlとを用いて、さらに多量のRNAを調製した。ボディ標識(body-labeled)RNAを、100μl 反応において1mM3種NTPの各々と、0.25mM同等の放射標識NTP(〔α−32P〕NTP,5μCi)と、15mM MgCl2と、T7RNAポリメラーゼ0.1mg/mlとを用いて調製した。5−ヨードウリジントリホスフェートと5−ブロモウリジントリホスフェートを含むヌクレオチドはSigma Chemical Co.(ミズリー州,セントルイス)から得た。RNAフラグメントは20%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって精製した。所望のフラグメントをポリアクリルアミドゲルから溶離させ、0.3M酢酸ナトリウムの存在下でエタノール沈殿させた。R17バクテリオファージを大腸菌(Escherichia coli) 菌株S26中で増殖させ、コートタンパク質をCarey と共同研究者が述べている方法(Carey 等(1983),Biochemistry 22:4723)を用いて精製した。
実施例2. R17コートタンパク質に対するRNA−1とRNA−2との結合定数.
バクテリオファージR17コートタンパク質に対するヘアピン変異体RNA−1(配列番号:1)、RNA−2(配列番号:2)及びRNA−3(配列番号:3)のRNA−タンパク質結合曲線を図7に示す。コートタンパク質とRNAヘアピン変異体との間の会合定数をCarey と共同研究者が述べているニトロセルロースフィルター保持検定(Carey 等(1983),上記文献)を用いて測定した。10mM酢酸マグネシウム、80mM KCl、80μg /mlのBSA及び100mMTris−HCl(pH8.5、4℃)(TMKバッファー)中で、定常な低濃度の32P標識RNAを0.06nM〜1μM の一連のコートタンパク質濃度と混合した。これらは架橋実験に用いた溶液条件と同じであった。4℃における45〜60分間のインキュベーション後に、混合物をニトロセルロースフィルターに通して濾過して、フィルター上に保留された複合体量を液体シンチレーション計測によって測定した。各実験に関して、データ点を非協同(non-cooperative)結合曲線に当てはめて、図7に示すKd値を算出した。
バクテリオファージR17コートタンパク質に対するヘアピン変異体RNA−1(配列番号:1)、RNA−2(配列番号:2)及びRNA−3(配列番号:3)のRNA−タンパク質結合曲線を図7に示す。コートタンパク質とRNAヘアピン変異体との間の会合定数をCarey と共同研究者が述べているニトロセルロースフィルター保持検定(Carey 等(1983),上記文献)を用いて測定した。10mM酢酸マグネシウム、80mM KCl、80μg /mlのBSA及び100mMTris−HCl(pH8.5、4℃)(TMKバッファー)中で、定常な低濃度の32P標識RNAを0.06nM〜1μM の一連のコートタンパク質濃度と混合した。これらは架橋実験に用いた溶液条件と同じであった。4℃における45〜60分間のインキュベーション後に、混合物をニトロセルロースフィルターに通して濾過して、フィルター上に保留された複合体量を液体シンチレーション計測によって測定した。各実験に関して、データ点を非協同(non-cooperative)結合曲線に当てはめて、図7に示すKd値を算出した。
実施例3. 308nmにおけるR17コートタンパク質に対するRNA−1とRNA−2との光架橋
32P標識RNA配列RNA−1(配列番号:1)及びRNA−2(配列番号:2)(5nM)と、R17コートタンパク質(120nM)とを、それぞれ、100mM Tris−HCl(pH8.5、4℃)、80mM KCl、10mM 酢酸マグネシウム、80μg /mlのBSA中で氷上において15〜25分間インキュベートしてから、照射した。これらは、RNAをコートタンパク質に完全に結合させた条件と同じであった。RNAがヘアピンコンホメーションであることを保証するために、RNAを水中で85℃に3分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した(GroebeとUhlenbech (1988),Nucleic Acids Res.16:1725)。60mbarキセノン、80mbarヘリウム中5%HCl及び2360mbarヘリウムを装填したLambda Physik EMG−101エクサイマーレーザーを308nm照射に用いた。XeClレーザーの出力をRNA−タンパク質複合体を含む4mm幅X1cm光路長さの石英キュベット方向に非収束的(unfocussed)に導いた。 このレーザーを10Hzにおいて60mJ/パルスの範囲内で操作した;しかし、レーザービームの約25%のみが反応セル上に入射した。R17バクテリオファージコートタンパク質へのRNA−1(配列番号:1)及びRNA−2(配列番号:2)の光架橋収量を照射時間の関数として図8に示す。架橋RNAを非架橋RNAからPAGEによって分離し;収量をオートラジオグラフィーによって測定した。コートタンパク質に対する競合光損傷がRNAへの結合を阻害するために、5−ブロモウラシル含有変異体RNA−1(配列番号:1)の架橋は約40%で最大であった(Gott等(1991),上記文献)。より短い照射時間のために、RNA2に関してはコートタンパク質への少ない光損傷が生じた。
吸収された光子の関数としての架橋は、308nmにおける照射によってBrU−RNA1の架橋の量子収量が0.014であり、IU−RNA−2(配列番号:2)の架橋の量子収量が0.006であることを実証した。IU−RNA−2によっては、量子収量が低いにも拘わらず、308nmにおけるIU発色団の吸収確率が数倍高いために、高い架橋収量が得られた。BrUとIUとは、それぞれ、385と2640L/mol ・cmのモル吸光係数によって308nmにおいて吸光する。それ故、タンパク質損傷の前にIU−RNAの高レベルの光架橋が得られた。
32P標識RNA配列RNA−1(配列番号:1)及びRNA−2(配列番号:2)(5nM)と、R17コートタンパク質(120nM)とを、それぞれ、100mM Tris−HCl(pH8.5、4℃)、80mM KCl、10mM 酢酸マグネシウム、80μg /mlのBSA中で氷上において15〜25分間インキュベートしてから、照射した。これらは、RNAをコートタンパク質に完全に結合させた条件と同じであった。RNAがヘアピンコンホメーションであることを保証するために、RNAを水中で85℃に3分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した(GroebeとUhlenbech (1988),Nucleic Acids Res.16:1725)。60mbarキセノン、80mbarヘリウム中5%HCl及び2360mbarヘリウムを装填したLambda Physik EMG−101エクサイマーレーザーを308nm照射に用いた。XeClレーザーの出力をRNA−タンパク質複合体を含む4mm幅X1cm光路長さの石英キュベット方向に非収束的(unfocussed)に導いた。 このレーザーを10Hzにおいて60mJ/パルスの範囲内で操作した;しかし、レーザービームの約25%のみが反応セル上に入射した。R17バクテリオファージコートタンパク質へのRNA−1(配列番号:1)及びRNA−2(配列番号:2)の光架橋収量を照射時間の関数として図8に示す。架橋RNAを非架橋RNAからPAGEによって分離し;収量をオートラジオグラフィーによって測定した。コートタンパク質に対する競合光損傷がRNAへの結合を阻害するために、5−ブロモウラシル含有変異体RNA−1(配列番号:1)の架橋は約40%で最大であった(Gott等(1991),上記文献)。より短い照射時間のために、RNA2に関してはコートタンパク質への少ない光損傷が生じた。
吸収された光子の関数としての架橋は、308nmにおける照射によってBrU−RNA1の架橋の量子収量が0.014であり、IU−RNA−2(配列番号:2)の架橋の量子収量が0.006であることを実証した。IU−RNA−2によっては、量子収量が低いにも拘わらず、308nmにおけるIU発色団の吸収確率が数倍高いために、高い架橋収量が得られた。BrUとIUとは、それぞれ、385と2640L/mol ・cmのモル吸光係数によって308nmにおいて吸光する。それ故、タンパク質損傷の前にIU−RNAの高レベルの光架橋が得られた。
実施例4. R17コートタンパク質へのRNA−1の架橋に関係するアミノ酸残基の同定.
R17コートタンパク質へのRNA−1(配列番号:1)の大規模架橋。 300nM5’−末端標識RNAと500nMコートタンパク質とを含む溶液(10ml)を100mM Tris−HCl(pH8.5、4℃)と、10mMMg(OAc)2と、80mM KClと、ウシ血清アルブミン(BSA)(80mg)と、5mMジチオトレイトール(DTT)との存在下で氷上において10〜90分間インキュベートした。308nmにおける単色光線照射のためには、Lambda Physik EMG−101エクサイマーレーザーを用いた。ビーム出力は10Hzにおいて69±5mJ/パルスと測定された。ビームの約50%が、サーモスタットで調温されたセルホルダー中の1cm光路長さ石英キュベット中に、7mm直径円形ビームマスク(beam mask)を通して収束した。レーザー出力をScientech 360−001ディスクカロリーメーター出力計によって測定した。Laude RC3循環浴によって、温度を4±2℃に調節した。
2mlフラクションで実施した照射の直前に反応混合物(10ml)を調製した。5分間照射した後に、タンパク質濃度を1μM にした。反応混合物を次に3分間インキュベートして、核タンパク質複合体中の光損傷したタンパク質を新しいタンパク質と交換させ、さらに5分間照射した。20%変性PAGEによって分析し、Molecular Dynamics Phosphoimager上で定量した架橋は22%架橋であった。
サンプル(90ml)は5.9nmolの架橋RNAと、21nmolの遊離RNAと、97nmolの遊離コートタンパク質と、BSA(7.2mg)とを含有した。全体量を20mlに減じ、2個の50mlポリプロピレンねじぶた遠心管(Nalgen)に等分し、−20℃において一晩エタノール沈殿させた。RNA及びタンパク質をBeckman J2−21遠心機の固定角度J−20ローター中で13,000rpm において回転させて、ペレットにした。各ペレットを0.5M尿素、50mM Tris−HCl(pH8.3)及び0.2%SDSの1ml中に4℃において48時間振とうさせながら再懸濁させた。フラクションを一緒にし、次に、トリプシンの活性を減じないように、SDSを沈殿によって除去した。これは40mM KClによって達成され、沈殿物を0.22μm 酢酸セルローススピンフィルターによるスピニングによって除去した。この溶液(500μl )を用いて、トリプシン状態を最適化した。
R17コートタンパク質へのRNA−1(配列番号:1)の大規模架橋。 300nM5’−末端標識RNAと500nMコートタンパク質とを含む溶液(10ml)を100mM Tris−HCl(pH8.5、4℃)と、10mMMg(OAc)2と、80mM KClと、ウシ血清アルブミン(BSA)(80mg)と、5mMジチオトレイトール(DTT)との存在下で氷上において10〜90分間インキュベートした。308nmにおける単色光線照射のためには、Lambda Physik EMG−101エクサイマーレーザーを用いた。ビーム出力は10Hzにおいて69±5mJ/パルスと測定された。ビームの約50%が、サーモスタットで調温されたセルホルダー中の1cm光路長さ石英キュベット中に、7mm直径円形ビームマスク(beam mask)を通して収束した。レーザー出力をScientech 360−001ディスクカロリーメーター出力計によって測定した。Laude RC3循環浴によって、温度を4±2℃に調節した。
2mlフラクションで実施した照射の直前に反応混合物(10ml)を調製した。5分間照射した後に、タンパク質濃度を1μM にした。反応混合物を次に3分間インキュベートして、核タンパク質複合体中の光損傷したタンパク質を新しいタンパク質と交換させ、さらに5分間照射した。20%変性PAGEによって分析し、Molecular Dynamics Phosphoimager上で定量した架橋は22%架橋であった。
サンプル(90ml)は5.9nmolの架橋RNAと、21nmolの遊離RNAと、97nmolの遊離コートタンパク質と、BSA(7.2mg)とを含有した。全体量を20mlに減じ、2個の50mlポリプロピレンねじぶた遠心管(Nalgen)に等分し、−20℃において一晩エタノール沈殿させた。RNA及びタンパク質をBeckman J2−21遠心機の固定角度J−20ローター中で13,000rpm において回転させて、ペレットにした。各ペレットを0.5M尿素、50mM Tris−HCl(pH8.3)及び0.2%SDSの1ml中に4℃において48時間振とうさせながら再懸濁させた。フラクションを一緒にし、次に、トリプシンの活性を減じないように、SDSを沈殿によって除去した。これは40mM KClによって達成され、沈殿物を0.22μm 酢酸セルローススピンフィルターによるスピニングによって除去した。この溶液(500μl )を用いて、トリプシン状態を最適化した。
タンパク質分解消化. 遊離RNAとタンパク質とを含む残留架橋RNA溶液(1.5ml)を、1M 尿素、20mM CaCl2及び6mM DTTを含む6mlにし、次にトリプシン−TPCK(251単位/mg)(1.61mg(1:5w/w))を加えた。反応を36℃において2時間進行させ、この時点でさらに1.61mgのトリプシンを加えた。4時間目に、アリコート(100 μl )を取り出し、急速凍結によって反応を停止させた。20%ポリアクリルアミド19:1架橋、7M尿素、90mM Tris−ボレート/2mM EDTA(TBE)ゲル電気泳動(20%尿素変性PAGE)によって、反応を分析した。
