CN108337902A

CN108337902A - 用于以给定图案将目的化合物固定在基底上的方法以及用于实施所述方法的套件

Info

Publication number: CN108337902A
Application number: CN201580084186.6A
Authority: CN
Inventors: 吉恩-玛丽·弗朗索瓦; 朱莉·丰西; 埃马努埃莱·特雷维肖尔; 奇尔德里克·塞韦拉克
Original assignee: Thede Lys Co; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Thede Lys Co; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明涉及用于通过由聚合物材料制成的印刷衬垫(10)来以给定图案将目的化合物固定在基底(40)的表面上的方法，所述印刷衬垫(10)包含具有与所述图案在几何上匹配的中空轮廓(13)的面(12)。所述方法包括将目的化合物沉积在凹槽(13)的壁表面上，然后将能够与基底(40)形成连接并且与目的化合物形成连接的化合物在能够渗透进聚合物材料的溶剂中的溶液(32)限制(27)在基底(1O)与衬垫的面(12)之间在凹槽(13)内。所述限制在足以允许溶剂渗透聚合物材料的温度和时间下进行。

Description

用于以给定图案将目的化合物固定在基底上的方法以及用于实施所述方法的套件

本发明涉及用于根据给定图案将目的化合物固定在基底表面上的方法并且还涉及这样的方法用于制造生物芯片的用途。本发明还涉及用于进行这样的方法的套件。

将在本说明书中更具体详细描述的本发明的具体应用领域是DNA生物芯片的制造，在这种情况下目的化合物是核酸分子。

然而，这样的应用领域对本发明而言绝不是限制性的，本发明还适用于其中可以证明根据预定图案将一种或更多种化合物沉积并固定在固体基底或半固体基底(例如凝胶)上具有意义的任何领域。在本说明书通篇，术语“图案”旨在表示三维几何排布。

DNA生物芯片使得可以检测复杂生物样品中数十或甚至上千种特定核苷酸序列的存在。其优选地是包含基底的微型化系统，在所述基底上称为探针的核酸分子以有序方式沉积，特别是共价键合，所述核酸分子各自处在基底上的精确位置。DNA生物芯片的基本原理基于两条DNA链或DNA链与RNA链之间的互补性，一方面是核苷酸碱基A与T的互补性，另一方面是核苷酸碱基G与C的互补性。其在于：在存在“靶”核酸群的情况下放置生物芯片，并检测靶核酸与固定在基底上的探针特异性杂交的任何复合物。

从技术角度看，生物芯片的制造包括两个不同的阶段：固体或半固体支持物的官能化以向其提供允许探针分子随后结合的化学官能团；然后是这些探针分子在由此官能化的基底表面上的有序定向。

关于第一阶段，现有技术已经提出了使基底官能化的多种技术。这些技术使得在基底表面上引入允许后续探针附接的官能团成为可能。这样的表面官能化可以通过将基底浸于合适化学化合物的溶液中(Trévisiol，2003，New Journal of Chemistry，27，1713-1719)或通过软光刻术(例如微接触印刷)(Thibault等，2006，MicroelectronicEngineering，83，1513-1516)来实现。

关于第二阶段，其中探针定向的图案在很大程度上取决于设想的读取生物芯片的方法。例如，对于荧光生物芯片，探针可以通过针型机器人或喷墨机器人在基底表面上定向(Barbulovic-Nad等，2003，Critical reviews in Biotechnology，26，237-259)。在这种情况下，图案是圆点，其尺寸与荧光读取扫描仪的分辨率兼容。在不经荧光标记进行检测(例如，通过光衍射进行检测)的情况下，探针根据“衍射”图案在官能化基底上有序排布，所述衍射图案的尺寸和形状取决于衍射读取系统。探针的定向则可以例如通过微接触印刷技术来实现。

