CN107238712B

CN107238712B - 血浆s100a12在st段抬高型心肌梗死预后中的应用

Info

Publication number: CN107238712B
Application number: CN201710417567.2A
Authority: CN
Inventors: 韩雅玲; 张效林; 高乃婧; 程茗慧; 闫承慧; 田孝祥; 李毅; 刘丹
Original assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Current assignee: General Hospital of Shenyang Military Region
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2018-12-28
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: CN107238712A

Abstract

本发明属于医学生物学技术领域，尤其涉及S100A12蛋白在ST段抬高型心肌梗死(STEMI)预后中的应用。所述的S100A12蛋白可以作为ST段抬高型心肌梗死预后的生物标志物；具体的，所述的S100A12蛋白可以用于制备ST段抬高型心肌梗死预后的试剂盒。本发明对STEMI患者进行了发病1年内MACCE事件的随访实验，探讨血浆中S100A12水平与STEMI患者预后的相关性，为评估STEMI患者预后提供一个良好的预测指标。

Description

血浆S100A12在ST段抬高型心肌梗死预后中的应用

技术领域

本发明属于医学生物学技术领域，尤其涉及血浆S100A12在ST段抬高型心肌梗死预后中的应用，具体为S100A12蛋白在ST段抬高型心肌梗死(STEMI)预后中的应用。

背景技术

急性心肌梗死严重威胁人类健康的常见的重要疾病之一。急性心肌梗死的发病基础是冠状动脉内粥样硬化斑块破裂和血栓形成，导致心肌急性坏死，约90％-95％透壁性心肌梗死是由冠状动脉粥样硬化斑块破裂导致局部血栓形成所致。其发生机制是多种心血管危险因素造成血管内皮损伤和功能失常，引起血管壁的慢性炎症，巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、平滑肌细胞及各种炎症因子，进一步促进并放大血管壁的慢性炎症反应，加快动脉粥样硬化进展及不稳定斑块的破裂，引起冠状动脉内血栓形成，造成透壁性坏死，最终发生STEMI。急性心肌梗死尤其是ST段抬高型心肌梗死发病急，发病率和死亡率呈持续升高趋势，临床研究证明STEMI患者不仅发病早期死亡率高，并且预后差，患者生活质量降低，因此早期诊断及时治疗进而改善预后是提高急性心肌梗死生存率的关键。目前，尚未有早期评估急性心肌梗死预后不良的预测指标。

临床研究报道在猝死的糖尿病患者的冠状动脉尸检中发现患者的冠状动脉粥样硬化斑块内有S100A12的大量表达，说明S100A12与动脉粥样硬化不稳定斑块的形成存在相关关系；国外研究发现高水平的血清S100A12为持续透析患者的心血管病事件的危险因素；有研究指出外周血S100A12mRNA水平可作为冠状动脉闭塞的预测指标。根据以上文献报道，本团队推测血浆S100A12与STEMI的预后存在某种相关关系，但是查阅大量的国内外相关文献，至今并未得到探索和求证；然而，目前临床上还尚未解决STEMI预后差，死亡率高这一难题，亟需一个在发病早期便能准确识别出急性心肌梗死预后不良患者的指标，对预后不良高风险患者进行早期干预并及时采取巩固治疗，延长服药时间等相应医疗措施，这是提高急性心肌梗死远期生存率改善患者预后的关键。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供血浆S100A12在ST段抬高型心肌梗死预后中的应用，具体为S100A12蛋白在ST段抬高型心肌梗死预后中的应用。

所述的S100A12蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示：Met Thr Lys Leu GluGlu His Leu Glu Gly Ile Val Asn Ile Phe His Gln Tyr Ser Val Arg Lys Gly HisPhe Asp Thr Leu Ser Lys Gly Glu Leu Lys Gln Leu Leu Thr Lys Glu Leu Ala AsnThr Ile Lys Asn Ile Lys Asp Lys Ala Val Ile Asp Glu Ile Phe Gln Gly Leu AspAla Asn Gln Asp Glu Gln Val Asp Phe Gln Glu Phe Ile Ser Leu Val Ala Ile AlaLeu Lys Ala Ala His Tyr His Thr His Lys Glu。

