CN101824477A - 一种基底、基因芯片及其制备方法以及检测靶标的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型树枝状大分子通过共价键结合在固体支持物上形成，所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。本发明提供的用于生物芯片的基底利用树枝状大分子的多氨基末端增加了反应点，使生物芯片灵敏度提高。本发明还提供用所述基底制备的基因芯片、所述基因芯片的制备方法以及利用该基因芯片检测靶标的方法。

Description

一种基底、基因芯片及其制备方法以及检测靶标的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基底、基因芯片及其制备方法以及检测靶标的方法。

背景技术

基因芯片技术是一种被广泛应用于研究基因表达，蛋白质与基因序列相互作用以及单核苷酸多态性的高通量的分析方法。在基因芯片的应用过程中，检测的灵敏度和选择性是两个非常重要的考察参数，所以，制作一种理想的，具有高的固定化效率，并且不与反应体系中的其他物质进行非特异性反应的芯片基底成为了基因芯片技术的关键。

基因芯片由基底和靶标探针组成。基底大致分为两类：1、表面修饰有醛基、环氧基或羧基等官能团的二维(2D)平板基底；2、在2D平板基底上涂覆聚丙烯酰胺凝胶使其表面具有三维(3D)结构的3D基底。相对于2D基底，3D基底具有高的固定化效率，能提供较多的反应位点与靶标反应，这样就大大提高了芯片的检测灵敏度，但是涂覆凝胶依然存在反应点少，与靶标探针结合不完全，生物相容性和可降解性不好的缺点。

树枝状大分子是一种特殊的聚合物，它不像链状高聚物那样会发生卷曲，因此能够提供很多末端基团用于功能化反应。此外，这种树枝状的分子还具有比较好的生物相容性。鉴于它的这种优良的性质，很多的研究工作者已经利用它来修饰基底，制作3D的基因芯片。这种大分子修饰的3D基底不仅具有很高的固定化效率，而且在后面的一系列反应和洗涤过程中性能稳定。

目前，对表面修饰有树枝状大分子的3D基因芯片的检测主要依赖传统的荧光分子染料检测方法，但是荧光染料检测方法不仅光稳定性差，还必须使用高精度的仪器，检测过程步骤复杂，不易控制。在不断寻求创新方法的过程中，本领域人员发现，金属、半导体以及磁纳米粒子具有比较特殊的性质，能够取代荧光染料而用于基因检测。尤其是金属纳米粒子的共振光散射检测法灵敏度更高，甚至能够检测单分子识别反应。Mirkin研究小组将金纳米粒子应用于芯片上来检测靶标，文中用金标记的靶标探针来识别靶标，再用基于无电导的银沉积步骤来提高共振光散射信号。这种方法能够灵敏的检测靶标而不用聚合酶链反应(PCR)等靶标放大技术。此外，这种基于金纳米粒子共振光散射的基因芯片的信号提取可以直接使用普通的白光扫描仪，因此，能够节省很多经费，但是Mirkin只报道了金纳米粒子应用于2D基底或涂覆凝胶的3D基底制备的芯片，应用于树枝状大分子修饰的芯片还未有报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的生物芯片检测灵敏度和识别度欠佳的缺陷，提供一种灵敏度和识别度更高的基因芯片和检测靶标的方法。

为了解决以上问题，本发明提供了一种用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型树枝状大分子通过共价键结合在固体支持物上形成，所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。

优选的，所述固体支持物为玻片。

优选的，所述生物芯片为基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片或组织芯片。

本发明还提供了一种基因芯片，包括：表面通过共价键结合了聚酰胺-胺型树枝状大分子的固体支持物，以及通过共价键固定在所述聚酰胺-胺型树枝状大分子上的靶标探针；所述靶标探针含有能与靶标杂交的序列；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。

优选的，所述固体支持物为玻片。

优选的，所述玻片为二氧化硅玻片或有机硅玻片。

优选的，所述靶标探针为3′-NH₂修饰的DNA探针或RNA探针。

本发明还提供了所述基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将表面醛基化的固体支持物浸泡于聚酰胺-胺型树枝状大分子溶液中10h～14h得到与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的固体支持物；

步骤2：用pH值为7～7.4的戊二醛溶液将所述与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的固体支持物活化；

