ES2710723T3 - Aptámeros que se unen a IL-6 y su uso en el tratamiento o el diagnóstico de afecciones mediadas por IL-6 - Google Patents

Abstract

Un aptámero de la IL-6 que comprende una secuencia seleccionada de entre: (a) una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 101, 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100, 102 a 239, 400 a 446 y 599 a 625; o (b) una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 101, 7, 8 y 400, en las que se ha sustituido, eliminado o insertado de 1 a 5 nucleótidos; en donde el aptámero de la IL-6 se une específicamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM; o (c) una secuencia de nucleótidos que es al menos un 95 % o más, idéntica a una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 101, 7, 8 y 400; en la que el aptámero de la IL-6 se une específicamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM.

Description

DESCRIPCION

Aptameros que se unen a IL-6 y su uso en el tratamiento o el diagnostico de afecciones mediadas por IL-6

Campo

La presente divulgacion se refiere en general al campo de los acidos nucleicos y mas particularmente a aptameros capaces de unirse a la interleucina-6 (IL-6). Dichos aptameros pueden ser utiles como agentes terapeuticos para el tratamiento, y/o mejorla de enfermedades inflamatorias, enfermedades malignas, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, y otras enfermedades o afecciones en los que se ha implicado la IL-6. Dichos aptameros pueden ser utiles para el diagnostico de enfermedades o afecciones relacionadas con la IL-6.

Antecedentes

La siguiente descripcion proporciona un sumario, de informacion, y no es una admision de que cualquiera de la informacion proporcionada o las publicaciones a las que se hace referencia en el presente documento es una tecnica anterior a la presente divulgacion.

La interleucina 6 (IL-6) pertenece a la familia de las citocinas, se caracterizan por una estructura en huso con cuatro helices en una larga cadena. Otros miembros de esta familia incluyen la IL-11, IL-17, IL-27, oncostatina -M (OSM), factor neurotrofico ciliar (CNTF), factor inhibidor de leucemia (LIF) cardiotrofina-1 (CT-1) y citocina tipo cardiotrofina (CLC). La IL-6 es producida por las celulas B, celulas T, monocitos, fibroblastos y otros tipos celulares y tiene propiedades tanto pro- como antiinflamatorias. Tiene papeles multifuncionales en un amplio intervalo de actividades biologicas incluyendo los procesos inflamatorios de celulas normales, los mecanismos de defensa inmunitaria del huesped, y la modulacion del crecimiento celular. Tambien esta implicada en la proliferacion y diferenciacion de distintas celulas de tumores malignos (Guo, Y., et al., Cancer Treatment Reviews, 2012. 38:904-910). En algunas afecciones inflamatorias agudas, su concentracion puede aumentar de pg/ml a pg/ml (Waage, A., et al, Clinical Immu and Immunpath, 1989. 50:394-398).

La IL-6 activa las celulas uniendose al receptor de IL-6 no senalizador, presente en la membrana celular. Este complejo ligando-receptor se unen entonces a la protelna de transduccion de la senal, gp130, y activa la tirosina cinasa janus (JAK), que resulta en la activacion de transductores de senal corriente abajo y activadores de la transcripcion de la ruta de serialization de la transcription de protelna 3 (STAT3) (Heinrich, P.C., et al., Biochem J., 1998. 334:297-314). La IL-6 tambien activa la ruta de la protelna cinasa activada por mitogeno (MAPK) (Heinrich, P.C., et al, Biochem J., 2003. 374: 1-20). El IL-6Rse expresa como una protelna unida a la membrana en solo unos pocos tipos celulares, incluyendo los hepatocitos, neutrofilos, monocitos/macrofagos y algunos linfocitos, mientras que el pg130 se expresa ubicuamente en todos los tipos celulares y actua como una protelna de senalizacion para otros miembros de la familia de la citocina IL-6. La transduccion de senal de la IL-6 mediante el IL-6R unido a la membrana se conoce como la ruta de senalizacion clasica en la bibliografla. Ademas del IL-6R unido a la membrana, esta presente una forma soluble del IL-6R(sIL-6R) en altas concentraciones en la sangre y otros fluidos corporales (Honda 1992, Novick 1989), con una afinidad similar para la IL-6. Al interactuar con la IL-6, el sIL-6R no se comporta como antagonista, sino que en vez de esto aumenta la semivida circulante de la IL-6 y al mismo tiempo activa la ruta de senalizacion en las celulas en las que no se expresa el IL-6R, pero si la gp130. Esta ruta de senalizacion activada por IL-6:sIL-6R se conoce como el mecanismo de trans-senalizacion. La expresion ubicua de gp130 sugiere que la ruta de trans-senalizacion de IL-6 puede activar todos o la mayorla de los tipos celulares del cuerpo. Una forma soluble de la gp130 actua como un antagonista para la ruta de senalizacion de IL-6.

Los estudios precllnicos han demostrado el papel de las citocinas en distintas enfermedades inflamatorias y por lo tanto han llegado a ser dianas terapeuticas principales. Hay varios agentes anti-TNF-a en el mercado que se utilizan ampliamente para reducir la inflamacion. Como no son eficaces en todos los pacientes, existe la necesidad de explorar otras citocinas en cuanto a su papel terapeutico en la inflamacion, tales como la IL-6. Un anticuerpo anti-IL-6R, el tocilizumab, se utiliza actualmente para el tratamiento de la artritis reumatoide.

Los aptameros son oligonucleotidos que se unen a sus dianas con alta afinidad y especificidad. Los aptameros se pueden seleccionar utilizando el metodo SELEX (evolution sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial). Los aptameros modificados con velocidad de disociacion lenta (SOMAmeros) se seleccionan de bibliotecas aleatorias que contienen grupos funcionales ausentes en el ADN natural (Gold et al, 2010, PLoS ONE 5(12): el5004). En algunos casos, estas nuevas modificaciones de bases pueden mediar interacciones hidrofobas entre el aptamero y la diana, dando lugar a una mejora significativa en la afinidad de union.

El documento US 2010/0055695 desvela metodos para la production de aptameros y fotoaptameros que tienen constantes de disociacion mas lentas que se obtienen utilizando metodos anteriores SELEX y photoSELEX.

El documento US 2010/0317120 desvela metodos, dispositivos, reactivos y kits para la detection de una o mas moleculas diana que se pueden prevenir en una muestra de ensayo.

Sumario

La invencion es como se define en las reivindicaciones.

La presente divulgacion proporciona aptameros que se unen a la interleucina-6 (IL-6) y composiciones que comprenden los aptameros que se unen a la IL-6. Los aptameros desvelados son utiles como agentes terapeuticos para la prevencion, tratamiento y/o mejora de enfermedades inflamatorias, enfermedades malignas, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, y/u otras enfermedades o afecciones en las que esta implicada la IL-6. La presente divulgacion tambien proporciona composiciones o formulaciones farmaceuticas que comprenden un aptamero de IL-6, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Dichas composiciones se pueden preparar en cualquier forma de dosificacion adecuada farmaceuticamente aceptable.

Se proporcionan metodos y composiciones o formulaciones farmaceuticas para la prevencion, tratamiento, y/o mejora de una enfermedad o afeccion mediada por IL-6. En algunos casos, un metodo comprende la administracion de un aptamero de IL-6, o composiciones o formulaciones farmaceuticas que comprenden un aptamero de IL-6, a un sujeto, tal como un mamlfero. En algunos metodos, el sujeto es un ser humano.

Se pueden proporcionar metodos y composiciones farmaceuticas para la prevencion, tratamiento, y/o mejora de enfermedades inflamatorias, enfermedades malignas, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, y/u otras enfermedades o afecciones en las que esta implicada la IL-6. Las enfermedades inflamatorias ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen artritis reumatoide, artritis idiopatica juvenil, artritis idiopatica sistemica de aparicion juvenil, osteoartritis, sepsis, asma, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis sistemica, inflamacion intraocular, enfermedad de Graves, endometriosis, esclerosis sistemica, enfermedad de Still de aparicion en el adulto, amiloidosis de amiloide A, polimialgia reumatica, sinovitis simetrica seronegativa remitente con edema con fovea, enfermedad de Behcet, uveitis, enfermedad del injerto contra el huesped, y slndrome periodico asociado a TNFR. Enfermedades malignas que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen canceres y afecciones relacionadas con el cancer. Los canceres ejemplares no limitantes incluyen mieloma multiple, leucemia, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer colorrectal, caquexia, melanoma, cancer de cuello de utero, cancer ovarico, linfoma, gastrointestinal, cancer de pulmon, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, cancer de rinon metastatico, tumores solidos, carcinoma pulmonar de celulas no pequenas, linfoma no Hodgkin, cancer de vejiga, cancer oral, neoplasia mieloproliferativa, enfermedad linfoproliferativa de celulas B, y leucemia de celulas plasmaticas. Afecciones relacionadas con el cancer ejemplares no limitantes incluyen fatiga relacionada con el cancer de pulmon de celulas no pequenas y anorexia relacionada con el cancer. Las infecciones ejemplares no limitantes que pueden tratarse con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotropico T humano (HTLV), malaria cerebral, infecciones del tracto urinario, e infecciones meningococicas. Las enfermedades autoinmunitarias ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, polimiositis, slndrome de vasculitis incluyendo arteritis de celulas gigantes, arteritis de Takayasu, crioglobulinemia, glomerulonefritis semilunar asociada con anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilosmieloperoxidasa, vasculitis reumatoide, enfermedad de Crohn, policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, y anemia hemolltica autoinmunitaria. Enfermedades adicionales que se pueden tratar con los aptameros de la IL-6 descritos en el presente documento incluyen pero no se limitan a, enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante, enfermedad cardlaca coronaria, enfermedad cardiovascular en artritis reumatoide, hipertension arterial pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), dermatitis atopica, psoriasis, ciatica, diabetes tipo II, obesidad, arteritis de celulas gigantes, enfermedad del injerto contra el huesped aguda (GVHD), infarto de miocardico sin elevacion de ST, vasculitis asociada a anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilos (ANCA), neuromielitis optica, glomerulonefritis cronica, y arteritis de Takayasu.

Se proporcionan metodos para el tratamiento de la artritis reumatoide comprende la administracion de un aptamero de IL-6 a un sujeto. Se proporcionan tambien metodos de tratamiento de mieloma multiple que comprenden la administracion de un aptamero de IL-6 a un sujeto.

Algunos aptameros desvelados en el presente documento tienen aplicaciones potenciales que varlan desde el descubrimiento de un biomarcador y el diagnostico (Ostroff, R.M., et al, PLoS One, 2010. 5(12): p. el5003; Mehan, M., et al, PLoS One, 2012. en prensa) a histoqulmica y creacion de imagenes (Gupta, S., et al, Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2011. 19(3): p. 273-8).

En algunos metodos, se puede conseguir un efecto terapeutico (por ejemplo, en el tratamiento, prevencion, y/o mejora de enfermedades inflamatorias, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, y otras enfermedades o afecciones en las que esta implicada la IL-6) administrando al menos un aptamero de la IL-6 de manera que el aptamero se expone, y se puede unir a la IL-6. En algunos casos, dicha union se produce independientemente del metodo de suministro del aptamero al sujeto que se va a tratar. En algunos metodos, el efecto terapeutico se puede conseguir administrando al menos un aptamero de la IL-6 de manera que se exponga, y se una a la IL-6 y previene o reduce la union de la IL-6 a uno o mas receptores celulares.

En algunos casos, la union de un aptamero de la IL-6 a la IL-6 interfiere con la union de la IL-6 a un receptor de IL-6. En algunos casos, un aptamero de la IL-6 reduce la senalizacion junto con la ruta de transduccion de la senal de un receptor de la IL-6. En algunos casos, un aptamero de la IL-6 inhibe la activacion de las JAK cinasas, y/o inhibe la fosforilacion de STAT3 y/o SHP2.

En algunos metodos, un aptamero de la IL-6 se administracion uno o mas agentes activos adicionales. Dicha administracion puede ser secuencial o en combinacion. Los agentes activos adicionales ejemplares no limitantes incluyen, inhibidores del TNF-a, inhibidores de la IL-1, inhibidores de la IL-23, inhibidores del IFN-y, inhibidores de la IL-17, inhibidores de la IL-22, inhibidores de la IL-4/IL-13, inhibidores de la IL-13, inhibidores de la IL-5, e inhibidores de la JAK. Los inhibidores ejemplares no limitantes del TNF-a incluyen infliximab, adalimumab, golimumab, etanercept, certolizumab, AN0128 (Anacor), ART621 (Arena Therapeutics), y un nanocuerpo anti-TNF-a (tal como ATN-103, Pfizer). Los inhibidores de la IL-1 ejemplares no limitantes incluyen anakinra, canakinumab, XOMA052 (Xoma), y rilonacept. Los inhibidores de la IL-23 ejemplares no limitantes incluyen uztekinumab, briakinumab, apilimod. Un inhibidor del IFN-y ejemplar no limitante es el AMG811 (Amgen). Los inhibidores de la IL-17 ejemplares no limitantes incluyen AIN457 (Novartis), ixekizumab, AMG827 (Amgen), y Rg4934 (Roche). Un inhibidor de la IL-22 es el fezakinumab. Los inhibidores de la IL-4/IL-13 ejemplares no limitantes incluyen AMG317 (Amgen), pitrakinra, Nuvance, y AIR645 (Altair). Los inhibidores de la IL-13 ejemplares no limitantes incluyen anrukinzumab, lebrikizumab, CAT-354 (Medimmune), y IMA-026 (Wyeth). Un inhibidor de la IL-5 ejemplar no limitante es mepolizumab. Los inhibidores de la JAK ejemplares no limitantes incluyen tofacitib y ruxolitinib.

En algunos metodos, se proporciona un metodo de diagnostico in vitro o in vivo que comprende poner en contacto un aptamero de la IL-6 con una muestra sospechosa de comprender la IL-6. En algunos metodos, se proporciona un metodo de diagnostico in vivo que comprende la administracion de un aptamero de IL-6 marcado adecuadamente a un individuo sospechoso de tener una enfermedad o trastorno mediado por la IL-6, en el que el aptamero marcado se detecta con el fin de diagnosticar o evaluar el estado de salud del individuo. El marcador utilizado se puede seleccionar de acuerdo con la modalidad de creacion de imagenes que se va a utilizar. En algunos casos, se proporciona un kit o dispositivo de diagnostico que comprende una aptamero de IL-6.

En algunos casos, se proporciona un aptamero que se une especlficamente a la IL-6. En algunos metodos, se proporciona un aptamero que se une especlficamente a una IL-6 que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 10. En algunos casos, un aptamero se une especlficamente a una region de la IL-6 definida por los aminoacidos 16 a 31 de la SEQ ID NO: 10. En algunos casos, un aptamero se une especlficamente a un epltopo de la IL-6 que comprende los aminoacidos 16 a 31 y los aminoacido 117 a 125 de la SEQ ID NO: 10.

Se proporciona un aptamero que compite por la union con IL-6 con un aptamero de SEQ ID NO: 101. En algunos casos, se proporciona un aptamero que compite por la union con IL-6 con un aptamero de SEQ ID NO: 400.

El aptamero puede comprender al menos una pirimidina modificada.

En algunos casos, un aptamero comprende un motivo de cuarteto G. En algunos aptameros, el motivo de cuarteto G comprende una estructura seleccionada de entre

5'-GG-ZZZ-GG-Qa-GG-Qb-GG-3' (III) (SEQ ID NO: 702);

5'-GG-Qa-GG-ZZZ-GG-Qb-GG-3' (IV) (SEQ ID NO: 703); y

5'-GG-Qa-GG-Qb-GG-ZZZ-GG-3' (V) (SEQ ID NO: 704).

En algunos aptameros, cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y una pirimidina modificada. En algunos aptameros, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado, y un nucleotido no modificado. En algunos aptameros, a es 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o 1 a 5. En algunos aptameros, b es 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o 1 a 5. En algunos casos, el aptamero comprende la secuencia:

5 '-GGCAGGZZZGGZQaGZGG-3' (I) (SEQ ID NO: 700).

En algunos aptameros, cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y una pirimidina modificada. En algunos aptameros, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado y un nucleotido no modificado. En algunos aptameros, a es 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o 1 a 5.

En algunos casos se proporciona un aptamero que se une especlficamente a IL-6, en el que el aptamero comprende una secuencia seleccionada de entre:

5'-YXAXGYARQaMGYAAGSCGRY-3' (VI) (SEQ ID NO: 705); y

5'-MGYAAGSCGRYQbYXAXGYAR-3' (VII) (SEQ ID NO: 706).

En algunos aptameros cada Y se selecciona independientemente de entre pirimidinas modificadas. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre pirimidinas modificadas. En algunos aptameros, M se selecciona de entre C y A, y S se selecciona de entre C y G, y cada R se selecciona independientemente de entre G y A. En algunos aptameros, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado, y un nucleotido no modificado. En algunos aptameros, a es 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 0 1 a 5. En algunos aptameros, b es 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o 1 a 5.

En algunos aptameros, por ejemplo, de SEQ ID NO: 700 y 702 o 706, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador CrC20 sustituido o no sustituido, un alquilenglicol, y un polialquilenglicol. En algunos aptameros cada Q se selecciona independientemente de un enlazador CrC²o sustituido o no sustituido, un 1,3 propano diol, un poli (1,3-propanodiol) que tiene 2 a 100 unidades de 1,3-propano diol, un etilenglicol, y un polietilenglicol que tiene 2 a 100 unidades de etilenglicol. En algunos aptameros cada enlazador CrC²o sustituido o no sustituido es un enlazador CrCg, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador CrCg sustituido o no sustituido, un enlazador CrC4 sustituido o no sustituido, o un enlazador C3 sustituido o no sustituido.

En algunos casos, se proporciona un aptamero que se une especlficamente a la IL-6, en el que el aptamero comprende la secuencia:

5'-GGGYXAXGYAGCLbGZGCGYAAGGCGGY-3' (II) (SEQ ID NO: 701).

Z puede seleccionarse de entre U, T, y una pirimidina modificada. En algunos casos, cada Y se selecciona independientemente de entre pirimidinas modificadas. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre pirimidinas modificadas. En algunos casos, cada L se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado, y un nucleotido no modificado. En algunos aptameros, b es 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, o 1 a 5.

En algunos aptameros, por ejemplo, de SEQ ID NO: 701, cada L se selecciona independientemente de entre un enlazador C C ²⁰ sustituido o no sustituido, un alquilenglicol, y un polialquilenglicol. En algunos aptameros cada L se selecciona independientemente de un enlazador CC ²⁰ sustituido o no sustituido, un 1,3 propano diol, un poli (1,3-propanodiol) que tiene 2 a 100 unidades de 1,3-propano diol, un etilenglicol, y un polietilenglicol que tiene 2 a 100 unidades de etilenglicol. En algunos aptameros cada enlazador CrC20 sustituido o no sustituido es un enlazador C2-Ca sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C6 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C5 sustituido o no sustituido, un enlazador C2-C4 sustituido o no sustituido, o un enlazador C3 sustituido o no sustituido.

En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada X puede seleccionarse independientemente de entre una pirimidina modificada aromatica. En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada X puede seleccionarse independientemente de las pirimidinas modificadas aromaticas que se muestran el Figura 20 y Figura 24. En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada X se puede seleccionar independientemente de entre Nap, 2Nap, NE, BF, y BT de la Figura 24.

En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada Y puede seleccionarse independientemente de entre las pirimidinas que se muestran en la Figura 20 y Figura 24. En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada Y puede seleccionarse independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24.

En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada Z puede seleccionarse de entre U, T y las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 20 y Figura 24. En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada Z se puede seleccionar independientemente de entre U, T, y las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24.

En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada pirimidina modificada se puede seleccionar independientemente de entre:

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU),

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU),

5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TdU),

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU),

5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TirdU),

5-(N-3,4-metilenedioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU),

5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU),

5-(N-3-fenilpropilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU),

5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU),

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (T rpdU),

5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrdU),

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-[1-(3-trimetilamonium) propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina chloride,

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU),

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-[1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2'-desoxiuridina),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-1 -naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),

5-(N-1 -naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-1 -naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU),

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(TST-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU),

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU),

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, y

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina.

En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, cada X se puede seleccionar independientemente de entre:

5-(N-1 -naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU),

5-(N-1 -naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-1 -naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-1 -naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),

5-(N-1 -naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-1 -naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU),

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU),

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina,

5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina,

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU),

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, y

5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina.

En algunos casos, se proporciona un aptamero que comprende una secuencia seleccionada de entre: (a) una secuencia de nucleotidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625; o (b) una secuencia de nucleotidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625, en las que se han sustituido, eliminado o insertado de 1 a 20 nucleotidos; en el que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad () de menos de 20 nM; o (c) una secuencia de nucleotidos que es al menos un 80 % o mas, identico a una secuencia de nucleotidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625; en la que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad () de menos de 10 nM. En algunos aptameros, el aptamero tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM.

En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, el aptamero puede comprender al menos 2 a 6 pirimidinas modificadas y/o una 2'-O-Me. En cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, un aptamero puede comprender al menos uno, o al menos 2 a 5 enlaces fosforotioato.

En algunos aptameros, el aptamero se une a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM. En algunos aptameros, el aptamero inhibe al menos una actividad seleccionada de entre la union de una IL-6 a un receptor de iL-6, la fosforilacion de STAT3, y la transcripcion mediada por STAT.

Tambien se proporciona en el presente documento una composition farmaceutica que comprende cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

Tambien se describen en el presente documento metodos de tratamiento de una enfermedad o afeccion mediada por la IL-6. En algunos casos, el metodo comprende la administracion de un aptamero descrito en el presente documento. En algunos casos, un metodo que comprende la administracion de una composition farmaceutica que comprende cualquiera de los aptameros descritos en el presente documento, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

En algunos metodos, la enfermedad o afeccion mediada por la IL-6 se selecciona de entre una enfermedad inflamatoria, una enfermedad maligna, una infection, y una enfermedad autoinmunitaria.

En algunos metodos, la enfermedad o afeccion mediada por la IL-6 se selecciona de entre enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante, enfermedad cardlaca coronaria, enfermedad cardiovascular en artritis reumatoide, hipertension arterial pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), dermatitis atopica, psoriasis, ciatica, diabetes tipo II, obesidad, arteritis de celulas gigantes, enfermedad del injerto contra el huesped aguda (GVHD), infarto de miocardico sin elevation de ST, vasculitis asociada a anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilos (ANCA), neuromielitis optica, glomerulonefritis cronica, y arteritis de Takayasu.

En algunos metodos, la enfermedad o afeccion mediada por la IL-6 es una enfermedad inflamatoria seleccionada de entre artritis reumatoide, artritis idiopatica juvenil, artritis idiopatica sistemica de aparicion juvenil, osteoartritis, sepsis, asma, enfermedad pulmonar interstitial, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis sistemica, inflamacion intraocular, enfermedad de Graves, endometriosis, esclerosis sistemica, enfermedad de Still de aparicion en el adulto, amiloidosis de amiloide A, polimialgia reumatica, sinovitis simetrica seronegativa remitente con edema con fovea, enfermedad de Behcet, uveitis, enfermedad del injerto contra el huesped, y slndrome periodico asociado a TNFR.

En algunos metodos, la enfermedad o afeccion mediada por la IL-6 es una enfermedad maligna seleccionada entre un cancer y una afeccion relacionada con el cancer. En algunos metodos la enfermedad maligna es un cancer seleccionado de entre mieloma multiple, leucemia, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer colorrectal, caquexia, melanoma, cancer de cuello de utero, cancer ovarico, linfoma, gastrointestinal, cancer de pulmon, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, cancer de rinon metastatico, tumores solidos, carcinoma pulmonar de celulas no pequenas, linfoma no Hodgkin, cancer de vejiga, cancer oral, neoplasia mieloproliferativa, enfermedad linfoproliferativa de celulas B, y leucemia de celulas plasmaticas. En algunos metodos la enfermedad maligna es una afeccion relacionada con el cancer seleccionada de entre fatiga relacionada con el cancer de pulmon de celulas no pequenas y anorexia relacionada con el cancer.

En algunos metodos, la enfermedad o afeccion mediada por la IL-6 es una infeccion seleccionada de entre el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotropico T humano (HTLV), malaria cerebral, infecciones del tracto urinario, e infeccion meningococica.

En algunos metodos, la enfermedad o afeccion mediada por la IL-6 es una enfermedad autoinmunitaria seleccionada de entre lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, polimiositis, slndrome de vasculitis incluyendo arteritis de celulas gigantes, arteritis de Takayasu, crioglobulinemia, glomerulonefritis semilunar asociada con anticuerpos anticitoplasmaticos de neutrofilos-mieloperoxidasa, vasculitis reumatoide, enfermedad de Crohn, policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, y anemia hemolltica autoinmunitaria.

La presente divulgation tambien proporciona dos estructuras co-cristalinas de aptameros unidos a la IL-6, resueltos con una resolution de 2,4 A y 2,55 A.

Algunos aptameros se unen especlficamente a la IL-6, donde dicho aptamero se une a la IL-6 con menos de o igual a un contacto polar por 100 A2 de area de interfaz, en el que dicho contacto polar esta comprendido por uno o mas enlaces de hidrogeno y una o mas interacciones carga-carga, y el area de interfaz es una fraction de la superficie proteica ocupada por el aptamero. Como un ejemplo no limitante, el 2573-20_136 (SEQ ID NO: 101) se une a la IL-6 con una relation de contactos polares al area de interfaz de 0,0072. Por lo tanto, la presente divulgacion tambien proporciona aptameros que se unen a la IL-6 con una relacion de contactos polares con el area de interfaz de menos de 0,01, menos de 0,009, menos de 0,008, o a aproximadamente 0,007.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra la inhibition de la proliferation de celulas TF-1 por los aptameros que se unen a la IL-6, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 2 muestra la inhibicion de la expresion de luciferasa dirigida por STAT por los aptameros de IL-6, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 3 muestra ciertas modificaciones dU y modificaciones en la estructura, como se expone en el Ejemplo 5.

La Figura 4 muestra los valores de afinidad relativa de las variantes 2573-20_15 (SEQ ID NO: 22) con sustituciones de la modification dU, como se describe en el Ejemplo 5. Las relaciones de afinidad (kd de la variante/Kd parental) se muestran para cada position de dU.

La Figura 5 muestra los valores de afinidad relativa de las variantes 2573-20_15 (SEQ ID NO: 22) con sustituciones 2'-O-metil o espaciador C3 como se describe en el Ejemplo 5. Las relaciones de afinidad (Kd de la variante/Kd parental) se muestran para cada posicion de dA, dC o dG.