所述的S100A12蛋白可以作为ST段抬高型心肌梗死预后的生物标志物；具体的，所述的S100A12蛋白可以用于制备ST段抬高型心肌梗死预后的试剂盒。

为了实现上述问题，本发明提供的一种S100A12蛋白检测试剂盒直接购于日本MBL公司。

所述的S100A12蛋白在ST段抬高型心肌梗死预后中的应用，方法如下。

步骤1、血浆的采集：研究对象入选后即刻抽取其静脉血，用含EDTA真空抗凝管收集血标本5ml。

步骤2、样本的处理：抽取静脉血10分钟内，抗凝管3000r/min离心处理10min，分离血浆，将处理好的血浆储藏于-80℃冰箱保存，用S100A12ELISA试剂盒(购于日本MBL公司)统一检测入选研究对象血浆S100A12浓度。

步骤3、ELISA方法检测血浆中S100A12蛋白表达含量：S100A12ELISA检测试剂盒(采用双抗体夹心酶联免疫试验法)购于日本MBL公司，检测入选研究对象的血浆中S100A12浓度的变化，以实验孔和副孔的平均值作为检测对象的测定值。

步骤4、数据的标准化处理：按照试剂盒说明书配制S100A12标准品浓度，根据说明书要求按浓度梯度依次加入标准品，建立标准曲线。

步骤5、对入选的患者进行为期一年的电话随访，终点事件定义为主要不良心脑血管事件包括：心衰、再发心梗、全因死亡、心源性死亡、脑梗塞；将发病后1年内发生MACCE事件与未发生MACCE事件的患者S100A12蛋白浓度作比较。

本发明的有益效果。

本发明中，S100家族是一类低分子量的酸性蛋白，是具有高度结构同源性的钙结合蛋白，S100家族的成员定位在人类的1q21号染色体上。S100A12是S100家族中的新成员，S100A12分子量为12KD，主要由心肌细胞、血管壁动脉粥样硬化的平滑细胞、血液中性粒细胞分泌，S100A12含有2个EF手型钙离子结合区，在动脉粥样硬化炎症病灶处即斑块内的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞及平滑肌细胞有大量S100A12表达。S100A12与其糖基化终产物受体结合可引起细胞核内转录因子κB的表达上调，从而导致NF-κB介导的细胞因子的释放，使动脉粥样硬化病变部位炎症反应加剧，同时S100A12具有较强的趋化作用，趋化炎症细胞游走到动脉粥样硬化炎症病变局部，并通过炎症的级联放大效应引起炎性因子的释放，介导并加强炎症反应和导致动脉粥样硬化不稳定斑块的形成；因此，炎症因子S100A12可能参与不稳定斑块的破裂并导致血栓形成。我们前期组织学结果显示，S100A12在动脉粥样硬化斑块中大量表达可能加速不稳定斑块的破裂导致STEMI的形成，并且在STEMI发病极早期S100A12水平显著升高。在此研究基础上，我们对STEMI患者进行了发病1年内MACCE事件的随访实验，探讨血浆中S100A12水平与STEMI患者预后的相关性，为评估STEMI患者预后提供一个良好的预测指标。

进一步的深入研究发现，在血栓形成时大量S100A12从不稳定斑块的巨噬细胞、平滑肌细胞中释放到循环血中，使STEMI发病早期S100A12水平显著升高，STEMI早期血浆S100A12升高的现象是否与STEMI患者的预后不良有关呢？因此，为了进一步明确S100A12在STEMI预后中的作用，我们进行了STEMI患者1年的主要心脑血管不良事件的随访，结果显示发生预后不良事件的STEMI患者发病时血浆S100A12浓度显著高于未发生MACCE事件的患者，根据1年MACCE事件的随访结果，可以得出血浆中S100A12浓度的升高是STEMI患者预后发生MACCE事件的独立危险因素这一重要结论；临床上监测S100A12浓度水平有助于评估STEMI的不良预后。

附图说明

图1：为对照组、UAP组、NSTEMI组及STEMI组S100A12蛋白浓度变化；其中：*代表STEMI组与Control组、UA、NSTEMI三组相比，P值均<0.01。

图2：Control组、STEMI发病1年内出现MACCE事件患者及未出现MACCE事件患者的S100A12蛋白浓度；其中：*代表MACCE组与Control组比较P<0.05；#代表MACCE组与非MACCE比较，P<0.05。

图3：非MACCE组与发生不同MACCE事件患者(包括心衰、再发心梗、全因死亡、心源性死亡、脑梗塞)S100A12蛋白浓度；*代表再发心梗、全因死亡、心源性死亡、脑梗塞四组与非MACCE组比较，P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1。

