JPWO2018038076A1

JPWO2018038076A1 - Ｅ−カドヘリン結合型核酸アプタマーを用いる細胞足場材料

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Publication number: JPWO2018038076A1
Application number: JP2018535678A
Authority: JP
Inventors: 古性　均; 均古性; 敬太郎吉本; 亮丸山
Original assignee: Nissan Chemical Corp; University of Tokyo NUC
Current assignee: Nissan Chemical Corp; University of Tokyo NUC
Priority date: 2016-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2019-06-20
Also published as: US20190225942A1; EP3502232A1; TW201821609A; EP3502232A4; WO2018038076A1; CN109963937A; KR20190039788A

Abstract

化学合成が可能で、動物由来成分を含まず、生体適合性の高い材料である核酸アプタマーを用いた、細胞培養用の足場材料を提供する。Ｅ−カドヘリン結合型核酸アプタマーを含む、細胞足場材料。

Description

本発明は、細胞接着因子であるＥ−カドヘリン（E-cadherin）に対して特異的に結合し得る核酸を含む細胞足場材料に関する。

細胞の増殖、生理機能、分化能は細胞表面に存在する接着タンパク質とそのリガンドとの結合によって変化することが知られている（非特許文献１）。従って、細胞表面タンパク質と強く結合する化学修飾可能な分子群を獲得し、非天然型の高度な結合様式を細胞に提供することが可能となれば、遺伝子導入無しに、安全かつ簡便に細胞機能を改善できる新しい方法論の構築が期待できる。

細胞の機能は培養環境に大きく左右されることが知られている。なかでも、細胞と基材表面の接着、さらに細胞同士の接着が細胞の増殖や分化に大きく影響している。例えば、基材表面に細胞接着能を付与させるために、フィブロネクチンやコラーゲンなどのタンパク質、さらにフィブロネクチンのインテグリン結合部位であるＲＧＤペプチドを基材表面に修飾するなどのアプローチが行われていた。

近年では、幹細胞の分化能を単層状態で維持するために、Ｅ−カドヘリンを固定化した基材表面の利用が提案された。ゼラチンコートプレートまたは支持細胞層（フィーダー細胞層）で培養されたＥＳ細胞は、Ｅ−カドヘリンを介した細胞−細胞接着（Cell-Cell adhesion）によりタイトで凝集したコロニーを形成している（非特許文献２）。長岡らはＥ−カドヘリンと免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃドメインとの融合タンパク質（ＥＣａｄ−Ｆｃ）でコートしたプレートの上でマウスのＥＳ細胞を培養した時、細胞間の接触がなく、コロニーを形成しないということを示した。このように培養されたものは、長期の培養後も３つ全ての胚葉細胞への分化のための多分化能と生殖細胞系伝達を含む全てのＥＳ細胞機能を維持し、コロニー形成状態よりも、高い増殖能力があった（非特許文献３）。

一般的に、細胞培養は動物由来成分を用いて行われる。通常、培養用培地成分には５〜１０％程度の血清が含まれており、さらに生存率、増殖率、分化を向上させるために、ある種のタンパク質を添加する。これら血清やタンパク質成分は動物由来成分である。また、再生医療、薬効、毒性評価などのツールとしての利用が期待されるヒト多能性幹（ｉＰＳ）細胞（非特許文献４）は、フィーダー細胞としてマウス胎児由来線維芽細胞、またはマトリジェル（マウス肉腫由来基底膜マトリックス）などの動物成分由来の足場材料によって培養されている（非特許文献５）。これらの培養は、細胞−細胞接着ではなく、細胞−基質接着（cell-substratum adhesion）を利用するものである。

これらのヒトｉＰＳ細胞用足場材料はさまざまな不確定因子を含んでいる事から、臨床応用における安全性が懸念されていることに加え、動物由来成分が多数含まれているため製造元やロット間で再現性を考慮する必要がある。また、ヒトｉＰＳ細胞の未分化維持や分化における分子機構を解明するためにも、不確定因子を含まない全て既知の組成からなる非動物由来成分（Xeno-free）の足場材料の構築が望まれる。

