CN111253932A - 一种基于荧光碳点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于无机发光材料领域，一种基于荧光碳点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针及其制备方法和应用，该比率型荧光探针包括二氧化硅微球和10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶，二氧化硅微球表面氨基化后修饰一层10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶，并在10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶外层还包裹修饰有氨基化荧光碳量子点。采用10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶量子点修饰在二氧化硅微球表面，且由于二氧化硅的网格是光透明的，能很大程度上减小荧光信号标签的光强度损失。采用生物毒性低的荧光碳量子点严实地包裹在量子点表面，不仅增加了微球最外层的碳点负载的效率，而且也降低了探针的生物毒性。在运用这种探针进行L929细胞内Hg2+检测及成像时，由于探针的毒性低，L929细胞对它的摄取足量，使得该探针在细胞内Hg2+超灵敏无干扰的分析检测中具有很好的应用前景。

Description

一种基于荧光碳点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于无机发光材料领域，尤其涉及一种基于荧光碳点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
汞是毒性较强的金属元素之一主要以Hg0、Hg2+以及有机汞三种形式存在其中有机汞的毒性最大。Hg2+被吸收后可通过血液循环系统进入全身及各个组织器官可造成中枢神经异常以及肝、肾等内脏的不可逆转地永久性损害导致食欲不振、懒惰等症状。采用荧光探针检测Hg2+具有高灵敏度与高分辨率的特性目前主要研究的探针包含碳量子点、MOF或者有机物体系这些体系的光学性能不稳定例如有机物的发光效率会随着照射时间的延长而减弱。
目前汞离子检测的方法主要分为两大类，一类是依赖大型分析仪器的检测方法，主要有原子吸收光度法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、共振瑞利散射光谱法(RSS)、电化学法、气相色谱法、液相色谱法、质谱法以及多种仪器联用技术法等这些方法大都需要对样品进行富集、分离等专业而的繁琐预处理过程对操作者有一定的安全隐患再者仪器价格昂贵运行、维护费用高检测成本太高。另一类是化学传感器检测方法该方法具有灵敏、简便、响应时间短、分析速度快、选择性较高、实时检测及生物应用等区别于大型分析仪器检测方法的突出优点。
量子点(QuantumDotQD)又称为纳米晶或人造原子是一种由II-VI族或III-V族元素组成的准零维(quasi-zero-dimensional)的纳米颗粒。通常量子点在三个维度上的尺寸都在100纳米(nm)以下。由于量子限域效应(quantumconfinementeffect)量子点中的电子和空穴具有分立能级结构受激后可以发射荧光。通过控制量子点的形状、结构和尺寸可以方便地调节其能隙宽度、激子束缚能的大小以及激子的能量蓝移等电子状态。随着量子点尺寸的逐渐减小量子点的光吸收谱出现蓝移现象。尺寸越小则谱蓝移现象也越显著即所谓的量子尺寸效应。由于量子点可吸收所有高于其带隙能量的光子而发射的光波长(即颜色)具有尺寸依赖性因此可用尺寸不同的同类量子点形成发光波长(即颜色)不同的一系列标记物。
中国发明专利申请(申请号：)公开了制备纳米晶的过程中通过加入碱土钙离子降低硫氧化铋纳米晶的形核能垒进而促进硫氧化铋纳米晶的生长且纳米晶表面由于油酸的包覆而带负电。制备得到的Ca/Tb:Bi2O2S纳米晶材料在254nm紫外灯照射下发出明亮的绿光荧光，量子效率为40.2％。在该体系中Tb3+离子的5d能级位置较低4f-5d跃迁位于紫外区域与Hg2+离子在紫外区域的吸收峰位置相近当纳米晶表面通过静电吸附Hg2+离子后Tb3+离子5d能级上的电子经Hg2+离子无辐射弛豫到基态减少了Tb3+离子5D4能级的电子布居数导致Tb3+离子的发光强度减弱且减弱的幅度非常明显非常适合于Hg2+离子的检测。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本申请的一个目的是提供一种基于荧光碳量子点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针，该比率型荧光探针采用SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS结构的荧光探针，具有双发射荧光，可以用于比率荧光分析方法，用于体外分析时不依赖昂贵的仪器且用裸眼完全可以定量或半定量分析，能够在两个发射波长或者激发波长下来检测荧光比率强度，能够很好地校正检测环境时所带来的误差，提高了信号强度。
