JP2016517273A - Il−6に結合するアプタマー及びil−6介在性状態の治療または診断におけるそれらの使用 - Google Patents
Il−6に結合するアプタマー及びil−6介在性状態の治療または診断におけるそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
5’−GG−ZZZ−GG−Qa−GG−Qb−GG−3’(III)(配列番号702);
5’−GG−Qa−GG−ZZZ−GG−Qb−GG−3’(IV)(配列番号703);及び
5’−GG−Qa−GG−Qb−GG−ZZZ−GG−3’(V)(配列番号704)
から選択される構造を含む。
或る実施形態では、各ZはU、T、及び修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Qはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択される。或る実施形態では、aは1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、または1〜5である。或る実施形態では、bは1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、または1〜5である。或る実施形態では、アプタマーは、
配列:5’−GGCAGGZZZGGZQaGZGG−3’(I)(配列番号700)
を含む。或る実施形態では、各ZはU、T、及び修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Qはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択される。或る実施形態では、aは1〜50、1〜40、1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、または1〜5である。
5’−YXAXGYARQaMGYAAGSCGRY−3’(VI)(配列番号705);及び
5’−MGYAAGSCGRYQbYXAXGYAR−3’(VII)(配列番号706)
から選択される配列を含む。
或る実施形態では、各Yは修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、MはC及びAから選択され、SはC及びGから選択され、各RはG及びAから独立して選択される。或る実施形態では、各Qはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択される。或る実施形態では、aは1〜30、1〜20、1〜15、1〜10、または1〜5である。或る実施形態では、bは1〜30、1〜20、1〜15、1〜10または1〜5である。
5’−GGGYXAXGYAGCLbGZGCGYAAGGCGGY−3’(II)(配列番号:701)
を含む。或る実施形態では、ZはU、T及び修飾ピリミジンから選択される。或る実施形態では、各Yは修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Lはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択される。或る実施形態では、bは1〜20、1〜15、1〜10または1〜5である。
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、
5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、
5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、
5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、
5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、
5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、
5−(N−イミジゾイルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、
5−(N−R−スレオニニルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウムプロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン
から独立して選択され得る。
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン
から独立して選択され得る。
(a)配列番号7、8、11、19〜22、26〜39、100〜239、300〜356、400〜446、500〜573、及び599〜625から選択されるヌクレオチド配列、または(b)配列番号7、8、11、19〜22、26〜39、100〜239、300〜356、400〜446、500〜573、及び599〜625から選択され、1〜20のヌクレオチドが置換、欠失または挿入され、前記アプタマーが20nM未満の親和性(Kd)でIL−6に特異的に結合するヌクレオチド配列、または(c)配列番号7、8、11、19〜22、26〜39、100〜239、300〜356、400〜446、500〜573、及び599〜625から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも80%以上同一であり、前記アプタマーが10nM未満の親和性(Kd)でIL−6に特異的に結合するヌクレオチド配列から選択される配列を含むアプタマーが提供される。或る実施形態では、上記アプタマーは、10nM未満のIL−6アンタゴニスト活性(IC50)を有する。
例示的なIL−6アプタマー
I.5’−GGCAGGZZZGGZQaGZGG−3’(配列番号700)
(式中、各ZはU、T、及び修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、各Qはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、aは1〜50である)を含む。或る実施形態では、aは、2〜50、1〜40、2〜40、1〜30、2〜30、1〜20、2〜20、1〜15、2〜15、1〜10、2〜10、1〜5、または2〜5である。或る実施形態では、各Qは、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各Qは、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、1,3−プロパンジオール、2〜100の1,3−プロパンジオール単位を有するポリ(1,3−プロパンジオール)、エチレングリコール、及び2〜100のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各Zは、U、T、及び図20に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Zは、U、T、及び図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、IL−6アプタマーの1または複数のヌクレオチドは、2’−O−メチル修飾を含む。或る実施形態では、IL−6アプタマー中の1または複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
II.5’−GGGYXAXGYAGCLbGZGCGYAAGGCGGY−3’(配列番号701)