消化された架橋DNAの精製. トリプシン反応混合物を10mlにして、塩のモル濃度を減じ、240μl DEAEイオン交換遠心カラムに通して処理した。このカラムを100mM NaClによって洗浄し、実験台(bench top)遠心機において乾式遠心して、遊離ペプチドを除去した。RNAと架橋トリプシンフラグメントとを含むカラム結合物質をカラムから600mM NaCl(1ml)によって溶離し、カラムを乾式遠心した。さらに200μl の600mM NaClをカラムに通して遠心した。2フラクションをプールし、エタノール沈殿させ、4℃において35分間、10,000rpm でペレット化した。ペレットを7M尿素−TBEバッファー、10mM DTT、0.1%ブロモフェノールブルー、0.1%キシレンシラノールの25μl中に再懸濁させ、85℃に4分間、加熱し、20%変性PAGEによって精製した。このゲルを600Vにおいて3.5時間処理した。このゲルを5分間ホスホイメージ(phosphoimage)暴露させた。消化されたタンパク質−RNA架橋をゲルから、Bio−RAD製のPVDFタンパク質配列決定膜(sequencing membrane)(0.2ミクロン)上に電気分解式にブロットした。この膜を風乾させ、1分間クーマシー染色し、50%MeOH:50%H2O中で2分間汚れを除去し、脱イオンH2Oによって2回すすぎ洗いした。膜のオートラジオグラムを作成して、膜から取り出された、消化されたタンパク質RNA架橋を可視化し、エドマン(Edman)分解を受けさせた。Howard Hughesの方法及びプロトコール(Clive Slaughter,テキサス大学 Howard Hughes 医学研究所(サウスウエスターン))を用いて、Applied Biosystems 470Aシークエンサーにおいて実施した自動化エドマン分解によって、固定化ペプチドの配列決定した。このエドマン分析は、架橋位置が既知アミノ酸配列に基づいてチロシン−85であることを実証した(Weber (1983),Biochemistry 6:3144)。
消化された架橋DNAの精製. トリプシン反応混合物を10mlにして、塩のモル濃度を減じ、240μl DEAEイオン交換遠心カラムに通して処理した。このカラムを100mM NaClによって洗浄し、実験台(bench top)遠心機において乾式遠心して、遊離ペプチドを除去した。RNAと架橋トリプシンフラグメントとを含むカラム結合物質をカラムから600mM NaCl(1ml)によって溶離し、カラムを乾式遠心した。さらに200μl の600mM NaClをカラムに通して遠心した。2フラクションをプールし、エタノール沈殿させ、4℃において35分間、10,000rpm でペレット化した。ペレットを7M尿素−TBEバッファー、10mM DTT、0.1%ブロモフェノールブルー、0.1%キシレンシラノールの25μl中に再懸濁させ、85℃に4分間、加熱し、20%変性PAGEによって精製した。このゲルを600Vにおいて3.5時間処理した。このゲルを5分間ホスホイメージ(phosphoimage)暴露させた。消化されたタンパク質−RNA架橋をゲルから、Bio−RAD製のPVDFタンパク質配列決定膜(sequencing membrane)(0.2ミクロン)上に電気分解式にブロットした。この膜を風乾させ、1分間クーマシー染色し、50%MeOH:50%H2O中で2分間汚れを除去し、脱イオンH2Oによって2回すすぎ洗いした。膜のオートラジオグラムを作成して、膜から取り出された、消化されたタンパク質RNA架橋を可視化し、エドマン(Edman)分解を受けさせた。Howard Hughesの方法及びプロトコール(Clive Slaughter,テキサス大学 Howard Hughes 医学研究所(サウスウエスターン))を用いて、Applied Biosystems 470Aシークエンサーにおいて実施した自動化エドマン分解によって、固定化ペプチドの配列決定した。このエドマン分析は、架橋位置が既知アミノ酸配列に基づいてチロシン−85であることを実証した(Weber (1983),Biochemistry 6:3144)。
実施例5. 308nmにおけるR17コートタンパク質に対するRNA−2の光架橋
実施例3に述べた実験と同様な実験において、IU置換RNA−2(配列番号:2)をR17コートタンパク質に、Omnichrome HeCdレーザー(モデル3074−40M325)からの325nmにおける単色発光によって光架橋させた。HeCdレーザーの出力は37mWであり、直径3mmのビーム全体がサンプル上に入射した。単位時間あたりの励起を高めるために、誘電体塗布凹面鏡によってビームを反射させて、サンプルに通して戻した。架橋RNAをPAGEによって非架橋RNAから分離し、収量をホスホイメージャーによって測定した。タンパク質に架橋したRNAの%を照射時間の関数として図9に示す。R17コートタンパク質に対する光損傷なしに、高収量架橋が生じた。別の実験では、さらに高い線量による325nmによるコートタンパク質のみの同様な照射が、R17コートタンパク質と同じ結合定数を示すタンパク質を生じた。BrU含有RNA−1−R17コートタンパク質複合体の325nm照射は、BrU発色団が325nmにおいて透光性であるために、架橋を生じなかった。
実施例3に述べた実験と同様な実験において、IU置換RNA−2(配列番号:2)をR17コートタンパク質に、Omnichrome HeCdレーザー(モデル3074−40M325)からの325nmにおける単色発光によって光架橋させた。HeCdレーザーの出力は37mWであり、直径3mmのビーム全体がサンプル上に入射した。単位時間あたりの励起を高めるために、誘電体塗布凹面鏡によってビームを反射させて、サンプルに通して戻した。架橋RNAをPAGEによって非架橋RNAから分離し、収量をホスホイメージャーによって測定した。タンパク質に架橋したRNAの%を照射時間の関数として図9に示す。R17コートタンパク質に対する光損傷なしに、高収量架橋が生じた。別の実験では、さらに高い線量による325nmによるコートタンパク質のみの同様な照射が、R17コートタンパク質と同じ結合定数を示すタンパク質を生じた。BrU含有RNA−1−R17コートタンパク質複合体の325nm照射は、BrU発色団が325nmにおいて透光性であるために、架橋を生じなかった。
実施例6. トランスイルミネーターによるR17コートタンパク質に対するRNA−1及びRNA−2の光架橋.
実施例3に述べた実験と同様な実験において、RNA−1(配列番号:1)及びRNA−2(配列番号:2)をR17コートタンパク質に、ポリスチレンによって濾過した、Fisher Biotech Transilluminator (モデルFBTIV−816)からの312nm範囲内の広帯域発光によって光架橋させた。架橋RNAをPAGEによって非架橋RNAから分離し、収量をオートラジオグラフィーによって測定した。タンパク質に架橋したRNAの%を照射時間の関数として図10に示す。
実施例3に述べた実験と同様な実験において、RNA−1(配列番号:1)及びRNA−2(配列番号:2)をR17コートタンパク質に、ポリスチレンによって濾過した、Fisher Biotech Transilluminator (モデルFBTIV−816)からの312nm範囲内の広帯域発光によって光架橋させた。架橋RNAをPAGEによって非架橋RNAから分離し、収量をオートラジオグラフィーによって測定した。タンパク質に架橋したRNAの%を照射時間の関数として図10に示す。
実施例7. 5−ヨードウラシルとN−アセチルチロシン N−エチルアミドとの光反応
Dietz とKoch(1987)(上記文献)が開示するように、N−アセチルチロシン N−エチルアミドを調製した。ヨードウラシルと10モル当量過剰なN−アセチルチロシン N−エチルアミドをXeClエキシマーレーザーによる308nmにおける照射は、図11に示すように、ブロモウラシルとN−アセチルチロシン N−エチルアミドとからの光付加物(photoadduct)(構造6)(Dietz とKoch(1987),上記文献)と同様な光付加物を生じた。C−18逆相HPLCと1H NMRスペクトロスコピーとによって生成物比較を行った。会合タンパク質へのIU置換核酸の光架橋の機構については殆ど知られていないが、この結果は、この光架橋の機構が会合タンパク質へのBrU置換核酸の光架橋の機構と同じであることを示唆する。
Dietz とKoch(1987)(上記文献)が開示するように、N−アセチルチロシン N−エチルアミドを調製した。ヨードウラシルと10モル当量過剰なN−アセチルチロシン N−エチルアミドをXeClエキシマーレーザーによる308nmにおける照射は、図11に示すように、ブロモウラシルとN−アセチルチロシン N−エチルアミドとからの光付加物(photoadduct)(構造6)(Dietz とKoch(1987),上記文献)と同様な光付加物を生じた。C−18逆相HPLCと1H NMRスペクトロスコピーとによって生成物比較を行った。会合タンパク質へのIU置換核酸の光架橋の機構については殆ど知られていないが、この結果は、この光架橋の機構が会合タンパク質へのBrU置換核酸の光架橋の機構と同じであることを示唆する。
実施例8. タンパク質に光架橋したRNAからのcDNAの調製
DNA鋳型の代わりにプラスミドを用いて、実施例1に報告するような方法によって、RNA−7(配列番号:4)(図11)を製造した。実施例3に述べるように、光架橋を実施した。6.75nM RNAと120nM R17コートタンパク質とから成る反応混合物(4ml)をXeClエキシマーレーザーからの非収束発光によって308nmにおいて、一度に2mlずつ、照射した。レーザーは50mJ/パルスを生じ、レーザーを10Hzにおいて操作した。5分間の照射中に、この反応はほぼ定量的な架橋(85〜90%)にまで進行した。架橋後に、全反応混合物の1mlを取り出した;EDTA(80mM)、SDS(0.1%)及びCaCl2(0.1mM)を加え;存在する遊離(非結合)RNAを精製除去して;タンパク質をプロテイナーゼKによって60℃において30分間消化させた。残留タンパク質に結合したRNAをエタノール沈殿させ、塩を除去し、遠心してペレットにした。これらのペレットを70%エタノールによって3回洗浄して、残留塩を除去した。逆転写反応を利用して、RNA鋳型の相補的DNAコピーを製造した。13−塩基プロモーターをRNAにアニールし、逆転写反応を製造業者,Gibco (メリーランド州,ガイサースブルグ)の標準条件下で実施し、1時間後に停止させた。cDNAを32P標識デオキシシチジントリホスフェートによってボディ標識した。次に、0.2M水酸化ナトリウムによる100℃における5分間の加水分解によって、RNA鋳型を除去した。cDNAの形成をPAGEによって追跡した。加水分解ラダー(ladder)とマーカーとをゲルに加えて、cDNAの長さを測定した。このcDNAは44ヌクレオチドRNA鋳型と同時移動した。架橋修飾の結果として、cDNAの停止があったとしても、31ヌクレオチドの短縮生成物が得られたと考えられる。ゲルの22〜25ヌクレオチド領域に少量の停止生成物が観察されたが、これはRNA鋳型上のcDNAの位置25において開始するヘアピン二次構造から生じたと考えられる。ゲルの31ヌクレオチド領域に停止は出現しなかった;このことは逆転写酵素が架橋の位置を通して読み取りを行ったことを実証した。ゲルの線図を図14に示す。
DNA鋳型の代わりにプラスミドを用いて、実施例1に報告するような方法によって、RNA−7(配列番号:4)(図11)を製造した。実施例3に述べるように、光架橋を実施した。6.75nM RNAと120nM R17コートタンパク質とから成る反応混合物(4ml)をXeClエキシマーレーザーからの非収束発光によって308nmにおいて、一度に2mlずつ、照射した。レーザーは50mJ/パルスを生じ、レーザーを10Hzにおいて操作した。5分間の照射中に、この反応はほぼ定量的な架橋(85〜90%)にまで進行した。架橋後に、全反応混合物の1mlを取り出した;EDTA(80mM)、SDS(0.1%)及びCaCl2(0.1mM)を加え;存在する遊離(非結合)RNAを精製除去して;タンパク質をプロテイナーゼKによって60℃において30分間消化させた。残留タンパク質に結合したRNAをエタノール沈殿させ、塩を除去し、遠心してペレットにした。これらのペレットを70%エタノールによって3回洗浄して、残留塩を除去した。逆転写反応を利用して、RNA鋳型の相補的DNAコピーを製造した。13−塩基プロモーターをRNAにアニールし、逆転写反応を製造業者,Gibco (メリーランド州,ガイサースブルグ)の標準条件下で実施し、1時間後に停止させた。cDNAを32P標識デオキシシチジントリホスフェートによってボディ標識した。次に、0.2M水酸化ナトリウムによる100℃における5分間の加水分解によって、RNA鋳型を除去した。cDNAの形成をPAGEによって追跡した。加水分解ラダー(ladder)とマーカーとをゲルに加えて、cDNAの長さを測定した。このcDNAは44ヌクレオチドRNA鋳型と同時移動した。架橋修飾の結果として、cDNAの停止があったとしても、31ヌクレオチドの短縮生成物が得られたと考えられる。ゲルの22〜25ヌクレオチド領域に少量の停止生成物が観察されたが、これはRNA鋳型上のcDNAの位置25において開始するヘアピン二次構造から生じたと考えられる。ゲルの31ヌクレオチド領域に停止は出現しなかった;このことは逆転写酵素が架橋の位置を通して読み取りを行ったことを実証した。ゲルの線図を図14に示す。
実施例9. ヨードシトシン光架橋.