无论如何，这些制造生物芯片的方法都具有实施起来时间长、具有限制性和相对昂贵的缺陷。

本发明旨在通过提供以下方法来克服现有技术提出用于根据预定图案将目的化合物固定在基底表面上的方法、特别是上述那些的缺陷：所述方法使得可以在短时间内且用很少步骤进行这样的固定，这不关注化合物在期望基底上定向所依据的图案，特别是不关注该图案是简单的点还是衍射光栅。

为此，本发明提供了用于根据给定图案(即根据给定三维几何排布)将目的化合物靶向固定在固体或半固体基底的表面上的方法。该方法包括以下连续步骤：

-在包含具有与所述图案在几何上互补之凹槽轮廓的面(称为印刷面)的由聚合物材料、特别是由弹性体材料制成的印刷衬垫(称为衬垫)上，将目的化合物沉积在至少一个凹槽、优选所有凹槽的壁表面上；

-以及将化合物(称为接头化合物)的溶液限制在基底与衬垫的印刷面之间的所述凹槽内，所述接头化合物能够同时与基底形成键、特别是共价键并且与目的化合物形成键、特别是共价键，并且所述接头化合物处在能够渗透进聚合物材料的溶剂中的溶液中。

这种限制在足以使所述凹槽内包含的溶剂渗透进聚合物材料的温度和时间下进行。

本领域技术人员能够根据其一般知识特别地考虑溶剂特征和衬垫特征来确定在施加的压力条件下限制阶段的时间和温度。进行限制阶段的压力优选为大气压，以便更容易地实施根据本发明的方法。

通过根据本发明的方法将目的化合物固定在基底表面上所依据的图案优选地在该表面的一个或更多个具有受控位置的限制性区域上延伸，特别是以一组离散图形的形式。

在本发明的一些具体实施方案中，选择溶剂以使其能够在环境温度下(即，在大气压下约18℃至约28℃的温度下)渗透进聚合物材料。然后，在适合确保溶剂渗透进聚合物材料的温度利时间下进行限制，该时间特别地取决于构成衬垫的聚合物材料的类型、凹槽的尺寸、凹槽中包含的接头化合物溶液的体积以及溶剂渗透进聚合物材料的能力。

本发明人已注意到，在溶剂渗透进聚合物材料之后，已形成键，一方面在接头化合物与基底之间形成键，另一方面在接头化合物与目的化合物之间形成键，使得目的化合物以有序图案固定在基底上，所述有序图案由衬垫之印刷面的凹槽轮廓决定。根据所使用的接头化合物，这些键可以是共价的或非共价的。

因此，根据本发明的方法使得可以完全有利地在容易进行的单个步骤中并且在很短的时间内(数秒至数分钟，通常短于或等于5分钟)同时进行制造生物芯片所需的两个阶段，也就是说，使基底表面官能化并使目的化合物根据任何期望的图案附接在该表面上。无论图案是毫米尺寸、是微米尺寸还是纳米尺寸，这都同样适用。与现有技术方法相比，这有利地实现时间增益和成本节省。此外，这样的方法需要相对少量的接头化合物，只在衬垫的印刷面要面对的可用基底区域上有需要。

将目的化合物固定在基底上所依据的图案由突起形成，所述突起由接头化合物分子和与其键合的目的化合物分子的堆叠组成。在由构成衬垫之聚合物材料在溶剂向该材料中渗透期间的轻微变形引起的轻微尺寸变化内，所述图案与衬垫之印刷面的凹槽轮廓基本上互补。本发明人已注意到，这样的图案的获得由在限制阶段期间接头化合物和因此与其键合之目的化合物的分子沿在衬垫之印刷面中产生的凹槽的壁定向堆叠。