(式中、各ZはU、T、及び修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、各Yは修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、各Xは修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、各Lはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、bは1〜20である)を含む。或る実施形態では、bは1〜15、1〜12、1〜10、1〜9、1〜8、または1〜7である。或る実施形態では、各Lは置換または非置換のC2〜C20のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各Lは置換または非置換のC2〜C20のリンカー、1,3−プロパンジオール、2〜100の1,3−プロパンジオール単位を有するポリ(1,3−プロパンジオール)、エチレングリコール、及び2〜100のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各LはC3リンカーであり、bは2である。或る実施形態では、各Lは修飾または非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、bは1〜10である。或る実施形態では、各ZはU、T、及び図20に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Zは、U、T、及び図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Yは図20に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Yは図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは図20に示される芳香族修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは図24に示される芳香族修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは図24のNap、2Nap、NE、BF及びBTから独立して選択される。或る実施形態では、各XはNapである。或る実施形態では、LはC3リンカーであり、bは2である。或る実施形態では、IL−6アプタマーの1または複数のヌクレオチドは、2’−O−メチル修飾を含む。或る実施形態では、IL−6アプタマー中の1または複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
III.5’−GG−ZZZ−GG−Qa−GG−Qb−GG−3’(配列番号702)、
IV.5’−GG−Qa−GG−ZZZ−GG−Qb−GG−3’(配列番号703)、及び
V.5’−GG−Qa−GG−Qb−GG−ZZZ−GG−3’(配列番号704)
(式中、各ZはU、T、及び修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、各Qはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、aは1〜50であり、bは1〜50である)から選択されるGカルテットモチーフを含む。或る実施形態では、aは2〜50、1〜40、2〜40、1〜30、2〜30、1〜20、2〜20、1〜15、2〜15、1〜10、2〜10、1〜5、または2〜5である。或る実施形態では、bは2〜50、1〜40、2〜40、1〜30、2〜30、1〜20、2〜20、1〜15、2〜15、1〜10、2〜10、1〜5、または2〜5である。或る実施形態では、各Qは置換または非置換のC2〜C20のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各Qは置換または非置換のC2〜C20のリンカー、1,3−プロパンジオール、2〜100の1,3−プロパンジオール単位を有するポリ(1,3−プロパンジオール)、エチレングリコール、及び2〜100のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、少なくとも1つまたは少なくとも2つのZヌクレオチドは修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、少なくとも1つまたは少なくとも2つのZヌクレオチドは図20の修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、少なくとも1つまたは少なくとも2つのZヌクレオチドは図24の修飾ピリミジンから独立して選択される。
VI.5’−YXAXGYARQaMGYAAGSCGRY−3’(配列番号706)、または
VII.5’−MGYAAGSCGRYQbYXAXGYAR−3’(配列番号707)
(式中、各Yは修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、各Xは修飾ピリミジン(5’−修飾ピリミジン等)から独立して選択され、MはC及びAから選択され、SはC及びGから選択され、各RはG及びAから独立して選択され、各Qはリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、aは1〜30であり、及びbは1〜30である)から選択される配列を含む。或る実施形態では、aは1〜20、1〜10、4〜10、または6〜7である。或る実施形態では、bは1〜20、または1〜17である。或る実施形態では、各Qは、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各Qは、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、1,3−プロパンジオール、2〜100の1,3−プロパンジオール単位を有するポリ(1,3−プロパンジオール)、エチレングリコール、及び2〜100のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールから独立して選択される。或る実施形態では、各Yは図20に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Yは図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは図20に示される芳香族修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは図24に示される芳香族修飾ピリミジンから独立して選択される。或る実施形態では、各Xは図24のNap、2Nap、NE、BF及びBTから独立して選択される。或る実施形態では、各XはNapである。或る実施形態では、各NはA、C及びGから独立して選択される。或る実施形態では、各LはC3リンカーであり、bは2である。或る実施形態では、IL−6アプタマーの1または複数のヌクレオチドは、2’−O−メチル修飾を含む。或る実施形態では、IL−6アプタマー中の1または複数のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
(a)成熟タンパク質のアミノ酸16〜31を含む成熟IL−6(配列番号10)の領域に結合する;
(b)成熟タンパク質のアミノ酸16〜31及びアミノ酸117〜125を含む成熟IL−6(配列番号10)のエピトープに結合する;
(c)IL−6アプタマー2573−20_136(配列番号101)と競合して成熟IL−6(配列番号10)に結合する;及び/または
(d)0.01未満、0.009未満、0.008未満、または約0.007の界面面積に対する有極接点の比で成熟IL−6に結合する。
アプタマーを含む医薬組成物
アプタマーを含むキット
治療方法
診断方法または検出方法
以下の実施例は解説の目的でのみ提供され、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載される全ての実施例は、当業者によく知られている標準的な技術を使用して行われた。以下の実施例に記載される通例の分子生物学の技術は、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd.ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001)等の標準的な実験室のマニュアルに記載されるように行われ得る。
A.候補混合物の調製
部分的にランダム化されたssDNAオリゴヌクレオチドの候補混合物を、表1に示されるビオチン化ssDNAテンプレートにアニールしたDNAプライマーのポリメラーゼ伸長により調製した。候補混合物は、dATP、dGTP、dCTP及びBndUTP(5−(N−ベンジルカルボキシアミド−2’−デオキシウリジントリホスフェート)またはNapdUTP(5−(N−ナフチルカルボキシアミド−2’−デオキシウリジントリホスフェート)のいずれかを含有する40ヌクレオチドのランダム化カセットを含有した。
タグ付けしていないヒトIL−6(R&D Systems)をリジン残基へのNHS−PEO4−ビオチン(Pierce)の共有結合的な連結によりビオチン化した。タンパク質(50μl中300pmol)をSephadex G−25マイクロスピンカラムでSB17Tへと交換した。NHS−PEO4−ビオチンを1.5mMまで添加し、反応物を4℃で16時間インキュベートした。未反応のNHS−PEO4−ビオチンをSephadex G−25マイクロスピンカラムで除去した。