5−位置にシトシンを含み、R17コートタンパク質に高アフィニティで結合したヘアピンRNA(RNA8)に、5−ヨードシトシン(IC)を組み入れた。このIC含有RNAをRNA9と名付ける。RNA9(5nM)とR17コートタンパク質(120nM)とを100mM Tris−HCl(pH8.5、4℃)/80mM KCl/10mM酢酸マグネシウム/80μg /ml BSA中で氷上において15〜25分間インキュベートしてから、照射した。コートタンパク質に結合したコンホメーションであることを保証するために、水中のRNAを85℃に3分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した(GroebeとUhlenbech (1988),上記文献)。この複合体を4℃において5分間照射し、この実験をRNA2及びRNA8コートタンパク質複合体の対照照射に比較した。RNA8−コートタンパク質複合体の照射は架橋生成物を生じなかった。RNA9−コートタンパク質複合体の照射は、RNA2−コートタンパク質複合体の対照照射の収量(80〜90%)と同様な高収量(70〜80%)で形成される架橋の形成を生じた。RNA9の架橋はループヘアピンの位置−5にIUを含むRNAと同じ機構で生ずると推定される(図6と12)。この推定は、RNA8は光架橋しなかったので、架橋の特異性に基づく。
5−位置にシトシンを含み、R17コートタンパク質に高アフィニティで結合したヘアピンRNA(RNA8)に、5−ヨードシトシン(IC)を組み入れた。このIC含有RNAをRNA9と名付ける。RNA9(5nM)とR17コートタンパク質(120nM)とを100mM Tris−HCl(pH8.5、4℃)/80mM KCl/10mM酢酸マグネシウム/80μg /ml BSA中で氷上において15〜25分間インキュベートしてから、照射した。コートタンパク質に結合したコンホメーションであることを保証するために、水中のRNAを85℃に3分間加熱し、氷上で急冷してから、使用した(GroebeとUhlenbech (1988),上記文献)。この複合体を4℃において5分間照射し、この実験をRNA2及びRNA8コートタンパク質複合体の対照照射に比較した。RNA8−コートタンパク質複合体の照射は架橋生成物を生じなかった。RNA9−コートタンパク質複合体の照射は、RNA2−コートタンパク質複合体の対照照射の収量(80〜90%)と同様な高収量(70〜80%)で形成される架橋の形成を生じた。RNA9の架橋はループヘアピンの位置−5にIUを含むRNAと同じ機構で生ずると推定される(図6と12)。この推定は、RNA8は光架橋しなかったので、架橋の特異性に基づく。
実施例10. DNAリガンド中へのハロゲン化ヌクレオチドの組み入れ.
上記方法による照射時に標的分子に架橋することができるDNAリガンド中に、光反応性ヌクレオチドを組み入れることができる。5−ブロモデオキシウラシル(BrdU)、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン及び5−ヨード−2’−デオキシウラシルは、このような光反応性ヌクレオチドの例である。
上記方法による照射時に標的分子に架橋することができるDNAリガンド中に、光反応性ヌクレオチドを組み入れることができる。5−ブロモデオキシウラシル(BrdU)、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン及び5−ヨード−2’−デオキシウラシルは、このような光反応性ヌクレオチドの例である。
実施例11. 光SELEX.
本発明の1実施態様では、標的分子に結合し、光架橋する核酸リガンドの選択に光SELEXを完成まで適用する。
光反応性基を含む核酸オリゴヌクレオチドのランダム化セットを合成する。候補混合物のオリゴヌクレオチドを、利用可能な各位置において、光反応性基によって部分的に又は完全に飽和することができる。候補混合物を標的分子と接触させ、光の適当な波長において照射する。標的分子と架橋したオリゴヌクレオチドを残りのオリゴヌクレオチドから単離し、標的分子を除去する。単離したRNA配列のcDNAコピーを作成し、増幅する。これらの増幅cDNA配列を光反応性基の存在下でRNA配列に転写し、必要に応じて、光SELEXを繰り返す。
本発明の1実施態様では、標的分子に結合し、光架橋する核酸リガンドの選択に光SELEXを完成まで適用する。
光反応性基を含む核酸オリゴヌクレオチドのランダム化セットを合成する。候補混合物のオリゴヌクレオチドを、利用可能な各位置において、光反応性基によって部分的に又は完全に飽和することができる。候補混合物を標的分子と接触させ、光の適当な波長において照射する。標的分子と架橋したオリゴヌクレオチドを残りのオリゴヌクレオチドから単離し、標的分子を除去する。単離したRNA配列のcDNAコピーを作成し、増幅する。これらの増幅cDNA配列を光反応性基の存在下でRNA配列に転写し、必要に応じて、光SELEXを繰り返す。
実施例12. 強化光架橋性リガンドの選択:光SELEXを伴うSELEX.
本発明の方法の1実施態様では、SELEXによる核酸リガンドの選択後に、標的分子に架橋することができるリガンドに関して光SELEXによって選択する。このプロトコールは、標的に光架橋することもできる、標的分子に対して高い結合アフィニティを有するリガンドを生じる。
特定トリホスフェートの代わりに反応性ヌクレオチドトリホスフェートによるT7ポリメラーゼ転写によって、RNA中に光反応性ヌクレオチドを組み入れる。例えば、5−ブロモウリジントリホスフェートをウリジントリホスフェートと置換する、又は8−ブロモアデノシントリホスフェートをアデノシントリホスフェートと置換する。光反応性ヌクレオチドを含むRNA配列のランダム化セットを形成し、SELEX方法を適用する。最初の選択ラウンドを用いて、本質的に不良なバインダーを除去し、分子プールの質を向上させて、光反応性基を有し、標的分子に結合するRNAプールを形成するように、分子プールを収斂させる(converge)。初期SELEXラウンドからのアリコートを照射する、ラウンドが進行するにつれて、光架橋の強化をPAGEによって追跡する。架橋生成物を表す、緩慢な移動帯が明白になり始めたときに、RNAプールを光SELEXのラウンド中に導入する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接して光反応性基を有するRNAを反応させ、選択して、反応性標的残基に近接して反応性ヌクレオチドを有さないRNAを除去する。
このプロトコールは、標的分子に対する予め同定されたリガンドに光SELEX選択を適用する。
本発明の方法の1実施態様では、SELEXによる核酸リガンドの選択後に、標的分子に架橋することができるリガンドに関して光SELEXによって選択する。このプロトコールは、標的に光架橋することもできる、標的分子に対して高い結合アフィニティを有するリガンドを生じる。
特定トリホスフェートの代わりに反応性ヌクレオチドトリホスフェートによるT7ポリメラーゼ転写によって、RNA中に光反応性ヌクレオチドを組み入れる。例えば、5−ブロモウリジントリホスフェートをウリジントリホスフェートと置換する、又は8−ブロモアデノシントリホスフェートをアデノシントリホスフェートと置換する。光反応性ヌクレオチドを含むRNA配列のランダム化セットを形成し、SELEX方法を適用する。最初の選択ラウンドを用いて、本質的に不良なバインダーを除去し、分子プールの質を向上させて、光反応性基を有し、標的分子に結合するRNAプールを形成するように、分子プールを収斂させる(converge)。初期SELEXラウンドからのアリコートを照射する、ラウンドが進行するにつれて、光架橋の強化をPAGEによって追跡する。架橋生成物を表す、緩慢な移動帯が明白になり始めたときに、RNAプールを光SELEXのラウンド中に導入する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接して光反応性基を有するRNAを反応させ、選択して、反応性標的残基に近接して反応性ヌクレオチドを有さないRNAを除去する。
このプロトコールは、標的分子に対する予め同定されたリガンドに光SELEX選択を適用する。
実施例13. SELEXを伴う光SELEX
本発明の方法の他の実施態様では、標的分子に光架橋することができるRNAリガンドを光SELEX方法によって予め選択する。その後に、SELEXを実施して、架橋用オリゴヌクレオチドを標的分子結合能力に関して選択する。
本発明の方法の他の実施態様では、標的分子に光架橋することができるRNAリガンドを光SELEX方法によって予め選択する。その後に、SELEXを実施して、架橋用オリゴヌクレオチドを標的分子結合能力に関して選択する。
実施例14. 光SELEXを伴う限定SELEX
本発明のこの実施態様では、限定された回数の選択ラウンドでのSELEX方法によって、核酸リガンドを選択する。実施例12と同様に、SELEXを完成まで適用しない。むしろ、標的分子に対して比較的大きいアフィニティを有するオリゴヌクレオチドに関して、候補混合物を部分的に選択する。候補混合物のランダムオリゴヌクレオチドは光反応性基を含む、初期SELEXを照射なしに実施する。次に、光SELEXを実施して、標的分子に架橋することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
このプロトコールは、幾らか大きい標的分子結合能力を有する架橋用リガンドの、オリゴヌクレオチドプールからの選択を可能にし、SELEXによる完成までの選択が架橋用リガンドを生成しない状況で有用である。
本発明のこの実施態様では、限定された回数の選択ラウンドでのSELEX方法によって、核酸リガンドを選択する。実施例12と同様に、SELEXを完成まで適用しない。むしろ、標的分子に対して比較的大きいアフィニティを有するオリゴヌクレオチドに関して、候補混合物を部分的に選択する。候補混合物のランダムオリゴヌクレオチドは光反応性基を含む、初期SELEXを照射なしに実施する。次に、光SELEXを実施して、標的分子に架橋することができるオリゴヌクレオチドを選択する。
このプロトコールは、幾らか大きい標的分子結合能力を有する架橋用リガンドの、オリゴヌクレオチドプールからの選択を可能にし、SELEXによる完成までの選択が架橋用リガンドを生成しない状況で有用である。
実施例15. 限定指向性(limited directed)光SELEX
本発明の方法の1実施態様では、SELEXによって同定される核酸リガンドが限定されたランダム化を受けた後に、光SELEXによる選択を受ける。
部分的ランダム化RNAの転写に用いるDNA鋳型の構成は初期選択リガンドの配列に基づくものであり、初期選択RNA配列の位置に相補的である各位置に主としてヌクレオチドを含む。しかし、各位置はその位置におけるオリジナル配列を変えるシークエンサー中に、他の3種のヌクレオチドの各々の少量を用いることによっても、部分的にランダム化される。次に、反応ミックス中の特定のトリホスフェートに置換する光反応性トリホスフェート(すなわち、Uに対してBrU)によって、DNA分子のこのセットから限定RNAプールを転写する。光反応性ヌクレオチドを含む、RNA分子の部分的ランダム化セットにある量の標的タンパク質を混合する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基を有する結合RNAは、照射時に、共有結合架橋を形成する。結合し、架橋するRNAを数回の光SELEXラウンドで選択し、結合するが架橋しないRNAから分離する。
本発明の方法の1実施態様では、SELEXによって同定される核酸リガンドが限定されたランダム化を受けた後に、光SELEXによる選択を受ける。
部分的ランダム化RNAの転写に用いるDNA鋳型の構成は初期選択リガンドの配列に基づくものであり、初期選択RNA配列の位置に相補的である各位置に主としてヌクレオチドを含む。しかし、各位置はその位置におけるオリジナル配列を変えるシークエンサー中に、他の3種のヌクレオチドの各々の少量を用いることによっても、部分的にランダム化される。次に、反応ミックス中の特定のトリホスフェートに置換する光反応性トリホスフェート(すなわち、Uに対してBrU)によって、DNA分子のこのセットから限定RNAプールを転写する。光反応性ヌクレオチドを含む、RNA分子の部分的ランダム化セットにある量の標的タンパク質を混合する。核タンパク質複合体中の反応性アミノ酸残基に隣接する光反応性基を有する結合RNAは、照射時に、共有結合架橋を形成する。結合し、架橋するRNAを数回の光SELEXラウンドで選択し、結合するが架橋しないRNAから分離する。
実施例16. 標的分子の修飾方法.