核酸アプタマーは分子認識能をもつ一本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡであり、その構造多様性から、低分子、タンパク質、細胞などの様々な標的に対して高い結合能をもつものがすでに多数報告されており、抗体に代わる新たな分子認識素子として注目されている（非特許文献６）。核酸アプタマーは、生物を利用せずにスクリーニングが可能であること、任意の箇所に化学修飾が導入できること、核酸アプタマー同士の連結が容易に行えること、熱安定性や保存性が高いなどの抗体には無い多くの特長を有する生体高分子である。核酸アプタマーは、化学合成が可能で、動物由来成分を含まず、生体適合性の高い材料である。

このような特徴から、核酸アプタマーを非動物由来成分（Xeno-free）の足場材料とすることで、生体外で培養した細胞や組織の均一性を保ちつつ、安全に利用することが可能となる。例えば、既存のヒトｉＰＳ細胞培養用足場材料の問題点であった臨床応用における安全性への懸念や、製造元やロット間による再現性の低下を解決することが出来ると考えられる。また、核酸アプタマーを利用した足場材料では、ヌクレアーゼ処理によって細胞表面タンパク質にダメージを与えることなく培養細胞を組織的に回収することができると期待される。一方、これまでに様々なターゲットに結合する核酸アプタマーが多数報告されているが、核酸アプタマー単体が細胞接着を誘導すること、及び足場材料として応用されている例は未だ報告がない。

タンパク質や細胞に対して特異的に結合する新規のアプタマーの探索には試験管内進化法（in vitro selection法）が最も有効な手段として用いられている。特にＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の２ステップがある。（例えば、特許文献１）この選別と増幅を、選択圧を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法などが報告されている。これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾も安価に行うことができ、構造が単純で、免疫原性もほとんどないという、抗体にはない様々な利点がある。

配列番号１の塩基配列からなる核酸について、その高次構造とＥ−カドヘリン−Ｆｃ融合タンパク質に対する結合能力が報告されている（非特許文献８）。しかし、細胞接着との関連は知られてなかった。

国際公開ＷＯ９１／１９８１３号公報

Albelda, S. M. et al., The Faseb J. 1990, 4, 2868-2880. Larue, L. et al., Development 1996, 122, 3185-3194. Nagaoka, M. et al., PLoS ONE 2006, e15, 1-7. Takahashi, K. et al, Cell, 2007, 131, 861-872. Xu, C. et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 971-974. Yang, L. et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2011, 63, 1361-1370. Jellinek et al., 1994, Biochemistry 33, 10450 第７５回分析化学討論会講演要旨集

以上のような背景の下に、本発明は、化学合成が可能で、動物由来成分を含まず、保存性と生体適合性の高い材料である核酸アプタマーを修飾した基材を用いて、細胞接着を直接誘導する機能性足場材料を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、磁性微粒子を用いるＳＥＬＥＸ法により、細胞接着因子の一つであるＥ−カドヘリンに対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有する核酸がＥ−カドヘリンに対する特異的アプタマーとして機能し得ることを見出し、さらに、当該アプタマーを修飾した表面が直接細胞接着を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一つの態様において、配列番号１で示される核酸配列を含み、Ｅ−カドヘリンに対して特異的に結合する核酸アプタマーを基板に吸着させてなる細胞足場材料を提供する。ここで、これらのアプタマーがＲＮＡの場合は、配列番号１の塩基配列においてＴ（チミン）はＵ（ウラシル）である。本発明の好ましい態様では、上記核酸アプタマーは、検出を容易とするために、その５’末端又は３’末端にプライマー認識配列、蛍光標識、また、基材表面に修飾するために、アミノ基、カルボキシ基、ビニル基、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結されていてもよい。

また、本発明は、支持体の表面をＥ−カドヘリン結合型核酸アプタマーを含む細胞足場材料で修飾する、細胞培養のための支持体の調製方法にも関する。好ましくは、Ｅ−カドヘリン結合型ＤＮＡアプタマーは、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸である。Ｅ−カドヘリン結合型ＤＮＡアプタマーは、糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換からなる群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含むことができる。Ｅ−カドヘリン結合型ＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端は、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の共有結合および非共有結合を提供可能な官能基、または、特異的結合塩基配列およびタグペプチドで修飾されていることができる。