ラウンド1のSELEXのため、標的タンパク質をMyOne−SA常磁性ビーズ(InvitrogenのMyOne SA、または以下SAビーズと呼ぶ)上に固定化した。IL−6を0.5mL SB17T中で0.2mg/mLまで希釈し、0.5mL SAビーズ(予め20mM NaOHで2回、SB17Tで1回洗浄した)に添加した。その混合物を25℃で30分間回転し、使用するまで4℃で保存した。
候補混合物を用い、標的タンパク質を有する試料(シグナルS)と標的タンパク質を含まない試料(バックグラウンドB)の間の結合を比較して選択を行った。親和性及びスローオフレートに関する選択を含む、合計8回のSELEXプロセスを完了した。
選択したアプタマーDNAをQPCRにより増幅し、定量した。12μLのQPCRミックス(5×KOD DNA Polymerase Buffer、25mM MgCl2、10μMフォワードPCRプライマー(プライマー2、配列番号3)、10μMビオチン化リバースPCRプライマー(プライマー3、配列番号4)、5×SYBR Green I、0.125U/μL KOD XL DNAポリメラーゼ、並びに各1mMのdATP、dCTP、dGTP、及びdTTP)に48μLのDNAを添加し、Bio−Rad MyIQ QPCR機器において、以下のプロトコル:99.9℃で15秒間を1サイクル、55℃で10秒間、68℃で30分間、99.9℃で15秒間を30サイクル、72℃で1分間の熱サイクルに供した。機器のソフトウェアを用いて定量を行い、標的タンパク質を有するまたは有しない、選択したDNAのコピー数を比較してシグナル/バックグラウンド比を決定した。
選択工程の標的タンパク質の相対濃度を、以下のようにS/B比に応じて各回で低下した(式中、シグナルS及びバックグラウンドBは上記D欄で規定される)。
式中、[P]=タンパク質濃度、及びi=現在のラウンド数。
8回のSELEXの後、収束したプールをクローニングし、シーケンシングした。非ビオチン化SELEXプライマーを用いて選択したDNAをPCRで増幅し、AGCT DNAを作製し、QIAquick 96 PCR Purification Kit(Cat#28181)を使用して精製し、Stratagene PCR−Script Cloning Kit(Cat#211189)を使用して製造業者のプロトコルの通りに精製した挿入物をクローニングした。リガンドSELEXプールを形質転換、96ウェルプレートへの配列、DNAprep及びシーケンシングのためシーケンシングベンダー(テキサス州ヒューストンのCogenics)に送った。約42のクローンの配列が得られ、配列数/コピー数を決定し、ローカル−アラインメントアルゴリズムを使用する共通の収束パターンを同定する特注ソフトウェアを使用して収束を分析した。約42クローンのうち16についてストレプトアビジンに結合することがわかった。残りのクローンについては、プール中で最も多い表示/コピー数を有する配列及び共通の結合モチーフに収束された配列を更なる特性評価のため選択した。2つの配列(1つのBn−dU及び1つのNap−dU)を更なる分析のため選択し、PCR増幅用テンプレートとしてCogenicsから得たプラスミドDNAを使用して酵素学的に調製した。
選択した配列の平衡結合定数を親和性アッセイにおいて測定した。放射性標識したDNAをSB17T−0.002緩衝液(40mM HEPES、pH7.5、125mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、0.002%TWEEN−20)中で95℃にて3分間加熱し、徐々に37℃まで冷却した。SB17T−0.002緩衝液中で低濃度の放射性標識したDNA(約1×10−11M)と、或る濃度範囲の標的タンパク質(1×10−7M〜1×10−12M)とを混合し、37℃で30分間インキュベートすることにより複合体を形成した。各反応の一部をナイロン膜に転写し、乾燥して各反応における総数を決定した。複合体をZORBAX樹脂(Agilent)上に捕捉し、真空下でMultiScreen HV Plate(Millipore)を通し、200μLのSB17T−0.002緩衝液で洗浄して結合していないDNAからタンパク質結合複合体を分離した。ナイロン膜及びMultiScreen HV Plateをホスホイメージャーで画像化し、FUJI FLA−3000を使用して各試料中の放射能の量を定量した。捕捉したDNAの画分をタンパク質濃度(Pt)の関数としてプロットし、y=(最大−最小)(Pt)/(Kd+Pt)+最小を使用して平衡結合定数(Kd)を決定した。2つの選択されたSOMAmerの配列及びIL−6に対するそれらの結合親和性を表2に列挙する。
in vitro細胞アッセイにおけるIL−6活性の阻害についてIL−6アプタマーをスクリーニングした。
IL−6はヒト赤白血病TF−1細胞の増殖を誘導する。10%FBSを含有するRPMI1640培地に96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり1×104細胞でTF−1細胞を懸濁し、5%CO2インキュベータにおいて37℃で1日培養した。IL−6(0または10ng/mL)を、水またはSB18T緩衝液中でIL−6アプタマー(2μM)と共に、またはIL−6なしで37℃にて30分間インキュベートし、0.5%FBSを含有するRPMI1640培地中の細胞に適用した。37℃で5日後、Alamar Blue(商標)を添加し、細胞を37℃で更に3時間インキュベートした。蛍光(560nmで励起、590nmで発光)をルミノメーター(Wallac 1420 ARVO Light, Perkin Elmer)で測定した。結果を図1に示し、各バーは4つの実験の平均+標準偏差を表し、SOMAmerなし対照に対して標準化した。Bn−dU2573−20(配列番号7)及びNap−dU2574−49(配列番号8)の両方が、IL−6誘導を伴わない対照のレベルまでTF−1細胞のIL−6誘導性増殖を阻害した。
転写因子STAT3によるIL−6シグナル。L4細胞はSTATの制御のもと、IL−6による誘導によってルシフェラーゼを発現し、蛍光シグナルを発生するルシフェラーゼ遺伝子で遺伝子導入されたHela細胞である。L4細胞を10% FBSを含有するDMEMに96ウェル白色プレート(Costar、No.3903)1ウェル当たり5×104細胞で播種し、CO2インキュベータにおいて37℃で1日培養した。IL−6(10ng/mL)を水またはSB18T中でIL−6アプタマー(10μM)と共に、またはIL−6アプタマーなしで37℃にて30分間インキュベートし、0.5%FBSを含有するフェノール不含DMEM中の細胞に適用した。CO2インキュベータにおいて37℃で5時間後、培地を廃棄し、ルシフェラーゼ基質試薬(Perkin Elmer #6016769)を周囲温度で1分間に亘って細胞に付加した。SpectraMax Plus(Molecular Devices)を使用して発光を測定した。図2に示される結果は、各バーが3つの実験の平均を表し、SOMAmerなし対照に対して標準化した。これらの結果は、TF−1増殖アッセイと一致する。Bn−dU 2573−20(配列番号7)及びNap−dU 2574−49(配列番号8)は、IL−6媒介ルシフェラーゼ発現を阻害した。
IL−6 SOMAmer 2573−20(配列番号7)は78ヌクレオチオ長であり、Bn−dU修飾及びKd=3×10−9Mを有する。より短い配列が効率の良いIL−6結合を維持するかどうかを決定するため、2573−20(配列番号7)の切断を生じさせた。或る例では、より短いアプタマーは、in vivoで組織穿通及び/またはヌクレアーゼ活性に対する安定性の増加を示した。また、より短いアプタマーは製造費用を削減し得る。
2573−20及び2574−49のSOMAmerファミリー内の配列をより完全に評価するため、454パイロシーケンシング技術を使用して濃縮プールをシーケンシングした。各プールについて、上記の454プライマーを用いてDNAを増幅し、PCR産物を精製し、SequalPrep normalization plate (Invitrogen、Cat# A10510−01)を使用して標準化した。遊離物をゲルに流して、各アンプリコンのサイズ及び純度を確認した。精製したPCR産物を、コロラド州オーロラのコロラド大学ヘルスサイエンスセンターの454パイロシーケンシング設備においてシーケンシングした。
A.代替U修飾による単一置換
或る例では、U修飾はIL−6アプタマーがIL−6上の芳香族アミノ酸と疎水性結合ポケットとの好ましい相互作用に携わることを可能とする。アプタマー2573−20_15(配列番号22)を、種々の末端基及びリンカー長を有する類縁体のライブラリを使用して様々なBn−dU位置で修飾した。図3を参照されたい。或る実施形態では、より長いリンカーは、更なる回転自由性及びタンパク質表面下の疎水性領域へのより良好な接近を可能とし得る。