本発明の他の実施態様では、標的分子を改質することができるリガンドを発展させるために光SELEXを適用する。これらの状況下で、光SELEX又はSELEXによって選択されるリガンド上又は中への光反応性基の組み入れは、標的分子の生物学的活性が改良されるような、幾つかの方法で標的分子を改質することができる。例えば、標的分子を光架橋リガンドによって不活化することができる。不活化機構には、化学的修飾を誘出する、標的分子からの電子若しくは水素の抽出又は標的分子へのラジカル付加がある。これらの種々な機構は照射形式を変えることによって達成することができる。
紫外(UV)光線と共に標的分子の診断法として用いられる、光SELEXによって選択されるリガンドも、照射光源をX線又はガンマー線に変えるならば、インビボにおいて同標的を不活化することもできる。生ずるビニルラジカルがヒドロキシラジカルと同様に、すなわち、標的分子の結合ドメインから水素原子を抽出することによって作用することができる。
放射能標識したIU−若しくはBrU−置換RNAヘアピン配列に結合したR17コートタンパク質のX線照射は、架橋の形成を生じることができる。BrU−又はIU−発色団をX線照射によって高いエネルギー状態に励起させて、その結果としてビニルラジカルを形成させることもできる(Mee (1987),Radiation Chemistry:principles and Applications (FarhatazizとRodgers 編集),VCH Publishers,ニューヨーク,477〜499頁)。このラジカルはR17コートタンパク質の結合ドメインから水素を抽出し、それによって、そのRNAリガンド結合能力を減ずるか又は抑制することができる。置換したRNAの存在下及び不存在下でのR17コートタンパク質のX線照射によって、不活化を試験する。架橋複合体の形成をPAGEによって分析する。タンパク質ドメインの修飾によって結合の改良を生じる、RNAのX線照射の効果をニトロセルロース結合検定によって追跡する。
本発明の他の実施態様では、標的分子を改質することができるリガンドを発展させるために光SELEXを適用する。これらの状況下で、光SELEX又はSELEXによって選択されるリガンド上又は中への光反応性基の組み入れは、標的分子の生物学的活性が改良されるような、幾つかの方法で標的分子を改質することができる。例えば、標的分子を光架橋リガンドによって不活化することができる。不活化機構には、化学的修飾を誘出する、標的分子からの電子若しくは水素の抽出又は標的分子へのラジカル付加がある。これらの種々な機構は照射形式を変えることによって達成することができる。
紫外(UV)光線と共に標的分子の診断法として用いられる、光SELEXによって選択されるリガンドも、照射光源をX線又はガンマー線に変えるならば、インビボにおいて同標的を不活化することもできる。生ずるビニルラジカルがヒドロキシラジカルと同様に、すなわち、標的分子の結合ドメインから水素原子を抽出することによって作用することができる。
放射能標識したIU−若しくはBrU−置換RNAヘアピン配列に結合したR17コートタンパク質のX線照射は、架橋の形成を生じることができる。BrU−又はIU−発色団をX線照射によって高いエネルギー状態に励起させて、その結果としてビニルラジカルを形成させることもできる(Mee (1987),Radiation Chemistry:principles and Applications (FarhatazizとRodgers 編集),VCH Publishers,ニューヨーク,477〜499頁)。このラジカルはR17コートタンパク質の結合ドメインから水素を抽出し、それによって、そのRNAリガンド結合能力を減ずるか又は抑制することができる。置換したRNAの存在下及び不存在下でのR17コートタンパク質のX線照射によって、不活化を試験する。架橋複合体の形成をPAGEによって分析する。タンパク質ドメインの修飾によって結合の改良を生じる、RNAのX線照射の効果をニトロセルロース結合検定によって追跡する。
実施例17. 特定の疾患経過に関連する固有タンパク質を同定するための光SELEXの診断的使用.
診断方法の目的は、固有タンパク質の発現を特定の疾患経過と相互に関係づけることである。これらの相互関係の幾つかは、例えば細菌又はウイルス感染後に、明らかになるので、抗原特異性である抗原、又は非感染対象の血液中に検出されない、このような抗原に対する抗体を検出することができる。あまり明らかではない相互関係には、最も一般的な形の睾丸性癌の存在と直接相関するα−フェトタンパク質の血清中の発現がある。
生物学的タンパク質とヒトの重要な疾患との間のまだ知られていない相互関係の解明に、光SELEX方法を適用することができる。本発明の1実施態様では、疾患を有する患者から血清を採取し、血清中の全てのタンパク質に対するRNAリガンドを製造し、正常血清に吸着させる。血清タンパク質に対するRNAリガンドをSELEX方法によって同定し、その後に光反応性基を組み入れる、又は1個以上の光反応性基を含むオリゴヌクレオチドの候補混合物から最初に選択して、光SELEXによって同定することができる。未結合で残されたRNAリガンドは疾患を有する患者からの血清中の固有タンパク質のみに特異的に結合するRNAリガンドである。例えば、限られた数の血清タンパク質(例えば、11種)に対するRNAリガンドを最初に同定する。同定されたRNAリガンドは標的タンパク質と可逆的に若しくは非可逆的に架橋することができる、可逆的若しくは光反応性官能基を有する修飾NTPを含む。あらゆるタンパク質に対する架橋リガンドの存在を任意に立証することができる。次に、RNAリガンドを取り出し、増幅する。次いで、RNAを第2SELEXラウンドで転写する。次に、RNAを最初の11種のタンパク質の中の非常に過剰な10種に結合させ、固有タンパク質(11番目)に特異的なRNAリガンドを残す。次に、このRNAを増幅する。これはサブトラクティブな(subtractive)方法である。
本発明の診断方法の1実施態様では、上記方法を用いて、異常なタンパク質(例えば、α−フェトタンパク質)に対するリガンドを同定する。重要な疾患を有する患者からの血清を得て、存在する全てのタンパク質に対するRNAリガンドを同定する。これらのRNAリガンドを正常な血清に吸着させ、未結合リガンドを残す。未結合リガンドは有力な診断剤であり、かつ疾患と特異的に関連する血清タンパク質を同定するためのツールである。
診断方法の目的は、固有タンパク質の発現を特定の疾患経過と相互に関係づけることである。これらの相互関係の幾つかは、例えば細菌又はウイルス感染後に、明らかになるので、抗原特異性である抗原、又は非感染対象の血液中に検出されない、このような抗原に対する抗体を検出することができる。あまり明らかではない相互関係には、最も一般的な形の睾丸性癌の存在と直接相関するα−フェトタンパク質の血清中の発現がある。
生物学的タンパク質とヒトの重要な疾患との間のまだ知られていない相互関係の解明に、光SELEX方法を適用することができる。本発明の1実施態様では、疾患を有する患者から血清を採取し、血清中の全てのタンパク質に対するRNAリガンドを製造し、正常血清に吸着させる。血清タンパク質に対するRNAリガンドをSELEX方法によって同定し、その後に光反応性基を組み入れる、又は1個以上の光反応性基を含むオリゴヌクレオチドの候補混合物から最初に選択して、光SELEXによって同定することができる。未結合で残されたRNAリガンドは疾患を有する患者からの血清中の固有タンパク質のみに特異的に結合するRNAリガンドである。例えば、限られた数の血清タンパク質(例えば、11種)に対するRNAリガンドを最初に同定する。同定されたRNAリガンドは標的タンパク質と可逆的に若しくは非可逆的に架橋することができる、可逆的若しくは光反応性官能基を有する修飾NTPを含む。あらゆるタンパク質に対する架橋リガンドの存在を任意に立証することができる。次に、RNAリガンドを取り出し、増幅する。次いで、RNAを第2SELEXラウンドで転写する。次に、RNAを最初の11種のタンパク質の中の非常に過剰な10種に結合させ、固有タンパク質(11番目)に特異的なRNAリガンドを残す。次に、このRNAを増幅する。これはサブトラクティブな(subtractive)方法である。
本発明の診断方法の1実施態様では、上記方法を用いて、異常なタンパク質(例えば、α−フェトタンパク質)に対するリガンドを同定する。重要な疾患を有する患者からの血清を得て、存在する全てのタンパク質に対するRNAリガンドを同定する。これらのRNAリガンドを正常な血清に吸着させ、未結合リガンドを残す。未結合リガンドは有力な診断剤であり、かつ疾患と特異的に関連する血清タンパク質を同定するためのツールである。
実施例18. 光架橋する核酸リガンドのインビボ利用による疾患の治療方法.
疾患状態と関連する標的分子に対する核酸リガンドを光SELEX方法によって選択する(実施例11)。光SELEX選択核酸リガンドを技術上周知の幾つかの方法で患者に導入する。例えば、非ハロゲン化光SELEXリガンドを、患者に移される幹細胞中にクローン化する。このリガンドは患者の細胞中に一過性に又は本質的に発現する。患者に投与されたICはクローン化配列のオリゴヌクレオチド産物中に組み入れられる。照射時に、リガンドは標的分子に架橋することができる。照射は可視光線、325nm、308nm、X線、紫外線及び赤外線を含むことができる。
或いは、光SELEXリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖DNAとして、患者の細胞に取り入れることができる。光SELEXリガンドを患者に導入する他の方法は患者の細胞中へハロゲン化リガンドをリポソーム投与することを含む。
疾患状態と関連する標的分子に対する核酸リガンドを光SELEX方法によって選択する(実施例11)。光SELEX選択核酸リガンドを技術上周知の幾つかの方法で患者に導入する。例えば、非ハロゲン化光SELEXリガンドを、患者に移される幹細胞中にクローン化する。このリガンドは患者の細胞中に一過性に又は本質的に発現する。患者に投与されたICはクローン化配列のオリゴヌクレオチド産物中に組み入れられる。照射時に、リガンドは標的分子に架橋することができる。照射は可視光線、325nm、308nm、X線、紫外線及び赤外線を含むことができる。
或いは、光SELEXリガンドを、ヨウ素化シトシンの存在下で細胞中に転写される二本鎖DNAとして、患者の細胞に取り入れることができる。光SELEXリガンドを患者に導入する他の方法は患者の細胞中へハロゲン化リガンドをリポソーム投与することを含む。
実施例19. インビトロ診断法、インビボイメージング及び治療デバイスに用いるための光SELEXリガンド.
疾患状態及び/又は異常な細胞(例えば、腫瘍細胞)と特異的に関係する分子を同定するために、光SELEXを用いることができる。このようなマーカー分子と共有結合的に反応する光SELEX同定オリゴヌクレオチドを製造することができる。
本発明の1実施態様では、光SELEXの標的は異常な血清又は腫瘍細胞(例えば、標的混合物)である。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドのライブラリー候補混合物を形成する。上記光SELEXプロトコールの1つを用いて、異常な血清中又は腫瘍細胞上の固有タンパク質に光架橋することができるオリゴヌクレオチドを同定する。腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、インビトロ診断剤として又は促進剤に結合する場合にはインビトロイメージングのために有用である。さらに、腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、例えば、免疫活性化方法として、不活化方法として、又は特異的な標的活性の薬剤化合物の投与方法として治療的に使用可能である。
疾患状態及び/又は異常な細胞(例えば、腫瘍細胞)と特異的に関係する分子を同定するために、光SELEXを用いることができる。このようなマーカー分子と共有結合的に反応する光SELEX同定オリゴヌクレオチドを製造することができる。
本発明の1実施態様では、光SELEXの標的は異常な血清又は腫瘍細胞(例えば、標的混合物)である。光反応性基を含むオリゴヌクレオチドのライブラリー候補混合物を形成する。上記光SELEXプロトコールの1つを用いて、異常な血清中又は腫瘍細胞上の固有タンパク質に光架橋することができるオリゴヌクレオチドを同定する。腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、インビトロ診断剤として又は促進剤に結合する場合にはインビトロイメージングのために有用である。さらに、腫瘍細胞上のマーカータンパク質に架橋することができるオリゴヌクレオチドは、例えば、免疫活性化方法として、不活化方法として、又は特異的な標的活性の薬剤化合物の投与方法として治療的に使用可能である。
実施例20. 光SELEXとHIV−1 Rev.