本発明によれば、核酸アプタマーを用いた新規な足場材料を提供することができる。すなわち、Ｅ−カドヘリンに特異的に結合しうる核酸アプタマーを用いることにより、タンパク質やアミノ酸を骨格とする分子を一切利用しない培養用足場環境の提供が可能となる。また、細胞を基材表面から回収する場合はタンパク質分解酵素を利用する必要が無いため、細胞にダメージを与えることがほとんどなく、培養細胞を容易に回収することが可能な足場材料が提供される。さらに、Ｅ−カドヘリンを多く発現する細胞のみを、基材に接着するという形態で簡単に他の細胞から分離、濃縮、回収することが可能となる。

コントロール、Ｂｉｏ−Ｔ４４をコートした基板及び本発明のＢｉｏ−Ｔ１０ＥＢＡを結合した基板における細胞の生死を確認するための撮影画像である。細胞を吸着させたコントロール、Ｂｉｏ−Ｔ４４をコートした基板及び本発明のＢｉｏ−Ｔ１０ＥＢＡを結合した基板におけるＥＤＴＡ洗浄前と洗浄後における細胞の吸着状態を示す撮影画像である。Ｂｉｏ−Ｔ１０ＥＢＡを結合した基板から、ヌクレアーゼを用いて細胞の回収状況を示す撮影画像である。

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

１．核酸アプタマー
本明細書において「核酸アプタマー」とは、例えば約２０〜２００塩基長のような短い配列を有する核酸分子であって、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖核酸分子を意味し、本発明に係る核酸アプタマーは、Ｅ−カドヘリンに対して特異的に結合する機能を有する一本鎖核酸分子である。

本発明に係る核酸アプタマーの結合ターゲットは、Ｅ−カドヘリンであり、好ましくはＥ−カドヘリンのアミノ酸配列のうち細胞表面上に露出している細胞外ドメインであり、より好ましくは細胞外ドメインの高次構造である。

＜配列番号１＞
５’−ＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＴ−３’

本明細書において、用語「特異的」とは、Ｅ−カドヘリンに対する本発明に係る核酸アプタマーの選択的結合を指す。アプタマーは、Ｅ−カドヘリン又はそれを細胞膜上に発現する細胞を、所定の条件下において、無関係のタンパク質若しくは細胞に対する結合と比較することによって、結合特異性について試験され得る。本発明に係る核酸アプタマーは、Ｅ−カドヘリンに対して、無関係のタンパク質若しくは細胞に対してよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、好ましくは少なくとも１０倍結合する場合に、そのアプタマーは特異的であると考えられる。「無関係のタンパク質」とは、Ｅ−カドヘリンとは異なるタンパク質であり、その構造及び機能等がＥ−カドヘリンと異なればよい。特異的結合の結合様式は特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、静電的又は疎水的な相互作用等が含まれる。

本発明に係る核酸アプタマーは、Ｅ−カドヘリンに対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号１に示す配列における１もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、１〜３個であり、より好ましくは１又は２個であり、さらに好ましくは１個である。また、配列番号１の核酸アプタマー機能を妨げない限り、同配列に別の塩基配列や核酸アプタマー、ペプチド、タンパク質（酵素や抗体）を連結させてもよい。

また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係る核酸アプタマーの配列は、上記配列番号１のそれぞれと９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９６％以上の同一性を有する配列（以下、「相同体」という場合がある。）であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「配列同一性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって（例えば、Karlin and Altschul, 1990, PNAS 87:2264-2268; Karlin and Altschul, 1993, PNAS 90:5873-5877)または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。

１もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準ＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう（例えば、Loakes et al., 1997, J. Mol. Bio. 270:426-435)。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド(carbozamide)、ならびにニトロアゾール誘導体（３’−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールなど）が挙げられる(Loakes, 2001, Nucleic Acids Res. 29:2437)。

また、本発明に係る核酸アプタマーは、Ｅ−カドヘリンに対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はなく、核酸アプタマー機能を妨げない限り、同配列に別の塩基配列や核酸アプタマーを連結させてもよい。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態における核酸アプタマーの長さは、上限としては、例えば２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下である。

全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号１における塩基数以上、すなわち３４塩基以上である。核酸アプタマーは１本鎖（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に２本鎖構造を形成する場合であっても、その核酸アプタマーの長さは１本鎖の長さとして計算するものとする。