为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：
一种基于荧光碳量子点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针，该比率型荧光探针包括二氧化硅微球和10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶，所述的二氧化硅微球表面氨基化后修饰一层10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶，并在10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶外层还包裹修饰有氨基化荧光碳量子点。
优选，二氧化硅微球、10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶、氨基化荧光碳量子点的摩尔比为1:5-10:10-30；优选为1:6-8:12-25。
另一方面，本申请还公开了比率型荧光探针的制备方法，该方法包括以下的步骤：
1)二氧化硅微球的合成
首先向250.0mL的烧瓶中依次加入乙醇80.0mL、水4.850mL和25％氨水3.6mL，在剧烈搅拌的下将其加热至55℃。然后迅速地往烧瓶中加入3.1mL四乙氧基硅烷(TEOS)和8.0mL乙醇的混合溶液；使溶液的温度保持在55℃，反应5h，制得粒径在40±5nm左右的二氧化硅微球，制得的微球做为微球继续生长的种子；
在250.0mL的烧瓶中，加入10.0mL以上反应所制得的二氧化硅微球的种子溶液、乙醇70.0mL、水13.0mL和25％的氨水7.5mL，混合搅拌，并逐滴加入配置好的1.0mL四乙氧基硅烷和10.0mL乙醇的混合溶液，保持连续搅拌反应大于5h，即可制得直径在220士5nm左右的二氧化硅微球；
2)氨基化碳量子点的合成及纯化
在四氟乙烯容器中加入1.O mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和9.0mL的丙三醇，通入高纯氩气5min，以除去溶液中的溶解氧，然后放入200℃的反应釜中，半小时后反应完成，待容器稍微冷却些，取出四氟乙烯容器中的淡黄色透明溶液；将淡黄色溶液注入到1000Da的透析袋中，用超纯水透析纯化，并每6h换一次超纯水，至少透析12h，最后透析袋中所得到的淡黄色溶液即是制备的氨基化碳量子点溶液；
3)二氧化硅微球的氨基化及其表面修饰量子点
取20.0mg二氧化硅微球重新溶解在新鲜配制的2.0mL的无水甲醇溶液中，该新鲜配制的无水甲醇溶液中3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度占10％，超声分散开，然后室温搅拌反应2h；反应之后，将氨基化的硅球依次用甲醇溶液和水反复洗涤三次后分散于2.OmL的10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶(5mg/mL)和2.0mL的EDC(20mg/mL)的混合液中，在4℃下混合搅拌12h，反应完后用水离心洗涤3次，将未耦连上的纳米晶洗去，制备得到10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶修饰的硅球；
4)将10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶修饰的硅球溶解于2.0mL的EDC(20mg/mL)溶液中，向其中加入提前制备好的氨基化荧光碳量子点1.0mL，室温下搅拌反应12h，反应完成后将溶液离心洗涤三次，除去多余的碳量子点后，将其分散在2.0mL的水中，即得到双发射比率型荧光探针。
另一方面，本申请还公开了率型荧光探针用于比率型Hg2+离子检测中的应用。
优选，比率型荧光探针用于制备生物汞检测的设备中的应用。
再优选，所述的比率型荧光探针用于制备人体汞中毒检测的设备中的应用。
本申请由于采用了上述的技术方案，采用离子选择性良好的10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶量子点修饰在二氧化硅微球表面，且由于二氧化硅的网格是光透明的，这种设计能很大程度上减小荧光信号标签的光强度损失。采用生物毒性低的荧光碳量子点严实地包裹在量子点表面，不仅增加了微球最外层的碳点负载的效率，而且也降低了探针的生物毒性。在运用这种探针进行L929细胞内Hg2+检测及成像时，由于探针的毒性低，L929细胞对它的摄取足量，使得该探针在细胞内Hg2+超灵敏无干扰的分析检测中具有很好的应用前景。
附图说明
图1：本专利实施例1中10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶的X射线衍射图。
图2：本专利实施例1中10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶的透射电镜图。
图3：本专利实施例1中10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶的下转换发光谱图。