鋳型デオキシオリゴヌクレオチド合成の各位置において、ヌクレオチド試薬比は62.5:12.5:12.5:12.5であった。各位置において多量に加えるヌクレオチドは、同じ位置における6a配列(配列番号:5)中に見られるヌクレオチドに一致する。
クローン化と配列決定操作: 各ラウンドから単離したRNAを逆転写して、cDNAを製造し、PCR増幅して、末端に固有のBamHI及びHindIII制限部位を有する111bpフラグメントを得た。フェノール/CHCl3処理したフラグメント及びpUCl8ベクターを、一緒に、37℃においてBamHIとHindIIIとによって一晩消化させ、フェノール/CHCl3処理し、沈殿させた。ベクターとPCR生成物の消化物を室温において4時間、T4DNAリガーゼによって連結させ、 コンピテントなDH5α−F’細胞に形質転換させ、この細胞を次にアンピシリン含有LBプレート上で成長させた。個別コロニーをLB−アンピシリン培地中で一晩成長させ、Wizard(Promega)プラスミド調製キットを用いて、プラスミドを製造した。配列決定はSequenase (USB)キットを用いて実施した。
ニトロセルロースフィルター結合選択のための条件:全てのラウンドは約20nM RNAを用いた。ラウンド1と2:6nM Rev. ラウンド3:3nM Rev. ラウンド8:1nM Rev. ラウンド9〜10:3nM Rev. 結合反応量は5mlから1mlまでの範囲であった。
架橋選択のための条件: 約50〜100nM折り畳み(folded)プールRNAを、氷上で、1xBB(50mM TrisAc pH7.7、200mM KOAc、10mM DTT)中の0.2μM Rev(ラウンド4〜6)又は0.5μM Rev(ラウンド7)、1μM BSAに加えて、37℃において5分間インキュベートした。次に、サンプルをXeClエクサイマーレーザーによって308nmにおいて3分間(ラウンド4)、HeCdレーザーによって325nmにおいて30分間(ラウンド5)、325nmにおいて10分間(ラウンド6)又は325nmにおいて1分間(ラウンド7)、37℃において照射した。サンプルの約1/2を50%ホルムアミド、tRNA(40μg )中で90℃において4分間加熱し、8%ポリアクリルアミド/8M尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
次の操作を用いて、アクリルアミドゲルから架橋RNAを約80%の回収率で溶離した:核タンパク質含有ゲルスライスを1xPKバッファー(100mM Tris−Cl pH7.7、50mM NaCl及び10mM EDTA)中で粉砕して、均質なスラリーにした。プロテイナーゼKを1mg/mlの濃度まで加え、42℃において30分間インキュベートした。尿素濃度を約0.7M、1.9M及び3.3Mと高めながらの42℃における15分間のインキュベーションを実施した。得られた溶液をDMCS処理グラスウールと0.2μm 酢酸セルロースフィルターとに通した。濾過した溶液をフェノール/CHCl3によって2回洗浄し、EtOH:イソプロパノールの1:1容量混合物によって沈殿させた。
各ラウンドからの架橋帯をシンチレーション液体中に入れて、Beckman LS−133液体シンチレーション系において計測した。架橋%=〔(325nmにおける4分間照射後のRNA+Revからの架橋生成物cpm)−(照射したRNAのみの架橋領域cpm)〕/総cpm。架橋における折り畳み増加(fold increase)はR13架橋%/D37架橋%である。
競合体tRNAを用いた、アフィニティ及び架橋に関する同時選択を次のように実施した。10μM 酵母tRNAを1xBB(50mM TrisAc(pH=7.5)、200mM KOAc、10mM DTT)中の0.5μM Rev、1μM BSAに加えて、氷上で10分間インキュベートした。200,000cpm (約50〜100nM最終濃度RNA)を加えて、氷上でさらに15〜60分間インキュベートした後に、37℃において5分間インキュベートした。次に、サンプルを37℃においてHeCdレーザーによって325nmで4分間照射した。サンプルの約1/3を50%ホルムアミド、tRNA(40μg )中で90℃において4分間加熱し、8%ポリアクリルアミド/8M 尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
LI架橋用RNAリガンドは4分間の325nmレーザー照射によってさらに架橋生成物を形成する。
切頭RNAを生成するために用いる鋳型オリゴは次の通りである:
PTS-1; 5′-TAATACGACTCACTATA-3′,(配列番号:60)DNA-2;
5′-GAGTGGAAACACACGTGGTGTTTCATACACCCTATAGTGAGTCGTATTA- 3′(配列番号:61),及びDNA-24; 5′-AGGGTTAACAGGTGTGCCTGTTAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′(配列番号:62).
PTS−1をDNA−2又はDNA−24と共にアニールして、T7転写のための鋳型を製造する。
6a(配列番号:5)に比べた個々の分子の変化数を計算するために、各分子を6aに最大の類似性になるように配向させた。ギャップを1変化として数えて、切頭分子は無変化として計数した。各クラス中に分子を見いだす平均確率を算出するために;特異的変化(s)と非特異的変化(ns)と無変化(u)との平均数を計算して、次式に用いた:
(P)=(.125)s(.375)ns(.625)u.クラスIa(P)=9x10−15;Ib(P)=3x10−15;Ic(P)=7x10−13;Id(P)=3x10−15;クラスII(P)=2x10−14。出発群は1014分子から成るので、(P)<10−14を有する配列は表されない。(s)は大文字の共通ヌクレオチドを生じるために必要な変化であり;(ns)は付加的な変化である。
ヒト核抽出物の存在下でHIV−1 Revと光独立性に架橋するTrunc 24(配列番号:59)を次のように測定した:Trunc 24 RNAと、核抽出物と、Revタンパク質とを一緒にし、氷上で10分間インキュベートした。サンプルに8M尿素含有バッファーを1:1で混合し、分析のために7M尿素、8%ポリアクリルアミドゲル上に置いた、XLは核タンパク質複合体を意味し、RNAは遊離のtrunc 24 RNAを意味する。
鋳型デオキシオリゴヌクレオチド合成の各位置において、ヌクレオチド試薬比は62.5:12.5:12.5:12.5であった。各位置において多量に加えるヌクレオチドは、同じ位置における6a配列(配列番号:5)中に見られるヌクレオチドに一致する。
クローン化と配列決定操作: 各ラウンドから単離したRNAを逆転写して、cDNAを製造し、PCR増幅して、末端に固有のBamHI及びHindIII制限部位を有する111bpフラグメントを得た。フェノール/CHCl3処理したフラグメント及びpUCl8ベクターを、一緒に、37℃においてBamHIとHindIIIとによって一晩消化させ、フェノール/CHCl3処理し、沈殿させた。ベクターとPCR生成物の消化物を室温において4時間、T4DNAリガーゼによって連結させ、 コンピテントなDH5α−F’細胞に形質転換させ、この細胞を次にアンピシリン含有LBプレート上で成長させた。個別コロニーをLB−アンピシリン培地中で一晩成長させ、Wizard(Promega)プラスミド調製キットを用いて、プラスミドを製造した。配列決定はSequenase (USB)キットを用いて実施した。
ニトロセルロースフィルター結合選択のための条件:全てのラウンドは約20nM RNAを用いた。ラウンド1と2:6nM Rev. ラウンド3:3nM Rev. ラウンド8:1nM Rev. ラウンド9〜10:3nM Rev. 結合反応量は5mlから1mlまでの範囲であった。
架橋選択のための条件: 約50〜100nM折り畳み(folded)プールRNAを、氷上で、1xBB(50mM TrisAc pH7.7、200mM KOAc、10mM DTT)中の0.2μM Rev(ラウンド4〜6)又は0.5μM Rev(ラウンド7)、1μM BSAに加えて、37℃において5分間インキュベートした。次に、サンプルをXeClエクサイマーレーザーによって308nmにおいて3分間(ラウンド4)、HeCdレーザーによって325nmにおいて30分間(ラウンド5)、325nmにおいて10分間(ラウンド6)又は325nmにおいて1分間(ラウンド7)、37℃において照射した。サンプルの約1/2を50%ホルムアミド、tRNA(40μg )中で90℃において4分間加熱し、8%ポリアクリルアミド/8M尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
次の操作を用いて、アクリルアミドゲルから架橋RNAを約80%の回収率で溶離した:核タンパク質含有ゲルスライスを1xPKバッファー(100mM Tris−Cl pH7.7、50mM NaCl及び10mM EDTA)中で粉砕して、均質なスラリーにした。プロテイナーゼKを1mg/mlの濃度まで加え、42℃において30分間インキュベートした。尿素濃度を約0.7M、1.9M及び3.3Mと高めながらの42℃における15分間のインキュベーションを実施した。得られた溶液をDMCS処理グラスウールと0.2μm 酢酸セルロースフィルターとに通した。濾過した溶液をフェノール/CHCl3によって2回洗浄し、EtOH:イソプロパノールの1:1容量混合物によって沈殿させた。
各ラウンドからの架橋帯をシンチレーション液体中に入れて、Beckman LS−133液体シンチレーション系において計測した。架橋%=〔(325nmにおける4分間照射後のRNA+Revからの架橋生成物cpm)−(照射したRNAのみの架橋領域cpm)〕/総cpm。架橋における折り畳み増加(fold increase)はR13架橋%/D37架橋%である。
競合体tRNAを用いた、アフィニティ及び架橋に関する同時選択を次のように実施した。10μM 酵母tRNAを1xBB(50mM TrisAc(pH=7.5)、200mM KOAc、10mM DTT)中の0.5μM Rev、1μM BSAに加えて、氷上で10分間インキュベートした。200,000cpm (約50〜100nM最終濃度RNA)を加えて、氷上でさらに15〜60分間インキュベートした後に、37℃において5分間インキュベートした。次に、サンプルを37℃においてHeCdレーザーによって325nmで4分間照射した。サンプルの約1/3を50%ホルムアミド、tRNA(40μg )中で90℃において4分間加熱し、8%ポリアクリルアミド/8M 尿素ゲル中での電気泳動によって分離した。
LI架橋用RNAリガンドは4分間の325nmレーザー照射によってさらに架橋生成物を形成する。
切頭RNAを生成するために用いる鋳型オリゴは次の通りである:
PTS-1; 5′-TAATACGACTCACTATA-3′,(配列番号:60)DNA-2;
5′-GAGTGGAAACACACGTGGTGTTTCATACACCCTATAGTGAGTCGTATTA- 3′(配列番号:61),及びDNA-24; 5′-AGGGTTAACAGGTGTGCCTGTTAATCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3′(配列番号:62).
PTS−1をDNA−2又はDNA−24と共にアニールして、T7転写のための鋳型を製造する。
6a(配列番号:5)に比べた個々の分子の変化数を計算するために、各分子を6aに最大の類似性になるように配向させた。ギャップを1変化として数えて、切頭分子は無変化として計数した。各クラス中に分子を見いだす平均確率を算出するために;特異的変化(s)と非特異的変化(ns)と無変化(u)との平均数を計算して、次式に用いた:
(P)=(.125)s(.375)ns(.625)u.クラスIa(P)=9x10−15;Ib(P)=3x10−15;Ic(P)=7x10−13;Id(P)=3x10−15;クラスII(P)=2x10−14。出発群は1014分子から成るので、(P)<10−14を有する配列は表されない。(s)は大文字の共通ヌクレオチドを生じるために必要な変化であり;(ns)は付加的な変化である。
ヒト核抽出物の存在下でHIV−1 Revと光独立性に架橋するTrunc 24(配列番号:59)を次のように測定した:Trunc 24 RNAと、核抽出物と、Revタンパク質とを一緒にし、氷上で10分間インキュベートした。サンプルに8M尿素含有バッファーを1:1で混合し、分析のために7M尿素、8%ポリアクリルアミドゲル上に置いた、XLは核タンパク質複合体を意味し、RNAは遊離のtrunc 24 RNAを意味する。
実施例21. プライマー伸長抑制溶液SELEX.