步骤3：取靶标探针在步骤2所得固体支持物上点样，得到基因芯片。

本发明还提供了利用所述基因芯片进行靶标检测的方法，包括以下步骤：

步骤1：使半径为10nm～13nm金纳米粒子与二硫键修饰检测探针反应，制备与检测探针耦合的金纳米粒子，所述检测探针与靶标杂交；

步骤2：使固定于权利要求4所述基因芯片上的靶标探针与可能含靶标的待测样品反应，洗涤后使所述基因芯片与步骤1所制备的与检测探针耦合的金纳米粒子反应，所述靶标探针不与检测探针杂交；

步骤3：取0.05～0.09mol/L的硝酸银溶液与0.02～0.05mol/L的对苯二酚溶液按体积比1～1.5∶1混合后，与经步骤2处理后的基因芯片在室温下反应，洗涤后检测共振光散射信号。

优选的，所述靶标为DNA序列或RNA序列。

本发明提供了一种用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型树枝状大分子通过共价键结合在固体支持物上形成，所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。该基底可以用于基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片和组织芯片的制备。本发明还提供了一种基因芯片，包括：表面通过共价键结合了聚酰胺-胺型树枝状大分子的固体支持物，以及通过共价键固定在所述聚酰胺-胺型树枝状大分子上的靶标探针；所述靶标探针含有能与靶标杂交的序列；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。本发明提供的基因芯片，使用聚酰胺-胺树枝状大分子修饰玻片，并将靶标探针通过共价键固定在所述树枝状大分子上，由于所述聚酰胺-胺树枝状大分子具有64个氨基末端，与现有技术相比增加了反应点，这样就能够连接更多的相同的靶标探针，增加了基因芯片的灵敏度；也可以同时连接不同的靶标探针，以增加基因芯片的检测通量。本发明还提供了一种基因芯片的制备方法，包括：步骤1：将表面醛基化的玻片浸泡于聚酰胺-胺型树枝状大分子溶液中10h～14h得到与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的玻片；步骤2：用pH值为7～7.4的戊二醛溶液将所述与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的玻片活化；步骤3：取靶标探针在步骤2所得玻片上点样，得到基因芯片。由于使用的是聚酰胺-胺型树枝状大分子，所以具有多个反应点，与靶标探针和玻片的反应及固化速率都很高，降低了反应条件，不需要大型的复杂的设备，节约了成本。本发明还提供了一种利用基因芯片检测靶标的方法，包括步骤1：使半径为10nm～13nm金纳米粒子与二硫键修饰检测探针反应，制备与检测探针耦合的金纳米粒子，所述检测探针与靶标杂交；步骤2：使固定于权利要求4所述基因芯片上的靶标探针与可能含靶标的待测样品反应，洗涤后使所述基因芯片与步骤1所制备的与检测探针耦合的金纳米粒子反应，所述靶标探针不与检测探针杂交；步骤3：取0.05～0.09mol/L的硝酸银溶液与0.02～0.05mol/L的对苯二酚溶液按体积比1～1.5∶1混合后，与经步骤2处理后的基因芯片在室温下反应，洗涤后检测共振光散射信号。本发明提供的检测方法，用检测探针耦合的金纳米粒子做为靶标的标记物。如果靶标探针与靶标不能完全配对，靶标探针序列与靶标序列中的错位碱基越多，金纳米粒子的共振光散射信号就越弱，因此通过共振光散射信号的强弱以及靶标探针的序列就可以判断靶标的序列，与现有技术相比本发明提供的靶标检测方法提高了识别度。灵敏度和准确性。

附图说明

图1示本发明所述基底的制备过程；

a为玻片通过醛基共价结合聚酰胺-胺型树枝状大分子的过程，b为用硼氢化钠除去希夫碱的过程，c为聚酰胺-胺型树枝状大分子与戊二醛反应的过程。GA为戊二醛、PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状大分子；

图2示用本发明所述基因芯片进行靶标检测的过程，其中a为通过醛基共价结合聚酰胺-胺型树枝状大分子的玻片，P为靶标探针，T为靶标，G为检测探针耦合的金纳米粒子；

图3示共振光散射信号与靶标探针P₁浓度的关系，白色对应于未通过醛基共价结合聚酰胺-胺型树枝状大分子的玻片制作的基因芯片，黑色对应通过醛基共价结合聚酰胺-胺型树枝状大分子的玻片制备的基因芯片；

图4示不同基底制备的基因芯片的信噪比、质量因子对比，其中，共振光散射强度在3×10⁴～4×10⁴之间的正方形点对应使用修饰有聚酰胺-胺型树枝状大分子的基底制备的基因芯片上各个检测点的共振光散射信号，而1×10⁴～2×10⁴之间的圆形点是未使用聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰的基底制备的基因芯片上各个检测点的共振光散射信号，0～1×10⁴之间的正方形点和圆点为背景的共振光散射信号；