La Figura 6 muestra la actividad de inhibicion de las variantes de 2573-20 (SEQ ID NO: 7), como se describe en el Ejemplo 5 (^2573-20_15 (SEQ ID NO: 22); 02573-20_137 (SEQ ID NO: 573); A2573- 20_136 (SEQ ID NO: 101)).

La Figura 7 muestra la actividad de inhibicion de las variantes 2574-49 (SEQ ID NO: 8), como se describe en el Ejemplo 6 (• 2574-493 (SEQ ID NO: 26); o2574-49260 (SEQ ID NO: 400)).

La Figura 8A y B muestran la estabilidad de ciertos aptameros que contienen dU modificado y aptameros de control dT en el 90 % del suero humano, como se describen en el Ejemplo 7. La Figura 8C muestra la estabilidad de ciertos aptameros con dU modificado y aptameros de control en suero humano, de rata y de mono Cynomolgus, como se describe en el Ejemplo 7.

La Figura 9 muestra un ensayo de competicion entre los aptameros 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) y 2574­ 49260 (SEQ ID NO: 400), como se describe en el Ejemplo 8 (• 2573-20136 (SEQ ID NO: 101); o 2574-49260 (SEQ ID NO: 400)).

La Figura 10 muestra la inhibicion de la union de IL-6 al receptor soluble sIL-6R por el aptamero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101), como se describe en el Ejemplo 9.

La Figura 11 muestra la estructura cristalina de 2,55 A del SOMAmero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) unido a la IL-6 humana (forma 2 cadenas A y B), como se describe en el Ejemplo 13.

La Figura 12 muestra las estructuras superpuestas de la IL-6 proteica humana en un complejo con el SOMAmero o con la estructura IL-6/IL-6Ra/gp130 (Boulanger, M.J., et al, Science. 2003. 300: 2101-2104), como se describe en el Ejemplo 13. Las helices se marcan (A-D) desde el extremo N al C y se colorean de azul (oscuro y claro para el SOMAmero y el complejo receptor; helice A), verde (helice B), amarillo (helice C) y rojo (helice D). El esquema de color se mantiene a lo largo de las Figuras.

La Figura 13 muestra la estructura del SOMAmero que ese puede dividir en dos dominios, como se describe en el Ejemplo 13. El dominio 1 contiene un motivo de cuarteto G y un dominio 2 que contiene una configuracion en tallo-lazo. Los nucleotidos modificados se marcan con colores: Bn-dU (magenta), PE-dU (rojo) y Nap-dU (verde). Las posiciones con sustituciones 2'-O-metil se indican en azul claro. El mismo esquema de colores se mantiene a lo largo de las Figuras.

La Figura 14 muestra el motivo de cuarteto G (dominio 1), como se describe en el Ejemplo 13. (A) Las tetradas G contiene cada una dos bases G en syn (magenta) y anti-conformaciones (blanco). Los enlaces hidrogeno de las bases acercan las bases G a lo larg° de la cara de Watson-Crick, asi como la cara H°°gsteen. Cada tetrada coordina un ion Na . (B) La conformacion cuadruple-G en la estructura del SOMAmero es arriba-arriba-abajoabajo con tres bucles laterales. (C) Bolsillo hidrofobo creado por las bases modificadas Bn-dU7, Bn-dU8, NapdU12 y Bn-dU30. Las interacciones de amontonamiento Pi se producen entre el anillo de uridina de Bn-dU7 y Nap-dU12 con Bn8. Hay una interaccion final con cara entre las bases amontonadas y Bn7 y Bn30. (D) La base PE-dU9 se amonona en G32 y el grupo modificado se expone al disolvente.

La Figura 15 muestra las interacciones protelna- SOMAmero en el dominio 1, como se describen en el Ejemplo 13. (A) El resto R16 de la cola del extremo N de IL-6 se une con enlaces hidrogeno en la cara Hoogsteen de G29. El grupo bencilo de Bn-dU30 se amontona contra la cadena lateral de metileno de R16. (B) La cola del extremo N de la IL-6 forma un sandwich entre la estructura del SOMAmero, protegiendo los nucleotidos hidrofobos modificados del disolvente. (C) el R24 en la helice A o la IL-6 forma un puente salino con la estructura del SOMAmero en G5-G6, sellando adicionalmente el bolsillo hidrofobo del disolvente. (D) El Y31 de la helice A de IL-6 se amontona con Nap 12 que a su vez se amontona con Bn8 y el anillo de uridina de Bn-dU7. Bn7 y Bn30 tienen interacciones de final con cara con los restos amontonados. (E) Nap12 tiene interacciones hidrofobas con la cadena lateral de metileno de M117 en la helice C de la IL-6. El grupo naftilo tambien se amontona contra el anillo de uridina de Bn-dU8. (F) Bn7 y Bn8 tienen interacciones de final con cara con F125 en la helice C y Bn7 interactua con cadenas laterales de metileno de R24 y K27.

La Figura 16 muestra el motivo tallo-lazo (dominio 2), como se describe en el Ejemplo 13. (A) La parte inferior del tallo lazo del dominio 2 contiene dos bases no emparejadas en Bn27 y C28. El anillo de uridina de Bn27 se amontona con G26, sin embargo, el grupo bencilo de C28 sobresale. (B) Emparejamiento de bases del tallo lazo. Hay cuatro pares de bases de Watson-Crick en el tallo lazo del SOMAmero entre Bn-dU14:A25, Bn-dU15:A24, Bn-dU23:A16, y Bn-dU22:C17. (C) la region de bucle del SOMAmero contiene cuatro bases no emparejadas, de C18 a G21. A19 y C20 son bases protuberantes. (D) El agrupamiento hidrofobo de grupos bencilo de Bn15, Bn22 y Bn23. (E) El anillo de uridina de Bn14 se amontona con la amida de Bn15 mientras que el grupo bencilo apunta en oposicion al agrupamiento hidrofobo de Bn15, Bn22 y Bn23.

La Figura 17 muestra que los contactos protelna-SOMAmero del dominio 2 son primariamente hidrofobos, como os describe en el Ejemplo 13. (A) Bn15, Bn22 y Bn23 tiene interacciones hidrofobas con las cadenas laterales metileno de los restos de la helice A y la helice D en la protelna IL-6. (B) Bn14 tiene interacciones del final con cara con Y31, as! como interacciones entre los finales con las cadenas laterales no polares de K27 y R30. (C) Puentes salinos entre K27 y R30 en la IL-6 y la estructura del SOMAmero en A13 y Bn-dU14.

La Figura 18 muestra el solapamiento del SOMAmero y los sitios de union al receptor en la IL-6, como se describe en el Ejemplo 13. Las visiones globales de las interacciones de la IL-6 con el SOMAmero (A) y los receptores de IL-6 IL-6Ra y gp130 (B).

La Figura 19 muestra en detalle los sitios de union del receptor y el SOMAmero, como se describe en el Ejemplo 13. (A) El resto F279 del IL-6Ra y Bn22 en el SOMAmero reconocen el mismo sitio de union en las helices A y D de la IL-6 (el verde claro denota el IL-6Ra, los otros colores son como en las otras figuras). (B) El SOMAmero y la gp130 reconocen el mismo sitio de union en la IL-6 proteica. F169 o gp130 y Bn7, Bn8 y Nap12 del SOMAmero interaction con Y31 y el metileno de las cadenas laterales de L19 y R24 en la helice A de IL-6. (rosa = gp130). (C) La estructura del SOMAmero entre G6 y Bn7 en la estructura IL-6- SOMAmero ocupa el mismo espacio que el W142 en la estructura IL-6/I L-6Ra/gp130.

La Figura 20 muestra ciertas pirimidinas modificadas ejemplares que se pueden incorporar en los aptameros tal como los aptameros de disociacion lenta.

La Figura 21 muestra una secuencia ejemplar del precursor de IL-6 humana (SEQ ID NO: 9). La secuencia de senal (aminoacidos 1 a 28) esta subrayada. Una IL-6 madura humana ejemplar comprende los aminoacidos 29 a 212 de la SEQ ID NO: 9, y se muestra en la SEQ ID NO: 10.

La Figura 22 muestra un resumen de la sustitucion sistematica de nucleotidos modificados en el fragmento del cuarteto G (2573-20_324 (SEQ ID NO: 319)), como se describe en el Ejemplo 13. Los valores mostrados son la relacion de los valores Kd (Kdvariante/Kdparental). El valor de Kd para el fragmento parental 2573-20_324 (SEQ ID NO: 319)) es 2-7 x 10^-7 M.

La Figura 23 muestra un alineamiento de secuencias de SOMAmero unicas con motivos de cuarteto G del final del agrupamiento SELEX, como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 24 muestra ciertas modificaciones 5-dU ejemplares, como se exponen en el Ejemplo 15. Cada modificacion de la estructura se une a dU como se muestra, por ejemplo, en la Figura 3.

La Figura 25 muestra un alineamiento de las secuencias del SOMAmero unico con motivos de secuencia similar al SOMAmero 2574-49 (SEQ ID NO: 8) como se describe en el Ejemplo 14.

La Figura 26 muestra el efecto del PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con un PEG de 40 kDa conjugado con el extremo 5') sobre la inflamacion articular en monos Cynomolgus con artritis inducida por colageno.

Descripcion detallada

A menos de que se defina de otra manera, los terminos tecnicos y cientlficos utilizado en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por el experto habituado en la tecnica a la que pertenece la divulgacion. Aunque se puede utilizar cualquiera de los metodos, dispositivos, y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o ensayo de la divulgacion, se describen a continuacion los metodos, dispositivos y materiales preferidos.

Todas las publicaciones, documentos de patente, y solicitudes de patente publicados que se citan en la presente divulgacion son indicativas del nivel de experiencia en la tecnica a la que pertenece la divulgacion.

Como se utiliza en la presente divulgacion, incluyendo las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de “un”, “una” y “el” incluyen las referencias en plural, a menos de que el contexto dicte claramente otra cosa, y se utilizan de manera intercambiable como “al menos uno” y “uno o mas”. Por lo tanto, la referencia a “un aptamero” incluye mezclas de aptameros, y similares.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “aproximadamente” representa una modificacion o variacion insignificante del valor numerico de manera que la funcion basica del artlculo al cual se refiere el valor numerico no cambia.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “contiene”, que “contiene” y cualquier variacion de las mismas, tienen la intencion de cubrir una inclusion no excluyente, de manera que un procedimiento, metodo, producto del procedimiento, una composicion de materia que comprende, incluye, o contiene un elemento o lista de elementos no incluye solo los elementos sino que puede incluir otros elementos no enumerados expresamente o inherentes a dicho procedimiento, metodo, producto del procedimiento o composicion de materia.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “nucleotido” se refiere a un ribonucleotido o un desoxirribonucleotido, o una forma modificada del mismo. Los nucleotidos incluyen especies que incluyen purinas (por ejemplo, adenina, hipoxantina, guanina, y sus derivados y analogos) as! como pirimidinas (por ejemplo, citosina, uracilo, timina, y sus derivados y analogos). Cuando una base se indica como "A", "C", "G", "U", o "T", tiene la intencion de englobar tanto ribonucleotidos como desoxirribonucleotidos, y formas modificadas y analogos de los mismos.

Como se utiliza en el presente documento, un “acido nucleico”, “oligonucleotido”, y “polinucleotido” se utilizan de manera intercambiable para referirse a un pollmero de nucleotidos e incluyen el ADN, ARN, hlbridos ADN/ARN y modificaciones de estas clases de acido nucleicos, oligonucleotidos y polinucleotidos, en los que esta incluida la union con distintas entidades o restos de las unidades de nucleotido en cualquier posicion. Los terminos “polinucleotido”, “oligonucleotido”, y “acido nucleico” incluye moleculas de cadena doble o sencilla, as! como moleculas triple helicoidales. El acido nucleico, oligonucleotido, y polinucleotido son terminos mas amplios que el termino aptamero y, por lo tanto, los terminos acido nucleico, oligonucleotido y polinucleotido no se limitan a los aptameros.

Como se utiliza en el presente documento, los terminos “modificar”, “modificado”, “modificacion”, y cualquiera variacion de los mismos, cuando se utiliza en referencia a un oligonucleotido, significa que al menos una de las cuatro bases constituyentes (es decir, A, G, T/U, y C) del oligonucleotido es un analogo o ester de un nucleotido de origen natural. El nucleotido modificado puede conferir resistencia a nucleasas al oligonucleotido. Los nucleotidos modificados pueden dar lugar a interacciones predominantemente hidrofobas de los aptameros con dianas proteicas que dan como resultado una alta eficacia de union y complejos co-cristalinos estables. Una pirimidina con una sustitucion en la posicion del C-5 es un ejemplo de un nucleotido modificado. Las modificaciones pueden incluir modificaciones de la estructura, metilaciones, combinaciones de emparejamiento de bases no habituales tales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares. Las modificaciones pueden incluir tambien las modificaciones 3' y 5', tales como la proteccion. Otras modificaciones pueden incluir la sustitucion de uno o mas de los nucleotidos de origen natural con un analogo, modificaciones entre nucleotidos, tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y las que tienen enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), las que contienen alquilantes, y las que tienen enlaces modificados ( por ejemplo, acidos nucleicos alfa anomericos, etc.9. Adicionalmente, cualquiera de los grupos hidroxilos presentes habitualmente en el azucar de un nucleotido se pueden remplazar con un grupo fosfonato o un grupo fosfato, protegido por grupos de proteccion convencionales; o activados para preparar enlaces adicionales con nucleotidos adicionales o a un soporte solido. Los grupos OH del extremo 5' y 3' pueden estar fosforilados o sustituidos con amias, restos de grupos de proteccion de desde aproximadamente 1 a aproximadamente 20 atomos de carbono, pollmeros de polietilenglicol (PEG), que varlan desde aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa, pollmeros de PEG, que varlan desde aproximadamente 20 a aproximadamente 60 kDa, u otros pollmeros sinteticos o biologicos, hidrofilos o hidrofobos. Las modificaciones pueden ser en la posicion C-5 de las pirimidinas. Estas modificaciones se pueden producir mediante un enlace amida directamente en la posicion C-5 o por otros tipos de enlaces.

Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares ribosa o desoxirribosa que se conocen en general en la tecnica, que incluyen 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucares carboclclicos, azucares a-anomericos, azucares epimericos tal como arabinosa, xilosa, o lixosa, azucares piranosas, azucares furanosas, seudoheptulosas, analogos aclclicos y analogos de nucleosidos abasicos tal como metil ribosido. Como se ha senalado anteriormente, uno o mas enlaces fosfodiester se pueden remplazar por grupos de union alternativos. Estos grupos de union alternativos incluyen en los que se sustituye un fosfato por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o un alquilo sustituido o no sustituido (de 1-20 C) que contienen opcionalmente un enlace eter (-O-), arilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleotidos tienen que ser identicos. La sustitucion de formas analogas de azucares, purinas, y pirimidinas pueden ser ventajosas en el diseno de un producto final, como puede ser, por ejemplo, estructuras del armazon alternativas como un armazon de poliamida.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “nucleasa” se refiere a una enzima capaz de escindir el enlace fosfodiester entre las subunidades de nucleotido de un oligonucleotido. Como se utiliza en el presente documento, el termino “endonucleasa” se refiere a una enzima que escinde los enlaces fosfodiester en el sitio interno del oligonucleotido. Como se utiliza en el presente documento, el termino “exonucleasa” se refiere a una enzima que escinde los enlaces fosfodiester que unen el final de los nucleotidos de un oligonucleotido. Los fluidos biologicos normalmente contienen una mezcla de ambas endonucleasas y exonucleasas.

Como se utiliza en el presente documento, las expresiones “resistente a nucleasas” y “resistencia a nucleasas” se refiere a la capacidad reducida de un oligonucleotido para servir como sustrato para una endo o exonucleasa, de manera que, cuando se pone en contacto con dicha enzima, el oligonucleotido o no se degrada o se degrada mas lentamente que un oligonucleotido compuesto de nucleotidos no modificados.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “pirimidina modificada en C-5” se refiere a una pirimidina con una modificacion en la posicion C-5 que incluye, pero no se limita a, los restos ilustrados en la Figura 20 y la Figura 24. Ejemplos de una pirimidina modificada en C-5 incluye las descritas en la Pat. de EE. UU. N.° 5.719.273 y 5.945.527. Ejemplos de una modificacion en C-5 incluyen la sustitucion de desoxiuridina en la posicion C-5 con un sustituyente seleccionado independientemente de entre: bencilcarboxiamida (de manera alternativa bencilaminocarbonil) (Bn), naftilmetilcarboxiamida (de manera alternativa naftilmetilaminocarbonil) (Nap), triptaminocarboxiamida (de manera alternativa triptaminocarbonil) (Trp), fenetilcarboxiamida (alternativeli fenetilamino carbonil) (Pe), tiofenilmetilcarboxiamida (de manera alternativa tiofenilmetilaminocarbonil) (Th) y isobutilcarboxiamida (de manera alternativa isobutilaminocarbonil) (iBu) como se ilustra inmediatamente a continuacion.

Las modificaciones qulmicas de una pirimidina modificada en C-5 tambien se puede combinar con, independientemente o en combinacion, modificaciones de azucares en la posicion 2', modificaciones en las aminas exoclclicas, y sustituciones de 4-tiouridina y similares.

Las pirimidinas modificadas en C-5 representativas incluyen: 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridine (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-0-metiluridine, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridine, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridine (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-0-metiluridine, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridine (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-0-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio) propil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-0-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina o 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina).

Los nucleotidos se pueden modificar antes o despues de la slntesis de un oligonucleotido. Una secuencia de nucleotidos de un oligonucleotido puede estar interrumpida por uno o mas componentes no nucleotldicos. Un oligonucleotido puede modificarse adicionalmente despues de la polimerizacion, tal como, por ejemplo, por conjugacion con cualquiera componente de marcacion adecuado.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “al menos una pirimidina”, cuando se refiere a modificaciones de un acido nucleico, se refiere a una, varias o todas las pirimidinas del acido nucleico, indicando que cualquiera o todas las existencias o cualquiera o todas de C, T, o U en un acido nucleico se puede modificar o no.

Como se utiliza en el presente documento, “ligando de acido nucleico”, “aptamero” y “clon” se utiliza de manera intercambiable para referirse a un acido nucleico de origen no natural que tiene una accion deseable sobre una molecula diana. Una accion deseable incluye, pero no se limita a, union a la diana, cambios catallticos en la diana, reaccion con la diana de una manera que modifique o altere la diana o la actividad funcional de la diana, union covalente a la diana (como en un inhibidor suicida), y facilitar la reaccion entre la diana y otra molecula. En un aptamero, la accion es la afinidad de union especlfica para una molecula diana, siendo dicha molecula diana una estructura qulmica tridimensional distinta de un polinucleotido que se une al ligando de acido nucleico mediante un mecanismo que es independiente de la formation de triple helice o emparejamiento de bases de Watson/Crick, en el que el aptamero no es un acido nucleico que tenga una funcion fisiologica conocida o que se une a la molecula diana. Los aptameros de una diana determinada incluyen acidos nucleicos que se identifican como una mezcla de acidos nucleicos candidatos, donde el aptamero es un ligando de la diana, por un metodo que comprende: (a) poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, en el que los acidos nucleicos tengan un aumento de afinidad con la diana con respecto a otros acidos nucleicos de la mezcla de candidatos se puede particionar desde el resto de la mezcla de candidatos; (b) hacer la partition de los acidos nucleicos con afinidad aumentada del resto de la mezcla de candidatos; y (c) amplificar los acidos nucleicos con afinidad aumentada para dar lugar a una mezcla enriquecidas de ligandos de acidos nucleicos, por lo que los aptameros de la molecula diana se identifican. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una materia de grados; sin embargo, en este contexto, la “afinidad de union especifica” de un aptamero para esta diana significa que el aptamero se une a su diana en general con un grado mucho mayor de afinidad de lo que se une a otros componentes no diana en una mezcla o muestra. Un “aptamero” o “ligando de acido nucleico” es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula de acido nucleico que tiene una secuencia de nucleotido particular. Un aptamero puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. “Aptameros” se refiere a mas de uno de dicho conjunto de moleculas. Los diferentes aptameros pueden tener el mismo o diferente numero de nucleotidos. Los aptameros pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena sencilla, de doble cadena, o contener regiones de doble cadena y triple cadena.

Como se utiliza en el presente documento, un “SOMAmero” o Aptamero Modificado de Disociacion Lenta se refiere a un aptamero (incluyendo un aptamero que comprende al menos un nucleotido con una modification hidrofoba) con una velocidad de disociacion (t1/2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos, o > 240 minutos. Los SOMAmeros se pueden generar utilizando los metodos SELEX mejorados descritos en la Patente de EE. UU. 7.947.447, titulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".

Como se utiliza en el presente documento, un “cuarteto G” es un motivo de secuencia de nucleotidos que comprende cuatro pares de nucleotidos G con al menos un grupo de nucleotidos o espaciador entre cada para de nucleotidos G. Los motivos de cuarteto G se describen, por ejemplo, en Lane, A.N., et al, NAR, 2008. 36(17): 5482:5515.

Como se utiliza en el presente documento, “proteina” se utiliza de manera sinonima con “peptido”, “polipeptido” o “fragmento peptidico”. Un polipeptido, proteina, peptido o fragmento peptidico “purificado” esta sustancialmente libre de material celular u otras proteinas contaminantes de la celula, tejido, o fuente libre de celulas de la que se obtiene la secuencia de aminoacidos, o sustancialmente libre de precursores quimicos u otros quimicos cuando se sintetiza quimicamente.

Como se utiliza en el presente documento, “enfermedad inflamatoria” se refiere a una enfermedad o afeccion que implica una repuesta inflamatoria. La respuesta inflamatoria puede ser aguda y/o cronica. En algunos metodos, la inflamacion cronica implica un aumento del nivel de la IL-6. Enfermedades ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen la artritis reumatoide, artritis idiopatica juvenil, artritis idiopatica juvenil de aparicion sistemica, osteoartritis, sepsis, asma, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis sistemica, inflamacion intraocular, enfermedad de Graves, endometriosis, esclerosis sistemica, enfermedad de aparicion en el adulto, amiloidosis de amiloide A, polimialgia reumatica, sinovitis simetrica seronegativa remitente con edema con fovea, enfermedad de Behcet, uveitis, enfermedad del injerto contra el huesped, y sindrome periodico asociado a TNFR.

Como se utiliza en el presente documento, “enfermedad maligna” incluye el cancer y afecciones relacionadas con el cancer.

Como se utiliza en el presente documento, “cancer” significa una enfermedad o afeccion que implica un crecimiento no regulado y anormal. Los canceres ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de la IL-6 descritos en el presente documento incluyen mieloma multiple, leucemia, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer colorrectal, caquexia, melanoma, cancer de cuello de utero, cancer ovarico, linfoma, gastrointestinal, cancer de pulmon, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, cancer de rinon metastatico, tumores solidos, carcinoma pulmonar de celulas no pequenas, linfoma no Hodgkin, cancer de vejiga, cancer oral, neoplasia mieloproliferativa, enfermedad linfoproliferativa, y leucemia de celulas plasmaticas. Afecciones relacionadas con el cancer ejemplares no limitantes incluyen fatiga relacionada con el cancer de pulmon de celulas no pequenas y anorexia relacionada con el cancer.

Como se utiliza en el presente documento, “infection se refiere a una enfermedad o afeccion causada por un agente patogeno, tal como una bacteria, virus, hongos, etc. Las infecciones ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotropico T humano (HTLV), malaria cerebral, infecciones del tracto urinario, e infecciones meningococicas.

Como se utiliza en el presente documento, “enfermedad autoinmunitaria” se refiere a una enfermedad o afeccion que aparece por una respuesta inmunitaria inapropiada contra los propios componentes del cuerpo, tal como tejidos u otros componentes. En algunos casos, los niveles de IL-6 estan elevados en una enfermedad autoinmunitaria. Las enfermedades autoinmunitarias ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros descritos en el presente documento incluyen el lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, polimiositis, sindrome de vasculitis incluyendo arteritis de celulas gigantes, arteritis de Takayasu, crioglobulinemia, glomerulonefritis semilunar asociada con anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilos-mieloperoxidasa, vasculitis reumatoide, enfermedad de Crohn, policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, y anemia hemolitica autoinmunitaria.

Como se utiliza en el presente documento, una “enfermedad o afeccion mediada por IL-6” se refiere a una enfermedad o afeccion en la que al menos uno de los sintomas y/o progresion de la enfermedad o afeccion estan causados por la serialization mediada por la IL-6. Las enfermedades o afecciones ejemplares no limitantes mediadas por la IL-6 incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad cardiovascular en artritis reumatoide, hipertension arterial pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), dermatitis atopica, psoriasis, ciatica, diabetes tipo II, obesidad, arteritis de celulas gigantes, enfermedad del injerto contra el huesped aguda (GVHD), infarto de miocardico sin elevacion de ST, vasculitis asociada a anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilos (ANCA), neuromielitis optica, glomerulonefritis cronica, y arteritis de Takayasu.

Como se utiliza en el presente documento, “modular” significa alterar, aumentando o disminuyendo, el nivel de un peptido o polipeptido, o alterar, aumentando o disminuyendo, la estabilidad o actividad de un peptido o un polipeptido. El termino “inhibir” significa disminuir el nivel de un peptido o un polipeptido o disminuir la actividad o estabilidad de un peptido o polipeptido. Como se describe en el presente documento, la proteina que se modula o se inhibe es la IL-6.

Como se utiliza en el presente documento, el termino “bioactividad” indica el efecto de uno o mas proceso celular o extracelular (por ejemplo, mediante union, senalizacion, etc.) que puede tener un impacto en procesos fisiologicos o patofisiologicos.

Como se utiliza en el presente documento, los terminos “interleucina-6” y “IL-6” se refieren a la IL-6 de origen natural, incluyendo las isoformas y variantes de origen natural. Como se utiliza en el presente documento, IL-6 incluye todas las especies de mamifero de IL-6, incluyendo humana, canina, felina, murina, de primates, equina y bovina. Un precursor de la IL-6 humana ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra en el N.° de registro de Swiss-Prot P05231.1, que se muestra en la Figura 21 (SEQ ID NO: 9). Una IL-6 humana madura ejemplar no limitante comprende los aminoacidos 29 a 212 del N.° de registro de Swiss-Prot P05231.1 (SEQ ID NO: 10).