好ましい実施態様において、本発明に係る核酸アプタマーは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれかの配列、及びその５’及び３’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該核酸アプタマーは、
５’−Ｐ_１−Ｘ−Ｐ_２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Ｘは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。Ｐ_１及びＰ_２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である。好ましくは、Ｐ_１は、ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴ(配列番号２)であり、及びＰ_２は、ＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ（配列番号３）である。

本発明に係る核酸アプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換（例えば、２’−０メチル化）、リン酸エステル部分での化学的置換（例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アセチル基等）、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。同様に、５’又は３’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

２．核酸アプタマーの選別
本発明の核酸アプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment：ＳＥＬＥＸ法）が用いられる。

当該ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド（アプタマー）の選別と、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)による指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより、ターゲット物質に親和性を有する核酸分子（一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ）を得るというものである。

なお、これら以外にも当該技術分野において周知の方法を用いて本発明の核酸アプタマーを選別及び取得することもできる。

上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール（例えば、ＤＮＡプール）から標的分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。当該選択されたアプタマー分子のみをＰＣＲ法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができる。

具体的には、まず、２０〜３００塩基、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００塩基程度のランダムなヌクレオチド配列（塩基配列）領域を含む一本鎖核酸フラグメントを調製する。ランダマイズされた一本鎖核酸フラグメント群の作製は、化学的核酸合成法、自動核酸合成機を利用した合成法、ＰＣＲ法等の増幅を利用した合成法、これらの組み合わせなどによって行うことができる。ＤＮＡからＲＮＡの作製のために、二本鎖ＤＮＡライブラリーを鋳型にして例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写によって一本鎖ＲＮＡライブラリーを作成することもできる。これらの一本鎖核酸フラグメントは、ＰＣＲ増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。

プライマー認識配列部分は、ＰＣＲ増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約２０〜５０、好ましくは２０〜３０塩基程度である。また、ＰＣＲ増幅後の一本鎖ＤＮＡを電気泳動などで分離可能とするために、５’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。

次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸フラグメント（ライブラリープール）と、磁性微粒子等の担体に固定化した標的分子とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、混合物を遠心機にかけて、核酸フラグメント−標的分子複合体と遊離核酸フラグメントとを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた複合体から回収した一本鎖核酸フラグメントを用いてＰＣＲ反応を行うことで標的分子結合性核酸配列の増幅を行う。この後、標的分子と複合体を形成しうる核酸フラグメントを当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうち細胞結合能を有するｓｓＤＮＡを分離することができ、さらにＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたｓｓＤＮＡをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。

上述の核酸フラグメントと標的分子との混合、標的分子と結合した核酸フラグメントの分離、ＰＣＲ増幅、増幅された核酸フラグメントを再び標的分子との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸フラグメントは、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。

したがって、本発明の１つの実施形態では、以下の工程を含む核酸アプタマーのスクリーニング方法が提供され、当該方法は、
（ａ）標的分子と複数種の一本鎖核酸フラグメントとを接触させて、標的分子と一本鎖核酸フラグメントとの複合体を形成させ、
（ｂ）前記複合体を形成していない一本鎖核酸フラグメントを除去し、
（ｃ）前記複合体を解離させて得られる一本鎖核酸フラグメントを含む候補核酸フラグメント群を取得し、
（ｄ）前記候補核酸フラグメント群を増幅し、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の工程を複数回繰り返し、
（ｆ）所定の回数繰り返した後の候補核酸フラグメント群の塩基配列を決定し、重複して検出される塩基配列からなる重複性核酸フラグメントを特定し、
（ｇ）前記工程（ｄ）における繰り返し数の増加に伴って、存在頻度が増加する前記重複性核酸フラグメントを選択する、工程を含み、前記標的分子が、ファミリーを構成する複数種の分子の１つであり、その各分子を交互に用いて前記工程（ｅ）を繰り返すことを特徴とする。

前記複合体が、担体に固定化された標的分子を用いて形成され、前記工程（ｅ）で得られた候補核酸フラグメント群と、標的分子が固定化されていない担体とを接触させて当該担体と複合体を形成しない候補核酸フラグメントをさらに選択する対抗選択工程を含むことが好ましい。
前記重複性核酸フラグメントの塩基配列は、前記標的分子が固定化されていない担体のみに結合する核酸フラグメントの塩基配列を含まないことがさらに好ましい。