图5示共振光散射信号与靶标T浓度的关系，图中正方形点对应于未使用聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰的基底制备的基因芯片上的共振光散射信号，圆点对应于使用聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰的基底制备的基因芯片上的共振光散射信号；

图6示未使用聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰的基底制备的基因芯片检测靶标序列结果，图中横坐标为5μmol/L的不同靶标探针，纵坐标为共振光散射相对强度，即以完全匹配的靶标探针P₁的信号为基准，其他靶标探针的信号与P₁信号的比值；

图7示使用醛基共价结合聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰的基底制备的基因芯片检测靶标序列结果，图中横坐标为5μmol/L的不同靶标探针，纵坐标为共振光散射相对强度，即以完全匹配的探针P₁的信号为基准，其他探针的信号与P₁信号的比值。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。

本发明提供了一种用于生物芯片的基底，由聚酰胺-胺型树枝状大分子通过共价键结合在固体支持物上形成，所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。按照本发明，利用醛基修饰的玻片(2D基底)与聚酰胺-胺型树枝状大分子通过共价键结合，得到聚酰胺-胺型树枝状大分子修饰的玻片(3D基底)，再通过所述聚酰胺-胺树枝状大分子表面的氨基末端醛基化即可用于制备基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片、组织芯片等生物芯片。本发明提供的用于生物芯片的基底利用树枝状大分子的多氨基末端增加了反应点，使生物芯片灵敏度提高。

本发明提供了一种使用所述基底的基因芯片，包括：表面通过共价键结合了聚酰胺-胺型树枝状大分子的固体支持物，以及通过共价键固定在所述聚酰胺-胺型树枝状大分子上的靶标探针；所述靶标探针含有能与靶标杂交的序列；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。

按照本发明，玻片优选为本领域人员熟知的二氧化硅玻璃片或有机硅半导体玻片，本发明不做限定，所述玻片的表面预先经过了醛基修饰。聚酰胺-胺型树枝状大分子优选以乙二胺为中心的含有64个氨基末端的第四代聚酰胺-胺型树枝状大分子(PAMAM)，而所述64个氨基末端形成了一个近似的圆球状，增加了玻片的表面积与反应点，能够结合更多的靶标探针，使制备的基因芯片灵敏度更高，检测更准确，所述PAMAM与玻片上醛基的个数比为1∶2～4。所述靶标探针为10～12个核苷酸组成的基因序列，是靶标一部分序列的互补链，用于和靶标结合。本发明优选使用西格玛(SIGMA)公司生产的分子量为14214.17的PAMAM、沸点为64.7℃，在25℃下，密度为0.813g/mL。

本发明还提供了一种基因芯片的制备方法，包括：

步骤1：将表面醛基化的固体支持物浸泡于聚酰胺-胺型树枝状大分子溶液中10h～14h得到与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的固体支持物；

步骤2：用pH值为7～7.4的戊二醛溶液将所述与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的固体支持物活化；

步骤3：取靶标探针在步骤2所得固体支持物上点样，得到基因芯片。

按照本发明，将醛基修饰的玻片放入25mL～35mL的第四代PAMAM甲醇溶液中，第四代PAMAM的质量百分数优选为0.05％～0.15％，在轻微搅拌下，PAMAM上的氨基末端会与玻片上的醛基反应，将PAMAM通过共价结合在醛基修饰的玻片上，室温反应10h～14h后，用25mL～35mL甲醇洗涤2～3次，每次2min～3min，目的是用甲醇除去未反应的PAMAM，洗涤结束后用N₂吹干所述通过醛基共价结合有PAMAM的玻片。PAMAM与玻片的共价结合过程中，PAMAM上的氨基末端和玻片上的醛基反应后，会生成希夫碱，而希夫碱中含有不稳定的亚胺键，容易水解，通过硼氢化钠还原亚胺键会变为较稳定的仲胺，按照本发明，将上述通过醛基共价结合PAMAM的玻片浸泡在体积为25mL～35mL，浓度为8mmol/L～12mmol/L硼氢化钠(NaBH₄)溶液中，还原所述希夫碱。然后，将通过醛基共价结合PAMAM的玻片放入25mL～35mL的戊二醛溶液中反应3h～5h，使PAMAM上的未与玻片表面上醛基反应的氨基波段与戊二醛反应。所述戊二醛溶液优选包括2wt％～5wt％的戊二醛和95wt％～98wt％的磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲液优选为含有40mmol/L～60mmol/L的磷酸盐、0.10mol/L～0.20mol/L的氯化钠的PBS溶液，添加磷酸盐缓冲液的目的在于保持整个戊二醛溶液的pH值为7～7.4。所述反应结束后用25mL～35mL上述磷酸盐缓冲溶液洗涤所述玻片2～3次，每次2min～3min，再优选使用Milli-Q超纯水洗涤所述玻片2～3次，每次2min～3min，所有洗涤步骤结束后，优选使用离心干燥器将所述通过共价键结合PAMAM的玻片离心干燥后得到3D基底，并将所述基底在3℃～4℃下保存待用。基底的制备过程如图1所示。