在此不会对这一现象潜在的机理作出预先评判。然而，可以认为，溶剂向构成衬垫的聚合物材料中的渗透在凹槽内产生一定体积的空气从而使得形成三相线(lignetriple)，也就是“气体/液体/固体”界面，这使得接头化合物分子在目的化合物分子所在的凹槽壁表面超浓缩，并且产生这些分子抵靠这些壁垂直对流组装的现象。当凹槽中所包含接头化合物分子的量足够时，特别是当凹槽具有纳米尺寸时，接头化合物和目的化合物填满这些凹槽，并且随后在基底上形成的图案由基本上实心的形式组成。当限制在凹槽内的接头化合物分子的量不足以填满凹槽时，特别是当凹槽具有微米尺寸时，在基底上形成的图案由基本上中空的形式组成，再现凹槽的轮廓。

根据本发明的方法特别地适用于生物芯片的制造。在这样的应用领域中，当目的化合物是寡核苷酸探针时，通过根据本发明的方法制造的生物芯片具有特别有利且完全令人惊讶的性能，这正与该方法的特征相关。与通过现有技术、特别是通过微接触印刷技术在已预先官能化以允许寡核苷酸探针键合的基底上获得的生物芯片(如出版物Thibault等，2005，Journal of Nanobiotechnologies，3，7中特别描述的)相比，在与固定在基底上的寡核苷酸探针互补的靶寡核苷酸的存在下对这样的生物芯片孵育之后，确实观察到在寡核苷酸探针与靶寡核苷酸杂交后测量到的信号强烈增加。这样的有利结果可能是由于接头化合物分子沿在衬垫之印刷面中产生的凹槽的壁定向组装导致的。这种定向组装可以增加接头化合物分子与目的化合物分子键合的位点的数目，或者在荧光生物芯片的情况下，提高荧光团在荧光读取期间的可及性。

根据一些具体实施方案，本发明还具有以下单独实施或以其各种技术有效组合实施的特征。

在本发明的一些具体实施方案中，目的化合物在衬垫之印刷面中产生的凹槽的壁表面上的沉积通过以下连续步骤来进行：

-将所述目的化合物的溶液沉积在衬垫的印刷面上；该步骤在下文中将由表述“衬垫着墨”来表示；

-干燥该印刷面以除去溶剂；

-以及任选地除去衬垫之印刷面上不构成凹槽的区域中存在的目的化合物，例如通过使该印刷面与板接触来进行，以将目的化合物分子转移到该板上，并获得其中目的化合物只涂覆凹槽壁表面的构造。

将接头化合物限制在基底与衬垫的印刷面之间在凹槽内的阶段就此而言可以如下进行：在基底上沉积包含接头化合物的溶液，并抵靠由此覆盖有接头化合物溶液的基底施加衬垫的印刷面。该溶液随后被捕获在衬垫的印刷面中形成的凹槽内，与覆盖该一个或更多个凹槽的壁的目的化合物接触。优选地，将衬垫的印刷面抵靠基底地施加，使得该印刷面的所有不构成凹槽的区域同时被抵靠基底地施加。

抵靠覆盖有接头化合物溶液的基底施加衬垫之印刷面的力优选地足以实现衬垫与基底相接触而不破坏衬垫的印刷面。这样的破坏发生在均匀施加在衬垫之背面上的力等于或大于杨氏模量(module de Young)(E)乘以最初与接头化合物接触之具有最小表面积的凹槽的表面积平方(s²)的情况下。

衬垫可以由任何聚合物材料制成。其特别地可以由交联或部分交联的弹性体聚合物材料，例如基于有机硅、基于环氧树脂或基于丙烯酸脂的弹性体聚合物材料制成。

这种材料特别地可以是可固化类型的，也就是说，能够从相对流体的液体状态到固体状态以能够通过模塑制造，这种状态的改变例如通过交联，例如通过提高温度来实现。

在本发明的一些具体实施方案中，衬垫由交联的聚二甲基硅氧烷(PDMS)形成。

或者，衬垫可以由非弹性体材料形成，例如由聚(4-甲基-2-戊炔)形成，这在出版物Demko等，2012，ACSNANO，6，6890-6896中有特别描述。

其中溶解接头化合物的溶剂可以是一方面能够溶解接头化合物并且另一方面能够渗透进构成衬垫的聚合物材料的任何溶剂。这种溶剂特别地可以从甲苯和四氢呋喃中选择。

接头化合物可以是包含至少两个官能团的任何化合物，其中一个官能团能够与基底形成键，特别是但不限于共价键；并且其中一个官能团能够与目的化合物形成键，特别是不限于共价键。这两个官能团可以是相同的，例如可以是醛基。