３．Ｅ−カドヘリン結合アプタマーで表面を修飾した支持体
支持体としては、分子集合体、基板、分離用カラム充填剤、分離・診断用各種粒子、ナノ〜マイクロレベルサイズの各種材料等が挙げられる。分子集合体としては、例えば、疎水性および親水性部位を高分子からなるミセル、ベシクル、などが挙げられる。また、基板としては、細胞培養用のポリスチレンシャーレ、ガラスシャーレ、カバーガラス、金属薄膜蒸着基板などが挙げられる。また、単層または三次元形状で培養された細胞表面に対しても核酸アプタマーを修飾することができる。分離用粒子としては、ガラス・シリカを基盤とする粒子、さらにラテックス粒子、磁性粒子、ポリスチレン粒子、などが挙げられる。その他、高分子ゲルなどの網目構造を持つ担体などが挙げられる。

また、本発明の足場材料において核酸アプタマーは、通常、該核酸アプタマーが固相担体上に固定された態様で提供されることができる。

例えば、核酸アプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によって核酸アプタマーを固相担体表面に固定化することができる。この他、アミノ基、カルボキシ基、アルデヒド基、マレイミド基、チオール基、ビニル基、などの共有結合を形成する官能基を介する固定、さらに、静電的相互作用や疎水性相互作用を利用する手法で固定化しても良い。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［実施例１］Ｅ−カドヘリン結合型アプタマー（ＥＢＡ）の選抜
Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインに作用する核酸アプタマーを得るため、磁性粒子を用いるＳＥＬＥＸ法を行った。具体的には、Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインと免疫グロブリン（ＩｇＧ）の融合タンパク質（Recombinant Human E-Cadherin Fc Chimera, R&D SYSTEMS, Cat.No.:648-EC-100）を固定化した磁性粒子（Pierce（登録商標）Protein A Magnetic Beads, Thermo SCIENTIFIC, Cat.No.: 88845）を調製し、アプタマー候補配列であるランダム配列と上記磁性粒子を混合した後、洗浄、溶出、ＰＣＲによる増幅、一本鎖化の操作を行い、これを６ラウンドまで繰り返し行った。磁石を用いることで磁性粒子は迅速・簡便に回収できるため、カラムを用いる手法よりも洗浄操作の工程が容易になる。前章で選抜した核酸塩基配列を解析するため、ＩｏｎＰＧＭの次世代シーケンサーを用いて配列解析を行った。作業工程概要を下記に示す。（１）４，５，６ラウンドのＰＣＲ産物に解析用のタグ配列をＰＣＲで連結、（２）エマルジョンＰＣＲによる各配列のモノクローナル増幅、（３）次世代シーケンサーを用いる配列解析。CLC Bio社製のCLC Genomics Workbench 6を用いて、得られた配列データの整理（配列数のカウント）を行い、Clustal Xというソフトウェアを用いてアライメントを行った。各配列の存在率を算出し、ラウンド数に対する存在率をプロットして、増加傾向にある配列を抽出した。

ＤＮＡプールは、以下の配列を有する全長が７０塩基でランダム配列部分（Ｎ）が３４塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
ＤＮＡプールランダム３４（日本遺伝子研究所社製）
配列：５’−ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴ（Ｎ３４）ＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ−３’（配列番号４）
長さ：７０塩基（ランダム配列は中央の３４塩基）
分子量：２１３９１．３ｇ／ｍｏｌ
モル吸光係数：６３０４７５Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ
ランダム配列の両末端の塩基配列はＰＣＲの時に用いるプライマー配列である。
磁性粒子表面へのＥ−カドヘリンの外部ドメインと免疫グロブリン（IgG）の融合タンパク質の固定化は、磁性粒子に添付してある説明書に従い行った。