3D基底制备完成后，将点样缓冲液与靶标探针混合得到靶标探针溶液。本发明提供的靶标探针末端均有一个氨基修饰，目的是为了能和PAMAM上的醛基反应，将靶标探针链接到基底上。所述点样缓冲液包括：40mmol/L～50mmol/L柠檬酸三钠，0.4mol/L～0.5mol/L的氯化钠，1mol/L～2mol/L甜菜碱，0.004wt％～0.006wt％十二烷基磺酸钠。取10μL～20μL所述样品溶液于样品板中，用Smartarrayer48点样系统，在3D基底上点样。将点好样的基底放入恒湿箱中，在20～30℃下恒温反应至少10小时，再升温90℃～100℃，反应10min～20min。使得靶标探针上的氨基与醛基反应，将靶标探针连接在3D芯片基底上，反应结束后用25mL～35mL洗液洗涤2～3次每次2min～3min，再用Milli-Q超纯水洗涤2～3次每次2min～3min以除去未被固定的靶标探针。所述洗液优选包括：15mmol/L～17mmol/L柠檬酸三钠缓冲溶液，0.15mol/L～0.16mol/L的氯化钠，0.01wt％～0.03wt％十二烷基磺酸钠。洗涤结束后得到基因芯片。按照本发明首先恒温反应是为了时靶标探针能够均匀的与3D基底均匀结合，而升温反应是为了防止基底表面通过共价键结合的的靶标探针自杂交而降低基因芯片的检测灵敏度。按照本发明优选将制备好的基因芯片放入封闭溶液中，在25～30℃下反应1h～1.5h，目的是为了除去基因芯片表面未反应的活性醛基。所述封闭溶液为40mmol/L～60mmol/L磷酸盐、0.15mol/L～0.2mol/L氯化钠、0.1mol/L～0.2mol/L乙醇胺的PBS溶液，pH＝7～7.4。

本发明还提供了一种靶标的检测方法，包括：步骤1：使半径为10nm～13nm金纳米粒子与二硫键修饰检测探针反应，制备与检测探针耦合的金纳米粒子，所述检测探针与靶标杂交；

步骤2：使固定于权利要求4所述基因芯片上的靶标探针与可能含靶标的待测样品反应，洗涤后使所述基因芯片与步骤1所制备的与检测探针耦合的金纳米粒子反应，所述靶标探针不与检测探针杂交；

步骤3：取0.05～0.09mol/L的硝酸银溶液与0.02～0.05mol/L的对苯二酚溶液按体积比1～1.5∶1混合后，与经步骤2处理后的基因芯片在室温下反应，洗涤后检测共振光散射信号。

按照本发明，优选使用“Turkevich-Frens”方法制备金纳米粒子GNPs，即用柠檬酸三钠还原氯金酸制备的金纳米粒子，所述金纳米粒子的直径优选为10nm～13nm。按照本发明，检测探针耦合的金纳米粒子优选为将检测探针通过共价键与金纳米粒子GNPs耦合得到检测探针耦合的金纳米粒子，所述检测探针优选为二硫键修饰的探针(SP)。在本发明中首先将体积为20μL～30μL、浓度为30μmol/L～40μmol/L的SP水溶液与体积优选为450μL～550μL、浓度优选为4nmol/L～8nmol/L的GNPs溶液混合，静置过夜；然后加入450μL～550μL磷酸盐缓冲溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为7.0～7.4。所述磷酸盐缓冲溶液中优选含8mmol/L～12mmol/L磷酸盐、0.1mol/L～0.5mol/L氯化钠的PB S溶液。将所述第一混合溶液静置1.5h～2.5h后优选使用真空离心浓缩仪将第一混合液溶液浓缩至120μL～180μL得到第一浓缩液。然后再以8000～10000转/min的转速，10～20min的时间离心第一浓缩液2～3次，除去游离在第一浓缩液中未与金纳米粒子耦合的检测探针，将离心浓缩后得到的检测探针耦合的金纳米粒子溶于杂交缓冲液中并保持检测探针耦合的金纳米粒子最终浓度为4nmol/L～6nmol/L。所述杂交缓冲液优选包括：50mmol/L～70mmol/L柠檬酸三钠，0.5mol/L～0.7mol/L的氯化钠，0.05wt％～0.15wt％十二烷基磺酸钠。所述检测探针耦合的金纳米粒子为靶标检测中靶标的标记物，如果靶标探针与靶标不能完全配对，那么检测探针就无法与靶标杂交，就无法检测到金纳米粒子的共振光散射信号，靶标探针序列与靶标序列中的错位碱基越多，共振光散射信号就越弱，因此通过共振光散射信号的强弱以及靶标探针的序列就可以判断靶标的序列。