接头化合物可以例如是1，2-聚丁二烯-NH₂。

在本发明的一些具体实施方案中，接头化合物是树状聚合物，特别是具有中心核并在其外周包含所述官能团的含磷树状聚合物。

这种树状聚合物的尺寸优选为直径为1至20nm，例如6至8nm。

一般而言，树状聚合物是可以在形成期间严格控制尺寸、拓扑结构和分子量的超支化异构分子(isomoléculaires)聚合物。在大于一定尺寸下通常为球形的树状聚合物分子由单体从中心核重复辐射状分支产生。间隔臂为树状聚合物的生物芯片与具有其他间隔臂的生物芯片相比有利地具有高灵敏度和改善的信噪比，这特别是因为树状聚合物使得可以每单位表面积基底获得高密度探针并且获得更佳的探针可及性，这使得与靶DNA的杂交不是二维的，而是三维的。

优选地，树状聚合物从由以下组成的那些中选择：

-包含2至12个官能化基团、任选地包含磷的中心核PO形式的中心层，

-n个可以相同或不同的中间层，所述中间层各自由对应于下式(I)的单元P₁组成：

其中：

L是氧、磷、硫或氮原子，

M代表下列基团之一：

●被以下二、三或四取代的芳族基团：烷基，烷氧基，C₁-C₁₂烯型、偶氮型或炔型的不饱和基团，所有这些基团都可以任选地并入磷、氧、氮或硫原子，或卤素，或者

●包含数个取代基的烷基或烷氧基，所述取代基如当M是芳族基团时所限定；

可以相同或不同的R₁和R₂代表氢原子或下列基团之一：烷基、烷氧基、芳基，其任选地包含磷、氧、硫或氮原子，或卤素，其中R2通常与R₁不同，

n是1至11的整数

E是氧、硫或氮原子，所述氮原子可与以下键合：烷基、烷氧基或芳基，所有这些基团都可以任选地并入磷、氧、氮或硫原子，或卤素；

-由单元P₂组成的外层，P₂可以相同或不同并且对应于下式(II)：

其中：

W代表以下基团之一：烷基、烷氧基、芳基，所有这些基团都可以任选地包含磷、氧、氮或硫原子，或卤素，

X代表醛基、巯基、氨基、环氧化物基团、羧酸基团、醇基或酚基。

在本发明的一些优选实施方案中，X代表醛基。

这样的树状聚合物在文献WO 03/091304中有特别描述。

为了进行根据本发明的方法的限制步骤，沉积在基底上的树状聚合物的量特别地可以为0.1至1000μg/cm²基底，例如约等于50μg/cm²。

在本发明的一些特别优选的实施方案中，接头化合物是展现出上述一种或更多种特征的含磷树状聚合物，印刷衬垫由交联的PDMS形成，并且用于形成接头化合物溶液的溶剂是四氢呋喃或甲苯。

在本发明的一些具体实施方案中，进行限制10秒至15分钟，例如约5分钟的时间。

限制还优选地在环境温度下，即在优选大气压下约18℃至28℃、特别是20℃至25℃的温度下进行。

目的化合物固定在基底上所依据的图案可以是任何类型的。其特别地可以是称为点的均一图案；或更复杂的几何图形，其可以是或可以不是周期性的(périodique)；或这样的图案的组合。