本发明的研究基础。

1、酶联免疫吸附实验检测STEMI患者血清S100A12表达变化。

1.1研究对象。

连续入选2014年5月至2016年5月因急性胸痛就诊于沈阳军区总医院心血管内科并符合入选标准的患者共730例；有胸痛症状但冠脉造影结果阴性作为对照组30例；不稳定心绞痛(UAP)50例；非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)50例；ST段抬高型心肌梗死(STEMI)50例；实验结果显示STEMI组患者血浆S100A12浓度明显高于阴性对照组、UAP组及NSTEMI组，为进一步研究S100A12在STEMI患者中的临床意义，我们继续收集了550例STEMI患者进行发病1年内患者预后的随访实验。UAP、NSTEMI、STEMI的诊断均符合美国心脏病学学会/欧洲心脏病学会诊断指南定义的冠心病诊断标准。

1.2、入选标准。

1.2.1、入选样本均经过沈阳军区总医院伦理委员会同意，并由患者本人或患者家属签署知情同意书。

1.2.2、入选年龄35岁-75岁。

1.2.3、正常对照组：因胸痛就诊于胸痛中心，冠脉造影阴性，排除冠心病的患者。

1.2.4、UAP组：根据世界卫生组织UAP的诊断标准为：入院前48h内心绞痛发作至少1次；缺血性胸痛时间≤30min；心电图表现为ST段水平型或下斜型压低≥1mm或ST段抬高(肢体导联≥1mm，胸导联≥2mm)，发作后ST段又恢复到发作前的水平；无心肌坏死标记物的改变。

1.2.5、NSTEMI组；根据ACC/ESC诊断指南，NSTEMI的诊断标准：a、ST-T的动态衍变持续时间较长往往超过24h(一过性心肌缺血发作的ST-T改变常在数小时恢复)；b、胸痛持续至少半小时以上，符合心肌梗死的胸痛特点；c、血清酶学的改变符合心肌梗死的变化规律和(或)血清肌钙蛋白T或I升高≥正常值的2倍以上。如有“a和c”或“b和c”两条即可诊断为NSTEMI。

1.2.6、STEMI组：患者出现持续30分钟以上的典型胸痛症状；心电图出现动态演变过程，至少两个肢体导联ST段抬高≥0.1mv，或者胸导联ST段抬高≥0.2mv，或者新发的左束支传导阻滞；血清心肌酶有动态变化。

1.3、排除标准。

患者患有以下疾病：活动性炎性疾病；自身免疫病；严重的心衰；血流动力学不稳定；可疑心肌炎或心包炎；造血系统疾病；进展期肾脏或肝脏疾病；恶性肿瘤疾病；服用免疫抑制药物；既往曾冠状动脉搭桥手术。

1.4随访终点事件。

对STEMI患者进行1年内主要不良心脑血管事件的随访，主要不良心脑血管事件(MACCE)包括再发心梗、心衰、全因死亡、心源性死亡、脑梗塞，患者发病1年内出现其中任何一种均可定义为出现终点事件，研究人员应该在随访时记录具体的发生终点事件时间及类型。以是否发生MACCE事件将STEMI分为MACCE组和非MACCE组，比较两组患者STEMI发病入院时血浆S100A12水平，进行统计学分析。

1.5、实验流程。

1.5.1、按照入选标准、排除标准及冠状动脉造影结果于胸痛中心入选研究对象。本研究经沈阳军区总医院医学伦理委员会同意，研究中所有符合入选标准的研究对象均知情并签署知情同意书。

1.5.2、采集研究对象入院即刻外周静脉血，将待检的血样离心取上清检测患者血浆中S100A12的浓度表达。

1.5.3、询问入选研究对象病史，对其进行常规体格检查及血常规、血液生化、血脂分析、肝肾功能等常规的临床检查。

1.5.4、对入选的STEMI患者进行出院后为期1年的电话随访，统计出院1年内发生的主要不良心脑血管事件的患者例数及出现终点事件的时间，进行预后分析。

1.6、标本的采集及样本的处理。

1.6.1、标本的采集：入选后即刻抽取其静脉血，用含EDTA真空抗凝管收集血标本5ml。

1.6.2、样本的处理：抽取静脉血10分钟内，抗凝管3000转/min离心处理10min，分离血浆，将处理好的血浆储藏于-80℃冰箱保存，采用双抗体夹心酶联免疫试验法(ELISA法)检测血浆S100A12浓度。