利用预先制备好的基因芯片以及检测探针耦合的金纳米粒子就可以用来检测靶标的基因序列，检测分为两个阶段，第一阶段为靶标与基因芯片的杂交反应，然后所述靶标再与检测探针耦合的金纳米粒子进行杂交反应得到金纳米粒子标记的连接有靶标的基因芯片，第二阶段为用银粒子沉积在所述检测探针耦合的金纳米粒子上的金纳米粒子的表面，扩大金纳米粒子的半径，增强了共振光散射信号强度，从而提高检测的灵敏度和准确性。

按照本发明，靶标探针为靶标互补链的一部分，而与金纳米粒子耦合的检测探针为靶标互补链的另一部分，当把靶标与靶标探针杂交后，再用检测探针耦合的金纳米粒子与靶标杂交，且靶标探针不与检测探针杂交，通过金纳米粒子特有的共振光散射性质，可以通过检测信号的强弱来判断互补链与靶标是否完全匹配。

具体杂交步骤为：指将靶标溶解在杂交缓冲液中得到靶标溶液，取15μL～25μL的靶标溶液与在所述封闭溶液中封闭好的基因芯片在25℃～35℃下反应25min～35min。所述杂交缓冲液优选包括：60mmol/L～70mmol/L柠檬酸三钠溶液，0.6mol/L～0.8mmol/L的氯化钠溶液，0.1wt％～0.2wt％十二烷基磺酸钠。洗涤反应后的芯片，所述洗涤包括用上述杂交缓冲液在30℃下洗涤2～3次，每次2min～3min，再用所述洗液在室温下洗涤2～3次，每次2min～3min，最后用Milli-Q超纯水洗涤2～3次，每次2min～3min，洗涤结束后，再离心干燥1min～2min，让芯片与之前制备好的检测探针耦合的金纳米粒子在30℃下反应30min，再对芯片进行以上洗涤和干燥过程过程。

按照本发明在芯片与检测探针耦合的金纳米粒子反应完之后，用银增强溶液在室温下反应6min～10min，用水洗涤所述银增强处理后的基因芯片2～3次，每次2min～3min，离心干燥1min～2min。所述银增强溶液优选为体积比为1～1.5∶1的硝酸银溶液和对苯二酚溶液。最后，用微阵列扫描仪(ArrayIt SpotWare Colorimetric Microarray Scanner)扫描所述银增强后的基因芯片，提取共振光散射信号(RLS)。本发明中讨论所用的RLS信号值都是扣除背景以后的信号值，通过RLS信号的强弱可以判断靶标探针和靶标的匹配度进而推断出靶标的序列信息。

以下用具体实施例来详细阐述本发明的方案：

实施例1

按照以下步骤来制备检测探针耦合的金纳米粒子：

用Turkevich-Frens法制备直径为13nm金纳米粒子。将体积为25μL、浓度为40μmol/L的SP水溶液与500μL、6nmol/L的GNPs溶液混合，静置过夜，然后加入500μL磷酸盐缓冲溶液，得到第一混合溶液。所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4，且所述磷酸盐缓冲溶液为含有10mmol/L磷酸盐、0.2mol/L氯化钠的PBS溶液。将所述第一混合溶液静置2h后优选使用真空离心浓缩仪将溶液浓缩至150μL得到浓缩液。然后再以9000rad/min的转速离心浓缩液3次每次15min，将离心浓缩后得到的检测探针耦合的金纳米粒子溶于60mmol/L柠檬酸三钠，0.6mol/L的氯化钠，0.1wt％十二烷基磺酸钠组成的杂交缓冲液中并保持检测探针耦合的金纳米粒子溶液的最终浓度为5nmol/L。