原形質中の主なヌクレアーゼであるDNaseIは、配列非依存性にDNAのホスホジエステル骨格を加水分化できる。リボースの2’位での骨格修飾または非架橋酸素は、DNaseIによるヌクレアーゼ切断に対する耐性を提供する。RNAアプタマーにおける2’−F、2’−O−メチル、及びホスホロチオエート修飾によってヌクレアーゼ安定性及び原形質滞留時間の顕著な向上が達成された。2573−20_15(配列番号22)の各dA、dG及びdC位置における2’−O−メチル置換の耐容性を評価した。
ヌクレオチドと同じ距離に及ぶが、リボース糖または塩基を欠く3−炭素−リンカーで構成されるC3−スペーサーは、DNaseI耐性を提供し、また、タンパク質に関するアラニンスキャンのように、各位置においてヌクレオチド塩基相互作用をプローブするために使用され得る。2573−20_15(配列番号22)の各dA、dG及びdCの位置におけるC3−スペーサー置換の耐容性を評価した。
2’−O−メチル及びC3−スペーサーの置換を有する特定の変異体の結合及び阻害に基づき、耐容性を示した2’O−メチルとC−3スペーサーの置換とを組み合わせて一連の変異体を作製した。これらの配列を遺伝子レポーターアッセイにおいて結合及び阻害活性について試験した。変異体2573−20_137(配列番号573)のdC3、dG6、dA16、dA19、dC20及びdC28の位置における6つの2’−O−メチル置換は、結合親和性を5倍改善した。更なる2’O−メチルまたはC3−スペーサーの置換は、この実験において結合活性の喪失をもたらした。また、変異体2573−20_136(配列番号101)におけるPE−dUによるBn−dU9の置換及びNap−dUによるBn−dU12の置換が阻害活性の改善をもたらし、遺伝子レポーターアッセイにおいてIL−6の最大の阻害をほぼ100%に増加し、IC50値を5×10−10Mまで増加した。図6(●2573−20_15(配列番号22);○2573−20_137(配列番号573);▲2573−20_136(配列番号101))を参照されたい。2573−136の12位におけるNapdU(2573−20_137(配列番号573)におけるBn−dU)以外は同一である、変異体2573−20_137(配列番号573)及び変異体2573−20_136(配列番号101)は、12位におけるNapdU置換が改善された最大の阻害をもたらすことを示す。
切断型NapdU SOMAmer2574−49_14(配列番号35)を実施例5に記載される戦略を使用して修飾した。アプタマー2574−49_260(配列番号400)は、3つのC3−スペーサー修飾(1位、14位及び15位)を有する2574−49_14(配列番号35)の変異体であり、2574−49_3(配列番号26)よりもおよそ30倍高い効力でIL−6を阻害する。図7を参照されたい(●2574−49_3(配列番号26);○2574−49_260(配列番号400))。2574−49_260(配列番号400)の組成物を下記表12に示す。
血清ヌクレアーゼへの感受性に対するSELEX後アプタマーの切断及び修飾の効果を、新鮮な血清にアプタマーを暴露し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により時間の関数としてアプタマー加水分解の程度を定量することにより評価した。全てのBn−dU残基がdTで置き換えられたBn−dU SOMAmer 2573−20_15(配列番号22)の変異体(2573−20_116(配列番号300))、及び全てのNap−dU残基がdTで置き換えられたNap−dU SOMAmer 2574−49_14(配列番号35)の変異体(2574−49_456(配列番号572))を、ヌクレアーゼ安定性に対する修飾dU位置の効果を測定するため、対照として本研究に含めた。このアッセイで試験した全てのアプタマーは、3’〜5’のエクソヌクレアーゼ活性からアプタマーを保護するため3’inverted dTを含んだ。
別々のSELEX実験で得られたSOMAmer 2573−20_136(配列番号101)及び2574−49_260(配列番号400)がIL−6上の重複する部位に結合するかどうかを判定するため、結合競合実験を行った。IL−6タンパク質を受動的な吸着によりマイクロタイタープレート(Nunc Maxisorp)の表面に連結した。ビオチン化SOMAmer 2573−20_136(配列番号101)(100pM)を、SB18Tバッファー(40mM HEPES、pH7.5、102mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、0.05%TWEEN−20)中の種々の濃度の競合物(非ビオチン化SOMAmer 2573−20−136(配列番号101)または2574−49_260(配列番号400)、0.02〜20nM)と混合し、プレートに添加した。500RPMで振蕩しながら25℃で60分間インキュベートした後、結合していないSOMAmerを洗浄により除去し、プレートをセイヨウワサビペルオキシダーゼに連結したストレプトアビジン(1μg/mL)とインキュベートした。標準的な手順に従って、残存するビオチン化2573−20_136(配列番号101)の量をセイヨウワサビペルオキシダーゼ基質(TMB、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)を用いて測定した。IL−6に結合したビオチン化2573−20_136(配列番号101)の割合(非競合対照に対する)を競合SOMAmer濃度の関数としてプロットした。図9(●2573−20_136(配列番号101);○2574−49_260(配列番号400))を参照されたい。2574−49_260(配列番号400)の濃度が増加するにつれて、結合した2573−20_136(配列番号101)は減少し、2つのSOMAmerがIL−6上の共通の部位または重複する部位への結合に対して競合することを示す。
可溶性IL−6受容体(sIL−6R)へのIL−6の結合に対するSOMAmer 2573−20_136(配列番号101)の効果をサンドイッチアッセイフォーマットにおいて判定した。sIL−6R(100ng)を受動的な吸着によりマイクロタイタープレートの表面に連結した。ビオチン化IL−6(50ng/mL)をPBSTバッファー(0.05%TWEEN−20を含むPBS)中の種々の濃度の2573−20_136(配列番号101)(0μg〜10μg)と混合し、プレートに添加した。200RPMで振蕩しながら25℃で120分間インキュベートした後、結合していないIL−6を洗浄により除去し、標準的な手順に従い、ストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼを用いて残存するビオチン化IL−6の量を測定した。sIL−6Rに結合したビオチン化IL−6の割合(非競合対照に対する)をSOMAmer濃度の関数としてプロットした。図10を参照されたい。2573−20_136(配列番号101)の濃度が増加するにつれて、結合したsIL−6Rの量は減少し、その受容体であるsIL−6RへのIL−6の結合をSOMAmerが阻害することを示す。
カニクイザル及びラットのIL−6に対する結合特性及び阻害特性を比較することにより、2573−20_136(配列番号101)のオーソログ交差反応性を評価した。ヒトIL−6とカニクイザルIL−6の間のアミノ酸同一性は96%であるのに対し、ヒトIL−6とラットIL−6ではわずか39.9%が同一である。サルIL−6を6−Hisタグを用いてCHO細胞における発現により調製し、標準的なプロトコルに従ってNTAカラムを使用して精製した。IL−6タンパク質の濃度をELISAにより決定した。ラットIL−6を購入した(R&D Systems)。
PEG−N−2573−20_136(5’末端に結合した40kDaのPEGを有する2573−20_136(配列番号101))及び抗IL−6R抗体であるトシリズマブのIL−6阻害の効力を細胞増殖アッセイにおいて比較した。96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり1×104細胞で10%FBSを含有するRPMI1640培地に、PEG−N−2573−20_136またはトシリズマブ(0μg/mL、1μg/mL、10μg/mLまたは100μg/mL)と共にU266B1細胞を懸濁し、5%CO2インキュベータにおいて37℃で30分間培養した。IL−6(100ng/mL)を37℃で2日間細胞に添加した。Alamar Blue(商標)を添加し、細胞を37℃で更に3時間インキュベートした。蛍光(励起560nm、発光590nm)をルミノメーター(Wallac 1420 ARVO Light、Perkin Elmer)を用いて測定した。表5に結果を示す。値は、各濃度での3つの実験(1つの実験当たり3ウェル)の平均±標準誤差を表す。阻害剤を含まない対照群(0.0±15.7%、n=3)とPEG−N−2573−20_136またはトシリズマブとの間で、統計学的な有意差が観察された。(Dunnett検定、両側、*p<0.05、**p<0.01)。PEG−N−2573−20_136は1μg/mL(8.3×10−8M)でIL−6の完全な阻害を達成し、一方、トシリズマブはほぼ等量のモル濃度(6.7×10−8M)で60%の阻害を達成した。