其上固定有目的化合物的基底特别地可以用于在介质中搜寻能够与目的化合物相互作用的特定靶分子。

目的化合物与靶分子的相互作用的检测可以通过不同的技术来进行。

例如，可以用本身常规的可检测标记、特别是用荧光标记(例如荧光团)预先标记靶分子以产生可检测且任选地可量化的信号，特别是荧光信号。

在使其上固定有目的化合物的基底与可能包含待检测靶分子的介质接触之后，随后简单地如下确定目的化合物与靶分子之间的特异性相互作用：激发可检测标记，其可以已被组装到基底上；然后检测可以由该标记随后重发射的信号，特别是荧光信号。

或者，可以有利地通过基于光衍射光栅原理的技术来进行目的化合物与靶分子之间的相互作用的检测。

根据本发明的方法事实上使得不但可以根据允许通过荧光进行后续检测的有序图案来将目的化合物固定在基底上，而且还可以根据允许基于该光衍射光栅原理进行检测的图案来将目的化合物固定在基底上。

因此，在本发明的一些具体实施方案中，图案构成衍射系统，也就是说，其由能够使光衍射的几何图形组成，所述几何图形交替地包含具有目的化合物的突出区和不含目的化合物的区域。

这样的特征特别地证明，在根据本发明的方法制造用于在待分析介质中寻找靶分子的生物芯片的应用背景下是完全有利的。检测这样的靶分子与根据衍射图案固定在基底上的目的化合物的可能杂交的基本原理在文献WO 2010/029139中有特别描述。示意性地，已知当光栅被光源照射时，光栅使光束衍射并产生衍射图案。所观察到的衍射场特别地取决于光栅的特征(例如光栅的周期或厚度)、反射指数和光源的波长。因此，根据本发明根据衍射图案固定在基底上的目的化合物与暂时放置成与基底接触之样品中存在的可能靶分子之间的可能杂交的检测可以包括以下连续步骤：

a/测量在存在样品的情况下放置基底之前由衍射系统产生的衍射场的一阶衍射光束的强度I₀，

b/在存在可能包含待检测靶分子的样品的情况下放置基底，

c/测量在存在样品的情况下放置基底之后由衍射系统产生的衍射场的一阶衍射光束的强度I₁，

d/以及比较测量的强度I₀与I₁，

强度I₀与I₁之间的值差表明目的化合物与存在于样品中的靶分子之间的相互作用。

为此，可以用波长λ在可见或红外范围内选择的准直单色光源，例如激光来照射衍射系统。

根据本发明，衍射图案的周期优选地在λ和2λ之间(λ对应于衍射系统的照射波长)，使得只有一阶衍射光束是可见的。用于在衬垫上产生几何图案的光刻技术是本身公知的纳米级技术。

更一般地，根据本发明，构成图案的每个要素都可以具有纳米尺寸，特别是约1nm至约999nm的纳米尺寸；或微米尺寸，特别是约1μm至约999μm的微米尺寸。

例如，图案可以由一组间距为1μm、宽度为500nm的线组成。这样的尺寸允许通过衍射扫描仪对一阶衍射光束的强度进行最佳读取。

固定在基底上的目的化合物可以具有任何性质或来源。其特别地可以是核酸分子、肽、蛋白质、多糖、脂质等。特别地可以在实施根据本发明的方法之前对该化合物进行修饰以在其中引入能够与接头化合物的官能团反应以形成键(例如共价键)的官能团。

特别地，目的化合物可以由天然或合成来源的单链或双链核酸分子组成，例如适配体。在本发明的一些具体实施方案中，核酸分子是使用本领域技术人员已知技术通过化学合成获得的寡核苷酸。