实施例2

按照以下方法来制作3D基底：

将醛基修饰的玻片放入30mL质量分数为0.1wt％的第四代的PAMAM甲醇溶液中，在搅拌下，室温反应12h后，用30mL甲醇洗涤3次，每次3min，再用N₂吹干。用30mL，10mmol/L的硼氢化钠(NaBH₄)溶液还原上述反应中生成的希夫碱。然后，将修饰有树枝状分子的基底放入30mL的戊二醛溶液中反应4小时，所述戊二醛溶液优选包括5wt％的戊二醛和95％的磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲液为含有50mmol/L磷酸盐、0.15mol/L的氯化钠的PBS溶液，pH值为7.4。用30mL上述磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，每次3min，用Milli-Q超纯水洗涤3次，每次3min，离心干燥1min后得到PAMAM修饰的3D基底，将该3D基底保存于4℃下待用。

其具体制作过程参看图1。

实施例3

PAMAM修饰的3D基底制备的基因芯片的反应效率实验：

首先，按照实施例1，实施例2的方法得到检测探针耦合的金纳米粒子和PAMAM修饰的3D基底；

其次，用45mmol/L柠檬酸三钠缓冲液，0.45mol/L的氯化钠，1.5mol/L甜菜碱，0.005wt％十二烷基磺酸钠组成的点样缓冲液分别配制浓度为20μmol/L、5μmol/L、500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L的探针P₁溶液，P₁的序列如SEQ ID No.1所示。取15μL样品于样品板中，用Smartarrayer48点样系统，在普通的2D芯片基底上和修饰有PAMAM的3D基底上点样。将点好样的芯片放入恒温恒温箱中反应12小时，反应条件为T＝25℃，相对湿度90％，再在100℃下反应15min；接下来，用30mL洗液3次，每次3min，再用Milli-Q超纯水3次，每次3min。最后，将芯片放入封闭溶液中，在30℃下反应1小时得到基因芯片。

将靶标溶于杂交缓冲液中得到靶标溶液，取20μL的靶标溶液与在所述封闭溶液中封闭好的基因芯片在30℃下反应20min。所述杂交缓冲液包括：60mmol/L柠檬酸三钠，0.6mol/L的氯化钠，0.1wt％十二烷基磺酸钠。洗涤反应后的芯片，所述洗涤包括用上述杂交缓冲液在30℃下洗涤3次，每次3min，再用15mmol/L柠檬酸三钠，0.15mol/L的氯化钠，0.01wt％十二烷基磺酸钠组成的洗液在室温下洗涤3次，每次3min，最后用Milli-Q超纯水洗涤3次，每次3min，洗涤结束后，再离心干燥1min，让芯片与之前制备好的检测探针耦合的金纳米粒子在30℃下反应30min，再对芯片进行以上洗涤和干燥过程过程。

按照本发明在芯片与检测探针耦合的金纳米粒子反应完之后，用体积比为1∶1的浓度为0.08mol/L的硝酸银溶液和浓度为0.04mol/L的对苯二酚溶液组成的银增强溶液在室温下与检测探针耦合的金纳米粒子标记的基因芯片反应8min，用水洗涤所述银增强处理后的基因芯片3次，每次3min，离心干燥1min。所述银增强溶液为体积比为1∶1的硝酸银溶液和对苯二酚溶液。最后，用微阵列扫描仪(ArrayItSpotWare Colorimetric Microarray Scanner)扫描所述银增强后的基因芯片，提取共振光散射信号(RLS)。本发明中讨论所用的RLS信号值都是扣除背景以后的信号值。

芯片上的具体反应过程参看图2。

按照以上实验步骤，我们得到的结果如图3所示。

图3是在2D和3D基底上，共振光散射信号随着探针P₁(与靶标完全匹配)浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图其中，白色对应于2D基底，黑色对应于3D基底。实验中用到的探针P₁的浓度分别为20μmol/L、5μmol/L、500nmol/L、50nmol/L、5nmol/L；靶标T的浓度为100nmol/L，检测探针耦合的金纳米粒子的浓度为5nmol/L。当P₁浓度大于50nmol/L时得到最佳的信噪比值(3倍的标准偏差)，且当P₁浓度在50nmol/L-5μmol/L之间时，共振光散射信号随着浓度的增加而增强并在5μmol/L时基本达到饱和值。而在同样的实验条件下，2D基底制备的基因芯片上的信号则相对较弱。这个结果表明：树枝状分子修饰的3D基底制备的基因芯片相对于普通的2D基底制备的基因芯片具有较高的反应效率。