脳、前立腺、及び腎臓を含む多くの癌に対してIL−6受容体を過剰発現させ、上昇したIL−6リガンド及び受容体発現は患者の低い生存率と関連する。IL−6シグナリングの阻害は、腫瘍細胞の成長、生存、及び/または転移の可能性を抑制し得る。PEG−N−2573−20_136(その5’末端に結合した40kDaのポリエチレングリコールを有する2573−20_136(配列番号101))による腫瘍細胞増殖の阻害をPC3前立腺癌、HepG2肝臓癌、及びU87MG神経膠腫細胞について測定した。10%FBSを含有するF12K培地(PC3細胞)または10%FBSを含有するDMEM培地(HepG2細胞及びU87MG細胞)に96ウェルプレートにおいて1ウェル当たり1×104細胞で播種し、5%CO2インキュベータにおいて37℃で1日培養した。7日間に亘り37℃でPEG−N−2573−20_136(配列番号101)(10μg/mL)を各培地に適用した。Alamar Blue(商標)を添加し、細胞を37℃で更に1時間〜3時間インキュベートした。蛍光(励起560nm、発光590nm)をルミノメーター(Perkin ElmerのWallac 1420 ARVO Light)を用いて測定した。結果を表6に示す。値は、3つの実験(1つの実験当たり2ウェル)の平均±標準誤差を表す。PEG−N−2573−20_136は、3種類全ての細胞の増殖を抑制した。
全長IL−6(配列番号9)は、29アミノ酸のN末端シグナルペプチド及びup−up−down−downトポロジーで配置された4つのヘリックスバンドルを含む212アミノ酸で構成される(Somers et al.,EMBO J.1997:989−997)。ヘリックスは、歴史的にN末端からC末端へとA〜Dとされ、ヘリックスを接続する長いループを有し、1つのヘリックス当たり20〜25の残基を含む。N末端の20残基は何らの二次構造も採用せず、この可動性ループの最後の7残基のみが結晶構造中にはっきりと認められる。また、4つのヘリックスバンドルタンパク質の長鎖ファミリーにおける共通の特徴である、ヘリックスCとヘリックスDの間の長いループに存在する11残基(アミノ酸141〜152)の第5の短いヘリックスがある(Mott,H.R.and Campbell,I.D.,Current Opinion in Str.Bio.,1995.5:114−121)。この短いヘリックスに従い、C−Dループの残存する残基(アミノ酸131〜140)は無秩序化され、結晶構造中に見ることができない。同様に、長いA−Bループ(アミノ酸43〜79)は、17の欠損した残基(アミノ酸44〜60)を含む。本発明者らの結晶化研究で使用したフォームは、全長ヒトIL−6に基づいてアミノ酸残基30〜212を含む。
5’−G1G2C3A4G5G6Z7Z8E9G10G11P12A13Z14Z15A16A17C18A19C20G21Z22Z23A24A25G26Z27C28G29Z30G31G32−3’(配列番号101);
(式中、ZはBn−dU、EはPE−dU、PはNap−dU、及びヌクレオチド3、6、16、19、20、及び28は2’−OMe修飾を含む)を使用した。表10を参照されたい。
ドメイン1にはワトソン−クリック塩基対は存在せず、構造一体性の大部分がG−カルテットに由来する。各G四分子は、四分子の平面に位置するナトリウムイオンによって配位される。四分子1はG1、G6、G10及びG32を含むのに対し、四分子2はG2、G5、G11及びG31を含む。図14Aを参照されたい。各G−カルテットは、シン配座における2つの塩基及びアンチ配座における2つの塩基を含む。これは、各グアノシン塩基が、ワトソン−クリック面、また同様にフーグスティーン面の隣接するグアノシンと2つの水素結合を作ることを可能とする。その後、ナトリウムイオンはC6上のカルボニル酸素により配位される。
IL−6タンパク質上の7つの残基は、SOMAmerのドメイン1と分子間接触を有する。N末端テイルにおいて、R16は、G29に対してフーグスティーン面で水素結合する。図15Aを参照されたい。更に、R16はアルギニンメチレン側鎖に対して積層するBn30と疎水性接触を有する。疎水性分子間力は、表面のアミノ酸のメチレン側鎖と相互作用する修飾ヌクレオチドのこの繰り返される主題からわかるように、タンパク質−DNA相互作用において重要な役割を果たす。IL−6タンパク質のN末端テイルは、DNAの異常な湾曲によって造り出されるポケットに位置し、DNA骨格の間に挟まれて溶媒からBn7、BN8、Nap12及びBn30の疎水性クラスターを保護する。図15Bを参照されたい。リン酸基が互いに近接し、修飾塩基が溶媒から離れるように溶媒に向けられてタンパク質様の疎水性コアを形成するようにSOMAmer骨格の不定型の湾曲を歪めて、共にクラスター化する。IL−6ヘリックスAのN末端のR24と、G5とG6の間のSOMAmer骨格リン酸との間の塩橋は、疎水性ヌクレオチドに対して溶媒からの更なる保護を与える。図15Cを参照されたい。7位、8位、12位、及び30位で構成される修飾ヌクレオチドクラスターは、明らかにSOMAmerそれ自体、また同じくタンパク質と接触する疎水性表面に対して分子内構造の土台の二重機能を果たす。Bn8及びBn−dU7の塩基も含むπ−スタッキング相互作用のストリングに第4の方向感を付加するNap−dU12のウリジン環の頂部においてIL−6ヘリックスA上でY31が積層する。図15Dを参照されたい。Nap−dU12のアミドアームは、Bn−dU8のウリジン環のπ−スタッキング相互作用に加えて、ナフチル基がM117のメチレン側鎖と疎水性相互作用を有する、IL−6上のヘリックスCに手を伸ばす。図15B及び図14Cを参照されたい。更に、Bn7はR24の側鎖に対して積層し、K27とのエッジワイズ相互作用及び、R30に対するアミドリンカーのカルボニル酸素による水素結合を有する。また、Bn7及びBn8は、ヘリックスC上のF125とのedge−to−face相互作用に関与する。図15Fを参照されたい。
SOMAmerのドメイン2は、主にB型DNAであるがループ領域においてわずかに左側に捻れたステムループを含む。3’末端上のステムの底に2つの非対塩基、Bn−dU27及びC28が存在する。形式上はドメイン2に指定されたが、これら2つの不対塩基を、当該ステムの5’末端上のG26及びA13に沿って、2つのドメイン間の可動性ヒンジとして考えることができる。Bn−dU27のG26及びウリジン環は、Bn−dU27(Bn27)ベンジル基が完全に溶媒に暴露される間、弱いスタッキング相互作用を有する。図16Aを参照されたい。同様に、C28は、分子内または分子間の接触を生じず、また溶媒中へと突出される。これら2つの不対塩基に続いて、G26とA13との間でsheared型G−A塩基対(シアー:6.2Å;バックル:−34°;プロペラ:−11°)、並びにBn−dU14とA25、Bn−dU15とA24、及びA16とBn−dU23、並びにB型ヘリックス立体配座を採用するA17とBn−dU22との間の4つのワトソンクリック塩基対が存在する。図16Bを参照されたい。また、ワトソンクリック塩基対は、−14°の平均バックリング(標準偏差(s.d.)26)及び−11°の平均プロペラ捻れ(s.d.9.2)を有する理想的なB型角度とは異なる、様々なバックリング及びプロペラ捻れのパラメーターを呈する。上記ステムの上部でC18、A19、C20及びG21とテトラループを形成する。形式上は上記テトラループ内で、C18及びG21は、不規則なシアリング(1.1Å)、ストレッチング(3.4Å)、スタッガー(1.4Å)、バックリング(32°)、プロペラ(−52°)、及び開口(−61°)のパラメーターを有する2つの伸縮H結合(3.5Å及び3.8Å)を特徴とする実質的に捻れた塩基対を形成する。H結合がC18のワトソンクリック面とG21のフーグスティーン末端との間で形成されるのに対し、G21のワトソンクリック面は、対称合致のC20との結晶コンタクトに関与している。更に、G21のシン配座は、A17:Bn−dU21とG18:G21塩基対との間で幾分左撚り(−18°)を生じる。G21塩基はステムにおいてBn−dU22と共に積層されるが、C18、A19及びC20はいずれの分子内接触及び分子間接触にも関与しない。C20塩基は部分的に溶媒中へと突出されるのに対し、A19は完全に溶媒に露出される。図16Cを参照されたい。