其中通过上文限定的含磷树状聚合物将核酸分子固定在基底上的生物芯片有利地具有优异的稳定性和特别高的检测灵敏度。

在其上固定目的化合物的基底可以是固体或半固体(例如凝胶)。基底可以是刚性的或柔性的。其优选是基本上平的。例如，其可以从载玻片和硅、塑料或金属基底中选择。

优选地，基底由玻璃、由硅或由塑料制成。

当基底由玻璃制成时，优选地对其进行预处理以使得能够与接头化合物反应的官能团附接至其表面，例如通过以本身常规的方式进行其表面的硅烷化来对其进行预处理。

根据另一方面，本发明涉及根据本发明的方法(其表现出上述一种或更多种特征)用于制造生物芯片、特别是DNA生物芯片的用途。

对于这样的需要将多种不同目的化合物(每一种以期望的预定图案)固定在基底上的应用，优选地使用以柱体的形式布置在同一基体上以形成将在本说明书中由术语大印章(macrotimbre)表示的更为整体的物体的多个衬垫。这种大印章优选地被配置成使得每一个衬垫的印刷面可以同时被施加在基底上。这种大印章的每一个衬垫都专用于特定的目的化合物，并且在其印刷面的水平上具有与与该目的化合物相关之预定图案在几何上互补的凹槽轮廓。完全有利的是，对于所有待固定在生物芯片上的目的化合物而言，则可以同时进行将接头化合物溶液限制在基底与衬垫之间在凹槽内的步骤。因此，获得生物芯片所需的时间和成本降低。

在文献EP 2 036 604中对这样的包含一组毫米尺寸柱体的大印章的实例进行了特别描述，每个柱体限定根据本发明一个实施方案的衬垫，并且其端面被纳米结构化以在其上形成与给定图案在几何上互补的凹槽。

大印章的每个衬垫的印刷面的结构化轮廓可以相同或不同。

本发明的另一个方面涉及用于进行根据本发明用于根据给定图案将目的化合物固定在基底表面上的方法的套件。这种套件包含：

-由聚合物材料制成的印刷衬垫，其包含具有与所述图案在几何上互补之凹槽轮廓的称为印刷面的面；

-和能够与所述基底形成键、特别是共价键并且同时与所述目的化合物形成键、特别是共价键称为接头化合物的化合物，其任选地在能够渗透进所述聚合物材料的溶剂中的溶液中。

印刷衬垫、目的化合物、接头化合物和溶剂可以具有上文参照根据本发明的方法所描述的一种或更多种特征。

套件还可以包含一个或更多个以下要素：

-可以具有一种或更多种上述特征的刚性或柔性的固体或半固体基底，其任选地已进行预处理以使接头化合物附接至所述基底的表面，例如通过硅烷化进行预处理，

-任选地，用于对所述基底进行这样的预处理、例如通过硅烷化进行的试剂，

-用于进行根据本发明的方法的操作说明书。

在图1至图10的支持下，根据下文的实施例，本发明的特征和优点将更清楚地显现出来，这些实施例仪是通过举例说明而提供并且绝不是对本发明进行限制，在图1至图10中：

-图1示意性地示出了根据本发明的一个具体实施方案的方法的各个步骤；

-图2示意性地示出了可以用于根据本发明的方法的印刷衬垫的多种变体；

-图3示出了在通过衬垫(包含具有圆形截面的单凹槽)、目的化合物(荧光寡核苷酸)和接头化合物(含磷树状聚合物)进行根据本发明的方法之后分别在对基底进行处理以还原寡核苷酸与树状聚合物之间以及树状聚合物与基底之间存在的亚胺官能团的步骤之前和之后通过荧光扫描仪对基底获得的图像：(a)已着墨有寡核苷酸溶液的衬垫，(b)已着墨有不含寡核苷酸的溶液的衬垫，(c)未被着墨的衬垫。

-图4示出了代表对图3中所示图像的每种基底测量的荧光强度的图；

-图5示出了在通过两种衬垫、目的化合物和接头化合物分别进行根据本发明的方法之后通过荧光扫描仪对基底获得的图像，所述衬垫具有包含线性凹槽的凹槽轮廓(衬垫T1：线的宽度为15μm，间距为30μm；和衬垫T2：线的宽度为10μm，间距为20μm)，所述目的化合物是荧光寡核苷酸，所述接头化合物是含磷树状聚合物；