实施例4

PAMAM修饰的3D基底制备的基因芯片的性能：

首先，按照的实施例1和实施例2方法得到检测探针耦合的金纳米粒子和PAMAM修饰的3D基底；

用实施例3的方法进行点样、杂交反应和检测标靶并做了大于50组的实验作为对比，其中靶标探针P₁的浓度为5μmol/L。

芯片上的具体反应过程参看图2。

按照以上实验步骤，我们得到的结果参看图4我们通过对2D(圆点)和3D(正方形)两种基底制备的基因芯片上的50个点的共振光散射信号，以及背景提取噪音信号的考察即共振光散射在0～10000之间的正方形点和圆形点，分别计算了两种基底的信噪比S/N和质量因子Z’。实验中用到的探针P₁的浓度为5μmol/L，靶标T的浓度为100nmol/L，检测探针耦合的金纳米粒子的浓度为5nmol/L。图中我们考察了50个点的共振光散射信号以及背景，分别计算了两种基底的S/N值和Z’质量因子，S/N值根据通过RSL检测的共振光散射信号强度与背景噪音信号的比值，而Z’是通过公式

计算，其中：

μ_c背景信号的平均值；σ_c背景的信号标准偏差；μ_s金纳米粒子共振光散射信号的平均值；σ_s金纳米粒子共振光散射信号的标准偏差。

通过计算得到3D基底制备的基因芯片的S/N为9.0，Z’为0.87，而2D基底制备的基因芯片S/N为5.72，Z’为0.57。S/N值越大，Z’值越趋向于1，芯片的质量越好。

所以通过以上的结果证明本发明提供的3D基底制备基因芯片的性能优于2D基底制备的基因芯片。

实施例5

本发明提供的基因芯片的检测限和线性范围：

首先，按照实施例1和实施例2的方法得到检测探针耦合的金纳米粒子和PAMAM修饰的3D基底；

按照实施例4的方法进行点样、杂交反应和检测靶标，其中靶标溶液的浓度分别为1μmol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、1nmol/L、500pmol/L、100pmol/L。

芯片上的具体反应过程参看图2。

按照以上实验步骤，我们得到的结果参看图5。

图5为是在2D基底制备的基因芯片和3D基底制备的基因芯片上，共振光散射信号随着靶标T浓度的变化而变化的图像以及相应的数据提取图，其中，正方形对应于2D基底制备的基因芯片上的信号曲线，圆点对应于3D基底上制备的基因芯片的信号曲线。图中横坐标为靶标浓度取对数值，纵坐标为共振光散射信号。实验中用到的探针P₁的浓度为5μM；靶标T的浓度分别为1μmol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L、5nmol/L、1nmol/L、500pmol/L、100pmol/L；检测探针耦合的金纳米粒子的浓度为5nmol/L。

在3D基底制备的基因芯片上，此方法对靶标的检测限为100pmol/L，且当浓度在1nmol/L-100nmol/L之间时，共振光散射信号随着浓度的增加而增强，在浓度为100nmol/L时达到饱和。而对于2D基底制备的基因芯片，信号值明显较低，且检测限为10nmol/L，即灵敏度降低了两个数量级。

实施例6

本发明提供的检测方法的选择性。

首先，按照实施例1和实施例2的方法得到检测探针耦合的金纳米粒子和PAMAM修饰的3D基底；

按照实施例4的方法进行点样、杂交反应和检测靶标，其中使用了10中不同的靶标探针溶液P₁～P₁₀。

芯片上的具体反应过程参看图2。

实验中用到的10种靶标探针P₁～P₁₀的序列如SEQ ID No.1、No.2No.3、No.4、No.5、No.6、No.7、No.8、No.9、No.10所示。靶标T的序列如SEQ ID No.11所示。其中，只有P₁与靶标完全匹配，P₂～P₇在不同位点各有一个错配碱基，P₈～P₁₀各有两个错配碱基。

按照以上实验步骤，我们得到的结果如图6，图7所示。图中y轴代表共振光散射的相对强度，即以完全匹配的探针P₁的信号为基准，其他探针的信号与P₁信号的比值；x轴代表相应的靶标探针种类。是对单核苷酸多态性考察。图6是在2D基底上10种靶标探针(P₁-P₁₀)的共振光散射信号图及相应的数据提取图，图7是在3D基底上10种探针的共振光散射信号图及相应的数据提取图。实验中用到的探针(P₁-P₁₀)的浓度均为5μmol/L，靶标T的浓度为100nmol/L，检测探针耦合的金纳米粒子的浓度为5nmol/L。