Como se utiliza en el presente documento, “receptor de IL-6” se refiere a un receptor que se une a y se activa por la IL-6, tal como el receptor de la IL-6, que comprende dos subunidades: IL-6R (al que tambien se hace referencia como la subunidad a del receptor de la IL-6) y gp130 (a la que tambien se hace referencia como subunidad b del receptor de la IL-6). Los receptores de la IL-6 incluyen los receptores de cualquier especie de mamifero, incluyendo, pero sin limitarse a, los humanos, caninos, felinos, murinos, equinos, de primates y bovinos. Un precursor IL-6R humano ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra con el N.° de registro de Swiss-Prot P08887.1. Una proteina madura IL-6R humana ejemplar no limitante tiene la secuencia de aminoacidos 20 a 468 con el N.° de registro de Swiss-Prot P08887.1. Un precursor de la gp130 humana ejemplar no limitante tiene la secuencia que se muestra con el N.° de registro de Swiss-Prot P40189.2. Una gp130 proteica madura humana ejemplar no limitante tiene la secuencia de aminoacidos 23 a 918 con el N.° de registro de Swiss-Prot P40189.2.

Un “aptamero de IL-6” es un aptamero que es capaz de unirse y modificar la actividad de la IL-6. Un aptamero de IL-6 puede inhibir al menos una actividad de la IL-6 in vitro. Las actividades de la IL-6 ejemplares no limitantes incluyen la union al receptor de la IL-6, que induce la proliferacion celular (tal como la proliferacion de las celulas TF-1 in vitro), la induccion de la fosforilacion de STAT3, y la induction de la transcription mediada por STAT3.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora de un gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea de los EE. UU. U otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, y mas particularmente, en seres humanos. El termino “vehiculo” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehiculo con el que se administra el agente terapeutico e incluye, pero sin limitarse a cualquier Kquido esteril como el agua o aceites.

Una “sal farmaceuticamente aceptable” o “sal” de un aptamero de IL-6 es un producto del compuesto desvelado que contiene un enlace ionico y se produce normalmente haciendo reaccionar el compuesto desvelado con un acido o una base, adecuados para la administration a un individuo. Una sal farmaceuticamente aceptable puede incluir, pero no se limita a sales por adicion de un acido que incluyen, hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos, hidrogeno sulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, arilalquilsulfonatos, acetatos, benzoatos, citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos y tartratos; cationes alcalinometalicos tales como Li, Una, K, sales metalicas alcalinoterreas tales como Mg o Ca, o sales organicas de amina.

Una “composition farmaceutica” es una formulation que comprende un aptamero de IL-6 en una forma adecuada para la administracion a un individuo. Una composicion farmaceutica se formula normalmente para que sea compatible con su via de administracion pretendida. Ejemplos de vias de administracion incluyen, pero no se limitan a oral y parenteral, por ejemplo, administracion intravenosa, intradermica, subcutanea, por inhalation, topica, transdermica, transmucosa, y rectal.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “cantidad terapeuticamente eficaz” significa la cantidad necesaria para mejorar al menos un sintoma de un trastorno o afeccion que se va a prevenir, reducir o tratar como se describe en el presente documento. La frase “cantidad terapeuticamente eficaz” como se refiere a aptameros de la IL-6 de la presente divulgation significa la dosificacion de aptamero que proporciona la respuesta farmacologica especifica para la que se administra el aptamero en un numero de individuos significativo que necesitan dicho tratamiento. Se hace enfasis que una cantidad terapeuticamente eficaz de un aptamero que se administra a un individuo en particular en un caso en particular no sera siempre eficaz en el tratamiento de las afecciones/enfermedades descritas en el presente documento, incluso cuando dicha dosificacion se considera que es una cantidad terapeuticamente eficaz para los expertos en la tecnica.

Los terminos “SELEX” y “procedimiento SELEX” se utilizan de manera intercambiable en el presente documento para referirse en general a una combinacion de (1) la seleccion de acidos nucleicos que interaction con una molecula diana de una manera deseable, por ejemplo, uniendose con alta afinidad a una protelna, con (2) la amplificacion de los acidos nucleicos seleccionados. El procedimiento SELEX puede utilizarse para identificar aptameros con alta afinidad para una molecula diana especlfica.

El SELEX en general incluye la preparacion de una mezcla de acidos nucleicos candidatos, la union de la mezcla del candidato a una molecula diana deseada para formar un complejo de afinidad, la separation de complejos de afinidad de los acidos nucleicos candidatos no unidos, la separacion y aislamiento del acido nucleico del complejo de afinidad, la purification del acido nucleico, y la identification de una secuencia de aptamero especlfica. El procedimiento puede incluir multiples rondas de refinamiento adicional de la afinidad del aptamero seleccionado. El procedimiento puede incluir las etapas de amplificacion en uno o mas puntos del procedimiento. Vease, por ejemplo, la Patente de Ee . UU. N.° 5.475.096, titulada "Nucleic Acid Ligands”. El procedimiento SELEX se puede utilizar para generar un aptamero que se une convenientemente a su diana, as! como un aptamero que se une no covalentemente a su diana. Vease, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N.° 5.705.337 titulada “Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX”.

El procedimiento SELEX se puede utilizar para identificar aptameros de alta afinidad que contienen nucleotidos modificados que confieren caracterlsticas mejoradas al aptamero, tal como, por ejemplo, estabilidad mejorada in vivo o caracterlsticas de suministro mejoradas. Ejemplos de dichas modificaciones incluyen sustituciones qulmicas de la ribosa y/o fosfato y/o posiciones de bases. Los aptameros identificados por el proceso SELEX que contienen nucleotidos modificados se describen en la Patente de EE. UU. N.° 5.660.985, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”, que describe los oligonucleotidos que contienen derivados de nucleotidos qulmicamente modificados en las posiciones C5 y/o 2' de pirimidinas. La Patente de EE. UU. N.° 5.580.737, vease supra, describe aptameros altamente especlficos que contienen uno o mas nucleotidos modificados con 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-O-metil (2'-OMe). Vease tambien, la Publication de Solicitud de Patente de EE. UU.

20090098549, titulada "SELEX and P^hOT^o S^e LEX”, que describe bibliotecas de acidos nucleicos que tienen propiedades flsicas y qulmicas y su uso en SELEX y photoSELEX.

La Solicitud Provisional de EE. UU. Serie N.° 61/264.545, presentada el 25 de noviembre de 2009, titulada "Nuclease Resistant Oligonucleotides”, describe metodos para la production de oligonucleotidos con una resistencia mejorada a la nucleasa. Los oligonucleotidos resistentes a la nucleasa incluyen al menos una pirimidina modificada en la position C-5 con un grupo seleccionado de entre los que se exponen en la Figura 20 y la Figura 24. Las modificaciones pueden incluir la sustitucion de desoxiuridina en la posicion C-5 con un sustituyente independientemente seleccionado de entre: bencilcarboxiamida (Bn), fenetil (Pe), tiofenilmetil (Th), naftilmetilcarboxiamida (Nap), triptaminocarboxiamida (Trp), e isobutilcarboxiamida como se ha ilustrado anteriormente.

Tambien se puede utilizar SELEX para identificar aptameros que tienen caracterlsticas de disociacion deseables. Vease la Patente de EE. UU 7.947.447, titulada “Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”, que describe metodos mejorados SELEX para generar aptameros que pueden unirse a moleculas diana. Se describen metodos para la produccion de aptameros que tienen velocidades de disociacion mas lentas de sus moleculas diana respectivas. Los metodos implican poner en contacto la mezcla de candidatos con la molecula diana, permitir que se produzca la formation de complejos acido nucleico-diana, y llevar a cabo un procedimiento de enriquecimiento de velocidad de disociacion lenta en el que los complejos de acido nucleico-diana con velocidades de disociacion rapida se disocian y no se vuelven a formar, mientras que los complejos con velocidades de disecacion lenta permanecen intactos. De manera adicional, los metodos incluyen el uso de nucleotidos modificados en la produccion de mezclas de acidos nucleicos candidatos para generar aptameros con una actuation de disociacion mejorada (vease, la Publicacion de patente de EE. UU. N.° 2009/0098549, titulada "SELEX and PhotoSELEX"). (Vease tambien la Patente de EE. UU. N.° 7.855.054 y la Publicacion de patente de EE. UU. N.° 2007/0166740).

Se proporcionan metodos de seleccion de aptameros que se unen a una molecula diana, que comprenden: (a) preparar una mezcla de acidos nucleicos candidatos, en la que la mezcla de candidatos comprende acidos nucleicos modificados en los que al menos una piridina en al menos uno, o en cada, acido nucleico de la mezcla de candidatos esta modificado qulmicamente en la posicion C5; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molecula diana en la que los acidos nucleicos que tiene una afinidad aumentada por la molecula diana con respecto a otros acidos nucleicos de la mezcla de candidatos se unen a la molecula diana, que forman complejos de acido nucleicomolecula diana; (c) dividir los acidos nucleico con afinidad aumentada del resto de la mezcla de candidatos; y (d) amplificar los acidos nucleicos con afinidad aumentada para dar la gura a una mezcla de acidos nucleico enriquecida en secuencias de acido nucleico que son capaces de unirse a la molecula diana con afinidad aumentada, por lo que se identifica un aptamero para la molecula diana. En ciertos metodos, el metodo incluye adicionalmente llevar a cabo un proceso de enriquecimiento de disociacion lenta.

“Diana” o “molecula diana” u “objetivo” se refiere en el presente documento a cualquier compuesto con el que un acido nucleico puede actuar de una manera deseable. Una molecula diana puede ser una proteina, un peptido, un acido nucleico, un carbohidrato, lipido, polisacarido, glicoproteina, hormona, receptor, antigeno, anticuerpo, virus, agente patogeno, sustancia toxica, sustrato, metabolito, analogo de estado de transicion, cofactor, inhibidor, farmaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento, celula, tejido, cualquier porcion o fragmento de cualquiera de los anteriores, etc., sin limitacion, Virtualmente cualquier producto quimico o efector biologico puede ser una diana adecuada. Las moleculas de cualquier tamano pueden servir como dianas. Una diana se puede modificar tambien de cierta manera para aumentar la probabilidad o fuerza de una interaccion entre la diana y el acido nucleico. Una diana tambien puede incluir cualquiera variacion menor de un compuesto o molecula particular, tal como, en el caso de una proteina, por ejemplo, variaciones menores en la secuencia de aminoacidos, formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra modificacion o alteracion tal como la conjugacion con un componente marcador, que no altere sustancialmente la identidad de la molecula. Una “molecula diana” o “diana” es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptamero. Las “moleculas diana” o “dianas” se refiere a mas de uno de dichos conjuntos de moleculas. Ejemplos del procedimiento SELEX en los que la diana es un peptido se describen en la Patente de EE. UU. N.° 6,376,190, titulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein”.

Aptameros de IL-6 ejemplares

Los aptameros de IL-6 de la presente divulgacion se identificaron un metodo SELEX mejorado para identificar los aptameros que tenian velocidades de disociacion lentas, como se describen en el Ejemplo 1. Se utilizo una biblioteca aleatoria de ADN compuesta de Bn-dU (5-(N-bencilcarboxiamida-2'-desoxiuridina), dA, dC y dG para una selection, y una biblioteca compuesta por NapdU (5-(N-naftilcarboxiamida-2'-desoxiuridina), dA, dC y dG se utilizaron para otra seleccion. Por lo tanto, en distintos metodos, un aptamero de IL-6 comprende al menos una pirimidina modificada.

Utilizando el aptamero Bn-dU 2573-20, se llevaron a cabo estudios para identificar una secuencia truncada que mantiene una fuerte afinidad por la IL-6. El truncado sistematico de los extremos 5' y 3' dan lugar a la identification de una secuencia de 32 nucleotidos (2573-20_15; SEQ ID NO: 22). Utilizando el aptamero Nap-dU 2574-49 (SEQ ID NO: 8), se llevaron a cabo estudios similares para identificar una secuencia truncada que mantiene una fuerte afinidad por la IL-6. El truncado sistematico de los extremos 5' y 3' dan lugar a la identificacion de una secuencia de 30 nucleotidos 2574-49_14; SEQ ID NO: 35).

Adicionalmente, los estudios de sustitucion de nucleotidos descritos en el Ejemplo 15 demostraban que muchas de las posiciones del aptamero 2573-20_136 (SEQ ID NO: 101) y aptamero 2574-49_260 (SEQ ID NO: 400) se podian modificar y/o sustituir con poca o ninguna perdida de actividad de union a la IL-6. Por lo tanto, en algunos aptameros, un aptamero que comprende la secuencia

I. 5'-GGCAGGZZZGGZQaGZGG-3' (SEQ ID NO: 700);

en la que cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado y un nucleotido no modificado; a es 1 a 50. En algunos aptameros a es 2 a 50, 1 a 40, 2 a 40, 1 a 30, 2 a 30, 1 a 20, 2 a 20, 1 a 15, 2 a 15, 1 a 10, 2 a 10, 1 a 5 o 2 a 5. En algunos aptameros, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador CrC20 sustituido o no sustituido, un alquilenglicol, y un polialquilenglicol. En algunos aptameros cada Q se selecciona independientemente de un enlazador CrC20 sustituido o no sustituido, un 1,3 propano diol, un poli (1,3-propanodiol) que tiene 2 a 100 unidades de 1,3-propano diol, un etilenglicol, y un polietilenglicol que tiene 2 a 100 unidades de etilenglicol. En algunos aptameros, cada Z se selecciona de entre U, T y las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24. En algunos aptameros, uno o mas nucleotidos del aptamero de la IL-6 comprenden una modificacion 2'-O-metil. En algunos aptameros, uno o mas enlaces entre nucleosidos del aptamero de IL-6 es un enlace fosforotioato.

En algunos aptameros, el aptamero de IL-6 comprende la secuencia:

II. 5'-GGGYXAXGYAGCLbGZGCGYAAGGCGGY-3' (SEQ ID NO: 701)

en la que cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); cada Y se selecciona independientemente de entre una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); cada X se selecciona independientemente de entre una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); cada L se selecciona independientemente de entre un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido, un alquilenglicol, y un polialquilenglicol. En algunos aptameros cada L se selecciona independientemente de un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido, un 1,3 propano diol, un poli (1,3-propanodiol) que tiene 2 a 100 unidades de 1,3-propano diol, un etilenglicol, y un polietilenglicol que tiene 2 a 100 unidades de etilenglicol. En algunos aptameros, cada L es un enlazador C3 sustituido y b es 2. En algunos aptameros, cada L es independientemente un nucleosido modificado o no modificado y b es 1 a 10. En algunos aptameros, cada Z se selecciona independientemente de entre U, T y las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24. En algunos aptameros, cada Y se selecciona independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, cada Y se selecciona independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre las pirimidinas aromaticas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre las pirimidinas aromaticas modificadas que se muestran en la Figura 24. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre Nap, 2Nap, NE, BF, y BT de la Figura 24. En algunos aptameros cada X es Nap. En algunos aptameros, L es un enlazador C3, y b es 2. En algunos aptameros, uno o mas nucleotidos del aptamero de la IL-6 comprenden una modification 2'-O-metil. En algunos aptameros, uno o mas enlaces entre nucleosidos del aptamero de IL-6 es un enlace fosforotioato.

Se llevaron a cabo estudios de secuenciacion adicionales en el agrupamiento de secuencias del que se selecciono el 2573- 20 (SEQ ID NO: 7). La secuenciacion 454, que es un metodo de alto rendimiento a gran escala que utiliza una pirosecuenciacion en paralelo, proporciona una preparation de muestras sin sesgo y un analisis de secuencia muy preciso. Los datos de la secuenciacion se utilizaron para identificar un motivo de consenso implicado en la union con la IL-6. Se identifico un cuarteto G conservado en muchos miembros del agrupamiento final de SELEX. A partir de las secuencias descritas en el Ejemplo 14 y la Figura 23, y la estructura cristalina del Ejemplo 13, se identifico un motivo de consenso para la union con la IL-6, que comprende un cuarteto G en el que dos pares de Ges flanquean tres U, T, y una pirimidina modificada en 5'). Por lo tanto, en algunos aptameros, un aptamero de IL-6 comprende un motivo de cuarteto G. En algunos aptameros, un aptamero de IL-6 comprende un motivo de cuarteto G seleccionado de entre:

III. 5'-GG-ZZZ-GG-Qa-GG-Qb-GG-3' (SEQ ID NO: 702);

IV. 5'-GG-Qa-GG-ZZZ-GG-Qb-GG-3' (SEQ ID NO: 703); y

V. 5'-GG-Qa-GG-Qb-GG-ZZZ-GG-3' (SEQ ID NO: 704);

en la que cada Z se selecciona independientemente de entre U, T, y una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado, y un nucleotido no modificado; a es de 1 a 50; y b es de 1 a 50. En algunos aptameros a es 2 a 50, 1 a 40, 2 a 40, 1 a 30, 2 a 30, 1 a 20, 2 a 20, 1 a 15, 2 a 15, 1 a 10, 2 a 10, 1 a 5 o 2 a 5. En algunos aptameros b es 2 a 50, 1 a 40, 2 a 40, 1 a 30, 2 a 30, 1 a 20, 2 a 20, 1 a 15, 2 a 15, 1 a 10, 2 a 10, 1 a 5 o 2 a 5. En algunos aptameros, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido, un alquilenglicol, y un polialquilenglicol. En algunos aptameros cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido, un 1,3 propano diol, un poli (1,3-propanodiol) que tiene 2 a 100 unidades de 1,3-propano diol, un etilenglicol, y un polietilenglicol que tiene 2 a 100 unidades de etilenglicol. En algunos aptameros, al menos uno o al menos dos nucleotidos Z se seleccionan independientemente de entre las pirimidinas modificadas.

En algunos aptameros, al menos uno o al menos dos nucleotidos Z se seleccionan independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, al menos uno o al menos dos nucleotidos Z se seleccionan independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24.

La secuenciacion 454 del agrupamiento SELEX de Nap identifico un grupo de secuencias unicas que compartlan dos motivos conservados. Vease la Figura 25. Se descubrio que los motivos estaban en cualquier orden (comparese, por ejemplo, 2574-49 (SEQ ID NO: 8) con 2574-104 (SEQ ID NO:621)). En algunos aptameros, el aptamero de IL-6 comprende una secuencia seleccionada de entre:

5'-YXAXGYARQaMGYAAGSCGRY-3' (SEQ ID NO: 705); o

VI. 5'-MGYAAGSCGRYQbYXAXGYAR-3' (SEQ ID NO: 706);

en el que cada Y se selecciona independientemente de entre una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); cada X se selecciona independientemente de entre una pirimidina modificada (tal como una pirimidina modificada en 5'); M se selecciona de entre C y A; S se selecciona de entre C y G; cada R se selecciona independientemente de entre G y A; cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador, un nucleotido modificado, y un nucleotido no modificado; a es de 1 a 30; y b es de 1 a 30. En algunos aptameros a es 1 a 20, 1 a 10, 4 a 10, o 6 a 7. En algunos aptameros b es 1 a 20 o 1 a 17. En algunos aptameros, cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador C2-C2o sustituido o no sustituido, un alquilenglicol, y un polialquilenglicol.

En algunos aptameros cada Q se selecciona independientemente de entre un enlazador C2-C20 sustituido o no sustituido, un 1,3 propano diol, un poli (1,3-propanodiol) que tiene 2 a 100 unidades de 1,3-propano diol, un etilenglicol, y un polietilenglicol que tiene 2 a 100 unidades de etilenglicol. En algunos aptameros, cada Y se selecciona independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, cada Y se selecciona independientemente de entre las pirimidinas modificadas que se muestran en la Figura 24. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre las pirimidinas aromaticas modificadas que se muestran en la Figura 20. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre las pirimidinas aromaticas modificadas que se muestran en la Figura 24. En algunos aptameros, cada X se selecciona independientemente de entre Nap, 2Nap, NE, BF, y BT de la Figura 24. En algunos aptameros cada X es Nap. En algunos aptameros, cada N se selecciona independientemente de entre A, C. y G. En algunos aptameros, L es un enlazador C3, y b es 2. En algunos aptameros, uno o mas nucleotidos del aptamero de la IL-6 comprenden una modificacion 2'-O-metil. En algunos aptameros, uno o mas enlaces entre nucleosidos del aptamero de IL-6 es un enlace fosforotioato.

En algunos aptameros, cada X, Y y/o Z es una uridina modificada. En algunos aptameros, cada X, Y y/o Z se selecciona independientemente de entre las pirimidinas modificadas como se definen en el presente documento. En algunos aptameros cada X, Y y/o Z se seleccionan independientemente de entre: 5- (N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida )-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida )-2'- desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'- desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[l-(3-trimetilamonium) propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- naftilmetilcarboxiamida )-2'-fluorouridina, y 5-(N-[l-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina). En algunos aptameros cada Z es 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU).

En ciertos aptameros, porciones del aptamero (Y) de la IL-6 pueden no ser necesarios para mantener la union y ciertas porciones del aptamero de IL-6 contiguo se pueden modificar, incluyendo, pero no limitado a la sustitucion con un resto espaciador o enlazador. En estos aptameros, por ejemplo, Y se puede representar como Y'-Q-Y''-Q'-Y''', en el que Y', Y'' e Y''' son partes de un aptamero o segmentos de diferentes aptameros de la IL-6 y Q y/o Q' son moleculas espaciadoras o enlazadoras que modifican ciertas caracterlsticas de acido nucleico del aptamero original de la IL-6. Cuando Q y Q' no estan presentes, Y', Y'' e Y''' representan un aptamero de IL-6 contiguo (Y).

Como se utiliza en el presente documento un “enlazador” es una entidad molecular que conecta dos o mas entidades moleculares mediante un enlace covalente o interacciones no covalentes, y que pueden permitir la separacion espacial de las entidades moleculares de manera que se conserven las propiedades funcionales de una 0 mas de las entidades moleculares. Un enlazador tambien se puede conocer como un espaciador. Las secuencias enlazadoras adecuadas se pueden concebir rapidamente por los expertos en la tecnica basandose en la presente divulgacion.

Como se utiliza en el presente documento, un enlazador puede comprender una o mas moleculas o subcomponentes, seleccionados de entre el grupo que incluye, pero no se limita a un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptldico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un aficuerpo, un anticuerpo mimetico, una molecula de carbono alifatica, aromatico o heteroaromatica, un alquilenglicol (por ejemplo, etilenglicol, 1,3-propanodiol), un polialquilenglicol (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)), un receptor celular, un ligando, un llpido, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores, o cualquier estructura qulmica o componente.

Mas especlficamente, como se utiliza en el presente documento un enlazador o una espaciador puede tener una estructura que comprende una cadena de 2 a 20 atomos de carbono (C2-C20) (saturado, insaturado, de cadena lineal, ramificada o clclica), 0 a 10 grupos arilo, 0 a 10 grupos heteroarilos, y 0 a 10 grupos heteroclclicos, que comprenden opcionalmente un enlace eter (-O-), (por ejemplo, una o mas unidades de alquilenglicol, incluyendo pero sin limitarse a una o mas unidades de etilenglicol -O-(CH2CH2O)-; una o mas unidades de 1,3-propanodiol -O-(CH2CH2CH2O)-, etc.; en algunos aptameros, un enlazador comprende de 1 a 100 unidades, de 1 a 50 unidades,, de 1 a 40 unidades, de 1 a 30 unidades, de 1 a 20 unidades, 1 a 12 unidades, o 1 a 10 unidades); una union amina (-NH-); una union amida (-NC(O)-); una union tioeter (-S-); etc.; en el que cada atomo de carbono del armazon puede ser independientemente no sustituido (es decir, que comprende sustituyentes -H) o puede estar sustituido con uno o mas grupos seleccionados desde un alquilo C1 a C3, -OH, -NH2, -SH, -O- (C1 a C6 alquilo), -S-(C1 a C6 alquilo), halogeno, -OC(O)(C1 a C6 alquilo), -NH-(C1 a C6 alquilo), y similares. En algunos aptameros, un enlazador C2-C20 es un enlazador C2-C8, un enlazador C2-C6, un enlazador C2-C5 sustituido, un enlazador C2-C4 o un enlazador C3, en el que cada carbono se puede sustituir independientemente como se describe anteriormente.

En algunos aptameros, uno o mas nucleosidos de un aptamero de la IL-6 comprende una modificacion seleccionada de entre una modificacion de la position 2' del azucar (tal como una 2'-amino (2'-NH2), una 2'-fluoro (2'-F) o una 2'-O-metil (2'-OMe)) una modificacion en una amina exoclclica de citosina, una modificacion en el enlace entre nucleosidos, y una 5-metil-citosina. En algunos aptameros, un aptamero de la IL6 comprende una protection en 3', en 5', y /o una desoxitimidina en el extremo 3'

En algunos aptameros, L puede ser un enlazador tal como un enlazador de hexaetilenglicol de 18 atomos. En algunos aptameros, la L puede ser una combinacion de nucleotidos y un enlazador. En algunos aptameros, un aptamero de la IL-6 tiene una secuencia seleccionada de entre las secuencias de SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. En algunos aptameros, un aptamero de la IL-6 tiene una secuencia seleccionada de entre las secuencias de SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 573, y 599 a 625. En algunos aptameros, un aptamero de la IL-6 tiene una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o 100 % identica a una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. En algunos aptameros, un aptamero de la IL-6 tiene una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o 100 % identica a una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. La identidad de secuencia respecto a al menos una secuencia de nucleotidos que se muestra en las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. No se limita particularmente a condicion de que el aptamero se una especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) menor de 10 nM y/o tenga una actividad antagonista (CI50) de menos de 10 nM.