图4：本专利实施例1中10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶的荧光强度与Hg2+离子浓度的关系曲线。
图5：对比例中6Tb:Bi2O3纳米晶的X射线衍射图。
图6：对比例中6Tb:Bi2O3纳米晶的荧光强度与Hg2+离子浓度的关系曲线。
图7：(A)不同浓度的NaCl溶液；(B)pH；(C)光照时间及(D)放置时间对碳量子点溶液荧光强度的影响。
图8：(A)不同金属离子对碳量子点荧光强度的影响；(B)其它金属离子存在时，Hg2+的测定。
图9：本专利实施例2SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS的扫描电镜图。
图10：本专利实施例2SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S(A，B)和SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS(C，D)高分辨透射电镜图。
图11：本专利实施例2SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针对Hg2+的分析，序列1为550nm，序列2为425nm。
图12：不同浓度的4SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针与HeLa细孵化24h后的细胞毒性分析。
图13：不同浓度的si02@QDs@CDs与L929细胞孵化24h后的细胞毒性分析。
图14：L929细胞加入Hg2+前(A1，B1，C1，D1)和加入Hg2+后(A2，B2，C2，D2)的激光共聚焦成像，(A1,A2)为蓝色通道，(B1，B2)为红色通道，(D1，D2)为前三者的叠加图，(Cl，C2)为明场成像，标尺为20μm。
具体实施方式
实施例110Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶的制备
(1)将0.84毫摩尔乙酸铋0.06毫摩尔乙酰丙酮铽0.1毫摩尔醋酸钙5毫升油酸在室温下加入到50毫升三颈瓶中升温至110℃并保温1小时；
(2)待步骤(1)中的溶液冷却至50℃以下加入10毫摩尔硫粉20毫升油胺用机械泵将三颈瓶内抽真空约10分钟然后升温至120℃并保温30分钟随后在氩气保护条件下迅速升温至310℃并保温1小时；
(3)待步骤(2)中的溶液冷却至室温后加入乙醇离心得到沉淀并用乙醇：环己烷为3:1的混合液洗涤产物然后于40℃烘干后得到最终产物。
粉末X射线衍射分析与透射电子显微镜观察分析表明：产物为正交晶系(图1)尺寸约为30nm的花瓣状(图2)。在254nm紫外灯照射下样品的发出明亮的绿光发射谱包含493nm，550nm，594nm与628nm分别对应于5D4→7F6，5D4→7F5，5D4→7F4与5D4→7F3的跃迁(图3)。将纳米晶分散在环己烷中然后在溶液中不同浓度的氯化汞Tb3+离子的发光强度随着Hg2+离子浓度的增大而逐渐减弱(图4)。这主要是由于Tb3+离子5d能级上的电子经Hg2+无辐射弛豫到基态减少了Tb3+离子5D4能级的电子布居数导致Tb3+离子的发光强度减弱。当Hg3+离子浓度仅为1微摩尔/升时Tb3+离子发光强度的减弱幅度大于90％表明该体系具有很高的灵敏度。
对比例1
(1)将0.94毫摩尔乙酸铋0.06毫摩尔乙酰丙酮铽5毫升油酸在室温下加入到50毫升三颈瓶中升温至110℃并保温1小时；
(2)待步骤(1)中的溶液冷却至50℃以下加入10毫摩尔硫粉20毫升油胺用机械泵将三颈瓶内抽真空约10分钟然后升温至120℃并保温30分钟随后在氩气保护条件下迅速升温至310℃并保温1小时；
(3)待步骤(2)中的溶液冷却至室温后加入乙醇离心得到沉淀并用乙醇：环己烷为3:1的混合液洗涤产物然后于40℃烘干后得到最终产物。
粉末X射线衍射分析表明：产物为6Tb:Bi2O3的物相(图5)。在254nm紫外灯照射下样品的发出微弱的绿光发射谱包含493nm，550nm，594nm与628nm分别对应于5D4→7F6，5D4→7F5，5D4→7F4与5D4→7F3的跃迁峰型与图3类似。将纳米晶分散在环己烷中然后在溶液中不同浓度的氯化汞Tb3+离子的发光强度基本保持不变(图6)。这表明Ca2+离子掺杂可以促进Bi2O2S纳米晶的生长且在6Tb:Bi2O3体系中Tb3+离子5d能级上的电子不受Hg2+离子的影响。
试验例110Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶在不同条件下的稳定性
碳量子点在不同NaCl溶液中的稳定性实验结果见图7A，碳量子点的荧光强度与NaCl溶液浓度无关(高达1mol/L)。当溶液pH值在3～11内变化时，碳量子点荧光强度变化甚微，表明碳量子点荧光强度不随pH值变化(图7B)。此外，用氙灯(500W)照射碳量子点溶液7h，碳量子点荧光强度几乎不变(图7C)。在室温下放置3个月，碳量子点荧光强度也很稳定(图7D)。这些实验结果说明此碳量子点稳定性较好。
试验例210Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶对Hg2+的选择性