通过以上实验结果可以证明：(1)只有与靶标相匹配的探针P₁有强的共振光散射信号；(2)具有一个错配碱基的寡聚物P₂-P₇有很弱的信号，且其信号值与碱基对的种类和错配位点有关：错配位点越靠近探针的固定端即3’端信号值越弱，且在同一错配位点处，含有T:G碱基对的靶标探针比含有T:C碱基对的信号要高；(3)具有两个错配碱基的寡聚物P₈-P₁₀没有可检测的共振光散射信号；(4)通过图中柱状数据的比较计算得出结论：含有一个错配碱基的靶标探针与完全匹配的靶标探针的散射光信号比值，2D基底制备的基因芯片的比值在0-24.3％之间，3D的基底制备的基因芯片比值在0-4.2％之间，说明3D基底制备的基因芯片的选择性明显优于2D基底制备的基因芯片。

以上对本发明提供的一种靶标的检测方法及其检测用基因芯片进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>中国科学院长春应用化学研究所

<120>一种基底、基因芯片及其制备方法以及检测靶标的方法

 

<130>MP1001767

 

<160>12

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₁

 

<400>1

taacaataat cc                                                            12

 

<210>2

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₂

 

<400>2

taacaatagt cc                                                            12

 

<210>3

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₃

 

<400>3

taacaatact cc                                                        12

 

<210>4

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₄

 

<400>4

taaccataat cc                                                        12

 

<210>5

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₅

 

<400>5

taacgataat cc                                                        12

 

<210>6

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₆

<400>6

tcacaataat cc                                                            12

 

<210>7

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₇

 

<400>7

tgacaataat cc                                                            12

 

<210>8

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₈

 

<400>8

tgacgataat cc                                                            12

 

<210>9

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₉

 

<400>9

tgacaatagt cc                                                        12

 

<210>10

<211>12

<212>DNA

<213>3′-NH₂修饰的靶标探针P₁₀

 

<400>10

taacgatagt cc                                                        12

 

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>靶标T

 

<400>11

ggattattgt taaatattga taaggat                                        27

 

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>5′-HO(CH₂)₆-S-S-(CH₂)₆修饰的检测探针SP

 

<400>12

tttttttttt atccttatc aatatt                                          25

Claims (10)

1.一种用于生物芯片的基底，其特征在于，由聚酰胺-胺型树枝状大分子通过共价键结合在固体支持物上形成，所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。

2.根据权利要求1所述的基底，其特征在于，所述固体支持物为玻片。

3.根据权利要求1所述的基底，其特征在于，所述生物芯片为基因芯片、蛋白质芯片、糖芯片或组织芯片。

4.一种基因芯片，包括：表面通过共价键结合了聚酰胺-胺型树枝状大分子的固体支持物，以及通过共价键固定在所述聚酰胺-胺型树枝状大分子上的靶标探针；所述靶标探针含有能与靶标杂交的序列；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子为以乙二胺为中心放射出64个氨基末端的树枝状大分子，分子量为14214～14220；所述聚酰胺-胺型树枝状大分子经醛基活化。

5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述固体支持物为玻片。

6.根据权利要求5所述的基因芯片，其特征在于，所述玻片为二氧化硅玻片或有机硅玻片。

7.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述靶标探针为3′-NH₂修饰的DNA探针或RNA探针。

8.权利要求4-7任一项所述基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：将表面醛基化的固体支持物浸泡于聚酰胺-胺型树枝状大分子溶液中10h～14h，得到与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的固体支持物；

步骤2：用pH值为7～7.4的戊二醛溶液将所述与聚酰胺-胺型树枝状大分子共价结合的固体支持物活化；

步骤3：取靶标探针在步骤2所得固体支持物上点样，得到基因芯片。

9.一种靶标的检测方法，包括以下步骤：

步骤1：使半径为10nm～13nm金纳米粒子与二硫键修饰检测探针反应，制备与检测探针耦合的金纳米粒子，所述检测探针与靶标杂交；

步骤2：使固定于权利要求4所述基因芯片上的靶标探针与可能含靶标的待测样品反应，洗涤后使所述基因芯片与步骤1所制备的与检测探针耦合的金纳米粒子反应，所述靶标探针不与检测探针杂交；

步骤3：取0.05～0.09mol/L的硝酸银溶液与0.02～0.05mol/L的对苯二酚溶液按体积比1～1.5∶1混合后，与经步骤2处理后的基因芯片在室温下反应，洗涤后检测共振光散射信号。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述靶标为DNA序列或RNA序列。

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