Las expresiones “identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad de secuencia”, “porcentaje de identidad”, “ % identica”, “ % de identidad”, y variaciones de las mismas, cuando se utilizan en el contexto de dos secuencias de acido nucleico, se utilizan de manera intercambiable para referirse al numero de bases nucleotldicas que son las mismas en un acido nucleico de busqueda, cundo se compara y alinea en maxima correspondencia con un acido nucleico de referencia dividido por (1) el numero de bases nucleotldicas en la secuencia de busqueda entre, e incluyendo, la base nucleotldica 5' mas correspondiente (es decir, alineado) y la base nucleotldica 3' mas correspondiente (es decir, alineado), o (2) la longitud total de la secuencia de referencia, la que sea mas grande. El alineamiento de secuencias ejemplar para la comparacion se puede llevar a cabo, por ejemplo, por el algoritmo de homologla local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981, por el algoritmo de homologla de alineamiento de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970, por el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, por programas computarizados de estos algoritmos (GAP, BeSt FIT, PASTA, y TFASTA del paquete de software Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), o por inspeccion visual (vease en general, Ausubel, F. M. et al, Current Protocols in Molecular Biology, pub. por Greene Publishing Assoc, y Wiley-Interscience (1987)).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia es el algoritmo utilizado en la herramienta de busqueda por alineamiento local basica (de aqul en adelante “BLAST”), vease, por ejemplo, Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 y Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15:3389-3402, 1997. El software para llevar a cabo los analisis BLAST estan disponibles para el publico a traves del Centro Nacional de Informacion Tecnologica (de aqul en adelante “NCBI”). Los parametros por defecto que se utilizan en la determinacion de identidad de secuencia que utilizan el software disponible en el NCBI, por ejemplo, BLASTN (para la secuencia de nucleotidos) se describen en McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25, 2004.

Como se utiliza en el presente documento, cuando se describe el porcentaje de identidad de un acido nucleico, tal como un aptamero de IL-6, la secuencia del mismo es al menos , por ejemplo, aproximadamente un 95 % identico a la secuencia del nucleotido de referencia, se pretende que la secuencia de acido nucleico sea identica a la secuencia de reverencia excepto en que la secuencia de acido nucleico puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleotidos de la secuencia de acido nucleico de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de acido nucleico deseada, en la secuencia que es al menos aproximadamente un 95 % identica a una secuencia de acido nucleico se pueden eliminar o sustituir con otros nucleotidos hasta un 5 % de los nucleotidos de la secuencia de referencia, o se pueden insertar en la secuencia de referencia cierto numero de nucleotidos hasta un 5 % del numero total de los nucleotidos de la secuencia de referencia (a lo que se hace referencia en el presente documento como insercion). Estas mutaciones de la secuencia de referencia para generar la secuencia deseada pueden producirse en las posiciones del extremo 5' o 3' de la secuencia de nucleotidos de referencia o en cualquier sitio entre estas posiciones terminales, intercaladas entre los nucleotidos individualmente o en uno o mas grupos contiguos en la secuencia de referencia. Ademas, se pretende que una base nucleotldica se considere “identica” para los fines de determinacion del porcentaje de identidad cuando la base nucleotldica (1) es la misma que la base nucleotldica de la secuencia de referencia, o (2) se deriva de la base nucleotldica de la secuencia de referencia, o (3) se deriva de la misma base nucleotldica de la que se deriva la base nucleotldica de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la 5-metilcitosina se considera que es “identica” a la citosina con fines del calculo del porcentaje de identidad. La secuencia de referencia puede ser cualquiera de las secuencias que se muestran en las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. La secuencia de referencia puede ser una cualquiera de las secuencias de nucleotidos que se muestran en la SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625.

Un aptamero de IL-6 puede comprender una secuencia de nucleotidos que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625, en la que se han sustituido, eliminado o insertado, de 1 a 20, 1 a 15, 1 a 12, 1 a 8, 1 a 5, o 1 a 3 nucleotidos. El numero de nucleotidos sustituidos, eliminados o insertados no esta limitado particularmente a condicion de que el aptamero se una especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tenga una actividad antagonista (CI50) de menos de 10 nM (10-8 M). En algunos aptameros, el aptamero de la IL-6 comprende no mas de 10, y en algunos aptameros, 4, 3, 2, o 1, sustituciones eliminaciones, y/o inserciones de nucleotidos con respecto a una secuencia de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625.

La presente divulgacion proporciona un aptamero de la IL-6 que al unirse a la IL-6 modula una funcion de la IL-6. Un aptamero de la IL-6 que se describe en el presente documento puede inhibir la fosforilacion mediada por la IL-6 de STAT3. El aptamero puede modular una funcion de la IL-6 in vivo, tal como inhibiendo la fosforilacion se STAT3 mediada por la IL-6 in vivo. El aptamero IL-6 puede tener una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. El aptamero de la IL-6 se puede seleccionar de entre ciertos aptameros que se muestran en las Tablas 2 a 4, 10 a 13, y las Figuras 23 y 25 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625). El aptamero de la IL-6 puede seleccionarse de entre los aptameros que se muestran en las Tablas 2 a 4, 10 o 12, o las Figura 23 y 25, o los aptameros de las Tablas 3 y 4 que se unen especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM. El aptamero de la IL-6 tiene una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. En algunos aptameros, el aptamero comprende de 12 a 80, o 20 a 80, o 25 a 80, o 30 a 80 nucleotidos contiguos de un aptamero seleccionado de entre ciertos aptameros que se muestran en las Tablas 2 a 4, 10 a 13, y las Figuras 23 y 25 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625., en las que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8)). En algunos aptameros, el aptamero de la IL-6 comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleotidos contiguos que son identicos en la secuencia de bases nucleotldicas a una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625, en la que el aptamero se une especlficamente con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8 M). Un aptamero de la IL-6 puede consistir en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleotidos contiguos que son identicos en la secuencia de bases nucleotldicas a una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 300 a 356, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625, en la que el aptamero se une especlficamente con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8 M).

El aptamero de la IL-6 puede comprender 12 a 80, o 20 a 80, o 25 a 80, o 30 a 80 nucleotidos contiguos de un aptamero seleccionado de entre los aptameros que se muestran en las Tablas 2 a 4, 10, 12 y las Figuras 23 y 25 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 573, y 599 a 625), en los que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8 M). El aptamero de la IL-6 puede comprender al menos 12, al menos 23, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleotidos contiguos de un aptamero seleccionado de entre ciertos aptameros que se muestran en las Tablas 2 a 4, 10 a 13, y las Figuras 23 y 25 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625), en las que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8)). En algunos aptameros, el aptamero de la IL-6 comprende al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleotidos contiguos que son identicos en la secuencia de bases nucleotldicas a una secuencia seleccionada de entre SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625, en la que el aptamero se une especlficamente con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8 M).

El aptamero de la IL-6 puede comprender 12 a 80, o 20 a 80, o 25 a 80, o 30 a 80 nucleotidos contiguos de un aptamero seleccionado de entre ciertos aptameros que se muestran en las Tablas 10 o la Tabla 12, (por ejemplo, las SEQ ID NO: 100 a 239, 573 y 400 a 446), en las que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8). El aptamero de la IL-6 puede comprender al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleotidos contiguos de un aptamero que se muestra en las Tablas 10 y 12 (SEQ ID NO: 100 a 239, 573 y 400 a 446), en las que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8). Algunos aptameros de la IL-6 consisten en al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, al menos 25, al menos 26, al menos 27, al menos 28, al menos 29, o al menos 30 nucleotidos contiguos de un aptamero que se muestra en las Tablas 10 y 12 (SEQ ID NO: 100 a 239, 573 y 400 a 446), en las que el aptamero se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM y/o tiene una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10 nM (10-8).

Un aptamero de la IL-6 puede comprender nucleotidos adicionales u otros restos qulmicos en el extremo 5', el extremo 3', o en ambos extremos 5' y 3' del aptamero.

El aptamero de la IL-6 puede contener cualquier numero de nucleotidos ademas de la region de union a la IL-6. El aptamero de la il-6 puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleotidos, hasta aproximadamente 95 nucleotidos, hasta aproximadamente 90 nucleotidos, hasta aproximadamente 85 nucleotidos, hasta aproximadamente 80 nucleotidos, hasta aproximadamente 75 nucleotidos, hasta aproximadamente 70 nucleotidos, hasta aproximadamente 65 nucleotidos, hasta aproximadamente 60 nucleotidos, hasta aproximadamente 55 nucleotidos, hasta aproximadamente 50 nucleotidos, hasta aproximadamente 45 nucleotidos, hasta aproximadamente 40 nucleotidos, hasta aproximadamente 35 nucleotidos, hasta aproximadamente 30 nucleotidos, hasta aproximadamente 25 nucleotidos, y hasta aproximadamente 20 nucleotidos.

El aptamero de la IL-6 se puede seleccionar de entre un aptamero que tenga caracterlsticas de union similares y la capacidad para tratar enfermedades inflamatorias asociadas a la IL-6, enfermedades malignas, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, y otras enfermedades o afecciones en las que se ha implicado la IL-6 como un aptamero seleccionado de entre las SEQ ID NO: 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100 a 239, 400 a 446, 500 a 573, y 599 a 625. Se proporciona un aptamero de la IL-6 que se une a la misma region de una IL-6 que un aptamero seleccionado de entre los aptameros que se muestran en cualquiera de las Tablas 2, 10, 12, y las Figuras 23 y 25.

Los aptameros desvelados en el presente documento se unen especlficamente a la IL-6 madura (SEQ ID NO: 10) (aminoacidos 29 a 212 de la SEQ ID NO: 9; vease la Figura 21). Se proporciona un aptamero que se une a la misma region de la IL-6 que el aptamero de la IL-62573-20136 (SEQ ID NO: 101). En algunos casos, se proporciona un aptamero de al IL-6 que se une a una region (epltopo) de la IL-6 que comprende los aminoacidos 16 a 31 de la protelna madura (SEQ ID NO: 10) (aminoacidos 44 a 59 de la secuencia precursora (SEQ ID NO: 9); vease la Figura 21). Esta region engloba la interaccion de superficie a cargo del “dominio 1” del aptamero de la IL-6 2573-20136 (SEQ ID NO: 101). En algunos casos, se proporciona un aptamero de la IL-6 que se une a un epltopo de la IL-6 que comprende los aminoacidos 16 a 31 y 117 a 125 de la protelna madura (SEQ ID NO: 10) (aminoacidos 44 a 59 y 145 a 153 de la secuencia precursora (SEQ ID NO: 9); vease la Figura 21). Este epltopo engloba la interaccion de superficie a cargo del “dominio 1” y el “dominio 2” del aptamero de la ⁱL-6 2573-20136 (SEQ ID NO: 101). Los contactos polares se definen como la suma de la suma de enlaces hidrogeno y las interacciones carga-carga. Se proporciona un aptamero de al IL-6 que se une a la IL-6 con una relacion de contactos polares respecto al area de interfaz de menos de 0,01, menos de 0,009, menos de 0,008, o aproximadamente 0,007.

Un aptamero de la IL-6 puede competir por la union con la IL-6 madura, tal como la IL-6 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 10 (vease la Figura 21), con el aptamero de la IL-62573-20136 (S^eQ ID NO: 101). Se proporciona un aptamero de la IL-6 que se une a la misma region de una IL-6 que el aptamero de la IL-62574-49260 (SEQ ID NO: 400). En algunos casos, un aptamero de la IL-6 compite por la union con la IL-6 madura, tal como la IL-6 que comprende la secuencia de SEQ iD NO: 10 (vease la Figura 21), con un aptamero de la IL-6 2574-49260 (SEQ ID NO: 400).

Se proporciona un aptamero de la IL-6 que tiene cualquier combination de las siguientes caracterlsticas:

(a) se une a una region de la IL-6 madura (SEQ ID NO: 10) que comprende los aminoacidos 16 a 31 de la protelna madura;

(b) se une a un epltopo de la IL-6 madura (SEQ ID NO: 10) que comprende los aminoacidos 16 a 31 y 117 a 125 de la protelna madura;

(c) compite por la union con la IL-6 madura (SEQ ID NO: 10) con un aptamero de la IL-62573-20136 (SEQ ID NO: 101); y/o

(d) se une a la IL-6 madura con una relacion de contactos polares respecto al area de interfaz de menos de 0,009, menos de 0,008, o aproximadamente 0,007.

Algunos aptameros de la IL-6 tienen una actividad seleccionada de entre la inhibition de la union de la IL-6 a un receptor de la IL-6, inhibicion de la fosforilacion de STAT3, inhibicion de la transcription dirigida por STAT3, e inhibicion de la proliferation celular inducida por la IL-6.

El aptamero de la IL-6 se puede seleccionar para que tenga cualquier constante de disociacion (Kd) adecuada por la IL-6. En algunos casos, un aptamero de la lL-6 tiene una constante de disociacion (Kd) por la IL-6 de menos de 30 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 10 nM, menos de 9 nM, menos de 8 nM, menos de 7 nM, menos de 6 nM, menos de 5 nM, menos de 4 nM, menos de 3 nM, menos de 2 nM, o menos de 1 nM. Las constantes de disociacion se pueden determinar con un ensayo de union utilizando una titulacion multipunto y ajustando la ecuacion y = (max - min) (Protelna)/ (Kd Protelna) min como se describe en el Ejemplo 1, posteriormente. El aptamero de la IL-6 puede ser un aptamero con una Kd que sea menor o igual a la Kd de un aptamero mostrado en las Tablas 10 y 12 (SEQ ID NO: 100 a 239, 573 y 400 a 446). El aptamero de la IL-6 puede ser un aptamero con una Kd que sea menor o igual a la Kd del aptamero de la IL-62573-20136 (SEQ ID NO: 101). El aptamero de la IL-6 puede ser un aptamero con una Kd que sea menor o igual a la Kd del aptamero de la IL-6 2574-49260 (SEQ ID NO: 400).

Un aptamero de la IL-6 puede tener una actividad antagonista de la IL-6 (CI50) de menos de 10-8 M (<10 nM), menos de 10"9 M, menos de 10"10 M, o menos de 10"11 M. En distintos metodos, la actividad antagonista puede determinarse utilizando, por ejemplo, un ensayo de proliferacion celular y/o un ensayo de indicador genetico (vease, por ejemplo, los Ejemplos 2 y 11). En un ensayo de proliferacion celular, se mide la inhibicion del crecimiento celular de celulas que responden a la IL-6 por un aptamero de la IL-6. En un ensayo de indicador genetico ejemplar, se ensayan los aptameros de la IL-6 en cuanto a la inhibicion de la fosforilacion de STAT en las celulas transfectadas con un gen STAT.

Composiciones farmaceuticas que comprenden aptameros

Se proporcionan composiciones farmaceuticas que comprenden al menos un aptamero descrito en el presente documento y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Los vehlculos adecuados se describen en "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vigesimoprimera Edicion," publicado por Lippincott Williams & Wilkins. Las composiciones farmaceuticas que incluyen al menos un aptamero descrito en el presente documento y al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable tambien incluyen uno o mas principios activos.

Los aptameros descritos en el presente documento se pueden utilizar en una forma de dosificacion farmaceuticamente aceptable ,que incluye pero no se limita a formas de dosificacion inyectables, dispersiones llquidas, geles, aerosoles, unguentos, cremas, formulaciones liofilizadas, polvos secos, comprimidos, capsulas, formulaciones de liberacion controlada, formulaciones de fusion rapida, formulaciones de liberation retrasada, formulaciones de liberacion extendida, formulaciones de liberacion pulsatil, formulaciones con una mezcla de liberacion controlada y liberacion inmediata, etc. Especlficamente, los aptameros descritos en el presente documento se pueden formular: (a) por la administration seleccionada de entre cualquiera de las administraciones oral, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intratecal, intraarticular, rectal, oftalmica, colonica, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local, bucal nasal y topica; (b) en una forma de dosificacion seleccionada de entre cualquiera de dispersiones llquidas, geles, aerosoles, unguentos, cremas, comprimidos, papelillos y capsulas; (c) en una forma de dosificacion seleccionada de entre cualquiera de las formulaciones liofilizadas, polvos secos, formulaciones de fusion rapida, formulaciones de liberacion controlada, formulaciones de liberacion retrasada, formulaciones de libracion extendida, formulaciones de liberacion pulsatil y formulaciones con una mezcla de liberacion inmediata y liberacion controlada; o (d) cualquier combination de las mismas.

Las soluciones o suspensiones que se utilizan para la aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden comprender uno o mas de los siguientes componentes: (1) un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solution salina, aceites no volatiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol, u otros disolventes sinteticos, (3) agentes antibacterianos tales como alcohol bencllico o metil parabenos; (3) antioxidantes tales como el acido ascorbico o el bisulfito sodico, (4) agentes quelantes tales como el acido etilendiaminotetraacetico; (5) tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos; y (6) agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sodico o dextrosa. El pH se puede ajustar con acidos o bases, tales como el acido clorhldrico o el hidroxido sodico. Una preparation parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de multiples dosis fabricados en cristal o plastico.

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para su uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas esteriles (cuando sean hidrosolubles) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones inyectables o dispersiones. Para la administracion intravenosa, los vehlculos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solucion salina de fosfato (PBS). En todos los casos, la composition deberla ser esteril y deberla ser fluida hasta el punto de que se pueda introducir con una jeringa. La composicion farmaceutica deberla ser estables en condiciones de fabrication y almacenamiento y se deberla conservar de la action contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El termino “estable” como se utiliza en el presente documento significa que se mantenga en un estado o condition que sean adecuados para la administracion a un sujeto.

El vehlculo puede ser un disolvente o medio de dispersion, que incluya, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol llquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como de lecitina, para el mantenimiento del tamano de partlcula necesario en el caso de la dispersion y por el uso de tensioactivos. La prevention de la accion de microorganismos se puede conseguir mediante distintos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y sales inorganicas tales como el cloruro sodico en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar incorporando el principio activo (por ejemplo, un aptamero de la IL-6) en una cantidad apropiada de un disolvente adecuado con una o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se dese, seguido por esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando al menos un aptamero de la IL-6 en un vehlculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y otro ingrediente deseado. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos ejemplares de preparacion incluyen el secado al vaclo y el secado por congelacion, los cuales daran lugar a un polvo del aptamero de la IL-6 mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solucion esterilizada por filtracion del mismo.

Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehlculo comestible. Se pueden incluir, por ejemplo, en capsulas de gelatina, o comprimirse en comprimidos. Para el fin de la administracion terapeutica oral, el aptamero de la IL-6 se puede incorporar con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos, o capsulas. Las composiciones orales se pueden preparar tambien utilizando un vehlculo fluido para su uso como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehlculo fluido se aplica oralmente y se hacen enjuagues y se expulsa o se traga. Se pueden incluir agentes de union farmaceuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes como parte de la composicion.

Para la administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en forma de u pulverizador en aerosol a partir de un envase o suministrador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como el dioxido de carbono, un llquido nebulizado, o un polvo seco a partir de un dispositivo adecuado. Para la administracion transmucosa o transdermica se utilizan en la formulacion penetrantes apropiados a la barrera que se va a penetrar. Dichos penetrantes se conocen en general en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, para la administracion transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del acido fusldico. La administracion transmucosa se puede conseguir mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los principios activos se formulan en unguentos, pomadas, geles, o cremas como se conoce en general en la tecnica. Los reactivos se pueden preparar tambien en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para el suministro rectal.

Un aptamero de la IL-6 se puede preparar con un vehlculo que lo proteja de la rapida elimination del cuerpo. Por ejemplo, se puede utilizar una formulacion de liberation controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulado. Se pueden pollmeros biodegradables biocompatibles que utilizar tales como acetato de etileno vinilo, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Los metodos para la preparacion de dichas formulaciones seran evidentes para los expertos en la tecnica. Los materiales tambien se pueden obtener en el comercio en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc.

Tambien se pueden utilizar suspensiones liposomicas (incluyendo los liposomas dirigidos a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales contra antlgenos vlricos) como vehlculos farmaceuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con los metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo, como se describen el a Pat de EE. UU. N.° 4.522.811.

Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones del aptamero de la IL-6 como suspensiones inyectables oleosas. Los disolventes o vehlculos lipofilos adecuados incluyen, aceites grasos, tales como aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos, tales como oleato de etilo, trigliceridos o liposomas. Tambien se pueden utilizar para el suministro, pollmeros amino policationicos no lipldicos. Opcionalmente, la suspension puede incluir tambien estabilizantes o agentes para aumentar la solubilidad de los compuestos y permitan la preparacion de soluciones altamente concentradas.

En algunos casos, puede ser especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificacion unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de dosificacion. La forma de dosificacion unitaria como se utiliza en el presente documento se refiere a unidades separadas flsicamente adecuas para dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un aptamero de la IL-6 calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehlculo farmaceutico necesario. La especificacion para las formas de dosificacion unitaria de los aptameros descritos en el presente documento esta dictada por, y es dependiente directamente de, las caracterlsticas del aptamero de la IL-6 en particular y el efecto terapeutico particular que se va a conseguir, y las limitaciones inherentes en la tecnica de la composition de dicho agente activo para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden al menos un aptamero de lL-6 pueden incluir uno o mas excipientes farmaceuticos. Ejemplos de dichos excipientes incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes, agentes de carga, agentes lubricantes, agentes suspensores, edulcorantes, agentes saborizantes, conservantes, tampones, agentes humectantes, desintegrantes, agentes efervescentes y otros excipientes. Dichos excipientes se conocen en la tecnica. Los excipientes ejemplares incluyen: (1) agentes aglutinantes que incluyen distintas celulosas y polivinilpirrolidona reticulada, celulosa microcristalina tales como Avicel® PH101 y Avicel® PH102, celulosa microcristalina silificada (ProSolv SMCC™), goma de tragacanto y gelatina; (2) agentes de carga tales como distintos almidones, lactosa, lactosa monohidrato y lactosa anhidra; (3) agentes desintegrantes tales como acido alglnico, Primogel, almidon de malz, polivinilpirrolidona ligeramente reticulada, almidon de patata, almidon de malz, y almidones modificados, croscarmelosa sodica, povidona reticulada, glicolato de almidon sodico, y mezclas del os mismos; (4) lubricantes, que incluyen agentes que actuan sobre la fluidez de un polvo que se va a comprimir, incluyendo estearato magnesico, dioxido coloidal de silicio, tal como Aerosil® 200, talco, acido estearico, estearato calcico, y gel de sllice; (5) agentes de deslizamiento tales como el dioxido coloidal de silicio; (6) conservantes, tales como el sorbato potasico, metilparabeno, alcoholes tales como alcohol etllico o bencllico, compuestos fenolicos tales como el fenol, o compuestos cuaternarios tales como el cloruro de benzalconio; (7) diluyentes tales como las cargas inertes farmaceuticamente aceptables, tales como celulosa microcristalina, lactosa, fosfato dibasico de calcio, fosfato calcico, sacaridos y/o mezcla de cualquiera de los anteriores; ejemplos de diluyentes incluyen la celulosa microcristalina tal como Avicel® PH1I01 y Avicel® PH102; lactosa tal como lactosa monohidrato, lactosa anhidra y Pharmatose® DCL21; fosfato dibasico de calcio tal como Emcompress®; manitol, almidon; sorbitol; sacarosa; y glucosa; (8) agentes edulcorantes, que incluyen cualquier edulcorante natural o artificial, tal como sacarosa, sacarina, sacarosa, xilitol, sacarina sodica, ciclamato, aspartamo, y acesulfamo; (9) agentes saborizantes, tales como menta, salicilato de metilo, saborizante de naranja, Magnasweet® (marca registrada de MAFCO), sabor a chicle, sabores de fruta, y similares; y (10) agentes efervescentes, que incluyen parejas efervescentes tales como un acido organico y un carbonato o bicarbonato. Los acidos organicos adecuados incluyen, por ejemplo, acido cltrico, tartarico, malico, fumarico, adlpico, succlnico y alglnico y los anhldridos y sales acidas. Los carbonatos y bicarbonatos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato sodico, bicarbonato sodico, carbonato potasico, bicarbonato potasico, carbonato magnesico, carbonato sodico glicina, carbonato de L-lisina, y carbonato de arginina. De manera alternativa, solamente puede estar presente el componente carbonato de la pareja efervescente.

Las formulaciones descritas en el presente documento pueden ser sustancialmente puras. Como se utiliza en el presente documento, “sustancialmente puras” significa que el principio activo (por ejemplo, un aptamero de la IL-6) es la especie presente predominante (es decir con una ase molar es mas abundante que cualquier otra especie individual de la composicion). Una fraccion sustancialmente purificada es una composicion en la que el principio activo comprende al menos aproximadamente un 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En general una composicion sustancialmente pura incluira mas de aproximadamente el 80 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion. Una composicion sustancialmente pura puede incluir al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 99 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion. El principio activo puede estar purificado hasta la homogeneidad (no se pueden detectar especies contaminantes en la composicion por metodos de deteccion convencionales) en la que la composicion consiste esencialmente en una unica especie macromolecular.

Kits que comprenden aptameros

La presente divulgacion proporciona kits que comprenden cualquiera de los aptameros de la IL-6 descritos en el presente documento. Dichos kits pueden comprender, por ejemplo, (1) al menos un aptamero de la IL-6; y (2) al menos un vehlculo farmaceuticamente aceptable, tal como un disolvente o solucion. Los componentes adicionales del kit pueden incluir opcionalmente, por ejemplo: (1) cualquiera de los excipientes farmaceuticamente aceptables identificados en el presente documento, tales como estabilizantes, tampones, etc., (2) al menos un envase, vial o aparato similar, para mantener y/o mezclar los componentes del kit; y (3) un aparato de suministro. Los componentes del kit pueden incluir opcionalmente, por ejemplo, (1) agentes marcadores que se pueden utilizar para detectar una molecula diana que se une al aptamero, tales como una molecula fluorescente, colorantes, etc.; (2) un soporte solido tal como una micromatriz, una perla, etc., y (3) reactivos relacionados con la cuantificacion de productos de reaccion en cadena de la polimerasa, tales como agentes fluorescentes intercaladores o sondas de ADN fluorescentes, etc.

Metodos de tratamiento

La presente divulgacion proporciona metodos de prevention o tratamiento (por ejemplo, que alivian uno o mas slntomas de) afecciones medicas mediante el uso de un aptamero de la IL-6. Los metodos comprenden la administration de una cantidad terapeuticamente eficaz de un aptamero de la IL-6 a un sujetito que necesita el mismo. Los aptameros descritos tambien se pueden utilizar para la terapia profilactica. En algunos metodos el aptamero de la il-6 se administra por via intraperitoneal. En algunos metodos el aptamero de la IL-6 se administra por via oral o intravenosa.

El aptamero de la IL-6 que se utiliza en los metodos de tratamiento puede ser; (1) un aptamero de la IL-6 descrito en el presente documento, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, o un profarmaco del mismo.

El individuo o sujeto puede ser cualquier animal (domestico, de granja o silvestre), que incluye, pero no se limita a, gatos, perros, caballos, cerdos y ganado bovino, y preferentemente a sujetos humanos. Como se utiliza en el presente documento, los terminos: paciente, individuo, y sujeto se pueden utilizar de manera intercambiable.