如图8A所示，在相同实验条件下，50μmol/L的Cd2+，Zn2+，Fe2+，Mn2+，Ba2+，Cu2+，Co2+，Ca2+，K+，Fe3+，Mg2+，Pb2+，Ni2+及Na+等对碳量子点荧光强度几乎无影响。在其它金属离子(浓度为1μmol/L)存在时，Pb2+和Fe3+对Hg2+测定有微弱影响，而其余离子几乎无干扰(图8B)。这些结果表明，此碳量子点作为Hg2+传感器具有较好的选择性。同时，考察了不同汞盐(Hg(NO3)2，HgCl2，NaClO3、Hg(ClO4)，(CH3COO)2Hg)对碳量子点溶液荧光强度的影响。实验表明，所有汞盐引起的猝灭程度基本相同。用与汞盐有相同阴离子的钠盐进行对照实验，发现所有钠盐对溶液荧光都没有影响。这表明碳量子点只对Hg2+有荧光响应。
实施例2SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS合成
1)二氧化硅微球的合成
首先向250.0mL的烧瓶中依次加入乙醇80.0mL、水4.850mL和25％氨水3.6mL，在剧烈搅拌的下将其加热至55℃。然后迅速地往烧瓶中加入3.1mL四乙氧基硅烷(TEOS)和8.0mL乙醇的混合溶液；使溶液的温度保持在55℃，反应5h，制得粒径在40±5nm左右的二氧化硅微球，制得的微球做为微球继续生长的种子；
在250.0mL的烧瓶中，加入10.0mL以上反应所制得的二氧化硅微球的种子溶液、乙醇70.0mL、水13.0mL和25％的氨水7.5mL，混合搅拌，并逐滴加入配置好的1.0mL四乙氧基硅烷和10.0mL乙醇的混合溶液，保持连续搅拌反应大于5h，即可制得直径在220士5nm左右的二氧化硅微球；
2)氨基化碳量子点的合成及纯化
在四氟乙烯容器中加入1.OmL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和9.0mL的丙三醇，通入高纯氩气5min，以除去溶液中的溶解氧，然后放入200℃的反应釜中，半小时后反应完成，待容器稍微冷却些，取出四氟乙烯容器中的淡黄色透明溶液；将淡黄色溶液注入到1000Da的透析袋中，用超纯水透析纯化，并每6h换一次超纯水，至少透析12h，最后透析袋中所得到的淡黄色溶液即是制备的氨基化碳量子点溶液；
3)二氧化硅微球的氨基化及其表面修饰量子点
取20.0mg二氧化硅微球重新溶解在新鲜配制的2.0mL的无水甲醇溶液中，该新鲜配制的无水甲醇溶液中3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度占10％，超声分散开，然后室温搅拌反应2h；反应之后，将氨基化的硅球依次用甲醇溶液和水反复洗涤三次后分散于2.OmL的10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶(5mg/mL)和2.0mL的EDC(20mg/mL)的混合液中，在4℃下混合搅拌12h，反应完后用水离心洗涤3次，将未耦连上的纳米晶洗去，制备得到10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶修饰的硅球；
4)将10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶修饰的硅球溶解于2.0mL的EDC(20mg/mL)溶液中，向其中加入提前制备好的氨基化荧光碳量子点1.0mL，室温下搅拌反应12h，反应完成后将溶液离心洗涤三次，除去多余的碳量子点后，将其分散在2.0mL的水中，即得到双发射比率型SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针。
SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针作了透射电镜图和扫描电镜的分析表征。图9为分辨率由15000到35000逐渐增大的情况下扫面电镜图，观察到SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS探针粒径分布均匀且球形度和分散性好，硅球的直径在250nm左右，从高分辨电镜图图10观察到，当修饰上粒径分别为4.5nm和9.5nm左右的量子点和碳点后，微球的粒径最终达到265nm左右。从图10中A，B可以清楚看见，在硅球表面上均匀地布满了黑色点状，这便是硅球表面修饰上的量子点；在完成了微球最外层包裹碳点后，从图10中C，D可观察到，微球表面是糊状结构，并将前一步中的黑色点状几乎全部包裹在里面了，这即是碳点紧密地包裹在SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S微球表面。
试验例3SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针对Hg2+的分析检测研究
如图11所示，随着Hg2+浓度的增加，550nm特征峰处的量子点荧光强度逐渐下降，而425nm特征峰处的碳点荧光强度几乎没有改变，并且图中所示紫外光照下的颜色变化，便是肉眼直接可视的体系从红到蓝的变色过程。当Hg2+浓度大于1μmol/L时，550nm特征峰处的量子点荧光被完全淬灭，相应的荧光比值不再会发生变化。从量子点荧光的猝灭趋势可以看出，在O-1μmol/L范围内，550nm特征峰处的荧光强度与425nm特征峰处的荧光强度比值F550/F425的变化与Hg2+浓度呈很好的线性关系。由于Hg2+能在加入体系后的短时间内猝灭相应荧光，灵敏的猝灭模式对实现快速检测Hg2+非常有利。