プライマー伸長抑制は、緊密に結合した標的分子が高アフィニティオリゴヌクレオチドのcDNA合成を阻害しうることに基づき、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅可能なcDNAプールと、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅不能なcDNAプールとの形成を生じる。したがって、溶液SELEXのPCR工程は両cDNAプールの間の分割スクリーンとして作用する。核酸合成、プライマー伸長抑制及びPCRに関する一般的なプロトコールを本明細書では提供する。さらに、特定の核酸リガンドを分離するためのN−アクリロイルアミノフェニル水銀ゲル電気泳動条件を述べる。核酸リガンドをクローン化し、配列決定する方法はTuerk とGold(1990)(上記文献)が述べている通りである。
RNA合成. RNAポリメラーゼとDNA鋳型とをインキュベートすることによって、RNA候補混合物を生成した。反応条件は8%ポリエチレングリコール8000、5mMジチオトレイトール、40mM Tris−HCl(pH8.0)、12mMMgCl2、1mMスペルミジン、0.002% Triton X−100、2mMヌクレオチドトリホスフェート及び1単位/μl RNAポリメラーゼである。反応は37℃において2時間インキュベートする。
転写プロトコールを用いて、修飾ヌクレオチドを有するRNAを生成する。この転写反応はヌクレオチドトリホスフェート誘導体によってプライムされることができ(修飾5’末端を形成するため)、修飾ヌクレオチドを新生RNA鎖に、又はRNA生成物の5’末端若しくは3’末端に連結したオリゴヌクレオチド若しくはそれらの誘導体にランダムに組み入れることができる。
プライマー伸長抑制. プライマー伸長抑制をHartz 等(1988)(上記文献)が開示するように実施する。簡単には、候補混合物のオリゴヌクレオチドを蒸留水中で65℃において3分間、2倍モル過剰のプライマーと共にインキュベートすることによって、オリゴヌクレオチドプライマーを候補混合物のオリゴヌクレオチドの3’末端にアニールする。このアニーリング反応を氷上で冷却し、その後に1/10量の10x濃縮伸長用バッファー(例えば、10mM Tris−HCl(pH7.4)、60mM NH4Cl、10mM 酢酸Mg、6mM β−メルカプトエタノール、及び0.4mMヌクレオチドトリホスフェート)を添加する。ポリメラーゼの添加と、0〜80℃の範囲内の種々な温度のいずれかにおける数秒間から数時間までの範囲内の時間のインキュベーションとによって、プライマー伸長が開始される。本発明の方法の1実施態様では、低アフィニティ核酸が連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを優先的に組み入れるように、これらの連鎖ターミネーターの存在下でプライマー伸長を最初に実施する。次に、高アフィニティ核酸から標的を除去し、連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを除去した後に、第2プライマー伸長を実施する。
ポリメラーゼ連鎖反応. 一本鎖又は二本鎖のいずれかのオリゴヌクレオチド鋳型をバッファー(50mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.6)、2.5mM MgCl2、1.7mg/ml BSA、1mMデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び1μM プライマー)中で1単位/μl 熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベートすることによって、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が達成される。標準熱サイクルは95℃ 30秒間、55℃ 30秒間、及び72℃1分間であり、これを必要に応じて繰り返す。PCRプロトコールの1改良方法は、一本鎖又は二本鎖の鋳型を単一種の細長いプライマーのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって一本鎖DNAを生成し、細長い生成物を生じる。PCRは上記プライマー伸長工程によって増幅可能にされるオリゴヌクレオチドを優先的に増幅する。
(N−アクリロイルアミノ)フェニル水銀ゲル電気泳動. N−アクリロイルアミンフェニル水銀(APM)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動をIgloi(1988),Biochemistry 27:3842が開示するように実施した。酢酸(p−アミノフェニル)水銀(0.35g)にアセトニトリル(8ml)を0℃において混合し、次に1.2M NaHCO3(2ml)を加えることによって、APMを合成した。次に、塩化アクリロイル(全体で0.2ml)を激しく撹拌しながら加え、反応を4℃において一晩インキュベートした。固相を遠心分離によって回収し、水で洗浄し、ジオキサン(8.5ml)中で50℃に加温することによって溶解した後に、濾過して、不溶な汚染物を除去した。室温での放置中にARM結晶が形成され、この固体を再び水で洗浄し、真空下で乾燥させた。ARMを4℃において保存した。所定量のアクリルアミド、ビス(アクリルアミド)、尿素を0.1M Trisボレート/EDTA(pH8.3)中に含む溶液に、ホルムアミド中APMの1mg/ml溶液の適当なアリコートを加えることによって、APMポリアクリルアミドゲルを調製した。ゲル溶液10mlにつき1%過硫酸アンモニウム(0.5ml)とTEMED(7μl )とを加えることによって、重合を開始させた。
プライマー伸長抑制は、緊密に結合した標的分子が高アフィニティオリゴヌクレオチドのcDNA合成を阻害しうることに基づき、高アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅可能なcDNAプールと、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応する増幅不能なcDNAプールとの形成を生じる。したがって、溶液SELEXのPCR工程は両cDNAプールの間の分割スクリーンとして作用する。核酸合成、プライマー伸長抑制及びPCRに関する一般的なプロトコールを本明細書では提供する。さらに、特定の核酸リガンドを分離するためのN−アクリロイルアミノフェニル水銀ゲル電気泳動条件を述べる。核酸リガンドをクローン化し、配列決定する方法はTuerk とGold(1990)(上記文献)が述べている通りである。
RNA合成. RNAポリメラーゼとDNA鋳型とをインキュベートすることによって、RNA候補混合物を生成した。反応条件は8%ポリエチレングリコール8000、5mMジチオトレイトール、40mM Tris−HCl(pH8.0)、12mMMgCl2、1mMスペルミジン、0.002% Triton X−100、2mMヌクレオチドトリホスフェート及び1単位/μl RNAポリメラーゼである。反応は37℃において2時間インキュベートする。
転写プロトコールを用いて、修飾ヌクレオチドを有するRNAを生成する。この転写反応はヌクレオチドトリホスフェート誘導体によってプライムされることができ(修飾5’末端を形成するため)、修飾ヌクレオチドを新生RNA鎖に、又はRNA生成物の5’末端若しくは3’末端に連結したオリゴヌクレオチド若しくはそれらの誘導体にランダムに組み入れることができる。
プライマー伸長抑制. プライマー伸長抑制をHartz 等(1988)(上記文献)が開示するように実施する。簡単には、候補混合物のオリゴヌクレオチドを蒸留水中で65℃において3分間、2倍モル過剰のプライマーと共にインキュベートすることによって、オリゴヌクレオチドプライマーを候補混合物のオリゴヌクレオチドの3’末端にアニールする。このアニーリング反応を氷上で冷却し、その後に1/10量の10x濃縮伸長用バッファー(例えば、10mM Tris−HCl(pH7.4)、60mM NH4Cl、10mM 酢酸Mg、6mM β−メルカプトエタノール、及び0.4mMヌクレオチドトリホスフェート)を添加する。ポリメラーゼの添加と、0〜80℃の範囲内の種々な温度のいずれかにおける数秒間から数時間までの範囲内の時間のインキュベーションとによって、プライマー伸長が開始される。本発明の方法の1実施態様では、低アフィニティ核酸が連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを優先的に組み入れるように、これらの連鎖ターミネーターの存在下でプライマー伸長を最初に実施する。次に、高アフィニティ核酸から標的を除去し、連鎖停止ヌクレオチドトリホスフェートを除去した後に、第2プライマー伸長を実施する。
ポリメラーゼ連鎖反応. 一本鎖又は二本鎖のいずれかのオリゴヌクレオチド鋳型をバッファー(50mM KCl、10mM Tris−HCl(pH8.6)、2.5mM MgCl2、1.7mg/ml BSA、1mMデオキシヌクレオチドトリホスフェート及び1μM プライマー)中で1単位/μl 熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベートすることによって、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が達成される。標準熱サイクルは95℃ 30秒間、55℃ 30秒間、及び72℃1分間であり、これを必要に応じて繰り返す。PCRプロトコールの1改良方法は、一本鎖又は二本鎖の鋳型を単一種の細長いプライマーのオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって一本鎖DNAを生成し、細長い生成物を生じる。PCRは上記プライマー伸長工程によって増幅可能にされるオリゴヌクレオチドを優先的に増幅する。
(N−アクリロイルアミノ)フェニル水銀ゲル電気泳動. N−アクリロイルアミンフェニル水銀(APM)を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動をIgloi(1988),Biochemistry 27:3842が開示するように実施した。酢酸(p−アミノフェニル)水銀(0.35g)にアセトニトリル(8ml)を0℃において混合し、次に1.2M NaHCO3(2ml)を加えることによって、APMを合成した。次に、塩化アクリロイル(全体で0.2ml)を激しく撹拌しながら加え、反応を4℃において一晩インキュベートした。固相を遠心分離によって回収し、水で洗浄し、ジオキサン(8.5ml)中で50℃に加温することによって溶解した後に、濾過して、不溶な汚染物を除去した。室温での放置中にARM結晶が形成され、この固体を再び水で洗浄し、真空下で乾燥させた。ARMを4℃において保存した。所定量のアクリルアミド、ビス(アクリルアミド)、尿素を0.1M Trisボレート/EDTA(pH8.3)中に含む溶液に、ホルムアミド中APMの1mg/ml溶液の適当なアリコートを加えることによって、APMポリアクリルアミドゲルを調製した。ゲル溶液10mlにつき1%過硫酸アンモニウム(0.5ml)とTEMED(7μl )とを加えることによって、重合を開始させた。
実施例22. 酵素的又は化学的分解溶液SELEX.
酵素又は化学薬品を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するcDNAのプールを選択的に分解することができる。本発明の1実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するcDNAのプールを選択的に分解する。一本鎖DNAを開裂する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的な配列において、異なる効率で開裂する。
制限酵素の消化は多様な、配列特異性の制限エンドヌクレアーゼによって実施することができる。一本鎖DNAを開裂するエンドヌクレアーゼには、DdeI、HaeIII、HgaI、HinfI、HinPI、MnII、PstI及びRsaIがある。これらの酵素は分子生物学の分野に熟練した人に周知の標準条件下で用いられる。核酸制限配列と部位特異性制限ヌクレオチドとの適当な組合せを用いて、二本鎖核酸を開裂することもできる。
基本的な溶液SELEX操作は、SELEX特許出願に述べられているように、実施される。4個のdNTTの存在下で最初のcDNA伸長を実施し、次に標的を除去する。制限エンドヌクレアーゼによる酵素開裂に耐性である修飾ヌクレオチドによって第2cDNA伸長を実施する。cDNA伸長生成物の混合物を適当な制限酵素と共にインキュベートする。遊離核酸からの第1cDNA伸長生成物を開裂して、プライマーアニーリング部位を除去し、このcDNAプールをPCRによって増幅不能にする。制限エンドヌクレアーゼによる開裂の効率は、制限部位(RS)にヘアピンを用いて、図24に示すように局在二本鎖領域を形成することによって改良することができる。
或いは、第1cDNA伸長生成物を修飾ヌクレオチドの組み入れによって他のクラスの酵素によっても選択的に分解可能にする。例えば、低アフィニティリガンドに対応するcDNAをウラシルDNAグリコシラーゼに感受性のヌクレオチドによって合成することができ、高アフィニティリガンドに対応するcDNAは耐性ヌクレオチドを組み入れることができる。
低アフィニティリガンドに対応するcDNAの化学分解は、ピペリジンを用いた、上述のような7−メチルグアノシン、5−ブロモウラシル若しくは5−ヨードウラシルの組み入れ、又は光分解によって達成することができる(Sasse −DwightとGralla(1991),Methods Enzymol. 208:146;Aigen とGumport (1991),Methods Enzymol. 208:433;Hockensmith 等(1991),Methods Enzymol. 208:211)。
酵素又は化学薬品を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するcDNAのプールを選択的に分解することができる。本発明の1実施態様では、制限酵素を用いて、低アフィニティオリゴヌクレオチドに対応するcDNAのプールを選択的に分解する。一本鎖DNAを開裂する、幾つかの制限酵素が同定されている。これらの酵素は特異的な配列において、異なる効率で開裂する。
制限酵素の消化は多様な、配列特異性の制限エンドヌクレアーゼによって実施することができる。一本鎖DNAを開裂するエンドヌクレアーゼには、DdeI、HaeIII、HgaI、HinfI、HinPI、MnII、PstI及びRsaIがある。これらの酵素は分子生物学の分野に熟練した人に周知の標準条件下で用いられる。核酸制限配列と部位特異性制限ヌクレオチドとの適当な組合せを用いて、二本鎖核酸を開裂することもできる。
基本的な溶液SELEX操作は、SELEX特許出願に述べられているように、実施される。4個のdNTTの存在下で最初のcDNA伸長を実施し、次に標的を除去する。制限エンドヌクレアーゼによる酵素開裂に耐性である修飾ヌクレオチドによって第2cDNA伸長を実施する。cDNA伸長生成物の混合物を適当な制限酵素と共にインキュベートする。遊離核酸からの第1cDNA伸長生成物を開裂して、プライマーアニーリング部位を除去し、このcDNAプールをPCRによって増幅不能にする。制限エンドヌクレアーゼによる開裂の効率は、制限部位(RS)にヘアピンを用いて、図24に示すように局在二本鎖領域を形成することによって改良することができる。
或いは、第1cDNA伸長生成物を修飾ヌクレオチドの組み入れによって他のクラスの酵素によっても選択的に分解可能にする。例えば、低アフィニティリガンドに対応するcDNAをウラシルDNAグリコシラーゼに感受性のヌクレオチドによって合成することができ、高アフィニティリガンドに対応するcDNAは耐性ヌクレオチドを組み入れることができる。
低アフィニティリガンドに対応するcDNAの化学分解は、ピペリジンを用いた、上述のような7−メチルグアノシン、5−ブロモウラシル若しくは5−ヨードウラシルの組み入れ、又は光分解によって達成することができる(Sasse −DwightとGralla(1991),Methods Enzymol. 208:146;Aigen とGumport (1991),Methods Enzymol. 208:433;Hockensmith 等(1991),Methods Enzymol. 208:211)。
実施例23. アフィニティクロマトグラフィーを伴う溶液SELEX.