Como se utiliza en el presente documento, “tratamiento” describe el manejo y cuidado de un paciente con el fin de tratar una enfermedad, afeccion, o trastorno e incluye la administracion de un aptamero de la IL-6 para evitar el inicio de los slntomas o complicaciones de una enfermedad, afeccion o trastorno; para aliviar los slntomas o complicaciones de la enfermedad, afeccion o trastorno, o para eliminar la presencia de la enfermedad, afeccion o trastorno en el paciente. Mas especlficamente, “tratamiento” incluyen la inversion, atenuacion, alivio, minimizacion, supresion o deteccion de al menos un slntoma o efecto perjudicial de un estado de enfermedad (trastorno), progresion de la enfermedad, el agente causal de la enfermedad u otra afeccion anormal. El tratamiento se continua en general a condicion de que los slntomas y/o la patologla mejoren.

Las composiciones y metodos desvelados se pueden utilizar para prevenir, tratar, y/o mejorar enfermedades inflamatorias, enfermedades malignas, infecciones, enfermedades autoinmunitarias, y/u otras enfermedades o afecciones en las que este implicada la IL-6. Las enfermedades inflamatorias ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen artritis reumatoide, artritis idiopatica juvenil, artritis idiopatica sistemica de aparicion juvenil, osteoartritis, sepsis, asma, enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis sistemica, inflamacion intraocular, enfermedad de Graves, endometriosis, esclerosis sistemica, enfermedad de Still de aparicion en el adulto, amiloidosis de amiloide A, polimialgia reumatica, sinovitis simetrica seronegativa remitente con edema con fovea, enfermedad de Behcet, uveitis, enfermedad del injerto contra el huesped, y slndrome periodico asociado a TNFR. Las enfermedades malignas que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen canceres y afecciones relacionadas con el cancer. Los canceres ejemplares no limitantes incluyen mieloma multiple, leucemia, cancer pancreatico, cancer de mama, cancer colorrectal, caquexia, melanoma, cancer de cuello de utero, cancer ovarico, linfoma, gastrointestinal, cancer de pulmon, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, cancer de rinon metastatico, tumores solidos, carcinoma pulmonar de celulas no pequenas, linfoma no Hodgkin, cancer de vejiga, cancer oral, neoplasia mieloproliferativa, enfermedad linfoproliferativa de celulas B, y leucemia de celulas plasmaticas. Afecciones relacionadas con el cancer ejemplares no limitantes incluyen fatiga relacionada con el cancer de pulmon de celulas no pequenas y anorexia relacionada con el cancer. Las infecciones ejemplares no limitantes que pueden tratarse con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus linfotropico T humano (HTLV), malaria cerebral, infecciones del tracto urinario, e infecciones meningococicas. Las enfermedades autoinmunitarias ejemplares no limitantes que se pueden tratar con los aptameros de IL-6 descritos en el presente documento incluyen lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, polimiositis, slndrome de vasculitis incluyendo arteritis de celulas gigantes, arteritis de Takayasu, crioglobulinemia, glomerulonefritis semilunar asociada con anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilosmieloperoxidasa, vasculitis reumatoide, enfermedad de Crohn, policondritis recidivante, hemofilia A adquirida, y anemia hemolltica autoinmunitaria. Enfermedades adicionales que se pueden tratar con los aptameros de la IL-6 descritos en el presente documento incluyen pero no se limitan a, enfermedad de Castleman, espondilitis anquilosante, enfermedad cardlaca coronaria, enfermedad cardiovascular en artritis reumatoide, hipertension arterial pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva cronica (COPD), dermatitis atopica, psoriasis, ciatica, diabetes tipo II, obesidad, arteritis de celulas gigantes, enfermedad del injerto contra el huesped aguda (GVHD), infarto de miocardico sin elevacion de ST, vasculitis asociada a anticuerpos anti-citoplasmaticos de neutrofilos (ANCA), neuromielitis optica, glomerulonefritis cronica, y arteritis de Takayasu.

Los compuestos desvelados o las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos, o profarmacos se pueden administrar en combinacion con otros agentes activos. Las composiciones que incluyen los aptameros de la IL-6 pueden contener, por ejemplo, mas de un aptamero. Una composition que contiene uno o mas de los aptameros de la IL-6 se puede administrar en combinacion con uno o mas agentes adicionales para prevenir, tratar y/o mejorar las enfermedades inflamatorias, enfermedades malignas, infecciones, enfermedades autoinmunitarias y/u otras enfermedades o afecciones en las que este implicada la IL-6. Los agentes activos adicionales ejemplares no limitantes incluyen inhibidores del TNF-a, inhibidores de la IL-1, inhibidores de la IL-23, inhibidores del IFN-y, inhibidores de la IL-17, inhibidores de la IL-22, inhibidores de la IL-4/IL-13, inhibidores de la IL-13, inhibidores de la IL-5, e inhibidores de la JAK. Los inhibidores ejemplares no limitantes del TNF-a incluyen infliximab, adalimumab, golimumab, etanercept, certolizumab, AN0128 (Anacor), ART621 (Arena Therapeutics), y un nanocuerpo anti-TNF-a (tal como ATN-103, Pfizer). Los inhibidores de la IL-1 ejemplares no limitantes incluyen anakinra, canakinumab, XOMA052 (Xoma), y rilonacept. Los inhibidores de la IL-23 ejemplares no limitantes incluyen uztekinumab, briakinumab, apilimod. Un inhibidor del IFN-^y ejemplar no limitante es el AMG811 (Amgen). Los inhibidores de la IL-17 ejemplares no limitantes incluyen AIN457 (Novartis), ixekizumab, AMG827 (Amgen), y Rg4934 (Roche). Un inhibidor de la IL-22 es el fezakinumab. Los inhibidores de la IL-4/IL-13 ejemplares no limitantes incluyen AMG317 (Amgen), pitrakinra, Nuvance, y AIR645 (Altair). Los inhibidores de la IL-13 ejemplares no limitantes incluyen anrukinzumab, lebrikizumab, cAT-354 (Medimmune), y IMA-026 (Wyeth). Un inhibidor de la IL-5 ejemplar no limitante es mepolizumab. Los inhibidores de la JAK ejemplares no limitantes incluyen tofacitib y ruxolitinib.

En general, las formas de dosificacion disponibles actualmente de los agentes terapeuticos para su uso en dichas combinaciones seran adecuadas.

“Terapia de combinacion” (o “co-terapia”) incluye la administration de una composicion de aptamero de la IL-6 y al menos un segundo agente como parte de un regimen de tratamiento especlfico con la intention de proporcionar un efecto beneficioso por la co-accion de estos agentes terapeuticos. El efecto beneficioso de la combinacion incluye, pero no se limita a, co-accion farmacocinetica o farmacodinamica que resulta de la combinacion de los agentes terapeuticos. La administracion de estos agentes terapeuticos en combinacion normalmente se lleva a cabo durante un periodo de tiempo definido (habitualmente minutos, horas, dlas o semanas dependiendo de la combinacion seleccionada).

La “terapia de combinacion” puede, pero generalmente no, tener la intencion de englobar la administracion de dos o mas de estos agentes terapeuticos como parte de reglmenes de monoterapia separados que incidentalmente y arbitrariamente da como resultado las combinaciones de la presente divulgacion. La “terapia de combinacion” tiene la intencion de abarcar la administracion de estos agentes terapeuticos de una manera secuencial, es decir, en los que cada agente terapeutico se administra en un momento diferente, as! como la administracion de estos agentes terapeuticos o al menos dos de los agentes terapeuticos, de una manera sustancialmente simultanea. La administracion sustancialmente simultanea se puede conseguir, por ejemplo, administrando al sujeto una unica dosis que tiene una relacion fija de cada agente terapeutico o en multiples dosis unicas para cada uno de los agentes terapeuticos.

El regimen de dosificacion que utiliza los aptameros de la IL-6 se selecciona de acuerdo con varios factores, incluyendo, por ejemplo, el tipo, especie, edad, peso, sexo y afeccion medica del sujeto, la gravedad de la afeccion que se va a tratar; la via de administracion; la funcion renal y hepatica del sujeto; y el aptamero particular o las sales del mismo que se empleen Un medico o veterinario experto puede determinar facilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composicion necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afeccion.

En general, la dosificacion, es decir la cantidad terapeuticamente eficaz, varla desde aproximadamente 1 ng/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal, o de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del sujeto que se va a tratar, por dla.

Metodos de diagnostico o deteccion

Los aptameros capaces de unirse a la IL-6, descritos en el presente documento, se pueden utilizar como reactivos de diagnostico, sea in vitro o in vivo. Los aptameros de la IL-6 y los identificados en el presente documento se pueden utilizar en cualquier tecnica o procedimiento o ensayo de diagnostico, deteccion, creacion de imagenes, exploracion de alto rendimiento o de validacion de diana para los cuales se pueden utilizar, sin limitacion los aptameros, oligonucleotidos, anticuerpos y ligandos. Por ejemplo, los aptameros de la IL-6 y los identificados en el presente documento se pueden utilizar de acuerdo con los metodos descritos en detalle en la Patente de EE. UU.

7.855.054, titulada "Multiplexed Analyses of Test Samples".

Los aptameros capaces de unirse a la IL-6, descritos en el presente documento, se pueden utilizar en varios ensayos que incluyen, ensayos que utilizan matrices planas, perlas u otros tipos de soportes solidos. Los ensayos pueden utilizarse en varios contextos incluyendo en aplicaciones de investigacion de ciencias naturales, aplicaciones de diagnostico cllnico, (por ejemplo, en un ensayo diagnostico de una enfermedad, o un ensayo de “bienestar” en salud preventiva); los ensayos ALONA y UPS, y aplicaciones de creacion de imagenes in vivo. Para algunas aplicaciones se pueden utilizar ensayos multiples que emplean los aptameros de la IL-6 descritos.

Los aptameros de la IL-6 se pueden utilizar como reactivos muy sensibles y especlficos para la incorporacion en varios metodos y kits de diagnostico in vitro. Los aptameros de la IL-6 se pueden utilizar como sustitutos de anticuerpos en varios metodos de deteccion de enfermedad infecciosa, o de otro tipo en los que el aptamero de la IL-6 incluye cualquiera o ambos de un material detectable y un componente de inmovilizacion o captura. Despues de que se mezcla el aptamero del kit con un especimen cllnico, se pueden utilizar varios formatos de ensayo. El aptamero puede incluir un marcador detectable, tal como un fluoroforo. El formato de ensayo puede incluir un interruptor de fluorescencia, metodos de hibridacion, citometrla de flujo, espectrometrla de masa<s, metodos de inhibition o competition. Ensayos de oligonucleotidos ligados a enzimas, SPR, metodos de onda evanescente, etc. El aptamero se puede proporcionar en el kit en solution. El aptamero del kit puede estar inmovilizado en un soporte solido que se utiliza en conjuncion con el ensayo para ensayar el especimen. El soporte solido se puede disenar para la deteccion de una o mas dianas de internes. En otros metodos, el kit puede incluir adicionalmente reactivos para extraer la diana de interes, los reactivos para la amplification del aptamero, los reactivos para llevar a cabo el lavado, reactivos de deteccion, etc.

Tambien se proporcionan dispositivos de diagnostico o ensayo, por ejemplo, columnas, tiras de ensayo, biochips, que tienen uno o mas aptameros de la IL-6 adheridos a una superficie solida del dispositivo. Los aptameros se pueden posicionar de manera que sean capaces de unirse a las moleculas de IL-6 que se ponen en contacto con la superficie solida para formar complejos aptamero-diana que se mantienen adheridos a la superficie del dispositivo, capturando de esta manera la diana y haciendo posible la deteccion y cuantificacion opcional de la diana. Se puede proporcionar una matriz de aptameros (que pueden ser el mismo o diferentes) en dicho dispositivo.

Un metodo para la deteccion de la IL-6, un complejo de afinidad del aptamero o un complejo con el aptamero covalente se pone en contacto con un agente marcador que incluye una pareja de union que es especlfica de la IL-6. La pareja de union puede ser cualquier resto adecuado, incluyendo un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo sintetico mimetico, un biomimetico, un aptamero, un ligando molecular sensibilizado, y similares. La pareja de union especlfica ese conjuga o une a otro componente del agente marcador, habitualmente un resto detectable o un marcador. En un metodo para la deteccion de la IL-6, se pone en contacto un complejo de afinidad de aptamero o un complejo covalente de aptamero con un agente marcador que sea capaz de marcar la IL-6, sin una pareja de union, y comprende un resto detectable o marcador.

El resto detectable o marcador es capaz de detectarse directa o indirectamente. En general, cualquier molecula indicadora que sea detectable puede ser un marcador. Los marcadores incluyen, por ejemplo, (i) moleculas indicadoras que se pueden detectar directamente gracias a la generation de una senal, (ii) los miembros de la pareja de union especlfica que pueden detectarse indirectamente por la posterior union con un equivalente que contienen una molecula indicadora, (iii) marcadores de masas detectables por espectrometrla de masas, (iv) oligonucleotidos cebadores que pueden proporcionar una matriz para la amplification o ligadura, Y (v) una secuencia de polinucleotidos especlfica o secuencia de reconocimiento que puede actuar como un ligando, tal como por ejemplo, una protelna represora, en la en los dos ultimos casos el oligonucleotido cebador o la protelna represora tendra o sera capaz de tener una molecula indicadora, y asl. La molecula indicadora puede ser un catalizador tal como un enzima, un polinucleotido que codifica un catalizador, un promotor, colorante, molecula fluorescente, punto cuantico, molecula quimioluminiscente, coenzima, sustrato enzimatico, grupo radioactivo, molecula organica pequena, secuencia de polinucleotido que se puede amplificar, una partlcula tal como de latex o partlcula de carbono, un sol metalico, cristalita, liposoma, celula, etc., que puede o no estar adicionalmente marcada con un colorante, catalizador u otro grupo detectable, un marcador de masa que al tera el peso de la molecula con la que se conjuga con fines de la espectrometrla de masas y similares. En un metodo, el marcador detectable es un colorante fluorescente. Otros marcadores y esquemas de marcado seran evidentes para los expertos en la tecnica basandose en la divulgation del presente documento.

En otro metodo, el complejo de afinidad de aptamero o el complejo covalente de aptamero se detecta y/o cuantifica utilizando una Q-PCR. Como se utiliza en el presente documento, “Q-PCR” se refiere a una reaction de PCR que se lleva a cabo de tal manera y en tales condiciones controladas que los resultados del ensayo son cuantitativos, es decir, el ensayo es capaz de cuantificar la cantidad o concentration de aptamero presente en la muestra de ensayo. En un metodo ejemplar para la detection y/o cuantificacion de IL-6 que puede estar presente en la muestra de ensayo, se pone en contacto una muestra con un aptamero de IL-6. Se permite que se forma un complejo que incluye un aptamero unido a IL-6. Si la muestra de ensayo contiene la IL-6, se formara normalmente un complejo de afinidad del aptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad del aptamero se convierte opcionalmente, utilizando un metodo apropiado para el aptamero que se utilice, en un complejo covalente de aptamero que incluye un aptamero unido covalentemente a la IL-6. Como se escribe adicionalmente en el presente documento, la formation siguiente de un complejo de afinidad de aptamero y cualquier conversion opcional a un complejo covalente de aptamero, cualquier aptamero libre que pueda seta presente en la muestra de ensayo se divide del complejo de afinidad del aptamero o el complejo covalente de aptamero. El complejo de afinidad del aptamero o el complejo covalente de aptamero se cuantifica entonces utilizando tecnicas conocidas para la replication cuantitativa de polinucleotidos.

En un metodo, la cantidad o concentracion del complejo de afinidad de aptamero o complejo covalente de aptamero en la muestra de ensayo se determina utilizando una PCR TaqMan®. Esta tecnica se basa en general en la actividad de la 5'-3' exonucleasa de la enzima replicadora de oligonucleotido para generar una senal de una secuencia dirigida. Se selecciona una sonda TaqMan basandose en la secuencia del aptamero que se va a cuantificar e incluye un fluor en el extremo 5', tal como un 6-carboxifluorescelna, por ejemplo, y un interruptor en el extremo 3 ', tal como, por ejemplo, una 6-carboxitetrametilfluorescelna, para generar una senal segun se amplifica la secuencia de aptamero utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Segun la polimerasa copia la secuencia de aptamero, la actividad de la exonucleasa libera el fluor de la sonda, que se hibrida corriente abajo a partir de los cebadores de PCR, generando de esta manera la senal. La senal aumenta segun se produce el producto de la replicacion. La cantidad de producto de la PCR depende tanto del numero de ciclos de replicacion llevados a cabo, asl como la concentracion de partida de aptamero.

En otro metodo, se determina la cantidad o concentracion de un complejo de afinidad de aptamero o complejo covalente de aptamero utilizando un colorante intercalador fluorescente durante el procedimiento de replicacion. El colorante intercalador, tal como, por ejemplo, SYBR® verde, genera una gran senal fluorescente en presencia de un ADN de doble cadena en comparacion con la senal fluorescente generada en presencia de un AD de cadena sencilla. Como el producto de A^d de doble cadena se forma durante la PC, la senal producida por el colorante aumenta. La magnitud de la senal producida es dependiente tanto del numero de ciclos de ^pC^r como de la concentracion de partida de aptamero.

En otro metodo, la cantidad o concentracion del complejo de afinidad de aptamero o complejo covalente de aptamero se determina utilizando una “baliza molecular” durante el procedimiento de replicacion (vease, por ejemplo, Tyagi et al, Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; Pat. de EE. UU. N.° 5.925.517). Una baliza molecular es una sonda de acido nucleico especlfica que se pliega en un bucle ahorquillado que contiene un fluor en un extremo y un interruptor en el otro extremo de la estructura en horquilla de manera que no se genera senal o muy poca por el fluor cuando se forma la horquilla. La secuencia de bucle es especlfica de una secuencia de polinucleotido diana y, al hibridarse con la secuencia de aptamero la horquilla se despliega y de esta manera se genera la senal fluorescente.

Ejemplos

Se proporcionan los siguientes ejemplos con fines solamente ilustrativos y no se pretende que limiten al alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas. Todos los ejemplos descritos en el presente documento se llevaron a cabo utilizando tecnicas convencionales, que son bien conocidas y de rutina para los expertos en la tecnica. Las tecnicas de biologla molecular de rutina que se descrinen en los siguientes ejemplos se pueden llevar a cabo como se describe en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

Ejemplo 1. Seleccion de aptameros y secuencias

A. Preparacion de mezclas de candidatos

Las mezclas candidatas aleatorizadas de oligonucleotidos de ssADN se prepararon por extension mediante polimerasa de un cebador de ADN hibridado a una matriz de ssADN como se muestra en la Tabla 1. Las mezclas candidatas contenlan un casete aleatorizado de 40 nucleotidos que contenla dATP, dGTP, dCTP y BndUTP (5-(N-bencilcarboxiamida-2'-deoxiuridina trifosfato) o NapdUTP (5-(N-naftilcarboxiamida-2'-deoxiuridina trifosfato).

Se combinaron 4 nmol de la Matriz 1 (SEQ ID NO: 1) que posee dos restos de biotina (denominados B' en la secuencia) y 40 posiciones aleatorizadas (denominadas N en la secuencia) y 4,8 nmol de Cebador 1 (SEQ ID NO: 2), que comprende un fluoroforo Cy3, en 100 pl 1X de tampon de polimerasa KOD DNA (Novagen), calentado a 95 °C durante 8 minutos, y enfriado en hielo. Se anadieron los 100 pl de mezcla cebador:matriz a una reaccion de extension que contenla 400 pl de tampon 1X polimerasa KOD DNA, 0,125 U/pl de polimerasa KOD XL DNA, y 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y BndUTP o NapdUTP, y se incubo a 70 °C durante 30 minutos. El producto de doble cadena se capturo mediante las biotinas de la cadena de la matriz anadiendo 1 ml de perlas magneticas revestidas de estreptavidina (MagnaBind Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml en 3 M de NaCl que contiene un 0,05 % de TWEEN-20) e incubando a 25 °C durante 10 minutos con mezclado. Las perlas se lavaron tres veces con 0,75 ml de tampon SB17T (40 mM HEPES, pH 7,5, 102 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCh, 1 mM de EDTA, un 0,05 % TWE^e N-20). La cadena de aptamero se eluyo de las perlas con 1,2 ml de NaOH 20 mM, neutralizado con 0,3 ml de HCl 80 mM, y tamponado con 15 pl de 1 M de HEPES, pH 7,5. Las mezclas de candidatos se concentraron con Centricon-30 hasta aproximadamente 0,2 ml, y se cuantifico por espectroscopia de absorbancia

UV.

B. Preparacion de la protefna diana

Se biotinilo una IL-6 humana no marcada (R&D Systems) por acoplamiento covalente de NHS-PE04-biotin (Pierce) a restos de lisina. La proteina (300 pmol en 50 pl) se intercambiaron en SB17T con una columna Sephadex microspin G-25. Se añadió NHS-PE04-biotin hasta 1,5 mM y la reaccion se incubo a 4 °C durante 16 horas. La NHS-PE04-biotin que no reacciono se retiro con una columna Sephadex micospin G-25.

C. Inmovilizacion de la protefna diana

La proteina diana se inmovilizo en perlas paramagneticas MyOne-SA (MyOne SA, Invitrogen, o a las que se hace referencia de aqui en adelante como perlas SA) para la Ronda 1 de SELEx . Se diluyo la IL-6 a 0,2 mg/ml en 0,5 ml de SB17T y se anadieron a 0,5 ml de perlas SA (prelavados dos veces con 20 mM de NaOH y una vez con SB17T). La mezcla se roto durante 30 minutos a 25 °C y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

D. Seleccion de aptameros con un Procedimiento de enriquecimiento de disociacion lenta

Se llevaron a cabo las selecciones con la mezcla de candidatos, comparando la union entre las muestras con la proteina (senal S) y las muestras sin proteina diana (fondo B). Se completo un total de ocho rondas del procedimiento SELEX, con seleccion de afinidad y disociacion baja.

Para cada muestra, se preparo una mezcla de ADN de 90 pl en SB17T con 10-20 pmoles de la mezcla de candidatos (aproximadamente 100 pmoles en la primera ronda). Las muestras se calentaron a 95 °C durante 3 minutos y se enfriaron a 37 °C a una velocidad de 0,1 °C/segundo. Las muestras se combinaron con 10 pl de mezcla de proteina competidora (un 0,1 % de HSA, 10 pM de caseina y 10 pM de protrombina en SB17T), anadido a 0,5 mg de perlas SA y se incubo a 37 °C durante 5 minutos con mezclado. Las perlas se retiraron por separacion magnetica. Se llevaron reacciones de union anadiendo 10 pl de proteina diana (0,5 pM en SB17T) o SB17T a 40 pl de mezclas de ADN y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos antes de la captura de los complejos. En las rondas seis y siete, se diluyeron las muestras 20 veces anadiendo 950 pl de SB17T (precalentado a 37 °C). Se diluyeron 50 pl de cada muestra diluida de nuevo transfiriendola a 950 pl de SB17T (precalentado a 37 °C). para dar un total de 400 veces de dilucion, y se incubaron a 37 °C durante 60 minutos antes de capturar los complejos. En la ronda ocho, las muestras se diluyeron 20 veces anadiendo 950 pl de SB17T (precalentado a 37 °C). Se diluyeron de nuevo 50 pl de cada muestra diluida transfiriendola a 950 pl de SB17T que contenia 10 mM de sulfato de dextrano (5 kDa) (precalentado a 37 °C) para dar una dilucion total de 400 veces, y se incubo a 37 °C durante 60 minutos antes de capturar los complejos.

Los complejos se capturaron en perlas SA mediante las biotinas proteicas anadiendo 0,25 mg de perlas MyOne-SA (Invitrogen) y se incubaron a 25 °C durante 15 minutos con mezclado. El ADN libre se retiro lavando las perlas cinco veces con SB17T. A menos de que se indique, todos los lavados se llevaron a cabo resuspendiendo las perlas en 100 pl de solucion de lavado, mezclando durante 30 segundos a 25 °C, separando las perlas con un iman, y retirando la solucion de lavado. La cadena de aptamero se eluyo de las perlas anadiendo 85 pl de NaOH 20 mM, e incubando a 37 °C durante 1 minuto con mezclado. Se transfirieron 80 pl de aptamero eluido a un nuevo tubo despues de la separacion magnetica, se neutralizo con 20 pl de HCl 80 mM, y se tampono con 1 pl de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5.

E. Amplificacion y purificacion de aptameros

El ADN del aptamero se amplifico y se cuantifico por QPCR. Se anadieron 48 pl de ADN a 12 pl de la mezcla de QPCR (5X de tampon de polimerasa KOD DNA, 25 mM de Mgcl2, 10 pM de cebador directo de PCR (Cebador 2, SEQ ID NO: 3), 10 pM de cebador inverso de PCR biotinilado (Cebador 2, SEQ ID NO: 3), 10 pM de cebador inverso de PCR biotinilado (Cebador 3, SEQ ID NO: 4), 5X de SYBR verde I, 0,125 U/pl de polimerasa KOD XL DNA, y 1 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP) y se ciclo termicamente en un instrumento Bio-Rad MylQ QPCR con el siguiente protocolo: 1 ciclo de 99,9 °C, 15 s, 55 °C, 10 s, 68 °C, 30 min, 30 ciclos de 99,9 °C, 15 segundos, 72 °C, 1 minuto. Se hizo la cuantificacion con el software del instrumento y el numero de copias de ADN seleccionadas, con y sin proteina diana, se comparo para determinar las relaciones de senal/fondo.