1.6.3、S100A12的测定：本研究所采用的S100A12ELISA检测试剂盒购置于日本MBL公司，其组分如下(各组分的具体浓度和含量参见说明书)：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、S100A12标准品、20×辣根过氧化酶、底物、终止试剂；其检测范围为0～5000ng/ml，检测灵敏度为56pg/ml，按样本说明书进行下述具体操作：建立标准曲线，按照试剂盒说明书配制S100A12标准品浓度，标准品浓度梯度分别为5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、313pg/ml、156pg/ml、78pg/ml、0pg/ml，根据说明书要求按浓度梯度依次加入标准品，每孔100μl；待测血浆标本稀释100倍后，取100μl加入反应板孔内，将反应板置于室温25℃1h后洗板；每孔加入酶标抗体工作液100μl，将反应板置于室温25℃1h后洗板；每孔加入底物工作液100μl，室温25℃避光孵育18min至20min；每孔加入100μl终止液，混匀后，用450nm光波检测OD值。

1.6.4、冠状动脉造影检查：入选的研究对象入院1周内在沈阳军区总医院心内科导管室接受冠状动脉造影检查，采用Judkins法，选择多体位行左右冠状动脉造影。根据冠心病诊断标准；心外膜下冠状动脉LM、LAD、LCX、RCA中任一支均无任何狭窄者视为完全正常，如直径狭窄<50％为无意义病理病变，如直径狭窄>50％为有病理意义的病变。

1.6.5、经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary interventions，PCI)及PCI前后用药：PCI时原则上只干预梗死相关血管，对相关病变植入药物洗脱支架(DES)或金属裸支架。所有拟行急诊PCI的患者术前嚼服阿司匹林300mg、氯吡格雷300-600mg，如经桡动脉路径首先给予5000U的肝素/如经股动脉路径首先给予2000U肝素，而后按照患者的体重补充肝素(8000U)的用量(100U/kg持续维持静点)，后均转入冠心病监护室进行监护治疗，给予皮下注射低分子肝素，每12h皮下给予1次(5-7d)；服用氯吡格雷75mg(1次/d)，阿司匹林100mg(1次/d)。所有入选的研究对象均严格按照指南要求进行冠心病的二级预防。

2.统计分析方法。

采用SPSS 20.0软件包进行统计分析，统计检验均采用双侧检验(two-sidetest)，检验水准为0.05，P<0.05认为统计学有意义，所有可信区间的可信度采用95％。多因素Logistic回归分析血浆S100A12浓度在STEMI患者发生MACCE事件中的危险比，对各组的人口学信息和临床变量进行统计，定量指标采用均数、标准差表示，采用成组t检验或单变量ANOVA进行组间比较；定性指标采用例数和百分数表示，采用卡方检验或确切概率检验进行组间比较。变量发生时间定义为：如发生终点事件，时间为STEMI发病时间至终点事件发生的时间。

3.实验结果。

入选的对照组、UA组、NSTEMI组及STEMI组研究对象血浆中的S100A12浓度分别为135±75ng/ml、112±80ng/ml、144±70ng/ml及490±271ng/ml。STEMI组研究对象血浆中S100A12浓度明显高于正常对照组(P<0.01)、UA组(P<0.01)及NSTEMI组(P<0.01)，而在对照组、UA组及NSTEMI组3组间血浆S100A12浓度无统计学差异，见图1，说明S100A12浓度变化与STEMI的发生存在相关关系。

同时对入选的STEMI患者进行为期1年的随访研究，STEMI患者的基本临床资料，见表1，失访5人，随访率99.2％。1年内MACCE发生率为7.7％(46/600)，其中再发心梗9例(1.5％)、脑梗塞6例(1％)、心力衰竭7例(1.2％)、全因死亡24例(4％)、心源性死亡20例(3.3％)；其中出现再梗的患者血浆中S100A12浓度为655±90ng/ml、脑梗塞的患者血浆中S100A12浓度为899±181ng/ml、心力衰竭的患者血浆中S100A12浓度为568±94ng/ml、全因死亡的患者血浆中S100A12浓度为730±89ng/ml、心源性死亡的患者血浆中S100A12浓度为861±88ng/ml；比较出现MACCE患者(MACCE组)和未出现MACCE患者(非MACCE组)血浆中的S100A12浓度，发现MACCE组患者的血浆S100A12浓度明显高于非MACCE组患者的血浆浓度(708±45ng/mlvs 435±12ng/ml，P<0.05)，见图2；进一步分析MACCE事件组发生再梗、脑梗塞、心力衰竭及全因死亡、心源性死亡患者血浆S100A12浓度变化，发生脑梗塞的患者血浆S100A12浓度明显高于再梗、心力衰竭、全因死亡和心源性死亡的患者，差异有统计学意义(P<0.05)；发生再梗、全因死亡、心源性死亡及脑梗塞的患者血浆S100A12浓度均高于非MACCE组患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