试验例4SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针用于L929细胞荧光成像研究
一、实验材料
小鼠成纤维细胞(L929)，中国科学院细胞所提供；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶溶液质量分数0.25％、胎牛血清、青霉素&链霉素，杭州吉诺生物医药技术有限公司提供；磷酸盐(PBS)缓冲溶液pH＝7，杭州四季青生物工程材料有限公司提供；噻唑蓝(MTT)，蓝天生物科技有限公司提供；二甲基亚砜(DMSO)，国药集团化学试剂有限公司提供；氯化铅，国药集团化学试剂有限公司提供。
本申请选取正常的小鼠成纤维细胞L929细胞作为研究对象，来评价Β-环糊精修饰10Ca/6Eu:Bi2O2S纳米晶的生物毒性和成像效果。L929成纤维细胞轮廓清晰易分辨，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，生存能力比较旺盛。
首先将冻存的细胞进行复苏，复苏后的细胞转移到细胞培养瓶中，置于37℃的CO2的培养箱培养。次日更换新鲜培养基，继续培养，直至细胞增殖到一定数量后，将其消化，并种植在24孔板里。其中L929细胞培养所用培养基的配置如下：100mL培养基＝90％MEM培养基+10％新鲜胎牛血清FBS+1mL双抗(青霉素、链霉素)。
二、MTT细胞毒性测试
本申请采用MTT比色法，选取L929细胞为实验细胞，24h为考察点，考察Si02@QDs@CDs探针对细胞生长的影响。
将培养瓶中的L929细胞用胰酶处理，并分散于含有10％小牛血清与1％抗生素的DMEM培养基。调整细胞悬液浓度后，向96孔细胞培养板每孔加入100μL，在5％C02、37℃条件下孵育，至细胞贴壁。将超滤离心纯化后的4SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针冻干称重，溶于DMEM培养基中得到不同质量浓度的储备液，向每孔中加入100gL储备液，使Si02@QDs@CDs的终浓度为O.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL，每个浓度重复六次。孵育24小时后，每孔加入10gLMTT溶液，培养4h后用PBS洗涤。每孔加入150gLDMSO，振荡10min后在酶标仪上测定490nm处的吸光度值。细胞存活率(％)＝吸光度值(处理)/吸光度值(对照)X100％。
另取一个96孔板，用终浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL的Si02@QDs重复上面其他步骤，做一组Si02@QDs的细胞毒性测试，进行对照分析。
三、4SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针用于L929细胞成像
L929细胞株接种于六孔培养板，5％C02、37℃培养箱中培养。在细胞对数生长期加入Si02@QDs@CDs探针共同孵育。选取1、3、8和18h作为观察时间点。制定好时间计划，用无菌PBS冲洗2.3遍，90％甘油封片，借助共聚焦显微镜Zeiss510META观察Si02@QDs@，CDs探针与L929细胞结合情况。采用一组是含有Hg2+的L929细胞，同时要设计对比试验。以此证明Si02@QDs@CDs对L929细胞内Hg2+检测的特异性。
四、结果与分析
4.1SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针的细胞毒性分析
如图12和13所示，比较了SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针在包裹氨基化碳点的前后，分别对L929细胞存活率的影响。首先，在细胞培养皿中加入不同浓度的量子点，对于SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S微球而言，当细胞液中量子点浓度低于O.05mg/mL时，细胞存活率高于75％，但是，当细胞液中量子点浓度大于等于0.05mg/mL时，细胞存活率明显降低。
从图13观察到包裹碳点后的SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针在浓度0.05mg/mL.1.6mg/mL范围内，细胞存活率均保持在高于85％，由此可见，微球表面包裹致密的碳点材料能增加探针的细胞相容性，用这种生物毒性低的探针用于L929细胞成像对细胞的生长没有造成较大的影响。
4.2细胞成像分析