A continuacion de la amplificacion, se captura el producto de la PCR en perlas SA mediante la cadena antisentido biotinilada. Se lavaron 1,25 ml de perlas Sa (10 mg/ml) dos veces con 0,5 ml de NaOH 20 mM, una vez con 0,5 ml de SB17T, se resuspendieron en 1,25 ml de NaCl 3 M un 0,05 % de Tween y se almacenaron a 4 °C. Se anadieron 25 pl de perlas SA (10 mg/ml en NaCl 3 M) a 50 pl de los productos de la QPCR de doble cadena y se incubaron a 25 °C durante 5 minutos con mezclado. Las perlas se lavaron una vez con SB17T, y la cadena en “sentido” se eluyo de las perlas anadiendo 200 pl de NaOH 20 mM, y se incubo a 37 °C durante 1 minuto con mezclado. La cadena eluida se desecho y las perlas se lavaron 3 veces con SB17T y una vez con 16 mM NaCl. La cadena en sentido del aptamero se preparo con el dUTP modificado apropiado (BndUTP o NapdUTP) por extension de cebador a partir de la cadena antisentido inmovilizada. Las perlas se resuspendieron en 2q0 pl de mezcla de reaccion de extension del cebador (IX Primer Extension Buffer, 1,5 mM de MgCl2, 5 |jM de cebador directo (Cebador 1, SEQ ID NO: 2), 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y BndUTP o NapdUTP, y 0,125 U/jl de polimerasa KOD XL DNA) y se incubo a 68 °C durante 30 minutos con mezclado. Las perlas se lavaron 3 veces con SB17T, y la cadena del aptamero se eluyo de las perlas anadiendo 85 j l de NaOH 20 mM, e incubando a 37 °C durante 1 minuto con mezclado. Se transfirieron 80 j l del aptamero eluldo se transfirio a un nuevo tubo despues de la separacion magnetica, se neutralizo con 20 j l de 80 mM de HCl, y se tampono con 5 j l de HEPES 0,1 M, pH 7,5.

F. Seleccion de rigurosidad y retroalimentacion

La concentracion relativa de protelna diana de la etapa de seleccion disminula en cada ronda en respuesta a la relacion S/B de la siguiente manera, donde la senal S y el fondo B se definen en la Seccion D anterior:

Si S/B < 10, [PK,+1) = [P],

Si 10 < 10 S/B < 100, [P](,+1) = [P], / 3,2

Si S/B > 100, [P](,+1) = [P], / 10

donde [P] = concentracion proteica e i = numero de ronda actual.

Despues de cada ronda de seleccion, se determino el estado de convergencia de la mezcla de ADN enriquecida. Se diluyeron 10 j l del producto de QPCR de doble cadena en 200 j l con MgCh 4 mM que contenla IX S^y B^r Verde I. Las muestras se recubrieron con 75 j l de aceite de silicona y se analizo en cuanto a la convergencia utilizando un analisis de Cot que mide el tiempo de hibridacion para mezclas complejas de oligonucleotidos de doble cadena. Las muestras se ciclaron termicamente con el siguiente protocolo: 3 ciclos de 98 °C, 1 minuto, 85 °C, 1 minuto; 1 ciclo de 93 °C, 1 minuto, 85 °C, 15 minutos. Durante los 15 minutos a 85 °C se midieron las imagenes fluorescentes a intervalos de 5 segundos. La intensidad de fluorescencia se grafico como uncion del log (tiempo), y se observo un aumento de la velocidad de hibridacion con cada ronda de SELEX, indicando la convergencia de la secuencia.

G. Procedimiento de exploracion de clones e identificacion de aptameros

Despues de las ocho rondas de SELEX, los agrupamientos de convergencia se clonaron y secuenciaron. El ADN seleccionado se amplifico por PCR con cebadores de SELEX para crear AGCT ADN, se purifico utilizando un kit de purificacion de PCR QIAquick 96 (cat n° 28181), y las inserciones purificadas se clonaron utilizando el kit de clonacion PCR-Script de Stratagene (cat n° 21189) segun el protocolo del fabricante. Los agrupamientos SELEX ligados se enviaron al proveedor de secuenciacion (Cogenics, Houston, Texas) para la transformacion, la matriz en placas de 96 pocillos, preparacion de ADN y secuenciacion. Se obtuvieron ~42 secuencias de clones y se analizaron en cuanto a convergencia utilizando un software a medida que determina los recuentos/numero de copias e identifica los patrones de convergencia comun utilizando un algoritmo de alineamiento local. Se descubrio que 16 de los ~ 42 se unlan a la estreptavidina. De los clones restantes, las secuencias con mayor representacion/numero de copias en el agrupamiento y las secuencias que converglan a motivos de union comunes se escogieron para la caracterizacion posterior. Se escogieron dos secuencias (una de Bn-dU y una de Nap-dU) para analisis posteriores y se prepararon enzimaticamente utilizando un ADN plasmldico obtenido en Cogenics como matriz para la amplificacion por PCR.

H. Medicion de la constante de union en equilibrio (Kd)

Las constantes de union en equilibrio de las secuencias escogidas se midieron en un ensayo de afinidad. Se calento el ADN radiomarcado durante 3 minutos a 95 °C en tampon SB17T- 0,002 (40 mM de HEPES, pH 7,5, 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, un 0,002 % de T^w E^e N-20) y se enfrio lentamente hasta 37 °C. Los complejos se formaron mezclando una baja concentracion de ADN radiomarcado (~ 1 x 10"11 M) con un intervalo de concentraciones de protelna diana (1 x 107 M a 1 x 10"12 M) en tampon SB17T-0.002, y se incubo a 37 °C durante 30 minutos. Una parte de cada reaccion se transfirio a una membrana de nilon y se seco para determinar el recuento total de cada reaccion. Los complejos se capturaron en resina ZORBAX (Agilent), se pasaron a traves de una Placa HV Multiscreen (Millipore) al vaclo, y se lavo con 200 j l de tampon SB17T-0.002 para separar los complejos de protelna unida del ADN no unido. Se creo la fosforimagen de membrana de nilon y la placa HV Multiscreen y la cantidad de radioactividad de cada muestra se cuantifico utilizando un FUJI FLA-3000. La fraccion de ADN capturada se grafico en funcion a la concentracion de protelna (Pt) y se determinaron las constantes de union en equilibrio utilizando y = (max-mln) (Pt) / (Kd) min. Las secuencias de los dos SOMAmeros seleccionados y sus afinidades de union por la IL-6 se enumeran en la Tabla 2.

T l 2. MAm r E m l r Bn- N -

Ejemplo 2. Ensayos de actividad antagonista basado en celulas

Se exploraron los aptameros de la IL-6 en cuanto a la inhibicion de la actividad de la IL-6 en ensayos basados en celulas.

A. Ensayo de proliferacion celular

La IL-6 induce la proliferacion de celulas TF-1 eritroleucemicas humanas. Las celulas TF-1 se suspendieron en medio RPMI 1640 que contenla un 10 % de FGS a 1 x 104 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 1 dla a 27 °C en una incubadora con un 5 % de CO2. La IL-6 (0 o 10 ng/ml) se incubo con o sin aptameros de la IL-6 (2 |jM) en agua o tampon SB18T durante 30 minutos a 37 °C y se aplico a las celulas en un medio RPMI 1640 que contenla un 0,5 % de FBS. Despues de 5 dlas a 37 °C. Se midio la fluorescencia (excitacion a 560 nm, emision a 590 nm) con un luminometro (Wallac 1420 ARVO Light, Perkin Elmer). Los resultados se muestran en la Figura 1, en la que cada barra representa la media desviacion tlpica de cuatro experimentos normalizados al control no-SOMAmero. Ambos Bn-dU 2573-20 (SEQ ID NO: 7) y Nap-dU 2574-49 (SEQ ID NO: 8) inhiblan la IL-6 inducla la proliferacion de celulas TF-1 al nivel del control sin induccion de IL-6.

B. Ensayo de gen indicador

La IL-6 da senales a traves de la transcripcion del factor STAT3. Las celulas L4 y las celulas HeLa transfectadas con un gen de luciferasa bajo el control de STAT expresan luciferasa con la induccion de IL-6, generando una senal luminiscente. Las celulas L4 se colocaron en placas en DMEM que contenla un 10 % de FBS a 5 x 104 celulas por pocillo en una placa blanca de 96 pocillos (Costar, n° 3903) y se cultivo durante un dla a 37 °C en una incubadora con CO2. La il-6 (10 ng/ml) se incubo con o sin aptameros de IL-6 (10 ^j M) en agua o SB18T durante 30 minutos a 37 °C y se aplico a las celulas en DMEM libre de fenol que contenla un 0,5 % de FBS. Despues de 5 h a 37 °C en una incubadora con CO2, el medio se desecho y se el reactivo de sustrato a dñead luióciferasa (Perkin Elmer n° 6016769) a las celulas durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se midio la luminiscencia con SpectraMax Plus (Molecular Devices). Los resultados se muestran en la Figura 2, en la que cada barra representa la media de tres experimentos, se normalizaron con el SOMAmero de control. Estos resultados son consistentes con el ensayo de proliferacion. El Bn-dU 2573-20 (SEQ ID NO: 7) y Nap-dU 2574-49 (SEQ ID NO: 8) inhiblan la expresion de luciferasa mediada por IL-6.

Ejemplo 3. Estudios de truncado de secuencias

El SOMAmero de IL-62573 (SEQ ID NO: 7) tiene 78 nucleotidos de longitud con modificaciones Bn-dU y una Kd = 3 x 10-9 M. Los truncados de 2573 (SEQ ID NO: 7) se generaron para determinar se secuencias mas cortas mantendrlan una union con IL-6 eficaz. En algunos casos, los aptameros mas cortos presentan un aumento de penetracion tisular y/o estabilidad contra la actividad nucleasa in vivo. Los aptameros mas cortos tambien pueden reducir los costes de fabricacion.

Se sintetizo una serie de variantes truncadas de 2573-20 (SEQ ID NO: 7) con una o mas eliminaciones en el extremo 5' y/o 3'. Las secuencias de ciertos aptameros truncados se enumeran en la Tabla 3. Z representa Bn-dU. Los aptameros truncados se ensayaron en cuanto a la afinidad de union con IL-6 en el ensayo de afinidad de union como se ha descrito anteriormente.

Tabla 3. Secuencias valores de afinidad Kd del SOMAmero 2573-20 SEQ ID NO: 7 variantes truncadas

La variante 2573-203 (SEQ ID NO: 11) mantenla la actividad de union por la IL-6, sugiriendo que los 21 nucleotidos del extremo 5' (posiciones 1-21 de 2573-20 (SEQ ID NO: 7)) no son necesarios para la union a IL-6. De manera similar, la variante 2573-2015 (SEQ ID NO: 22) mantenla la union a IL-6, sugiriendo que los 25 nucleotidos del extremo 3' (posiciones 54-78 de 2573-20 (SEQ ID NO: 7)) no se necesitan para la union con IL-6. La variante 2573­ 2015 (SEQ ID NO: 22) se escogieron para una caracterizacion posterior.

El SOMAmero 2574-49 (SEQ ID NO: 8) de la IL-6 tiene 79 nucleotidos de longitud con modificaciones de Nap-dU y una Kd = 2 x 10-9 M. El truncado de 2574-49 (SEQ ID NO: 8) se genero para determinar si secuencias mas cortas mantendrlan una union a la IL-6 eficaz. Las secuencias de ciertas variantes se muestran en la Tabla 4. P representa Nap-dU.

Tabla 4. Secuencias valores de afinidad Kd de variantes truncadas del SOMAmero 2574-49

El 2574-49_14 (SEQ ID NO: 35) mantenla la actividad de union a IL-6, sugiriendo que al menos los 30 nucleotidos del extremo 3 (nucleotidos 50 a 79) de 2574-49 (SEQ ID NO: 8) no son necesarios para la union con IL-6. El 2574­ 4918 (SEQ ID NO: 39) mantenla la actividad de union con IL-6 (aunque reducida ~ 10 veces), sugiriendo que los 23 nucleotidos del extremo 3' (nucleotidos 1 a 23) de 2574-49 (SEQ ID NO: 8) no son necesarios para la union con la IL-6. La variante truncada 2574-4914 (SEQ ID NO: 35) se escogio para una caracterizacion adicional.

Ejemplo 4. Secuenciacion profunda de agrupamientos SELEX

Para evaluar mas completamente las secuencias de las familias 2573-20 y 2574-49 de SOMAmeros, se secuenciaron los agrupamientos enriquecidos utilizando tecnologla de pirosecuenciacion 454. Para cada agrupamiento, se amplifico el ADN con cebadores 454 como se ha descrito anteriormente y se purifico el producto de la PCR y se normalizo utilizando la placa de normalization SequalPrep (Invitrogen, cat n° 0510-01). El eluldo se ejecuto en un gel para confirmar el tamano y pureza de cada amplicon. El producto de la PCR purificado se secuencio en unas instalaciones de pirosecuenciacion 454 en el University of Colorado Health Science Center en Aurora CO.

Ejemplo 5. Modificacion del SOMAmero BndU 2573-20_15 (SEQ ID NO: 22)

A. Sustituciones unicas con modificaciones de U alternativas

En algunos casos, las modificaciones de U hace posible que los aptameros de la IL-6 se impliquen en interacciones favorables con aminoacidos aromaticos y bolsillos de union hidrofobos en la IL-6. El aptamero 2573-20_15 (SEQ ID NO: 22) se modifico en distintas posiciones de Bn-dU utilizando una biblioteca de analogos con diferentes grupos terminales y longitudes de enlazador. Vease la Figura 3. Un enlazador mas largo puede permitir una libertad rotacional adicional y un mejor acceso a las regiones hidrofobas por debajo de la superficie de la protelna.

Se evaluo el efecto de una sustitucion unica de Bn-dU con feniletil-dU (PE-dU), fenilpropil-dU (PP-dU), o naftilmetildU (Nap-dU) sobre la afinidad de union. Los resultados se muestran en la Figura 4. Aunque no se observaron mejoras significativas en la afinidad, la Pe-dU se toleraba bien en todas las posiciones Bn-dU excepto en la 8 y 14, PP-dU se toleraba en las posiciones 22, 27, y 30, y Nap-dU se toleraba en las posiciones 7, 9 y 12, donde se observo una ligera mejora de la afinidad.

B. Sustituciones unicas con modificaciones 2'-O-metil

La DNasa I, la nucleasa predominante en el plasma, puede hidrolizar el armazon fosfodiester del ADN de una manera independiente de la secuencia. Las modificaciones en la position 2' de la ribosa o los oxlgenos que no puentean proporcionan una resistencia a la escision por nucleasas de la DNasa I. Se alcanzaron aumentos significativos de estabilidad frente a nucleasas y tiempo de residencia en el plasma con modificaciones 2'-F, 2'-O-metil, y fosforotioato en aptameros de ARN. Se evaluo la tolerancia de una sustitucion 2'-O-metil en cada posicion dA, dG, y dC de 2573-20_15 (SEQ ID NO: 22).

Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 5. Una modificacion con 2'-O-metil era bien tolerada en las posiciones dC3, dG6, dA16-dC20, y dC28, causando incluso una mejora de afinidad en las posiciones dC3, dG6 y dC28.

C. Sustituciones unicas con modificaciones de un espaciador C3

Una sustitucion con un espaciador C3, comprendido por un espaciador de tres carbonos disenado para abarcar la misma distancia que un nucleotido pero que carece de un azucar ribosa o base, proporciona una resistencia a la DNasa I, y tambien se puede utilizar para probar interacciones de bases nucleotldicas en cada posicion, sobre todo como un barrido de alanina en las protelnas. Se evaluo la tolerancia de una sustitucion con un espaciador C3 en cada posicion dA, dG, y dC de 2573-20_15 (SEQ ID NO: 22).

Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 5. La modificacion con un espaciador C3 se toleraba en las posiciones dC18-dG21 y dC28. Esta misma region se mantenla relativamente sin afectar por la modificacion con 2'-O-metil, sugiriendo que esta region puede no estar implicada en contactos proteicos significativos.

D. Multiples sustituciones de modificaciones toleradas

Basandose en las actividades de union e inhibition de ciertas variantes con sustituciones 2'-O-metil y un espaciador C3, se produjo una serie de variantes combinando las sustituciones toleradas de 2'-O-metil y espaciador C3. Estas secuencias se ensayaron en cuanto a la actividad de union e inhibicion en un ensayo de gen indicador. La combinacion de seis sustituciones 2'-O-metil en las posiciones dC3, dG6, dA16, dA19, dC20 y dC28 de la variante 2573-20137 (SEQ ID NO: 573) mejoraba la afinidad de union 5 veces. Las sustituciones adicionales con 2'-O-metil o espaciador C3 daban como resultado una perdida de actividad de union en este experimento. Se descubrio tambien que la sustitucion de Bn-dU9 con PE-dU y Bn-dU12 con Nap-dU en la variante 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) daba como resultado una mejora en la actividad de inhibicion, aumentando la inhibicion maxima de la IL-6 en un ensayo de gen indicador cerca del 100 % con un valor de CI50 de 5 x 1010 M. Vease la Figura 6 (^2573-20_15 (SEQ ID NO: 22); o 2573-20137 (SEQ ID NO: 573); ▲ 2573-20_136 (SEQ ID NO: 101)). Una comparacion de las variantes 2573-20J37 (SEQ ID NO: 573) y 2573-20J36 (SEQ ID NO: 101), que son identicas experto en una posicion Nap-dU en la posicion de 2573-136 (Bn-dU en 2573-20J37 (SEQ ID NO: 573)), demostraba que la sustitucion Nap-dU en la posicion 12 daba como resultado una mejora en la inhibicion maxima.

Ejemplo 6. Modificacion NapdU del SOMAmero 2574-4914 (SEQ ID NO: 35)

El SOMAmero truncado NapdU 2574-4914 (SEQ ID NO: 35) se modifico utilizando las estrategias descritas en el Ejemplo 5. El aptamero 2574-49260 (SEQ ID NO: 400) es una variante de 2574-4914 (SEQ ID NO: 35) con tres modificaciones con un espaciador C3 (posiciones 1, 14 y 15) e inhibe la IL-6 con una potencia de aproximadamente 30 veces mayor que 2574-493 (SEQ ID NO: 26). Vease la Figura 7 (•2574-493 (SEQ ID NO: 26); o 2574-49260 (SEQ ID NO: 400)). La composition de 2574-49260 (SEQ ID NO: 400) se muestra en la Tabla 12, posteriormente.

Ejemplo 7. Evaluacion de la estabilidad del aptamero en el suero

Se evaluo el efecto de los truncados y modificaciones de la aptamero despues de SELEX sobre la sensibilidad a las nucleasas del suero exponiendo los aptameros a suero reciente y la cuantificacion de la extension de la hidrolisis del aptamero en funcion del tiempo por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) Se incluyeron variante del SOMAmero Bn-dU 2573-2015 (SEQ ID NO: 22) con todos los estos Bn-dU sustituidos con dT (2573-20J16 (SEQ ID NO: 300)), y una variante del SOMAmero Nap-dU 2574-4914 (SEQ ID NO: 35) con todos los restos Nap-dU sustituidos con dT (2574-49_456 (SEQ ID NO: 572)) en este estudio como controles para determinar el efecto de las posiciones dU modificadas sobe la estabilidad a la nucleasa. Todos los aptameros ensayados en este ensayo contenlan una dT invertida 3' para proteger el aptamero de la actividad exonucleasa en 3' a 5'.

Cada aptamero se diluyo hasta 0,5 |^jM en SB17T y se incubo con un 90 % de suero a 37 °C. Se extrajeron allcuotas en distintos momentos desde 0-48 horas, extraldas una vez con fenol y otra con cloroformo y se concentraron con un filtro de corte de peso molecular YM-10. Las muestras se analizaron mediante PAGE desnaturalizante utilizando un gen de 10 % de poliacrilamida/urea y se tino el aptamero con SYBR oro. Se crearon imagenes del ADN tenido con un Analizador de Imagenes Fluorescentes FLA-300 de FUJI y se cuantificaron utilizando del paquete de software ImageGauge para determinar la fraction de aptamero intacto en cada momento.

La exposition a suero humano al 90 % durante 48 horas a 37 °C tenia poco efecto sobre el SOMAmero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) (>95 % intacto), mientras que la variante dT de control 2573-20116 (SEQ ID NO: 300) se degrado casi completamente (<5 % intacta), y el SOMAmero 2573-2015 (SEQ ID NO: 22) se degrado parcialmente (50 % intacto). Vease la Figura 8A (2573-20J36 (SEQ ID NO: 101) (•), 2573-2015 (SEQ ID NO: 22) (o), 2573-20116 (SEQ ID NO: 300) (▲)). De la misma manera, el SOMAmero Nap-dU 2574-49_260 (SEQ ID ⁿO: 400) no estaba muy afectado por este tratamiento (>95 % intacto), mientras que las variantes dT de control 2574-49_456 (SEQ ID NO: 572) (<5 % intactas) estaban significativamente hidrolizadas. La variante Nap-dU 2574-49_14 (SEQ ID NO: 35) (60 % intacta) tambien estaba algo hidrolizada. Vease la Figura 8B (2574-49260 (SEQ ID NO: 400) (•), 2574-4914 (SEQ ID NO: 35) (o), 2574-49_456 (SEQ ID NO: 572) (▲)). Estos resultados indican que las modificaciones dU pueden proporcionar un nivel significativo de protection contra la escision por endonucleasas, y las modificaciones de la matriz adicionales 2'-O-metil estabilizan adicionalmente estos SOMAmeros. Se observaron resultaos similares con suero de rata y mono Cynomolgus. Vease la Figura 8C.

Ejemplo 8.2573-20136 (SEQ ID NO: 101) y 2574-49260 (SEQ ID NO: 400) compiten por la union con IL-6

Para determinar si los SOMAmeros 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) y 2574-49260 (SEQ ID NO: 400), que se obtuvieron en experimentos SELEX diferentes, se unlan en sitios solapados en la IL-6, se llevo a cabo un experimento de competition por la union. La protelna IL-6 se acoplo a la superficie de una placa de microtitulacion (Nunc Maxisorp) por adsorcion pasiva. El SOMAmero biotinilado 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) (100 pM) se mezclo con diferentes concentraciones de competidor (SOMAmero no biotinilado 2573-20-136 (SEQ iD NO: 101) o 2574­ 49260 (SEQ ID NO: 400), 0,02 - 20 nM) en tampon SB18T (40 mM de HEPES, pH 7,5, 102 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, un 0,05 % TWEEN-20) y se anadieron a la placa. Despues de luna incubation durante 60 minutos a 25 °C con agitado a 500 rpm, se retiro el SOMAmero no unido lavandolo y la placa se incubo con estreptavidina acoplada con peroxidasa de rabano rusticano (1 jg/ml). Se midio la cantidad remanente de 2573­ 20136 (SEQ ID NO: 101) biotinilado con el sustrato de peroxidasa de rabano rusticano (TMB; 3,3',5,5'-tetrametilbencidina) de acuerdo con procedimientos convencionales. Se grafico el porcentaje de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) biotinilado unido a IL-6 (con respecto al control no competidor) en funcion del a concentration del SOMAmero competidor. Vease la Figura 9 (• 2573-20136 (SEQ ID NO: 101); o 2574-49260 (SEQ ID NO: 400)).

Segun aumenta la concentracion de 2574-49260 (SEQ ID NO: 400), la cantidad de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) unido disminuye, indicando que los dos SOMAmeros compiten por la union con sitios comunes o sitios solapados de la IL-6.

Ejemplo 9. El aptamero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) bloquea la union de la IL-6 al receptor de IL-6

Se determino el efecto del SOMAmero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) en la union de la IL-6 al receptor soluble de la

IL-6 (sIL-6R) en un formato de ensayo sandwich. Se acoplo el sIL-6R (100 ng) a la superficie de una placa de microtitulacion por adsorcion pasiva. Se mezclo la IL-6 biotinilada (60 ng/ml) con diferentes concentraciones de

2573-20136 (SEQ ID NO: 101) (0-10 pg) en tampon PBST (PBS con un 0,05 % de TWEEN-20) y se a la añadió placa. Despues de una incubacion durante 120 minutos a 25 °C con agitado a 200 rpm, se retiro la IL-6 no unida lavandola y se midio la cantidad de IL-6 biotinilada restante con peroxidasa de rabano rusticano y estreptavidina de acuerdo con procedimientos convencionales. Se grafico el porcentaje de IL-6 biotinilada unida al sIL-6R (con respecto al control no competidor) en funcion de la concentracion de SOMAmero. Vease la Figura 10. Segun aumentaba la concentracion de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101), disminula la cantidad de sIL-6R unido indicando que el SOMAmero bloquea la union de la IL-6 a su receptor el sIL-6R.

Ejemplo 10. El aptamero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) inhibe la IL-6 de mono, pero no la de rata

Se evaluo la reactividad cruzada ortologa del 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) comparando las propiedades de union e inhibicion contra la IL-6 de mono Cynomolgus y rata. La identidad de aminoacidos entre la IL-6 humana y la del mono Cynomolgus es del 96 %, mientras que la IL-6 humana y la de rata son solamente un 39.9 % identicas. Se preparo la IL-6 de mono con un marcador 6-His mediante la expresion en celulas CHO y se purifico utilizando una columna NTA de acuerdo con protocolos convencionales. La concentracion de la IL-6 proteica se determino con un ELISA. La IL-6 de rata se adquirio (en R&D Systems).

El 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) se une a la IL-6 de mono con una Kd = 2 x 10-9 M, y a la IL-6 de rata con una Kd =

6 x 10-7 M. Ademas, el 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) inhibe la actividad de la IL-6 de mono en el ensayo de gen indicador con una CI50 = 9,7 x 10-9 M.

Ejemplo 11. Comparacion de la potencia de inhibicion de un anticuerpo y un aptamero

Se comparo la potencia de inhibicion de la IL-6 del PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) que tiene un

PEG de 40 kDa conjugado en su extremo 5' con el Tocilizumab, un anticuerpo anti-IL-6R en un ensayo de proliferacion celular. Se suspendieron celulas U266B1 con el PEG-N-2573-20136 o el Tocilizumab (0,1, 10 o 100 pg/ml) en medio RPMI 1640 que contenla un 10 % de FBS a 1 x 104 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivo durante 30 minutos a 37 °C en una incubadora con un 5 % de CO2. Se aplico la IL-6 (100 ng/ml) a las celulas durante 2 dlas a 37 °C. Se añ Aazduiló Alamar™ y se incubaron las celulas unas 3 horas adicionales a 37

°C. Se midio la fluorescencia (excitacion 560 nm, emision 590 nm) con un luminometro (Wallac 1420 ARVO Light, Perkin Elmer). Los resultados se muestran en la Tabla 5. Los valores representan la media ± error estandar de 3 experimentos (3 pocillos por experimento) a cada concentracion. Se observaron diferencias estadlsticamente significativas entre el grupo de control no inhibidor (0,0+15,7 %, n=3) y PEG-N-2573-20136 o Tocilizumab (ensayo de Dunnett, de dos colas, * p<0,05, ** p<0,01). El PEG-N-2573-20136 alcanzaba la inhibicion completa de IL-6 a 1 pg/ml (8,3 x 10-8 M), mientras que el Tocilizumab alcanzaba un 60 % de inhibicion a una concentracion molar practicamente equivalente (6,7 x 10-8 M).