第1cDNA伸長生成物又は第2cDNA伸長生成物のいずれかの選択的除去はアフィニティクロマトグラフィーによって達成することができる。第1cDNA伸長生成物の除去は遊離核酸又は低アフィニティ核酸に対応するcDNAプールを除去する。第2cDNA伸長生成物の除去は高アフィニティリガンドに対応するcDNAを保留する。この手法はcDNA合成中の修飾ヌクレオチドの組み入れに基づく。
第1伸長生成物の選択的除去. 基本的溶液SELEXプロトコール後に、アフィニティマトリックス上への第1cDNAプールの保持を可能にする修飾塩基(例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド)の存在下で、第1cDNA伸長を実施する(図25)。次に、標的を除去し、第2cDNA伸長を非修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。修飾ヌクレオチドを組み入れたcDNAを対応アフィニティリガンドを含むカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって取り出すことができる。標的に対して高いアフィニティを有する核酸に対応するcDNAプールは残留し、PCRによって増幅される。
第2伸長生成物の選択的除去. 基本的溶液SELEXプロトコール後に、第1cDNA伸長を4個のdNTTの存在下で実施し、上述のようにアフィニティマトリックス上への第2cDNAプールの保持を可能にする修飾塩基(例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド)の存在下で、第2cDNA伸長を実施する。
アフィニティマトリックスへのアニーリングのための非反復配列の組み入れ.
本発明の方法の代替え実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特別な配列を選択的に組み入れることもできる。したがって、上述のように、商業的に入手可能なマトリックス上で、第1又は第2合成cDNAを遅延させ、精製することができる。
第1cDNA伸長生成物又は第2cDNA伸長生成物のいずれかの選択的除去はアフィニティクロマトグラフィーによって達成することができる。第1cDNA伸長生成物の除去は遊離核酸又は低アフィニティ核酸に対応するcDNAプールを除去する。第2cDNA伸長生成物の除去は高アフィニティリガンドに対応するcDNAを保留する。この手法はcDNA合成中の修飾ヌクレオチドの組み入れに基づく。
第1伸長生成物の選択的除去. 基本的溶液SELEXプロトコール後に、アフィニティマトリックス上への第1cDNAプールの保持を可能にする修飾塩基(例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド)の存在下で、第1cDNA伸長を実施する(図25)。次に、標的を除去し、第2cDNA伸長を非修飾ヌクレオチドの存在下で実施する。修飾ヌクレオチドを組み入れたcDNAを対応アフィニティリガンドを含むカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって取り出すことができる。標的に対して高いアフィニティを有する核酸に対応するcDNAプールは残留し、PCRによって増幅される。
第2伸長生成物の選択的除去. 基本的溶液SELEXプロトコール後に、第1cDNA伸長を4個のdNTTの存在下で実施し、上述のようにアフィニティマトリックス上への第2cDNAプールの保持を可能にする修飾塩基(例えば、ビオチニル化、ヨウ素化、チオ標識又は他の任意の修飾ヌクレオチド)の存在下で、第2cDNA伸長を実施する。
アフィニティマトリックスへのアニーリングのための非反復配列の組み入れ.
本発明の方法の代替え実施態様では、アフィニティマトリックスへのアニーリングのために特別な配列を選択的に組み入れることもできる。したがって、上述のように、商業的に入手可能なマトリックス上で、第1又は第2合成cDNAを遅延させ、精製することができる。
実施例24. エキソヌクレアーゼ阻害溶液SELEX
エキソヌクレアーゼ阻害を用いて、二本鎖リガンドを単離することができる。標的分子に緊密に結合した二本鎖核酸リガンドは結合部位の3’末端においてエキソヌクレアーゼ加水分解を阻害する。これは、長い一本鎖5’オーバーハング(overhang)と中央塩基対領域とも含む、加水分解に耐性な核酸分子群を生じる(図26参照)。この核酸分子は任意のポリメラーゼに対する基質であり、ポリメラーゼと共のインキュベーションは二本鎖出発物質を生成する。この分子をPCRによって増幅する。標的分子に緊密に結合しない、核酸候補混合物の要素は初期エキソヌクレアーゼ工程中に消化される。
二本鎖核酸の3’→5’加水分解は任意の二本鎖特異性3’→5’エキソヌクレアーゼと共のインキュベーションによって達成される。エキソヌクレアーゼIII は二本鎖DNA3’→5’を特異的に加水分解して、50mM Tris−HCl(pH8.0),5mM MgCl2、10mM β−メルカプトエタノールを含む、種々なバッファー中で37℃において活性である。
エキソヌクレアーゼ阻害を用いて、二本鎖リガンドを単離することができる。標的分子に緊密に結合した二本鎖核酸リガンドは結合部位の3’末端においてエキソヌクレアーゼ加水分解を阻害する。これは、長い一本鎖5’オーバーハング(overhang)と中央塩基対領域とも含む、加水分解に耐性な核酸分子群を生じる(図26参照)。この核酸分子は任意のポリメラーゼに対する基質であり、ポリメラーゼと共のインキュベーションは二本鎖出発物質を生成する。この分子をPCRによって増幅する。標的分子に緊密に結合しない、核酸候補混合物の要素は初期エキソヌクレアーゼ工程中に消化される。
二本鎖核酸の3’→5’加水分解は任意の二本鎖特異性3’→5’エキソヌクレアーゼと共のインキュベーションによって達成される。エキソヌクレアーゼIII は二本鎖DNA3’→5’を特異的に加水分解して、50mM Tris−HCl(pH8.0),5mM MgCl2、10mM β−メルカプトエタノールを含む、種々なバッファー中で37℃において活性である。
実施例25. 触媒核酸を単離するための溶液SELEX方法
溶液SELEXを用いて、触媒核酸配列を単離することができる。本発明のこの実施態様は線状から環状への転換(transformation)を利用して、触媒核酸から非触媒核酸を分類する。
図27に示すように、PCR工程を利用して、核酸候補混合物を触媒要素に関して選別することができる。自己環化するか、又はそれらの5’末端若しくは3’末端をリガーゼによる環化を可能にするように変える触媒核酸をPCRによって増幅する。この図は候補混合物の触媒要素による環形成を説明する;候補混合物の非触媒要素は線状に留まる。環化後に、5’末端にアニールするプライマーと共に、候補混合物をインキュベートする。本発明のこの実施態様では、環状オリゴヌクレオチド要素のみがcDNAを生成し、PCR工程中に増幅される。
この手法は、自己環化を直接触媒するか又は、リガーゼと共にインキュベーションによって増幅可能な形状が生ずるように、それら自身の末端を変える核酸を単離する。図27に示すように、cDNAプライマーと候補混合物のオリゴヌクレオチドの5’末端との特別な相互作用が環状分子のみの増幅を可能にする。本発明の方法の他の実施態様では、この手法を変更して、新規な反応を触媒する触媒核酸の単離を可能にする。
溶液SELEXを用いて、触媒核酸配列を単離することができる。本発明のこの実施態様は線状から環状への転換(transformation)を利用して、触媒核酸から非触媒核酸を分類する。
図27に示すように、PCR工程を利用して、核酸候補混合物を触媒要素に関して選別することができる。自己環化するか、又はそれらの5’末端若しくは3’末端をリガーゼによる環化を可能にするように変える触媒核酸をPCRによって増幅する。この図は候補混合物の触媒要素による環形成を説明する;候補混合物の非触媒要素は線状に留まる。環化後に、5’末端にアニールするプライマーと共に、候補混合物をインキュベートする。本発明のこの実施態様では、環状オリゴヌクレオチド要素のみがcDNAを生成し、PCR工程中に増幅される。
この手法は、自己環化を直接触媒するか又は、リガーゼと共にインキュベーションによって増幅可能な形状が生ずるように、それら自身の末端を変える核酸を単離する。図27に示すように、cDNAプライマーと候補混合物のオリゴヌクレオチドの5’末端との特別な相互作用が環状分子のみの増幅を可能にする。本発明の方法の他の実施態様では、この手法を変更して、新規な反応を触媒する触媒核酸の単離を可能にする。
実施態様26. 溶液SELEXの自動化
この自動化溶液SELEXプロトコールは自動化DNA合成装置に用いられる方法の変更である。ビオチン/アビジン相互作用又は多様な共有結合クロマトグラフィー方法のいずれかによって、核酸候補混合物を固体サポートに結合させる(例えば、マレイミド又は無水シトラコン酸サポートへの修飾ヌクレオチドの縮合)。結合した核酸候補混合物は目標の結合のために良好な基質を提供し、カラムはSELEX操作のための単一反応器の使用を可能にする。プライマー伸長抑制を利用して、低アフィニティリガンドと高アフィニティリガンドとを物理的に選別する。低アフィニティ核酸は、実施例22に述べたようにcDNAを分解可能にする、第1cDNA伸長工程中の修飾塩基の組み入れによって分解されることができ、高アフィニティリガンドは分解不能なcDNAにコピーされ、PCRによって増幅される。溶液SELEXの付加的ラウンドでは、任意に同じ又は異なる反応器において、PCR形成候補混合物を精製するか、又はRNAに転写し、第2固体サポートに再結合させる。このプロセスを必要に応じて繰り返す。
この自動化溶液SELEXプロトコールは自動化DNA合成装置に用いられる方法の変更である。ビオチン/アビジン相互作用又は多様な共有結合クロマトグラフィー方法のいずれかによって、核酸候補混合物を固体サポートに結合させる(例えば、マレイミド又は無水シトラコン酸サポートへの修飾ヌクレオチドの縮合)。結合した核酸候補混合物は目標の結合のために良好な基質を提供し、カラムはSELEX操作のための単一反応器の使用を可能にする。プライマー伸長抑制を利用して、低アフィニティリガンドと高アフィニティリガンドとを物理的に選別する。低アフィニティ核酸は、実施例22に述べたようにcDNAを分解可能にする、第1cDNA伸長工程中の修飾塩基の組み入れによって分解されることができ、高アフィニティリガンドは分解不能なcDNAにコピーされ、PCRによって増幅される。溶液SELEXの付加的ラウンドでは、任意に同じ又は異なる反応器において、PCR形成候補混合物を精製するか、又はRNAに転写し、第2固体サポートに再結合させる。このプロセスを必要に応じて繰り返す。
配列表
(1)一般的情報
(i)出願人:Gold, Larry
Wills, Michael
Koch, Tad
Ringquist, Steven
Jensen, Kirt
Atkinson, Brent
(ii)発明の名称: 指数関数的富化によるリガントの系統的進化:核酸リガントの光選択と溶液SELEX
(iii)配列数: 64
(iv)通信住所:
(A) 住所:Swanson &Bratschun, L. L. C.
(B) 通り:8400E. Prentice Place, Suite 200
(C) 町:イングルウッド
(D) 州:コロラド
(E) 国:米国
(F) 郵便番号:80111
(v)コンピューター読み取り可能形式
(A)媒体型:ディスケット,5.25インチ,360Kb,ストレージ
(B)コンピューター: IBM
(C)操作システム: MS−DOS
(D)ソフトウエア: ワードパーフェクト 5.1
(vi)本出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先行出願データ:
(A)出願番号:08/123,935
(B)出願日: 1993年9月17日
(vii)先行出願データ:
(A)出願番号:08/143,564
(B)出願日: 1993年10月25日
(viii)弁理士/代理人情報
(A)名前: Barry J. Swanson
(B)登録番号:33,215
(C)参考文献/ドケット番号:NEX10/PCT
(ix)遠距離通信情報:
(A)電話:(303)793−3333
(B)FAX:(303)793−3433
(2)配列番号:1に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置13におけるUは5−ブロモウラシルである
(xi)配列:配列番号:1:
(2)配列番号:2に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置13におけるUは5−ヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:2:
(2)配列番号:3に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置13におけるUは結合水素分子である
(xi)配列:配列番号:3:
(2)配列番号:4に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:全てのUは5−ヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:4:
(2)配列番号:5に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:5:
(2)配列番号:6に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:6:
(2)配列番号:7に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:7:
(2)配列番号:8に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:8:
(2)配列番号:9に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:9:
(2)配列番号:10に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:10:
(2)配列番号:11に関する情報:
(i) 配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:11:
(2)配列番号:12に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:12:
(2)配列番号:13に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:13:
(2)配列番号:14に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:14:
(2)配列番号:15に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:15:
(2)配列番号:16に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:16:
(2)配列番号:17に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:17:
(2)配列番号:18に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:18:
(2)配列番号:19に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:19:
(2)配列番号:20に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:20:
(2)配列番号:21に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:21:
(2)配列番号:22に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:22:
(2)配列番号:23に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:23:
(2)配列番号:24に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:24:
(2)配列番号:25に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:25:
(2)配列番号:26に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:26:
(2)配列番号:27に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:27:
(2)配列番号:28に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:28:
(2)配列番号:29に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:29:
(2)配列番号:30に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:30:
(2)配列番号:31に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:31:
(2)配列番号:32に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:32:
(2)配列番号:33に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:33:
(2)配列番号:34に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:34:
(2)配列番号:35に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:35:
(2)配列番号:36に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:36:
(2)配列番号:37に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:37:
(2)配列番号:38に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:38:
(2)配列番号:39に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:30塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:39:
(2)配列番号:40に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:33塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:40:
(2)配列番号:41に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:41:
(2)配列番号:42に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:42:
(2)配列番号:43に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:43:
(2)配列番号:44に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:44:
(2)配列番号:45に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:45:
(2)配列番号:46に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:46:
(2)配列番号:47に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:47:
(2)配列番号:48に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:48:
(2)配列番号:49に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:49:
(2)配列番号:50に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:50:
(2)配列番号:51に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:51:
(2)配列番号:52に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:52:
(2)配列番号:53に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:53:
(2)配列番号:54に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:54:
(2)配列番号:55に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:55:
(2)配列番号:56に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置1と20におけるNは1−2相補的塩基対を示す
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置3におけるNは1または3ヌクレオチドを示す
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置10と12におけるNは1−4相補的塩基対を示す
(ix)特徴:(D)その他の情報:位置11におけるNは4又は5ヌクレオチドを示す
(ix)特徴:
(D)その他の情報:Uはヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:56:
(2)配列番号:57に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:Uはヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:57:
(2)配列番号:58に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:Uはヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:58:
(2)配列番号:59に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:29塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:59:
(2)配列番号:60に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:17塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:60:
(2)配列番号:61に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:49塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:61:
(2)配列番号:62に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:46塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:62:
(2)配列番号:63に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:63:
(2)配列番号:64に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:64:
(1)一般的情報
(i)出願人:Gold, Larry
Wills, Michael
Koch, Tad
Ringquist, Steven
Jensen, Kirt
Atkinson, Brent
(ii)発明の名称: 指数関数的富化によるリガントの系統的進化:核酸リガントの光選択と溶液SELEX
(iii)配列数: 64
(iv)通信住所:
(A) 住所:Swanson &Bratschun, L. L. C.