SOMAmerのドメイン2とのIL−6の相互作用の大半は、本質的に疎水性である。Bn15、Bn22及びBn23のベンジル基は、側鎖の非極性部分のヘリックスA上のR30、L33及びD34、並びにヘリックスD上のQ175、L178、及びR179によって作り出された疎水性ポケットにおいてIL−6上のヘリックスに寄りそう。図17Aを参照されたい。疎水性クラスターの外側にあるBn14のベンジル基は、Y31とのedge−to−face相互作用を有し、K27及びR30のメチレン側鎖とのエッジワイズ相互作用を有する。図17Bを参照されたい。また、A13リン酸とK27との間及びBn−dU14リン酸とR30との間のこのドメインに2つの塩架橋が存在し、いずれのアミノ酸残基もヘリックスAに由来する。図17Cを参照されたい。全てのIL−6:SOMAmer相互作用の完全な一覧を表9に要約する。IL−6タンパク質について算出された溶媒露出面積(S.A.S)は8696Å2であり、SOMAmerについて6672Å2であり、複合体について12872Å2である。界面の溶媒除外面積は、したがって、1248Å2であり、[(S.A.SIL−6+S.A.SSOMAmer)−S.A.S複合体]/2として算出される。この値は、以前報告された1225Å2のPDGF−BB SOMAmerの除外面積に類似する(Davies et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2012.109:19971−19976)。
SOMAmerにより関与されるIL−6上の結合面は、その2つの細胞表面受容体IL−6Rα及びgp130へのIL−6結合に関与する領域と広範囲に重複する。SOMAmerのドメイン1は、gp130への結合に広範囲に関与する結合部位を占有するのに対し、ドメイン2はIL−6Rαに対する結合部位を占有する。図18A及び図18Bを参照されたい。SOMAmerが、受容体に似た方式でIL-6を関与させる程度は、結合表面の全体的な重複を考慮する場合に部分的に明らかであるに過ぎない。具体的な相互作用の判断は、より大きな程度の受容体模倣を説明する。
SOMAmerにおいて観察された2つのドメインが独立した結合単位であるのかどうかを特定するため、本発明者らはドメイン1及びドメイン2の幾つかの変異体を合成した。ステムループドメインの様々な形態を表すフラグメントは、1μM以下のタンパク質濃度ではIL−6に対して明らかな結合親和性を示さなかった(データは示されていない)。対照的に、2つの配列領域を接続するC3スペーサーを含み1位〜12位及び29位〜32位で構成されるG−カルテットドメインを含むフラグメント(2573−20_324(配列番号319))は、およそ200nMのIL−6に対する結合親和性を呈した。この16ヌクレオチドフラグメントはG−カルテットドメイン全体に相当し、C3スペーサーは全長SOMAmerにおけるG−カルテットの2つの領域を接続するステムループドメインを置き換える。このG−カルテットフラグメントの結合親和性は、全長SOMAmerに比べて約1000倍低い。それにもかかわらず、全長SOMAmerについて−13.7kcal/molであり、G−カルテットフラグメントについて−9.5kcal/molである、結合エネルギー、ΔGに関して、G−カルテットドメインは、全長SOMAmerの全体的な結合親和性に主に寄与するようである。G−カルテットフラグメントの配列スクランブル類縁体は、1μMのIL−6まで結合を示さなかった。
2573−20 SOMAmerファミリー及び2574−49 SOMAmerファミリー内の配列をより完全に評価するため、実施例4に記載される454のパイロシーケンシング技術を使用して濃縮プールをシーケンシングした。
IL−6は、関節リウマチと関連する炎症反応の主なメディエーターである。コラーゲン誘発関節炎(CIA)は、カニクイザルにおいて関節リウマチを研究するための確立された自己免疫モデルである。関節の炎症の重症度に対するPEG−N−2573−20_136(5’末端に結合された40kDaのPEGを有する2573−20_136(配列番号101))の効果をこのモデルにおいて評価した。
或る例では、ヌクレアーゼ保護は、2’−O−メチル、2’−フルオロ、及びホスホロチオエート(PS)結合によって達成され得る。2’−O−メチルU、ホスホロチオエート、C3−スペーサー、及びHEGの置換の組合せを有する2573−20_136(配列番号101)の変異体を親和性及び阻害活性についてスクリーニングし、更なる活性なIL−6阻害剤を同定した。また、代替のU修飾を特定の位置で試験した。図24を参照されたい。表10は、10−11M〜10−8Mの範囲のIC50を有することがわかった変異体の一覧を示す。SOMAmer 2573−20_745(配列番号218)は、全ての位置において(18 2’−O−メチル、12ホスホロチオエート、及びdA19及びdC20を置換するHEG)保護骨格の置換を有し、IL−6アンタゴニスト活性(遺伝子レポーターアッセイにおいてIC50=4×10−9M)を保持する。表11は、10−8Mよりも大きいIC50を有することがわかった変異体の一覧を示す。
NapdU SOMAmer2574−49_260(配列番号400)を、実施例16に記載される戦略を使用して更に修飾した。表12は、10−11M〜10−8Mの範囲のIC50を有することがわかった変異体の一覧を示す。2574−49_411(配列番号443)は、28merであり、3つ以外の全ての位置(13の2’−O−メチル、10のホスホロチオエート、及び2のC3−スペーサー)における保護骨格置換を有し、IL−6アンタゴニスト活性を保持する(遺伝子レポーターアッセイにおいてIC50=6×10−9M)。表13は、10−8Mよりも大きいIC50を有することがわかった変異体の一覧を示す。
Claims (51)
- 配列番号10のアミノ酸配列を含む、IL−6に特異的に結合するアプタマー。
- 前記アプタマーが配列番号10のアミノ酸16〜31により定義されるIL−6の領域に特異的に結合する、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが配列番号10のアミノ酸16〜31及びアミノ酸117〜125を含むIL−6のエピトープに特異的に結合する、請求項1または2に記載のアプタマー。
- IL−6への結合に対して請求項2または3に記載のアプタマーと特異的に競合するアプタマー。
- 前記アプタマーがIL−6への結合に対して配列番号101のアプタマーと競合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーがIL−6への結合に対して配列番号400のアプタマーと競合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが少なくとも1つの修飾ピリミジンを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーがGカルテットモチーフを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 前記Gカルテットモチーフが、
5’−GG−ZZZ−GG−Qa−GG−Qb−GG−3’(III)(配列番号702)、
5’−GG−Qa−GG−ZZZ−GG−Qb−GG−3’(IV)(配列番号703)、及び
5’−GG−Qa−GG−Qb−GG−ZZZ−GG−3’(V)(配列番号704)から
(式中、各ZがU、T及び修飾ピリミジンから独立して選択され、各Qがリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、aが1〜50であり、及び/またはbが1〜50である)
から選択される構造を含む、請求項8に記載のアプタマー。 - 前記アプタマーが、5’−GGCAGGZZZGGZQaGZGG−3’(I)(配列番号700)
(式中、各ZがU、T及び修飾ピリミジンから独立して選択され、各Qがリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、aが1〜50である)の配列を含む、請求項9に記載のアプタマー。 - 前記各Qが置換または非置換のC2〜C20のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される、請求項9にまたは10に記載のアプタマー。
- 各Qが、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、1,3−プロパンジオール、2〜100の1,3プロパンジオール単位を有するポリ(1,3−プロパンジオール)、エチレングリコール、及び2〜100のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールから独立して選択される、請求項11に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、