磁性粒子を用いるＳＥＬＥＸの実施例
タンパク質固定化磁性粒子を１７μＬとり、磁石を用いながらバッファーＩ（リン酸バッファー、ｐＨ７．４、Ｃａ、Ｍｇフリー、２ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＨＳＡ）で良く洗浄したのち、１０μＭ濃度に調整したＤＮＡプール２０μＬを添加し、３０分間室温で混ぜ合わせる。その後、磁石を用いながらバッファーＩで洗浄を３回行うことでターゲット結合性ＤＮＡと非結合性ＤＮＡを分離した。最終的に溶液を５０μＬのＴＥバッファーに置換したのち、９５℃で１０分加熱し、タンパク質固定化磁性粒子に吸着したＤＮＡをはがした。回収した上澄み液にはタンパク質結合能を有するセンス鎖ＤＮＡが含まれているので、これを、ＰＣＲ法を用いて増幅した。増幅したＤＮＡは２重鎖構造をしており、アンチセンス鎖を形成するプライマー配列にはビオチンが修飾されているため、この２重鎖から目的とするセンス鎖のみをストレプトアビジン固定化磁性粒子を用いて精製・回収した。この回収した一本鎖ＤＮＡを再びタンパク質固定化磁性粒子と混合し、上記手順を繰り返した。まずＥ−カドヘリンの外部ドメインタンパク質固定化磁性粒子に対して上記手順を行い、その後免疫グロブリン（IgG）の融合タンパク質固定化磁性粒子に対して上記操作を行った。これを１サイクルとし、計６サイクル行ったところで得られたＤＮＡを、次世代シーケンサー（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰＧＭ）を用いて解析した。

シーケンスデータ解析の実施例
４、５、６サイクル目に得られたシーケンスデータをソフトウエア（ＣＬＣ）を用いて解析した。さらに、これらシーケンスデータをエクスポート後、ひとつに混ぜ合わせたファイルを作成し、ソフトウエア（ＣｌｕｓｔａｌＸなど）を用いてアラインメントを行った。得られた解析結果から、４Ｒから６Ｒになるにつれて存在割合が増大している配列を選び出した。このようにして選択されたＤＮＡアプタマーの塩基配列は以下のとおりである。

＜（配列番号１）＞
５’−ＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＴ−３’

表面プラズモン共鳴センサーを用いた結合能評価
チップ上の２つの流路の片方にＥ−カドヘリン結合型核酸アプタマー、もう一方にリファレンスとしてｂｉｏ−ｄＴ４４（チミン４４個からなるヌクレオチド）を固定した後、２流路を連結し、濃度を段階的に変えたＥ−カドヘリン−Ｆｃ（ＤＰＢＳＴ（ランニングバッファー、ｐＨ７．４）：ＤＰＢＳ（Wako,Cat.No.:041-20211）に０．２７ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２ＯとＴｗｅｅｎ２００．０５％））を流速２０μＬ／ｍｉｎで２１０秒間インジェクションした。各濃度のＥ−カドヘリン−Ｆｃをインジェクションした後、ランニングバッファーに切り替えて１０分間経過した後に５０ｍＭＮａＯＨ＋１ＭＮａＣｌ溶液を交互に流すことにより、センサー表面上のＥ−カドヘリン−Ｆｃの吸着を洗浄した。これを繰り返すことで、１枚のチップで異なるＥ−カドヘリン−Ｆｃ濃度のデータを取ることができる。コントロールとしてＩｇＧ−Ｆｃのインジェクションも行ったが、レスポンスの変化が確認されなかった。データ処理の段階でｂｉｏ−ｄＴ４４を固定化した流路のデータをリファレンスとし、差し引いたセンサーグラムを用いて解離定数の解析を行った。

Ｅ−カドヘリン結合型ＤＮＡアプタマー固定化基板の作製と細胞接着評価
Immobilizer Streptavidin plateの各ウェルを３００μＬのＤＰＢＳＴで三回洗浄し、１００μＬのＢｉｏ−Ｔ１０−ＥＢＡ（５００ｎＭ）、Ｂｉｏ−Ｔ４４（５００ｎＭ）を加え、室温で一時間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルを３００μＬのＤＰＢＳＴで三回洗浄することで核酸アプタマーの固定化を完了した。

作製した基板上にＡ５４９細胞を播種し、本基板上における細胞の生存率を下記の手順で評価した。コンフルエンスになったＡ５４９を２ｍＬのＤＰＢＳ（−）で二回洗浄した後、１０ｍＬの１ｍＭＥＤＴＡ−ＰＢＳ（−）を加え、３７℃で１０分インキュベートし細胞を剥がした。調製したプレートに１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように播種した。２４時間後、培地を除去し、Live-Dead Cell staining Kit（BioVision, Cat.No.: #K501-100）を用いて染色後、OLYMPUS IX51で蛍光観察画像を撮影した。この画像をもとに、ＥＢＡ固定化基板上に接着した生細胞と死細胞をカウントして定量した結果、９２％が生細胞であった。