Tabla 5. Inhibicion de la proliferacion celular dependiente de IL-6 por PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO:

1 1 n n PE 4 kD n n l xr m ’ l T iliz m

Ejemplo 12. Actividad antagonista del 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) contra celulas tumorales que responden a la IL-6

El receptor de la IL-6 esta sobre-expresado en muchos canceres incluyendo el de cerebro, prostata y rinon y la expresion elevada del ligando y el receptor de IL-6 se asocian con poca supervivencia del paciente. La inhibicion de la senalizacion de la IL-6 puede suprimir el crecimiento, supervivencia, y/o potencial metastatico de celulas tumorales. La inhibicion de la proliferacion de la celula tumoral por el PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con un polietilenglicol de 40 kDa conjugado en su extremo 5' se midio para las celulas PC3 de carcinoma prostatico, HepG2 de hepatoma, y U87MG de glioma. Las celulas se colocaron en placas en medio F12K que contenla un 10 % de FCS (para las celulas PC3) o medio DMEM que contenla un 10 % de FCS (para las celulas HepG2 y U87MG) a 1 x 104 celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 1 dla a 37 °C en una incubador con un 5 % de CO2. Se aplico el PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) (10 pg/ml) en cada medio durante 7 dlas a 37 °C. Se a añzaudli Aólamar™ y se incubaron las celulas 1-3 horas adicionales a 37 °C. Se midio la fluorescencia (excitacion 560 nm, emision 590 nm) con un luminometro (Wallac 1420 ARVO Light, Perkin Elmer). Los resultados se muestran en la Tabla 6. Los valores representan la media ± el error estandar de 3 experimentos (2 pocillos por experimento). El PEG-N-2573-20136 suprimla la proliferacion de los tres tipos celulares.

Tabla 6. Inhibicion de la proliferacion de celulas PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con un li il n li l 4 kD n xr m ’.

En las mismas condiciones experimentales, 12 aptameros (10 o 100 pg/ml) o el anticuerpo anti-receptor de la IL-6 Tocilizumab (150 o 1500 pg/ml) inhiblan la proliferacion de celulas tumorales. Los resultados se muestran en la Tabla 7. Los valores representan la media ± erro estandar de 3 experimentos (3 pocillos por experimento) para cada aptamero o el Tocilizumab. Se observaron diferencias estadlsticamente significativas entre el control (U87MG: 100,0 ± 3,7 %, HepG2: 100,0 ± 6,7 %, respectivamente) y los aptameros o Tocilizumab (ensayo de Dunnett de dos colas, *p<0,05, **p<0,01).

Ejemplo 13. Estructura cristalina del aptamero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) unido a la IL-6

La IL-6 (SEQ ID NO: 9) esta comprendida por 212 aminoacidos con un peptido de senal en el extremo N de 29 aminoacidos y un ramo de cuatro helices dispuesto en una topologia arriba-arriba-abajo-abajo (Somers et al., EMBO J. 1997: 989-997). Las helices se han denominado historicamente de A a D, desde el extremo N al extremo C, y cuentan con 20-25 restos por helice con largos bucles conectando las helices. Los 20 restos del extremo N no adoptan ninguna estructura secundaria y solamente los ultimos 7 restos de este bucle flexible se discrimina en la estructura cristalina. Existe tambien una quinta helice corta de 11 restos (aminoacidos 141-152) presente en el largo bucle entre las helices C y D, una caracteristica comun en la familia de proteinas de cadenas largas con un ramo de cuatro helices (Mott, H.R. y Campbell, I.D., Current Opinion in Str. Bio., 1995. 5:114-121). A continuation de esta helice corta los restantes restos del bucle C-D (aminoacidos 131-140) estan desordenados y no son visibles en la estructura cristalina. De la misma manera, el largo bucle A-B (aminoacidos 43-79), contiene 17 restos omitidos (aminoacidos 44-60). La forma que se utilizo en los estudios de cristalizacion de los inventores comprende los restos de aminoacido 30-212 basandose en la IL-6 humana de longitud completa.

Para los estudios de cristalizacion, los inventores utilizaron el SOMAmero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101), que se muestra a continuacion:

5'-G1G2C3A4G5G6Z7Z8E9G10G11P12A13Z14Z15A16A17C18A19C20G21Z22Z23A24A25G26Z27C28

G29Z30G31G32-3' (SEQ ID NO: 101);

en el que Z es Bn-dU, E es PE-dU, P es Nap-dU, y los nucleotidos 3, 6, 16, 19, 20, y 28 comprenden modificaciones 2'-OMe. Vease tambien la Tabla 10.

Los inventores obtuvieron dos estructuras cristalinas (a las que se hace referencia como forma 1 y forma 2) de la IL-6 proteica humana (numeration basada en la forma madura) unida al SOMAmero (2573-20136 (SEQ ID NO: 101). La forma 1 se resolvio a 2,40 A y contenia una molecula de IL-6 y una molecula de SOMAmero por unidad asimetrica. La forma 2 se resolvio a 2,55 A y contenia dos moleculas de IL-6 (cadenas A y C) y dos moleculas de SOMAmero (cadenas B y D) por unidad asimetrica. Las dos estructuras son muy similares en general y se podian asignar al grupo de espacio P32. El complejo de la forma 1 se puede superponer con ambos complejos de la forma 2 con una desviacion cuadrada media de la raiz (RMSD) de 0,431 A que abarca las cadenas A (de IL-6) y B (del SOMAmero) sobre 898 atomos y las cadenas C (de la IL-6) y D (del SOMAmero) con una RMSD de 0,456 A sobre 945 atomos. De manera similar, las dos moleculas de SOMAmero de la forma 2 se alinean bien, con una RMSD de 0,537 A sobre 655 atomos. Ambas estructuras de la forma 1 y la forma 2 carecen de los primeros 13-15 restos del extremo N no estructurado de la IL-6 asi como los restos de las regiones de bucle que conectan las helices y en el extremo C (aminoacidos 130-135 en la forma 1 y aminoacidos 135-140 en la forma 2). Adicionalmente, los nucleotidos 19 y 20 del SOMAmero estan omitidos en la forma 1, pero se pueden resolver en la forma 2. Como las estructuras de la forma 1 y la forma 2 son casi identicas, la mayoria de los analisis expuestos en el presente documento se hicieron en la estructura completa de IL-6: SOMAmero, especificamente las cadenas A y B. El complejo IL-6: SOMAmero comprendido de las cadenas A (IL-6) y B (SOMAmero) se muestran en la Figura 11. El SOMAmero interactua con los polos del extremo N y C del ramo de cuatro helices de IL-6, envolviendo alrededor la proteina perpendicular al eje largo de las helices. La conformation de la IL-6 en la estructura unida al SOMAmero es la misma que se observa en la estructura hexamerica IL-6/IL-6R/gp130, PDB ID 1P9M (Boulanger, M.J., et al, Science. 2003. 300: 2101-2104). Estas dos estructuras de la IL-6 se pueden superponer con una RMSD de 0,717 A sobre 832 atomos. Vease la Figura 12.

Con respecto a las preferencias conformacionales del SOMAmero, todas las bases son en conformacion de nucleosidos anti excepto 2'-0-Methyl C28, G1, G5, G10 y G31, que estan en conformacion syn. La mayoria de las ribosas estan en una conformacion C2'-endo (18/32), con el resto en conformaciones C1'-exo (6/32), C3'-exo (3/32), C3'-endo (2/32), 04'-endo (2/32) y C4'-exo (1/32). Vease la Tabla 8, posterior. Todas las bases modificadas estan en conformacion trans con la exception de Bn-dU22 que esta en conformacion cis.

Tabla 8. Conformaciones de ribosa en los SOMAmeros

El SOMAmero se puede dividir en dos dominios estructuralmente distintos que estan esencialmente divididos en la helice a de la IL-6 (helice A), interactuando cada dominio con la helice A y uno con la otra helice de la IL-6. Vease la Figura 11. El dominio 1 comprende los nucleotidos 1-12 y 29-32 y contienen un motivo de cuarteto G compuesto por dos tetradas G, as! como ambos extremos 3' y 5'. El domino 2 adopta un motivo en tallo-lazo compuesto por los nucleotidos 13-28. Vease la Figura 13.

Dominio 1: Cuarteto G

No hay emparejamientos de bases Watson-Crick en el dominio 1, en el que un volumen de la integridad estructural se deriva del cuarteto G. Cada tetrada G esta coordinada por un ion sodio que se situa en el plano de la tetrada. La tetrada uno contiene G1, G6, G10 y G32 mientras que la tetrada dos contiene G2, G5, G11 y G31. Vease la Figura 14A. Cada cuarteto G contiene dos bases en conformacion syn y dos en la conformacion anti. Esto permite que cada base de guanosina tenga dos enlaces de hidrogeno con una guanosina vecina en la cara de Watson-Crick, as! como en la cara Hoogsteen. Los iones de sodio estan coordinados entonces por el oxlgeno carbonilo de C6.

Los cuartetos G se clasifican por la orientacion de las cadenas y la conformacion glicosldica. Las cadenas del cuarteto G del SOMAmero discurre arriba-abajo-arriba-abajo creando un centro de tetradas G antiparalelo con tres bucles laterales o hacia los extremos. Vease la Figura 14B. De las 26 posibles topologlas para los tres bucles con cadenas G cuadruples contiguas, solo seis se han determinado experimentalmente. Esta topologla especlfica se habla visto previamente en el aptamero de ADN de union a la trombina (Macaya, R.F., et al., PNAS. 1993.

90(8):3745-3749).

Existen cinco bases modificadas en el dominio del cuarteto G, cuatro de las cuales forman una superficie hidrofoba que estan en contacto con la protelna .Este bolsillo hidrofobo se crea como un agrupamiento no contiguo de cadenas laterales de restos Bn-dU7, Bn-dU8, Nap-dU12 y Bn-dU30 (denominados Bn7, Bn8, Napl2 y Bn30) que se aproximan entre ellos por el armazon en total del cuarteto G de manera que crea una serie de interacciones reapiladas. Vease la Figura 14C. El anillo de uridina Bn-dU8 forma una interaccion de re-apilamiento con Nap12 mientras que Bn8 esta metido en un sandwich entre los anillos de uridina de Nap-dU12 y Bn-dU7 creando una interaccion de re-apilameinto adicional. Bn8 tambien esta rodeado por Bn7, NapI2 y Bn30 con los que forma interacciones de apilamiento final con cara. En un sentido, el nucleotido Bn-dU8 parece que sirve cono centro del agrupamiento hidrofobo que se implica simultaneamente con otras tres cadenas laterales de nucleotido modificadas, as! como dos bases. G29, que bordea el dominio 2, se apila con la base del Bn-dU30, que a su vez se apila con la G11 del cuarteto G. El resto de nucleotido modificado en este dominio, PE-dU9, no interactua con la protelna, sino mas bien se introduce por debajo del cuarteto G, con el anillo de uridina apilandose con la G32 y la cadena lateral modificada PE9 sobresaliendo den el disolvente. Vease la Figura 14D. En general, los factores B del dominio 1 son mucho mas bajos que los del dominio 2, debido mas probablemente a que el cuarteto G proporciona rigidez a esta mitad de la estructura del SOMAmero (datos no mostrados).

Interacciones IL-6: SOMAmero en el dominio 1

Siete restos de la IL-6 proteica tienen contactos intermoleculares con el dominio 1 del SOMAmero. En la cola del extremo N, R16 se une mediante hidrogeno con G29 en la cara de Hoogsteen. Vease la Figura 15A. De manera adicional, R16 tiene contactos hidrofobos con Bn30 que se apila contra la cadena lateral metileno de la arginina. Las fuerzas intermoleculares hidrofobas tienen un papel significativo en las interacciones protelna-ADN, como se ve en este tema repetido de nucleotidos modificados que interaction con las cadenas laterales de metileno de la superficie de aminoacidos. La cola del extremo N de la IL-6 proteica descansa en un bolsillo creado por una curvatura inusual del ADN, donde forma un sandwich entre la estructura del ADN y protege el agrupamiento hidrofobo de Bn7, Bn8, Nap12 y Bn30 del disolvente. Vease la Figura 15B. La curvatura atlpica de la estructura del SOMAmero se distorsiona de manera que los grupos fosfatos estan en estrecha proximidad entre ellos y se dirigen hacia el disolvente con las bases modificadas apuntando lejos del disolvente, el agrupamiento en conjunto forma un centro hidrofobo de tipo proteico. Un puente salino entre R24 y el extremo N de la helice A de lL-6 y el fosfato de la estructura del SOMAmero entre G6 y G6 da una proteccion adicional del disolvente a los nucleotidos hidrofobos. Vease la Figura 15C. El agrupamiento de nucleotidos modificado comprendido en las posiciones 7, 8, 12 y 30 sirven claramente a una funcion dual de una fundacion estructural intramolecular para el propio SOMAmero, as! como una superficie hidrofoba que se pone en contacto con la protelna. Y31 de la helice A de IL-6 se apila en la parte superior del anillo de uridina de Nap-dU12 anadiendo el cuarto anillo aromatico de la tira de interacciones n que tambien implica a Bn8 y la base de Bn-dU7. Vease la Figura 15D. El brazo amida de Nap-dU12 alcanza a traves de la helice C de IL-6, donde el grupo naftil tiene una interaccion hidrofoba con la cadena lateral de metileno de M117, ademas de la interaccion de apilamiento n el anillo de uridina de Bn-dU8. Vease las Figuras 15B y 14C. De manera adicional, Bn7 se apila contra la cadena lateral de R24, tiene una interaccion terminal con K27 y se une con enlaces de hidrogeno mediante el oxlgeno carbonilo del enlazador de amida a R30. El Bn7 y Bn8 tambien se implican en interacciones final con cara con F125 en la helice C. vease la Figura 15F.

Dominio 2: tallo-lazo

El dominio 2 del SOMAmero que es primariamente un ADN en forma B, pero con un ligero giro a la izquierda en la region del bucle. En la parte inferior del tallo en el extremo 3' son dos bases no emparejadas: Bn-dU27 y C28. Aunque se asigna formalmente al dominio 2, existen dos bases no emparejadas, junto con G26 y A13 en el extremo 5' del tallo, que se puede concebir como una bisagra flexible entre los dos dominios. G26 y el anillo de uridina de BndU27 tiene una interaccion de apilamiento debil mientras que el grupo bencilo de Bn-dU27 (Bn27) esta completamente expuesto al disolvente. Estas dos bases no emparejadas se continuan con un par recortado de bases G-A entre G26 y A13 (recorte: 6,2 A; doblez: -34°; helice -11°) y cuatro pares de bases de Watson y Crick entre Bn-dU14 y A25, Bn-dU15 y A24, A16 y Bn-dU23, y A17 y Bn-dU22 que adoptan la conformacion de helice de forma B. Vease la Figura 16B. Los pares de bases Watson-Crick tambien presentaban unos parametros con un intervalo de doblez y giro de helice que se alejaban de los angulos ideales de una forma B con una media de doblez de -14° (desviacion tlpica (s.d.) 26) y un giro de helice medio de -11° (s.d. 9,2). El tetrabucle de la parte superior del tallo esta formado por C18, A19, C20 y G21. Formalmente en el tetrabucle, C18 y G21 forman un par de bases sustancialmente distorsionada caracterizada por dos enlaces H estrechados (3,5 A y 3,8 A) con los parametros de recorte irregular (1,1 A), estrechamiento (3,4 A), escalonamiento (1,4 A), doblez (32°), helice (-52°) y abertura (-61°). Los enlaces H se forman entre la cara de Watson-Crick de C18 y el final Hoogsteen de G21 mientras que la cara Watson-Crick de G21 esta implicada en el contacto cristalino con C20 de un companero de simetrla. Adicionalmente, la conformacion syn de G21 da como resultado en algo de giro a la izquierda (-18°) entre los pares de bases A17:BndU21 y the C18:G21. La base G21 se apila con Bn-dU22 en el tallo, sin embargo, C18, A19 y C20 no estan implicadas en ningun contacto ni intra ni intermolecular. La base C20 esta parcialmente saliente en el disolvente mientras que A19 esta completamente expuesta al disolvente. Vease la Figura 16C.

La estructura de tallo-lazo del dominio 2 contiene cinco bencilnucleotidos modificados en las posiciones 14, 15, 22, 23 y 27. De estos, solo el Bn-dU27 en la region de la bisagra no contacta con la protelna. El resto de los nucleotidos modificados participan todos en el emparejamiento de bases entre el anillo de uridina, mientras que los grupos bencilo se dirigen fuera de la helice y hacia la protelna. Se crea un bolsillo hidrofobo mediante una disposition de agrupamiento no apilado de bencilos de Bn22, Bn23 y Bnl5. Vease la Figura 16D. El anillo de uridina de Bn14 se apila con la amida de Bn15 y el grupo bencilo apunta fura del agrupamiento de bencilo de Bn22, Bn23 y Bn15, pero hacia la IL-6 proteica. Vease la Figura 16E. El nucleotido Bn-dU14 se unen a las interacciones de interacciones proteicas del dominio 1 y el dominio 2 mientras que no participa en ninguno de los agrupamientos hidrofobos.

Interacciones IL-6: SOMAmero en el dominio 2

La mayorla de las interacciones de IL-6 con el dominio 2 del SOMAmero son hidrofobicos en la naturaleza. Los grupos bencilo Bnl5, Bn22 y Bn23 estan anidados contra las helices en IL-6 en un bolsillo hidrofobo creado por la parte no polar de las cadenas laterales de R30, L33 y D34 en la helice A y Q175, L178 y R179 en la helice D. Vease la Figura 17B. Tambien existen dos puentes salinos en este dominio entre el fosfato de matriz A13 y K27, y fosfato de Bn-dU14 y R30, con ambos restos de aminoacido de la helice A. vease la Figura 17C.

Una lista completa de todas las interacciones IL-6: SOMAmero se resumen en la Tabla 9. El area accesible al disolvente calculada (S.A.S) es de 8696 A2 para la protelna IL-6, 6672 A2 para el SOMAmero, y 12872 A2, calculado como [(S.A.S^il-6 S.A.S SOMAmero - S.A.Scomplejo)]/2. Este valor es similar a area excluido de solvente expuesta de PDGF-BB SOMAmero de 1125 A2 (Davies et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. 109: 19971-19976).

T l . In r i n r in - MAm r

Mimetismo con el receptor

La interfaz de union en la IL-6 a la que se conecta el SOMAmero se solapa extensamente con las regiones implicadas en la union de la IL-6 a sus dos receptores de la superficie celular, el IL-6Ra y gp130. El dominio 1 del SOMAmero ocupa el sitio de union implicado exclusivamente en la union con el gp130 mientras que el dominio 2 ocupa primariamente el sitio de union para el IL-6Ra. Vease las Figura 18A y 18B. El grado en el que el SOMAmero se une a la IL-6 de una manera que se asemeja a los receptores es solo parcialmente evidente cuando se considera el solapamiento global de las superficies de union. La consideracion de interacciones especlficos ilustra una extension incluso mayor de mimetismo con el receptor.

La estructura hexamerica de la union de IL-6 al receptor IL-6Ra y el receptor de serialization gp130 identificaba tres superficies en la IL-6 implicadas en las interacciones protelna-protelna (Boulanger, M.J., et al, Science. 2003. 300: p2101-2104). El sitio I consiste en las helices A y D, que interaction con el IL-6Ra para cubrir ~ 1200 A2. Los restos clave del IL-6Ra en esta interfaz son F229 y F279. F229 tiene interacciones del extremo con las cadenas laterales de metileno de R179 y Q183 en la helice D de IL-6. F279 tambien interactua con la cadena lateral de metileno de R179 en la cara opuesta y se asienta en un bolsillo hidrofobo creado por las cadenas laterales no polares de R179, Q175, LI78 en la helice D y L33 y R30 en la helice A. Este es el mismo bolsillo hidrofobo ocupado por el Bn22 del dominio 1 de la estructura del SOMAmero, en el que la unica diferencia es la rotation del grupo bencilo de Bn22 unos ~ 70° con respecto a F279. Vease la Figura 19A. No hay un nucleotido en el SOMAmero que interactue con la misma superficie en la IL-6 que el F229.

El heterodlmero IL-6/ IL-6Ra es el primer complejo que formar, seguido por la union de gp130 a los sitios IIa/b de la IL6 e IL-6Ra respectivamente. El sitio IIa tambien cubre ~ 1200 A2 e incluye las helices A y C de la IL-6. El resto F169 de gp130 interactua con la superficie en la helice A que contiene L19, R24, K27, y Y31, primeramente, mediante interacciones hidrofobas con las cadenas laterales no polares. Estos son muchos de los mismos restos implicados en la union del SOMAmero a la IL-6. Ademas, el F169 ocupa el mismo bolsillo de union en la estructura IL-6/ IL-6Ra/gp130 que as Bn7, Bn8 y Nap12 en la estructura del SOMAmero. Vease la Figura 19B. El armazon del SOMAmero entre G6 y Bn-dU7 en la estructura IL-6: SOMAmero ocupa los mismos sitios de W142 en gp130 de la estructura hexamerica. Vease la Figura 19C. W142 tiene una interaccion final con cara con F125 de la IL-6, as! como interacciones hidrofobas con las cadenas laterales no polares de Q124 y K128 en la helice C. Vease la Figura 19C. La segunda molecula de pg130 en la estructura hexamerica se une al sitio III de la IL-6, que se localiza en el polo opuesto del ramo de cuatro helices y contiene sitios de union no solapados con el SOMAmero. El solapamiento extenso de las superficies en la IL-6 a las que se une el SOMAmero y los receptores es consistente con la capacidad observada del SOMAmero para inhibir los efectos mediados por la IL-6.

Actividad del fragmento del dominio G y su modificacion despues del SELEX

Para determinar si los dos dominios observados en el SOMAmero representan unidades de union independientes, los inventores sintetizaron varias variantes de los dominios 1 y 2. Los fragmentos que representan distintas formas del dominio tallo-lazo no presentaba una afinidad de union apreciable para la IL-6 a concentraciones proteicas hasta 1 pM (datos no mostrados). Por el contrario, un fragmento que contenla el dominio del cuarteto G comprendido por las posiciones 1-12 y 29-32, con un espaciador C conectando las dos regiones secuencia 2573-20324 (SEQ ID NO: 319)) presentaban una afinidad de union con IL-6 de aproximadamente 200 nM. Este fragmento de16 nucleotidos se corresponde con el dominio completo del cuarteto G, en el que el espaciador C remplaza el dominio tallo-lazo que conecta las dos regiones del cuarteto G en el SOMAmero de longitud completa. La afinidad de union de este fragmento del cuarteto Ges aproximadamente 1000 veces menor en comparacion con el SOMAmero de longitud completa. No obstante, en terminos de energla libre de union, AG, que es -13,7 kcal/mol para el SOMAmero de longitud completa y -9,5 kcal/mol para el fragmento de cuarteto G, el dominio del cuarteto G parece hacer una mayor contribucion a la afinidad de union total del SOMAmero de longitud completa. Un analogo de una secuencia desordenada del fragmento de cuarteto G muestra no union hasta una concentracion de la IL-6 de 1 pM.

Junto con el mantenimiento de una fraccion sustancial de la afinidad de union, el fragmento del cuarteto G tambien mantiene su capacidad para inhibir los efectos mediados por la IL-6 in vitro, en el ensayo de gen indicador descrito anteriormente.

Comenzando con el 2573-20324 (SEQ ID NO: 319), los inventores examinaron el efecto de la sustitucion de cada uno de los cinco nucleotidos modificados con una coleccion de sustituyentes de la posicion 5 alternativos. El efecto de quince sustituyentes de la posicion 5 alternativos introducidos en cada uno de los restos dU modificados se resumen en la Figura 22, en la que se expresa el cambio de afinidad de la secuencia de referencia (parental) se expresa como la relacion de las constantes de disociacion (el valor de Kd de las variantes dividido por el valor Kd de un ligando de referencia 2573-20324 (SEQ ID NO: 319)). En el conjunto de quince restos alternativos, las cinco posiciones de nucleotidos modificados del fragmento del cuarteto G varia con respecto a su sensibilidad a las sustituciones. La posicion 9 es la mas tolerante a la sustitucion, siendo trece de los quince esencialmente neutros y presentaban menos de 3 veces de efecto sobre la afinidad de union. Esto no era esperable en vista del hecho de que la cadena lateral del nucleotido modificado en la posicion 9 no esta en contacto con la protelna y a su vez se expone al disolvente. En las posiciones 8 y 12, sin embargo, la mayorla de las sustituciones eran practicamente desfavorables y ninguna daba una mejora de la afinidad (la posicion 12 ya se cambio a naftilo desde el bencilo del 2573- 20324 (SEQ ID NO: 319) frente al 3573-20 (SEQ iD NO: 7). Esto es igual con la posicion 30, excepto por la sustitucion del grupo bencilo con el grupo isobutilo mas pequeno que da lugar a una mejora de afinidad de aproximadamente 6 veces. Por el contrario, la posicion 7 es algo sensible a la modificacion con notables cambios de afinidad que se observan tanto en la direccion favorable como desfavorable. La sustitucion del grupo bencilo aromatico con cadenas laterales no aromaticas es en general desfavorable en la posicion 7 y da lugar a una reduccion de afinidad de >100 veces. La sustitucion con grupos funcionales aromaticos mas grandes, por otra parte, da como resultado la mejora de afinidad. Con una de dichas sustituciones (MBn-dU), se observo una mejora de afinidad de 100 veces. En terminos de afinidad absoluta, esto se traduce en un valor de la Kd de 1 nM. La mejora en la afinidad de union tambien se reflejaba en una mejora de 20 veces en la actividad inhibidora in vitro.

Ejemplo 14. Analisis de los agrupamientos SELEX para determinar el consenso de union

Para evaluar mas completamente las secuencias en la familia de SOMAmeros 2573-20 y la familia de SOMAmeros 2574- 49, se secuenciaron utilizando tecnologla de pirosecuenciacion 454 como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4.

Se analizaron entonces secuencias para identificar SOMAmeros de union a IL-6 con un motivo de cuarteto G similar al motivo en el 2573-20136 (SEQ ID NO: 101). Se identificaron varias secuencias de SOMAmero unicas que pareclan tener motivos de cuarteto G, muchas de las cuales estaban presentes en el agrupamiento final de SELEX en multiples copias. La Figura 23 muestra secuencias de SOMAmero unicas ejemplares que parecen tener motivos de cuarteto G, que representan mas de 1600 clones en el agrupamiento de SELEX final. Para cada SOMAmero, solo se muestra la secuencia de la region aleatoria.