5’−YXAXGYARQaMGYAAGSCGRY−3’(VI)(配列番号705)、及び
5’−MGYAAGSCGRYQbYXAXGYAR−3’(VII)(配列番号706)
(式中、各Yが修飾ピリミジンから独立して選択され、各Xが修飾ピリミジンから独立して選択され、MがC及びAから選択され、SがC及びGから選択され、各RがG及びAから独立して選択され、各Qがリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、aが1〜30であり、及び/またはbが1〜30である)
から選択される配列を含む、IL−6に特異的に結合するアプタマー。 - 前記配列5’−GGGYXAXGYAGCLbGZGCGYAAGGCGGY−3’(II)(配列番号701)
(式中、ZがU、T及び修飾ピリミジンから選択され、各Yが修飾ピリミジンから独立して選択され、各Xが修飾ピリミジンから独立して選択され、各Lがリンカー、修飾ヌクレオチド、及び非修飾ヌクレオチドから独立して選択され、bが1〜20である)を含む、請求項12に記載のアプタマー。 - 前記各QまたはLが、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、アルキレングリコール、及びポリアルキレングリコールから独立して選択される、請求項13または請求項14に記載のアプタマー。
- 各QまたはLが、置換または非置換のC2〜C20のリンカー、1,3−プロパンジオール、2〜100の1,3−プロパンジオール単位を有するポリ(1,3−プロパンジオール)、エチレングリコール、2〜100のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコールから独立して選択される、請求項15に記載のアプタマー。
- 各Xが芳香族修飾ピリミジンから独立して選択される、請求項13〜16のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各Xが図20及び図24に示される芳香族修飾ピリミジンから独立して選択される、請求項13〜17のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各Xが図24のNap、2Nap、NE、BF、及びBTから独立して選択される、請求項13〜18のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各Yが図20及び図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される、請求項13〜19のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各Yが図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される、請求項13〜20のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各Zが、U、T、並びに図20及び図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される、請求項9〜21のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各Zが、U、T、及び図24に示される修飾ピリミジンから独立して選択される、請求項9〜22のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各置換または非置換のC2〜C20のリンカーが、置換若しくは非置換のC2〜C8のリンカー、置換若しくは非置換のC2〜C6のリンカー、置換若しくは非置換のC2〜C5のリンカー、置換若しくは非置換のC2〜C4のリンカー、または置換若しくは非置換のC3のリンカーである、請求項11、12及び15〜23のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 各修飾ピリミジンが、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BndU)、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ベンジルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−フェネチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PEdU)、
5−(N−チオフェニルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(iBudU)、
5−(N−チロシルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TyrdU)、
5−(N−3,4−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(MBndU)、
5−(N−4−フルオロベンジルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(FBndU)、
5−(N−3−フェニルプロピルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(PPdU)、
5−(N−イミジゾイルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ImdU)、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−イソブチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(TrpdU)、
5−(N−R−スレオニニルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(ThrdU)、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−トリプタミノカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(3−トリメチルアンモニウムプロピル]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジンクロリド、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−[1−(2,3−ジヒドロキシプロピル)]カルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン
から独立して選択される、請求項7〜24のいずれか一項に記載のアプタマー。 - 各Xが
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NapdU)、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NapdU)、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルメチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(NEdU)、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−1−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(2NEdU)、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−2−ナフチルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BFdU)、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、
5−(N−3−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−デオキシウリジン(BTdU)、
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−O−メチルウリジン、及び
5−(N−3−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド)−2’−フルオロウリジン
から独立して選択される、請求項13〜25のいずれか一項に記載のアプタマー。 - (a)配列番号7、8、11、19〜22、26〜39、100〜239、300〜356、400〜446、500〜572、及び599〜625から選択されるヌクレオチド配列、または