(B) 通り:8400E. Prentice Place, Suite 200
(C) 町:イングルウッド
(D) 州:コロラド
(E) 国:米国
(F) 郵便番号:80111
(v)コンピューター読み取り可能形式
(A)媒体型:ディスケット,5.25インチ,360Kb,ストレージ
(B)コンピューター: IBM
(C)操作システム: MS−DOS
(D)ソフトウエア: ワードパーフェクト 5.1
(vi)本出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先行出願データ:
(A)出願番号:08/123,935
(B)出願日: 1993年9月17日
(vii)先行出願データ:
(A)出願番号:08/143,564
(B)出願日: 1993年10月25日
(viii)弁理士/代理人情報
(A)名前: Barry J. Swanson
(B)登録番号:33,215
(C)参考文献/ドケット番号:NEX10/PCT
(ix)遠距離通信情報:
(A)電話:(303)793−3333
(B)FAX:(303)793−3433
(2)配列番号:1に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置13におけるUは5−ブロモウラシルである
(xi)配列:配列番号:1:
(2)配列番号:2に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置13におけるUは5−ヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:2:
(2)配列番号:3に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:19塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置13におけるUは結合水素分子である
(xi)配列:配列番号:3:
(2)配列番号:4に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:全てのUは5−ヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:4:
(2)配列番号:5に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:5:
(2)配列番号:6に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:6:
(2)配列番号:7に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:7:
(2)配列番号:8に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:8:
(2)配列番号:9に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:9:
(2)配列番号:10に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:10:
(2)配列番号:11に関する情報:
(i) 配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:11:
(2)配列番号:12に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:12:
(2)配列番号:13に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:13:
(2)配列番号:14に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:14:
(2)配列番号:15に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:15:
(2)配列番号:16に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:16:
(2)配列番号:17に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:17:
(2)配列番号:18に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:18:
(2)配列番号:19に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:19:
(2)配列番号:20に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:38塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:20:
(2)配列番号:21に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:21:
(2)配列番号:22に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:22:
(2)配列番号:23に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:23:
(2)配列番号:24に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:24:
(2)配列番号:25に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:25:
(2)配列番号:26に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:26:
(2)配列番号:27に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:27:
(2)配列番号:28に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:28:
(2)配列番号:29に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:29:
(2)配列番号:30に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:35塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:30:
(2)配列番号:31に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:31:
(2)配列番号:32に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:32:
(2)配列番号:33に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:33:
(2)配列番号:34に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:34:
(2)配列番号:35に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:35:
(2)配列番号:36に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:36:
(2)配列番号:37に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:37:
(2)配列番号:38に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:38:
(2)配列番号:39に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:30塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:39:
(2)配列番号:40に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:33塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:40:
(2)配列番号:41に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:41:
(2)配列番号:42に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:42:
(2)配列番号:43に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:43:
(2)配列番号:44に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:44:
(2)配列番号:45に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:45:
(2)配列番号:46に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:46:
(2)配列番号:47に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:47:
(2)配列番号:48に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:36塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:48:
(2)配列番号:49に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:49:
(2)配列番号:50に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:34塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:50:
(2)配列番号:51に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:51:
(2)配列番号:52に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:52:
(2)配列番号:53に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:53:
(2)配列番号:54に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:54:
(2)配列番号:55に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:37塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:55:
(2)配列番号:56に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:20塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置1と20におけるNは1−2相補的塩基対を示す
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置3におけるNは1または3ヌクレオチドを示す
(ix)特徴:
(D)その他の情報:位置10と12におけるNは1−4相補的塩基対を示す
(ix)特徴:(D)その他の情報:位置11におけるNは4又は5ヌクレオチドを示す
(ix)特徴:
(D)その他の情報:Uはヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:56:
(2)配列番号:57に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:23塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:Uはヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:57:
(2)配列番号:58に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:32塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(ix)特徴:
(D)その他の情報:Uはヨードウラシルである
(xi)配列:配列番号:58:
(2)配列番号:59に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:29塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:59:
(2)配列番号:60に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:17塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:60:
(2)配列番号:61に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:49塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:61:
(2)配列番号:62に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:46塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:62:
(2)配列番号:63に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:13塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:63:
(2)配列番号:64に関する情報:
(i)配列特徴:
(A)長さ:44塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:線状
(xi)配列:配列番号:64:
配列番号:1
<222> (13)..(13)
<223> 5−ブロモウラシル
配列番号:2
<222> (13)..(13)
<223> 5−ヨードウラシル
配列番号:3
<222> (13)..(13)
<223> 結合水素分子を有する
配列番号:4
<222> (6)..(6)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (12)..(13)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (19)..(19)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (23)..(24)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (30)..(30)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (40)..(40)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (42)..(42)
<223> 5−ヨードウラシル
配列番号:56
<222> (20)..(20)
<223> 位置1におけるnと1−2相補的な塩基
<222> (3)..(3)
<223> 1又は3ヌクレオチド
<222> (12)..(12)
<223> 位置10におけるnと1−4相補的な塩基
<222> (11)..(11)
<223> 4又は5ヌクレオチド
<222> (13)..(13)
<223> ヨードウラシル
<222> (15)..(16)
<223> ヨードウラシル
配列番号:57
<222> (7)..(7)
<223> ヨードウラシル
<222> (11)..(12)
<223> ヨードウラシル
<222> (15)..(15)
<223> ヨードウラシル
<222> (20)..(21)
<223> ヨードウラシル
配列番号:58
<222> (4)..(4)
<223> ヨードウラシル
<222> (8)..(8)
<223> ヨードウラシル
<222> (20)..(20)
<223> ヨードウラシル
<222> (22)..(22)
<223> ヨードウラシル
<222> (24)..(26)
<223> ヨードウラシル
<222> (31)..(31)
<223> ヨードウラシル
<222> (13)..(13)
<223> 5−ブロモウラシル
配列番号:2
<222> (13)..(13)
<223> 5−ヨードウラシル
配列番号:3
<222> (13)..(13)
<223> 結合水素分子を有する
配列番号:4
<222> (6)..(6)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (12)..(13)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (19)..(19)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (23)..(24)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (30)..(30)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (40)..(40)
<223> 5−ヨードウラシル
<222> (42)..(42)
<223> 5−ヨードウラシル
配列番号:56
<222> (20)..(20)
<223> 位置1におけるnと1−2相補的な塩基
<222> (3)..(3)
<223> 1又は3ヌクレオチド
<222> (12)..(12)
<223> 位置10におけるnと1−4相補的な塩基
<222> (11)..(11)
<223> 4又は5ヌクレオチド
<222> (13)..(13)
<223> ヨードウラシル
<222> (15)..(16)
<223> ヨードウラシル
配列番号:57
<222> (7)..(7)
<223> ヨードウラシル
<222> (11)..(12)
<223> ヨードウラシル
<222> (15)..(15)
<223> ヨードウラシル
<222> (20)..(21)
<223> ヨードウラシル
配列番号:58
<222> (4)..(4)
<223> ヨードウラシル
<222> (8)..(8)
<223> ヨードウラシル
<222> (20)..(20)
<223> ヨードウラシル
<222> (22)..(22)
<223> ヨードウラシル
<222> (24)..(26)
<223> ヨードウラシル
<222> (31)..(31)
<223> ヨードウラシル
Claims (19)
- 疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも1つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の診断に使用するための上記核酸リガンド。
- 前記リガンドがインビトロ試験として使用するための請求項1記載のリガンド。
- 前記リガンドがインビトロイメージングに使用するための促進剤に結合している請求項1又は2記載のリガンド。
- 疾病、病態又は毒性状態に関連した標的タンパク質に対する核酸リガンドであって、少なくとも1つの光反応性基を含み、リガンドを前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することにより疾病、病態又は毒性状態の治療に使用するための上記核酸リガンド。
- 前記光架橋がインビボで起こる請求項4記載のリガンド。
- 前記リガンドは標的タンパク質を阻害するために使用される請求項4又は5記載のリガンド。
- 前記リガンドは特異的な標的−活性薬学化合物を送達する際に使用するためのものである請求項4〜6のいずれか一項記載のリガンド。
- 少なくとも1つの光反応性基を含む核酸リガンドの使用であって、該リガンドの標的タンパク質へのインビボでの共有結合的光架橋を含む使用のための製品の製造における上記使用。
- 前記標的タンパク質が疾病、病態又は毒性状態と関連し、前記使用が疾病、病態又は毒性状態の診断のためのものである請求項8記載の使用。
- 前記標的タンパク質が疾病、病態又は毒性状態と関連し、前記使用が疾病、病態又は毒性状態の治療のためのものである請求項8記載の使用。
- 前記製品が治療剤、プローブ、標的タンパク質機能の阻害剤又は封鎖剤を含む請求項8〜10のいずれか一項記載の使用。
- 前記標的タンパク質が核酸結合タンパク質ではない請求項1〜11のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
- 前記標的タンパク質が核酸結合タンパク質ではなく、前記リガンドが少なくとも1つの光反応性基を含み、照射なしでも標的タンパク質に結合することができ、前記リガンドが照射により前記標的タンパク質に共有結合的に光架橋することができる、標的タンパク質への核酸リガンド。
- 前記光反応性基が、5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−ブロモビニルウラシル、5−ヨードビニルウラシル、5−アジドウラシル、4−チオウラシル、5−ブロモシトシン、5−ヨードシトシン、5−ブロモビニルシトシン、5−ヨードビニルシトシン、5−アジドシトシン、8−アジドアデニン、8−ブロモアデニン、8−ヨードアデニン、8−アジドグアニン、8−ブロモグアニン、8−ヨードグアニン、8−アジドヒポキサンチン、8−ブロモヒポキサンチン、8−ヨードヒポキサンチン、8−アジドキサンチン、8−ブロモキサンチン、8−ヨードキサンチン、5−ブロモデオキシウラシル、8−ブロモ−2’−デオキシアデニン、5−ヨード−2’−デオキシウラシル、5−ヨード−2’−デオキシシトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]シトシン、5−[(4−アジドフェナシル)チオ]ウラシル、7−デアザ−7−ヨードアデニン、7−デアザ−7−ヨードグアニン、7−デアザ−7−ブロモアデニン及び7−デアザ−7−ブロモグアニンから成る群から選択される請求項1〜13のいずれか一項記載のリガンド又は使用。
- 前記リガンドが1本鎖又は2本鎖RNAを含む請求項1〜14のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
- 前記リガンドが1本鎖又は2本鎖DNAを含む請求項1〜14のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
- 前記リガンドが修飾されたヌクレオチドを含む請求項1〜16のいずれか一項に記載のリガンド又は使用。
- 前記修飾はバックボーン修飾、メチル化、シトシン環外アミンの修飾、2−位置における修飾又はハロゲン化基による置換から選択される請求項17に記載のリガンド又は使用。
- 前記修飾は2−NH2、2−F、5−ブロモ−ウラシル、5−ヨード−ウラシル、2−NH2−ヨードウラシル、2−NH2−ヨードシトシン、2−NH2−ヨードアデニン、2−NH2−ブロモウラシル、2−NH2−ブロモシトシン、及び2−NH2−ブロモアデニンから選択される請求項17に記載のリガンド又は使用。
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