La Figura 25 muestra secuencias de SOMAmero unicas que son similares a 2574-49. Para cada SOMAmero, solo se muestra la secuencia de la region aleatoria.

Ejemplo 15. Efecto del SOMAmero 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) sobre la inflamacion en monos Cynomolgus con artritis inducida por colageno

La IL-6 es un mediador clave de la respuesta inflamatoria asociada con artritis reumatoide. La artritis inducida por colageno (CIA) es un modelo autoinmunitario establecido para el estudio de la artritis reumatoide en monos Cynomolgus. El efecto de PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con un PEG de 40 kDa conjugado en el extremo 5') sobre la gravedad de la inflamacion articular se evaluo en este modelo.

Se adquirieron hembras de mono Cynomolgus (Macaca fascicularis) de 3-5 anos de edad en Guangxi Grandforest Scientific Primate Company, Ltd (Guangxi, China). Todos los procedimientos que implicaban animales fueron aprobados por el comite de cuidado y uso de animales del laboratorio. Se mezclaron en proporciones iguales colageno bovino tipo II (4 mg/ml, colageno II tipo K41S, Collagen Research Center, Tokyo, Japon) y adyuvante completo de Freund (Becton Dickinson, Grayson, GA, USA) y se suspendio utilizando una jeringa enfriada para preparar una emulsion. La emulsion se inyecto por via intradermica en 19 sitios de la espalda y en un sitio en la base de la cola (total 2 ml/cuerpo). A los 21 dlas despues de la primera sensibilizacion, se administro de nuevo. La segunda sensibilizacion se llevo a cabo de la misma manera que la primera. Se inyecto PEG-N-2573-20136 (2573­ 20136 (SEQ ID NO: 101) con un PEG de 40 kDa conjugado en el extremo 5') (1 a 10 mg/ml/kg) en la vena cefalica en la extremidad anterior cuatro veces al dla durante 11 dlas y medio (46 inyecciones en total) despues de la primera sensibilizacion. Al grupo de control se le administro el vehlculo que se utilizo para la disolucion de la dosificacion del PEG-N-2573-20136 de la misma manera (1 ml/kg).

El dla 6 antes, y los dlas 6, 13, 20, 27 y 34 despues de la primera sensibilizacion, se evaluaron las valoraciones de artritis (niveles de hinchazon y rigidez de las articulaciones) para todos los monos. Las articulaciones examinadas inclulan las metacarpofalangianas, interfalagianas proximales, interfalangianas distales, muneca, tobillo, codo y rodilla (un total de 64 articulaciones/cuerpo). Despues de anestesiarlos mediante inyeccion intramuscular de clorhidrato de ketamina (Kamud Drugs Pvt, Ltd., 0.2 ml/kg, 10 mg/kg), se llevo a cabo el examen de acuerdo con los criterios de valuacion de hinchazon y rigidez que se muestra a continuation; Puntuacion 0: sin anormalidad, Puntuacion 1: hinchazon no visible pero que se puede determinar al tacto, Puntuacion 2: hinchazon ligeramente visible y que se puede confirmar al tacto, Puntuacion 3: hinchazon claramente visible y la articulation se puede flexionar completamente, Puntuacion 4: hinchazon claramente visible pero la articulacion no se puede flexionar completamente, Puntuacion 5: rigidez de las articulaciones. La valoracion de artritis de cada animal era la suma de las puntuaciones individuales de las 64 articulaciones. La puntuacion de artritis se juzgo de manera oculta por un tecnico encargado.

Los resultados de las puntuaciones de artritis se ilustran en la Figura 26. Cada barra representa la media ± error estandar (N = 4) de la puntuacion de artritis de cada grupo. Se noto una disminucion estadlsticamente significativa en el grupo de 10 mg/kg/tiempo de PEG-N-2573-20136 (2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con un PEG de 40 kDa conjugado en el extremo 5') mediante mediciones repetidas de ANOVA seguidas por un ensayo de Dunnett (P<0,05 vs al grupo de 0 mg/kg/tiempo).

Ejemplo 16. Modificacion adicional de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) para mejorar la estabilidad a la nucleasa y la actividad antagonista

En algunos casos, la protection frente a la nucleasa se puede conseguir con 2'-O-metil, 2'-fluoro, y enlaces fosforotioato (PS). Las variantes de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con combinaciones de 2'-O-metil U, fosforotioato, espaciador C3, y sustituciones HEG se exploraron en cuanto a la afinidad y la inhibition de la actividad para identificar inhibidores de la IL-6 adicionales activos. Las modificaciones alternativas de U tambien se ensayaron en ciertas posiciones. Vease la Figura 24. La Tabla 10 muestra una lista de variantes que se descubrio que tenlan una CI50 que variaba desde 10-11 M a 10-8 M. El SOMAmero 2573-20745 (SEQ ID NO: 218) tiene una sustitucion protectora en el armazon en cada position (182'-O-metil, 12 fosforotioato, y una sustitucion HEG dA19 y dC20), y mantiene la actividad antagonista de la IL-6 (CI50 = 4 x 10-9M en el ensavo de gen indicador). La Tabla 11 muestra una lista de variantes que se descubrio que tenlan una CI50 mayor de 10-8 M.

Tabla 10. Variantes de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con CI50 que varian desde 10-11 M a 10-8 M Aptamero Secuencia CI ⁵⁰ (M) SEQ ID NO

2573-20_135 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Bn-G-G-Bn-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 2,4E-10 100

Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

2573-20_136 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 5,0E-10 101

Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

2573-20_137 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Bn-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 5,0E-10 573

Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-B n-A 1-A -C -A 1-C 1-G- 6,5E-10 102 Bn-Bn-A-A-G -C3-C 1-G -Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,2E-10 103 Bn-Bn-A-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 2,7E-10 104 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 5,5E-10 105 Bn-Bn-A-A-G-C3-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 6,9E-10 106 Bn-Bn-A-A-G-Heg-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 2,2E-10 107 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Bn-Bn- 4,9E-10 108 A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C3-C3-Bn- 5,1E-10 109 Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-BT- 5,1E-10 110 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg- 5,5E-10 111 MBn-Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-NE- 6,1E-10 112 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 5,6E-10 113 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Pe-Bn- 4,1E-10 114 A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-U1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,5E-10 115 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-U1-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 4,2E-09 116 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-U1-A1-A-C-A1-C1-G- 1,4E-09 117 Bn-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,5E-09 118 U1-Bn-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,6E-09 119 Bn-U1-A-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Bn-Bn- 1,9E-09 120 A1-A-G-U1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr-Bn- 5,6E-10 121 A1-A-G-U1-G-Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-B n-A 1-A-Heg-Bn-Tyr- 1,7E-09 122 A 1-A -G -U 1-C 1-G -Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-B n-A 1-A-Heg-FBn- 4,4E-10 123 Bn-A1-A-G -U 1-C 1-G -Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-FBn- 3,4E-10 124 Tyr-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 1,2E-11 125 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 5,1E-11 126 Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 8,9E-11 127 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 2,2E-09 128 FBn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 3,8E-10 129 Bn-Tyr-A1-A-G-U1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 3,9E-10 130 Tyr-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 6,0E-10 131 FBn-Tyr-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1, 1 E-10 132 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1- C1-G- 6,9E-10 133 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 6,8E-11 134 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 1,4E-09 135 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Bn-Bn- 1,1E-09 136 A1-A-G-U1 -C3-G-Bn-G-G

G0-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G- 5,1E-09 137 Bn-Bn-A1-A-G-Heg-G-Bn-G-G

G-G0-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G0-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1- 7,4E-09 138 G-Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 4,1E-09 139 Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,3E-09 140 Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 4,3E-09 141 Bn-Bn-A1-A-G0-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 2,6E-09 142 Bn-Bn-A1-A-G0-Bn-C1-G-Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-B n-A 1-A -C -A 1-C 1-G- 4,2E-09 143 Bn-Bn-A1-A -G -B n-C 1-G -Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-B n-A 1-A -C -A 1-C 1-G- 2,0E-09 144 Bn-Bn-A1-A -G -B n-C 1-G 0-Bn-G -G 0

G-G-C1-A0-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 2,6E-09 145 Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A0-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A0-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1- 5,1E-09 146 G-Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A0-C-A1-C1-G- 8,3E-10 147 Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,3E-09 148 Bn-Bn-A1-A0-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C0-A1-C1-G- 3,9E-10 149 Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G- C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr- 1,9E-09 150 Bn-A1-A-G1-U1-G-Bn-G-G

G-G- C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr- 4,3E-09 151 Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-Heg-Tyr- 5,8E-10 152 Bn-A1-A-G-U1- C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr- 1,4E-09 153 Bn-A1-A1-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 6,1E-09 154 Bn-Bn-A1-A-G1-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 2,4E-09 155 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-C-A1-C1-G-Bn- 2,4E-09 156 Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 3,7E-09 157 Bn-Bn-A1-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Bn-Bn- 1,4E-09 158 A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr- 5,7E-10 159 Tyr-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr- 6,9E-10 160 Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr- 8,0E-10 161 Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Tyr-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-Heg-Tyr- 7,8E-11 162 Bn-A1-A-G1-U1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-Heg-Tyr- 1,8E-10 163 Bn-A1-A-G1-U1-G-Tyr-G-G1

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-B n-A 1-A 1-Heg-Tyr- 9,0E-11 164 Tyr-A 1-A -G 1-U 1-C 1-G -B n-G -G 1

G -G -C 1-A -G -G 1-Bn-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-Tyr-A 1-A 1-H eg-Tyr- 2,9E-10 165 Bn-A1-A -G 1-lA C 1-G -Tyr-G -G 1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-Heg-Tyr- 3,1E-10 166 Bn-A1-A0-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Tyr-A1-A1-Heg-Tyr- 9,0E-09 167 Bn-A1-A0-G1-U1-C1-G-Tyr-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 7,0E-09 168 Tyr-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 4,4E-09 169 Tyr-Bn-A1-A-G-U1-C3-G-Tyr-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-C-A1-C1-G-Bn- 1,8E-10 170 Bn-A1-A-G1-U1-C3-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-C-A1-C1-G- 7,6E-10 171 Tyr-Bn-A1-A-G1-U1-C3-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-C-A1-C1-G-Bn- 5,2E-10 172 Tyr-A1-A-G1-U1-C3-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-C-A1-C1-G- 1,9E-10 173 Tyr-Tyr-A1-A-G1-U1-C3-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Tyr-A1-C-A1-C1-G- 2,2E-09 174 Tyr-Bn-A1-A-G1-U1-C3-G-Tyr-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-C-A1-C1-G-Bn- 1,3E-09 175 Bn-A1-A0-G1-U1-C3-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C1-Heg-G1- 3,9E-10 176 Tyr-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C1-Heg-G- 3,3E-10 177 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G1- 7,1 E-10 178 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C1-Heg-G1- 5,6E-11 179 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 2,6E-10 180 Bn-Bn-A1-A-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 2,8E-10 181 Bn-Bn-A1-A-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C1-Heg-G- 8,6E-10 182 Tyr-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-Heg-G1- 1,9E-09 183 Tyr-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-U 1-G -G -N ap-A-Bn-Bn-A 1-A -C 1-H eg-G 1- 2,1 E -10 184 Tyr-B n-A 1-A-G -U 1-C 1-G -Bn-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-B n-B n-U 1-G -G -N ap-A-Bn-Bn-A 1-A 1-C 1-H eg-G 1- 8,6E-11 185 Tyr-B n-A 1-A -G 1-U 1-C 1-G -B n-G -G 1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 4,7E-11 186 Tyr-Bn-A1-A0-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A0-C-A1-C1-G- 3,3E-09 187 Bn-Bn-A1-A2-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A0-C-Heg-G- 2,4E-10 188 Bn-Bn-A1-A-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C1-Heg-G- 7,2E-10 189 Bn-Bn-A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg- 3,2E-09 190 G1-Bn-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg- 9,8E-10 191 G1-Tyr-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr-Bn- 4,1E-10 192 A1-A-G-U1-C1-G1-Bn-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr-Bn- 2,6E-10 193 A1-A-G-U1-C1-G-Bn-G-G2

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-Heg-Tyr-Bn- 7,4E-11 194 A1-A-G-U1-C1-G-Bn1-G-G

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Bn1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C1-A1-C1- 3,6E-09 195 G-Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Bn-G-G

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-Heg-Bn1- 1,2E-09 196 Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-G-G1-Br1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-Heg-Bn1- 3,7E-09 197 Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-G-G1-Br1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-Heg-Bn- 1,3E-09 198 Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-Heg- 4,1E-09 199 Bn1-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-Heg- 1,5E-09 200 Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G2-G1-Bn1-Bn-Bn1-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-Heg- 1,4E-09 201 Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G2-G2-G1-G1-Br1-Br1-Br1-G-G1-Nap1-Bn2-Bn2-A1-A1-Heg2-Bn2- 3,0E-09 202 Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Bn2-G2-G1

G2-G2-C1-A1-G2-G1-Bn2-Bn2-Bn2-G2-G2-Nap2-A2-Bn2-Bn2-A1-A1- 3,8E-09 203 Heg2-Bn2-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Bn2-G2-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-C1-Heg- 5,4E-10 204 G1-Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G -G -C 1-A 1-G -G 1-B n1-Bn-P e-G -G -N ap-A-Bn-Bn-A 1-A 1-C 1-Heg- 7,0E-09 205 G 1-B n1-B n1-A 1-A 1-G 1-U 1-C 1-G -Bn-G -G 1

G -G -C 1-A 1-G -G 1-B n1-B n-P e-G -G -N ap-A-Bn-Bn1-A 1-A 1-C 1-Heg- 9,0E-10 206 G 1-B n-B n1-A 1-A 1-G 1-U 1-C 1-G -Bn-G -G 1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-C1-Heg- 6,6E-10 207 G1-Bn1-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-G-G1-Bn1-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-C1-Heg-G1- 1,3E-09 208 Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn-Bn1-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-C1-Heg- 2,9E-09 209 G1-Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G2-G2-C1-A1-G2-G1-Bn2-Bn2-Bn2-G-G2-Nap2-A2-Bn2- 1,7E-09 210 Bn2-A1-A1-C1-Heg2-G1-Bn2-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Br1-G1-G1

G1-CW-G1-G1-Bn1-Bi1-Br1-G1-Nap2-A2-Bn2- 1,2E-09 211 Bn2-A1-A1-C1-Heg2-G1-Bn2-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Br1-G1-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn-Bn1-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A1-C1-Heg- 1,0E-08 212 G1-U1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg- 6,8E-09 213 G1-Bn-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg- 6,5E-09 214 G1-Bn-Bn-AW-G1-U1-G-Bn1-G1

G-G-C1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 6,1E-10 215 Bn-Bn-AW-G1-Bn-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 1,2E-09 216 Bn-Bn-A1-A1-G1-Bn-C1-G-lb-G-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn-Bn-Pe-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg- 8,3E-09 217 G1-Bn-Bn-AW-G1-Bn-C1-G-lb-G-G1

G2-G2-C1-A1-G2-G1-Bn1-Bn2-U1-G2-G2-Nap2-A2-Bn2- 4,3E-09 218 Bn1-A1-A1-C1-Heg-G1-Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Bn2-G'-G1

G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn2-U1-G-G-Nap-A-Bn2-Bn1-A1- 9,8E-10 219 A1-C1-Heg-G1-Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Bn2-G2-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 2,2E-10 220 Bn-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 5,7E-11 221 Bn-Bn-A1-A1-G1-U1-C1-G-Bn-G-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A1-C1-Heg-G1- 1, 1E-10 222 Bn-Bn-AW-G1-U1-G1-Br1-G1-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn2-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A-C-A1-C1- 6,3E-11 223 G-Bn-Bn1-A1-A-G-Bn-C1-G2-Bn2-G2-G1

G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 8,7E-11 224 Bn-Bn2-A-A-G-Bn-C1-G-Bn2-G-G

G -G -C 1-A -G -G 1-Bn-Bn-U1-G -G -N ap-A-Bn-Bn-A 1-A 1-C 1-H eg-G 1- 1,6E-10 225 Bn-Bn-A1-A 1-G 1-U 1-C 1-G -B n1-G -G 1

2573-20_803 G -G -C 1-A -G -G 1-Bn-Bn-U1-G -G -N ap-A-Bn-Bn1-A 1-A 1-C 1-H eg-G 1- 2 ,6E -10 226 B n-Bn-AW -G W -C 1-G -B r1-G -G 1

2573-20_804 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn1-Bn1-A1-A1-C1-Heg- 1,1E-10 227

G1-Bn-Bn-AW-GW-C1-G-Br1-G-G1

2573-20_806 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 6,3E-10 228

Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Br1-G-G

2573-20_807 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Bn-Bn1-A1-A-C-A1-C1-G- 1,2E-09 229

Bn-Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Br1-G-G

2573-20_808 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-U1-G-G-Nap-A-Br1-Bn1-A1-A-C-A1-G-Bn- 2,7E-09 230

Bn-A1-A-G-Bn-C1-G-Br1-G-G

2573-20_809 G-G-C1-A-G-G1-Bn-Bn-Pe1-G-G-Nap-A-Bn-Bn-A1-A-C-A1-C1-G- 1,8E-10 231

Bn-Bn1-A-A-G-Bn-C1-G1-Bn1-G1-G

2573-20_834 G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn2-U1-G-G-Nap-A-Bn2-Tyr2- 2,7E-11 232

AW-C1-Heg-G1-Tyr2-Tyr2-A1 -A1 -G1-U1-C1-G2-Tyr2-G'-G1

2573-20_835 G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn2-U1-G-G-Tyr-A-Bn2-Tyr2-A1-A1-C1-Heg- 1,1E-10 233

G1-Tyr2-Tyr2-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Tyr2-G'-G1

2573-20_836 G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn2-U1-G-G-Tyr-A-Nap2-Tyr2- 4,2E-10 234

A1-A1-C1-Heg-G1-Tyr2-Tyr2-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Tyr2-G'-G1

2573-20_837 G-G-C1-A1-G-G1-MBn1-Bn2-U1-G-G-Nap-A-Nap2-Tyr2- 6,9E-11 235

A1-A1-C1-Heg-G1-Tyr2-Tyr2-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Tyr2-G'-G1

2573-20_838 G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn2-U1-G-G-Nap-A-Bn2-Tyr2-A1-A1-C1- 4,8E-11 236

Heg-G1-Ty1-Ty1-A1-A1-G1-U1-C1-G-Ty1-G-G1

2573-20_898 G-G-CW-G-G1-Br1-Bn1-A1-G-G-Nap2-A2-Br1-Bn1- 1,6E-10 237

A1-A1-C1-Heg-G1-Bn1-Bn1-A1-A1-G1-U1-C1-G2-Bn2-G2-G1

2573-20 899 G-G-C1-A1-G-G1-Bn1-Bn1-A1-G-G-Nap2-A2-Bn2- 3,3E-09 238

MOE1-A1-A1-C1-Heg-G1-MOE1-MOE1-A1-A1-G1-U1-C1-G1-MOE1-G1

Sin superlndice indica desoxirribosa

Superlndice-0-indica-2' -fluoro

Superlndice-1-indica-2'-O-metil

Superlndice-2-indica-fosforotioato-(desoxirribosa)

C3 = enlazador de tres carbonos

Heg=enlazador de hexaetileno-glicol

Nap=-naftil-dU

Pe=-fenetil-dU

BT=-benzotiofenil-dU

Ib=-isobutil-dU

2Nap=-2-naftil-dU

NE=-naftiletil-dU

MBn=-metilenodioxibencil-dU

Tyr=-tirosil-dU

FBn=-fluorobencil-dU

Bn=-bencil-dU

Trp=-triptaminil-dU

Th=-tiofenil-dU

2NE=-2-naftiletil-dU

PP=-fenpropil-dU

Im = imidazolil-dU

Thr = treoninil-dU

CHM = ciclohexilmetil-dU

Pyr = piridil-dU___________________________

RTM = R-tetrahidrofuranil-dU

MOE = morfolinoetil

Tabla 11. Variantes de 2573-20136 (SEQ ID NO: 101) con la CI50 mayor de 10-8 M

Sin superlndice indica desoxirribosa

Superlndice-0-indica-2' -fluoro

Superlndice-1-indica-2'-O-metil

Superlndice-2-indica-fosforotioato-(desoxirribosa)

C3 = enlazador de tres carbonos

Heg=enlazador de hexaetileno-glicol

Nap=-naftil-dU

Pe=-fenetil-dU

BT=-benzotiofenil-dU

Ib=-isobutil-dU

2Nap=-2-naftil-dU

NE=-naftiletil-dU

MBn=-metilenodioxibencil-dU

Tyr=-tirosil-dU

FBn=-fluorobencil-dU

Bn=-bencil-dU

Trp=-triptaminil-dU

Th=-ti ofe nil-dU

2NE=-2-naftiletil-dU

PP=-fenpropil-dU

Im = imidazolil-dU

Thr = treoninil-dU

CHM = ciclohexilmetil-dU

Pyr = piridil-dU

RTM = R-tetrahidrofuranil-dU

MOE = morfolinoetil

Ejemplo 17. Modificaciones adicionales de 2574-49_260 (SEQ ID NO:101)

El SOMAmero NapdU 2574-49_260 (SEQ ID NO: 400) se modifico adicionalmente utilizando las estrategias descritas en el Ejemplo 16. La Tabla 12 muestra una lista de variantes que se descubrio que tenlan una CI50 que variaba desde 10-11 M a 10-8 M. El 2574-49_411 (SEQ ID NO: 443) es un 28 mero con una sustitucion protectora del armazon en todos excepto tres posiciones (132'-O-metil, 10 fosforotioato, y dos espaciadores C3), y mantienen la actividad antagonista de IL-6 (CI50 = 6 x 10-9 M en el ensayo del indicador genetico). La Tabla 13 muestra una lista de variantes que se descubrio que tenlan una CI50 mayor de 10-8 M.

Tabla 12. Variantes de 2574-49 260 (SEQ ID NO: 400) con CI50 que varian desde 10-11 M a 10-8 M.

Sin superlndice indica desoxirribosa Superlndice-0-indica-2' -fluoro

Superlndice-1-indica-2'-O-metil

Superlndice-2-indica-fosforotioato-(desoxirribosa) C3 = enlazador de tres carbonos Heg=enlazador de hexaetileno-glicol

Nap=-naftil-dU

Pe=-fenetil-dU

BT=-benzotiofenil-dU

Ib=-isobutil-dU

2Nap=-2-naftil-dU

NE=-naftiletil-dU

MBn=-metilenodioxibencil-dU

Tyr=-tirosil-dU

FBn=-fluorobencil-dU

Bn=-bencil-dU

Trp=-triptaminil-dU

Th=-ti ofe nil-dU

2NE=-2-naftiletil-dU

PP=-fenpropil-dU

Im = imidazolil-dU

Thr = treoninil-dU

CHM = ciclohexilmetil-dU

Pyr = piridil-dU

RTM = R-tetrahidrofuranil-dU

MOE = morfolinoetil

Tabla 13. Variantes de 2574-49 260 (SEQ ID NO: 400) con CI50 mayor de 10'8 M

Sin superlndice indica desoxirribosa

Superlndice-0-indica-2' -fluoro

Superlndice-1-indica-2'-O-metil

Superlndice-2-indica-fosforotioato-(desoxirribosa)

C3 = enlazador de tres carbonos

Heg=enlazador de hexaetileno-glicol

Nap=-naftil-dU

Pe=-fenetil-dU

BT=-benzotiofenil-dU

Ib=-isobutil-dU

2Nap=-2-naftil-dU

NE=-naftiletil-dU

MBn=-metilenodioxibencil-dU

Tyr=-tirosil-dU

FBn=-fluorobencil-dU

Bn=-bencil-dU

Trp=-triptaminil-dU

Th=-ti ofe nil-dU

2NE=-2-naftiletil-dU

PP=-fenpropil-dU

Im = imidazolil-dU

Thr = treoninil-dU

CHM = ciclohexilmetil-dU

Pyr = piridil-dU

RTM = R-tetrahidrofuranil-dU *510

MOE = morfolinoetil________________________

Las realizaciones y ejemplos antes tienen la intencion de ser solo ejemplos. No se tiene que considerar ninguna realizacion, ejemplo o elemento de una realizacion o ejemplo particular como un elemento o caracterlstica crlticos, necesarios o esenciales de cualquiera de las reivindicaciones. Se pueden hacer distintas alteraciones, modificaciones, sustituciones, y otras variaciones en las realizaciones desveladas sin alejarse del alcance de la presente invencion que se define por las reivindicaciones adjuntas. La memoria descriptiva, incluyendo las figuras y los ejemplos, se tiene que considerar de manera ilustrativa, mas que restrictiva, y se tiene la intencion de que todas dichas modificaciones y sustituciones esten incluidas en el alcance de la invencion. En consecuencia, el alcance de la invencion deberla determinarse por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales mas que por los ejemplos que se dieron anteriormente. Por ejemplo, las etapas mencionadas en cualquiera de los metodos o procedimientos reivindicados se pueden ejecutar en cualquier orden factible y no se limita al orden presentado en cualquiera de las realizaciones, los ejemplos o las reivindicaciones.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un aptamero de la IL-6 que comprende una secuencia seleccionada de entre:

(a) una secuencia de nucleotidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 101, 7, 8, 11, 19 a 22, 26 a 39, 100, 102 a 239, 400 a 446 y 599 a 625; o

(b) una secuencia de nucleotidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 101, 7, 8 y 400, en las que se ha sustituido, eliminado o insertado de 1 a 5 nucleotidos; en donde el aptamero de la IL-6 se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM; o

(c) una secuencia de nucleotidos que es al menos un 95 % o mas, identica a una secuencia de nucleotidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 101,7, 8 y 400; en la que el aptamero de la IL-6 se une especlficamente a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM.

2. El aptamero de la IL-6 de la reivindicacion 1, en donde el aptamero de la IL-6 comprende al menos 2 a 6 pirimidinas modificadas.

3. El aptamero de la IL-6 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el aptamero de la IL-6 se une a la IL-6 con una afinidad (Kd) de menos de 20 nM.

4. El aptamero de la IL-6 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el aptamero de la IL-6 inhibe al menos una actividad seleccionada de entre la union de la IL-6 a un receptor de la IL-6, la fosforilacion de STAT3 y la transcripcion mediada por STAT.

5. Una composicion farmaceutica que comprende al menos un aptamero de la IL-6 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

6. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o una afeccion mediadas por la IL-6, seleccionada de entre una enfermedad inflamatoria, una enfermedad maligna, una infeccion y una enfermedad autoinmunitaria.