(b)配列番号7、8、11、19〜22、26〜39、100〜239、300〜356、400〜446、500〜572、及び599〜625から選択され、1〜20のヌクレオチドが置換、欠失または挿入され、前記アプタマーが20nM未満の親和性(Kd)でIL−6に特異的に結合するヌクレオチド配列、または
(c)配列番号7、8、11、19〜22、26〜39、100〜239、300〜356、400〜446、500〜572、及び599〜625から選択されるヌクレオチド配列に少なくとも80%以上同一であり、前記アプタマーが20nM未満の親和性(Kd)でIL−6に特異的に結合するヌクレオチド配列
から選択される配列を含むアプタマー。 - 前記アプタマーが10nM未満のIL−6アンタゴニスト活性(IC50)を有する、請求項27に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、少なくとも2〜6の修飾ピリミジン及び/または2’−OMeを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 少なくとも1つ、少なくとも2〜5のヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項1〜29のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが20nM未満の親和性(Kd)でIL−6に特異的に結合する、請求項1〜30のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、IL−6受容体へのIL−6結合、STAT3リン酸化、及びSTAT−媒介転写から選択される少なくとも1つの活性を阻害する、請求項1〜31のいずれか一項に記載のアプタマー。
- 請求項1〜32のいずれか一項に記載の少なくとも1つのアプタマー、または薬学的に許容可能なその塩、及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- IL−6によって媒介される疾患または状態を治療するための請求項33に記載の医薬組成物。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、炎症性疾患、悪性疾患、感染症、及び自己免疫疾患から選択される、請求項34に記載の医薬組成物。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、キャッスルマン病、強直性脊椎炎、冠状動脈性心疾患、関節リウマチにおける心血管疾患、肺動脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アトピー性皮膚炎、乾癬、坐骨神経痛、II型糖尿病、肥満、巨細胞性動脈炎、急性移植片対宿主病(GVHD)、非ST上昇心筋梗塞、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎、視神経脊髄炎、慢性糸球体腎炎、及び高安動脈炎から選択される、請求項35に記載の医薬組成物。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、骨関節炎、敗血症、喘息、間質性肺疾患、炎症性腸疾患、全身性硬化症、眼内炎症、グレーヴス病、子宮内膜症、全身性硬化症、成人発症スティル病、アミロイドAアミロイド症、リウマチ性多発筋痛症、寛解傾向があり圧痕を形成する浮腫を伴う血清反応陰性対称性渇膜炎、ベーチェット病、ブドウ膜炎、植片対宿主疾患、TNFR受容体関連周期性症候群から選択される炎症性疾患である、請求項35に記載の医薬組成物。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、癌及び癌に関連する状態から選択される悪性疾患である、請求項35に記載の医薬組成物。
- 前記悪性疾患が、多発性骨髄腫、白血病、膵臓癌、乳癌、結腸直腸癌、悪液質、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、胃腸、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、転移性腎臓癌、固形腫瘍、神経膠腫、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、口腔癌、骨髄増殖性新生物、B細胞リンパ増殖性疾患、及び形質細胞性白血病から選択される癌である、請求項38に記載の医薬組成物。
- 前記悪性疾患が、非小細胞肺癌に関連する疲労及び癌に関連する食欲不振から選択される癌に関連する状態である、請求項38に記載の医薬組成物。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)、脳マラリア、尿路感染症、及び髄膜炎菌感染症から選択される感染症である、請求項35に記載の医薬組成物。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎を含む血管炎症候群、高安動脈炎、クリオグロブリン血症、ミエロペルオキシダーゼ−抗好中球細胞質抗体関連半月体形成性糸球体腎炎、リウマチ性血管炎、クローン病、再発性多発性軟骨炎、後天性血友病A、及び自己免疫性溶血性貧血から選択される自己免疫疾患である、請求項35に記載の医薬組成物。
- 請求項33に記載の医薬組成物を投与することを含む、IL−6によって媒介される前記疾患または状態の治療方法。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、炎症性疾患、悪性疾患、感染症、及び自己免疫疾患から選択される、請求項43に記載の方法。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、キャッスルマン病、強直性脊椎炎、冠状動脈性心疾患、関節リウマチにおける心血管疾患、肺動脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アトピー性皮膚炎、乾癬、坐骨神経痛、II型糖尿病、肥満、巨細胞性動脈炎、急性移植片対宿主病(GVHD)、非ST上昇心筋梗塞、抗好中球細胞質抗体(ANCA)関連血管炎、視神経脊髄炎、慢性糸球体腎炎、及び高安動脈炎から選択される、請求項43に記載の方法。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、全身型若年性特発性関節炎、骨関節炎、敗血症、喘息、間質性肺疾患、炎症性腸疾患、全身性硬化症、眼内炎症、グレーヴス病、子宮内膜症、全身性硬化症、成人発症スティル病、アミロイドAアミロイド症、リウマチ性多発筋痛症、寛解傾向があり圧痕を形成する浮腫を伴う血清反応陰性対称性渇膜炎、ベーチェット病、ブドウ膜炎、植片対宿主疾患、TNFR受容体関連周期性症候群から選択される炎症性疾患である、請求項44に記載の方法。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、癌及び癌に関連する状態から選択される悪性疾患である、請求項43に記載の方法。
- 前記悪性疾患が、多発性骨髄腫、白血病、膵臓癌、乳癌、結腸直腸癌、悪液質、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ腫、胃腸、肺癌、前立腺癌、腎細胞癌、転移性腎臓癌、固形腫瘍、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、膀胱癌、口腔癌、骨髄増殖性新生物、B細胞リンパ増殖性疾患、及び形質細胞性白血病から選択される癌である、請求項47に記載の方法。
- 前記悪性疾患が非小細胞肺癌に関連する疲労及び癌に関連する食欲不振から選択される癌に関連する状態である、請求項47に記載の方法。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)、脳マラリア、尿路感染症、及び髄膜炎菌感染症から選択される感染症である、請求項43に記載の方法。
- IL−6によって媒介される前記疾患または状態が、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、多発性筋炎、巨細胞性動脈炎を含む血管炎症候群、高安動脈炎、クリオグロブリン血症、ミエロペルオキシダーゼ−抗好中球細胞質抗体関連半月体形成性糸球体腎炎、リウマチ性血管炎、クローン病、再発性多発性軟骨炎、後天性血友病A、及び自己免疫性溶血性貧血から選択される自己免疫疾患である、請求項43に記載の方法。
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