为了评价所设计的探针在生物体系中荧光标记的应用前景，下面采用该探针直接用于L929细胞中Hg2+的荧光检测。从图14中可以观察到，用SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针孵育过的L929细胞呈现出清晰的绿色荧光，这耀眼的绿色荧光足以把碳点本身的蓝色荧光掩盖了；当加入恰当浓度的Hg2+后，双发射荧光探针中作为信号标签的量子点如愿以偿地发生了荧光猝灭反应，此时碳点的蓝色荧光慢慢凸显，很容易被肉眼捕捉。由于细胞膜内外荧光探针的渗透压差的存在，且SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针的生物性低，L929细胞对它的摄取量足够，才完满实现了细胞内对Hg2+的灵敏检测的荧光成像，并为实现该探针在活体中金属离子的检测提供了新的研究思路。
本申请实现了SiO2@10Ca/6Tb:Bi2O2S@CDS荧光探针在细胞体系中高灵敏、高选择性检测Hg2+的细胞成像技术。这一工作不仅为细胞内Hg2+的定量分析提供了一个新的思路，而且对于制备高性能的荧光探针，促进其在生命科学中的应用具有重要意义。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种基于荧光碳量子点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针，其特征在于，该比率型荧光探针包括二氧化硅微球和10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶，所述的二氧化硅微球表面氨基化后修饰一层10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶，并在10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶外层还包裹修饰有氨基化荧光碳量子点。
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光碳量子点、共掺杂纳米晶的比率型荧光探针，其特征在于，二氧化硅微球、10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶、氨基化荧光碳量子点的摩尔比为1:5-10:10-30；优选为1:6-8:12-25。
3.权利要求1或2所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：
1）二氧化硅微球的合成
首先向250.0mL的烧瓶中依次加入乙醇80.0mL、水4.850mL和25％氨水3.6mL，在剧烈搅拌的下将其加热至55℃。
4.然后迅速地往烧瓶中加入3.1mL四乙氧基硅烷(TEOS)和8.0mL乙醇的混合溶液；使溶液的温度保持在55℃，反应5h，制得粒径在40±5nm左右的二氧化硅微球，制得的微球做为微球继续生长的种子；
在250.0mL的烧瓶中，加入10.0mL以上反应所制得的二氧化硅微球的种子溶液、乙醇70.0mL、水13.0mL和25％的氨水7.5mL，混合搅拌，并逐滴加入配置好的1.0mL四乙氧基硅烷和10.0mL乙醇的混合溶液，保持连续搅拌反应大于5h，即可制得直径在220士5nm左右的二氧化硅微球；
2）氨基化碳量子点的合成及纯化
在四氟乙烯容器中加入1．O mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和9．0mL的丙三醇，通入高纯氩气5 min，以除去溶液中的溶解氧，然后放入200℃的反应釜中，半小时后反应完成，待容器稍微冷却些，取出四氟乙烯容器中的淡黄色透明溶液；将淡黄色溶液注入到1000Da的透析袋中，用超纯水透析纯化，并每6 h换一次超纯水，至少透析12 h，最后透析袋中所得到的淡黄色溶液即是制备的氨基化碳量子点溶液；
3）二氧化硅微球的氨基化及其表面修饰量子点
取20.0mg二氧化硅微球重新溶解在新鲜配制的2.0mL的无水甲醇溶液中，该新鲜配制的无水甲醇溶液中3-氨丙基三乙氧基硅烷的浓度占10％，超声分散开，然后室温搅拌反应2h；反应之后，将氨基化的硅球依次用甲醇溶液和水反复洗涤三次后分散于2.OmL的10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶（5mg/mL）和2.0mL的EDC(20mg/mL)的混合液中，在4℃下混合搅拌12h，反应完后用水离心洗涤3次，将未耦连上的纳米晶洗去，制备得到10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶修饰的硅球；
4）将10Ca/6Tb:Bi2O2S纳米晶修饰的硅球溶解于2.0mL的EDC(20mg/mL)溶液中，向其中加入提前制备好的氨基化荧光碳量子点1.0mL，室温下搅拌反应12h，反应完成后将溶液离心洗涤三次，除去多余的碳量子点后，将其分散在2.0mL的水中，即得到双发射比率型荧光探针。
5.权利要求1-3任意一项权利要求所述的比率型荧光探针用于比率型Hg2+离子检测中的应用。
6.权利要求1-3任意一项权利要求所述的比率型荧光探针用于制备生物汞检测的设备中的应用。
7.权利要求1-3任意一项权利要求所述的比率型荧光探针用于制备人体汞中毒检测的设备中的应用。
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