根据血浆中的S100A12浓度将入选的600例STEMI患者进行四分位分组(Quartile1、Quartile2、Quartile3、Quartile4)，每组患者的临床基本资料见表2。按照四分位分组的研究发现随着S100A12浓度的增加，患者血浆中的HDL-C浓度降低；同时女性患者、近期有吸烟史的患者、糖尿病患者增多；出现MACCE的病例数也明显增加。利用Kaplan-Meier分析发现，Quartile4组中出现MACCE事件最多(N＝21)，与Quartile1(N＝2)和Quartile2(N＝8)相比差异具有明显的统计学差异，Quartile4组中MACCE的发生率明显高于Quartile3(N＝15)，但差异无明显的统计学意义。多因素Cox生存回归分析STEMI患者血浆S100A12浓度预测1年MACCE的预测价值，结果显示年龄(HR＝1.158；95％CI：1.029-1.303，P＝0.015)、血小板计数(HR＝1.024；95％CI：1.004-1.044，P＝0.018)及血浆S100A12浓度(HR＝1.002；95％CI：1.000-1.004，P＝0.001)均能独立预测STEMI患者1年MACCE，见表3。

表1 STEMI组一般临床基线情况。

注：1.连续正态分布变量用均数±标准差表示；2.分类变量用例数(百分数％)表示；3.MI：心肌梗死；4.PCI：经皮冠状动脉介入治疗；5.ApoA：载脂蛋白A；6.TG：甘油三酯；7.TC：总胆固醇；8.LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；9.HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；10.BUN：尿素氮；11.Crea：肌酐；12.WBC：白细胞计数；13.PLT：血小板计数；14.CK-MB：肌酸激酶同工酶；15.hsTnT：超敏肌钙蛋白T；16.hs-CRP：超敏C反应蛋白；17.pro-BNP：脑利钠肽前体。

表2.STEMI患者按S100A12血浆浓度进行四分位分组后的基本临床资料情况。

注：1.连续正态分布变量均用均数±标准差表示；2.分类变量均用例数(百分数％)表示；3.MI：心肌梗死4.PCI：经皮冠状动脉介入治疗；5.ApoA：载脂蛋白A；6TG：甘油三酯；7.TC：总胆固醇；8.LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；9.HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；10.BUN：尿素氮；11.Crea：肌酐；12.WBC：白细胞计数；13.PLT：血小板计数；14.MACCE：主要不良心脑血管事件。

表3.STEMI发病后1年MACCE的Cox回归分析结果。

注：1.连续正态分布变量均用均数±标准差表示；2.分类变量均用例数(百分数％)表示；3.TC：总胆固醇；4.LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；5.HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；6.PLT：血小板计数；7.hscTnT：高敏肌钙蛋白T；8.CK-MB：肌酸激酶同工酶。

序列表

<110> 中国人民解放军沈阳军区总医院

<120> 血浆S100A12在ST段抬高型心肌梗死预后中的应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 92

<212> PRT

<213> 人工合成

Met Thr Lys Leu Glu Glu His Leu Glu Gly Ile Val Asn Ile Phe His GlnTyr Ser Val

1 5 1015 20

Arg Lys Gly His Phe Asp Thr Leu Ser Lys Gly Glu Leu Lys Gln Leu LeuThr Lys Glu

21 25 3035 40

Leu Ala Asn Thr Ile Lys Asn Ile Lys Asp Lys Ala Val Ile Asp Glu IlePhe Gln Gly

41 45 5055 60

Leu Asp Ala Asn Gln Asp Glu Gln Val Asp Phe Gln Glu Phe Ile Ser LeuVal Ala Ile

61 65 7075 80

Ala Leu Lys Ala Ala His Tyr His Thr His Lys Glu

81 85 90 92

Claims

1.血浆S100A12在制备 ST 段抬高型心肌梗死预后试剂盒中的应用。

2.如权利要求 1 所述的血浆S100A12在制备 ST 段抬高型心肌梗死预后试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒中，S100A12 蛋白作为 ST 段抬高型心肌梗死预后的生物标志物。

3.如权利要求 1 所述的血浆S100A12在制备 ST 段抬高型心肌梗死预后试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分如下：洗涤缓冲液、稀释缓冲液、 S100A12标准品、 20×辣根过氧化酶、底物和终止试剂。