他の基板を作製し、本基板の細胞接着性の評価を以下のように行った。Ｂｉｏ−Ｔ１０−ＥＢＡ（５００ｎＭ）と同様の手順で、Ｂｉｏ−Ｔ４４（５００ｎＭ）を固定化した表面を作製した。播種後コンフルエンスになったＡ５４９を２ｍＬのＤＰＢＳ（−）（Wako, Cat.No.: 041-20211）で二回洗浄した後、１０ｍＬの１ｍＭＥＤＴＡ−ＰＢＳ（EDTA Solution (BioVision, Cat.No.: 2103-100），ＤＰＢＳ（Wako, Cat.No.: 041-20211）を加え、３７℃で１０分インキュベートし細胞を剥がした。オリゴをコートした９６ウェルプレートに３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように播種した。一時間後、１ｍＭＥＤＴＡ−ＤＰＢＳで洗浄した。

ＥＤＴＡの洗浄により、核酸をコートしていない基板と、Ｂｉｏ−Ｔ４４をコートした基板では、細胞が剥がれた。一方、Ｂｉｏ−Ｔ１０−ＥＢＡをコートしたウェルでは、細胞がほとんど剥がれなかった。細胞−基質間の接着にはカルシウムなどのイオンが重要であるためＥＤＴＡの洗浄により細胞が剥がれ、アプタマーと細胞間の結合にはそのようなイオンが比較的重要ではないため細胞が接着したまま残ったと考えられる。

Ｅ−カドヘリン結合型ＤＮＡアプタマー固定化基板に接着した細胞の回収
Ｂｉｏ−Ｔ１０−ＥＢＡ固定化基板上にＡ５４９細胞を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように播種した。１時間後、Ｂｉｏ−Ｔ１０−ＥＢＡ固定化基板上における細胞の接着を確認した後、培地を除去し、ＮｕｃｌｅａｓｅＢＡＬ−３１（New England Biolabs, Cat.No.: M0213S）と反応バッファー（組成：６００ｍＭＮａＣｌ，１２ｍＭＣａＣｌ_２，１２ｍＭＭｇＣｌ_２，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）の混合溶液または反応バッファーのみを１００μＬ加え、３７℃で４０ｍｉｎインキュベートした後、OLYMPUS IX51で撮影し、画像を取得した。

Ｂｉｏ−Ｔ１０−ＥＢＡ固定化基板上に接着したＡ５４９はヌクレアーゼを含む溶液でインキュベートすることで剥がれた。ヌクレアーゼ処理によって細胞表面タンパク質にダメージを与えることなく培養細胞を回収することが可能であると考えられる。

これらの結果より明らかなように、本発明のＤＮＡアプタマーを固定化した基板は、細胞足場材料として機能することが示される。

本発明の核酸アプタマーは、蛍光標識等、検出手段に合わせた化学修飾が容易、保存性と安全性が高い、回収時にタンパク質分解酵素を用いる必要が無いという特徴を有するため、細胞接着能を高める機能性培養皿を作製するうえでタンパク質を利用するよりも有利である。さらに、化学合成が容易であることから、抗体のような大がかりな培養装置を必要とせず、製造のための手間やコストの抑制、均一な性能をもつ製品の継続的な供給が可能という利点もあり、その産業上の利用価値は極めて大きい。

Claims

Ｅ−カドヘリン結合型核酸アプタマーを含む、細胞足場材料。
Ｅ−カドヘリン結合型核酸アプタマーが、配列番号１で示される塩基配列からなる核酸である、請求項１に記載の細胞足場材料。
請求項１又は請求項２に記載の細胞足場材料で表面を修飾した、細胞培養のための支持体。
前記アプタマーが、糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換からなる群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１又は２記載の細胞足場材料。
前記アプタマーの５’末端又は３’末端が、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の共有結合および非共有結合を提供可能な官能基、または、特異的結合塩基配列およびタグペプチドで修飾されている、請求項１又は２に記載の細胞足場材料。