-图6示出了在通过衬垫、目的化合物和接头化合物进行根据本发明的方法之后通过荧光显微镜对基底获得的图像，所述衬垫具有包含间距为1μm、宽度为500nm的线性凹槽的凹槽轮廓，所述目的化合物是荧光寡核苷酸，所述接头化合物是含磷树状聚合物；

-图7示出了通过原子力显微术获得的图6基底的图像：(a)从上观察和(b)透视图；

-图8示出了在通过衬垫、目的化合物和接头化合物进行根据本发明的方法之后通过原子力显微术对基底获得的图像：(a)从上观察和(b)透视图，所述衬垫具有包含间距为40μm、宽度为20μm的线性凹槽的凹槽轮廓，所述目的化合物是荧光寡核苷酸，所述接头化合物是含磷树状聚合物；

-图9示出了在通过衬垫、(a)、(b)而不使用目的化合物进行根据本发明之方法的一些步骤之后通过原子力显微术从上观察对基底获得的图像，所述衬垫具有包含直径为20μm的具有圆形截面之凹槽的凹槽轮廓：(a)接头化合物是1，2-聚丁二烯-NH₂并目溶剂是甲苯，(b)接头化合物是含磷树状聚合物并且溶剂是乙醇；

-以及图10示出了代表不同浓度寡核苷酸探针(1、2和5μM)下的荧光强度的图，所述荧光强度在使固定在生物芯片上的寡核苷酸探针与荧光互补性靶寡核苷酸杂交之后对通过根据本发明的方法或通过现有技术方法(通过微接触印刷)获得的DNA生物芯片测量。

图1示出了根据本发明一个实施方案用于将目的化合物以给定图案固定在固体或半固体基底上的方法的多个步骤。

该方法使用由弹性体聚合物材料制成、例如由交联的PDMS制成的衬垫10。该衬垫10可以通过任何本身常规的方法来产生。例如，其可以通过合适形状的模具(例如由聚氨酯、硅或环氧树脂制成的模具)通过用构成衬垫10之材料的液体形式前体填充该模具并进行固化、特别是通过热交联固化来产生。

衬垫10由放置在载体结构14中的膜11形成，所述载体结构14例如由制成。根据与用于将目的化合物固定在基底上的期望图案在几何上互补的轮廓在该膜11的称为印刷面12的一个面中产生多个凹槽13。

在第一阶段中，根据本发明的方法包括将目的化合物沉积在凹槽13的壁表面上。这种沉积可以通过以下连续步骤来进行。

在图1中20所示的第一步骤中，将目的化合物在溶剂中的溶液的液滴30沉积在衬垫10的印刷面12上。

然后，将液滴30从由此已被着墨的衬垫10中移除，并干燥所述衬垫、特别是在氮气流下干燥以获得如图1中21所示的衬垫10，其印刷面12的表面(包括凹槽13中)被涂覆有目的化合物的层31，所述层31保持附着至该表面。在图1中，为了更好地观察层31，将其用比其实际厚度大得多的厚度表示。同样地，图1中所示所有要素的相对尺寸并不代表真实情况，一些要素被人工放大以便于理解。

图1中22所示的下一步骤在于除去印刷面12的不同于凹槽13的区域中的目的化合物。为此，根据“微接触印刷”技术，将衬垫10的印刷面12施加到例如载玻片23的固体表面上。与载片23接触的目的化合物分子被转移到该载片上。之后，目的化合物保持仅存在于凹槽13的壁表面上。

根据本发明的方法的下一阶段由以下组成：将接头化合物的溶液限制在基底40与衬垫10之间在凹槽13内。

为此，如图1中24所示，将接头化合物在溶剂(例如四氢呋喃或甲苯)中的溶液的液滴32沉积在基底40上，例如通过移液管25。然后，如26中所示，将衬垫10的印刷面12抵靠基底40的表面施加。

这一操作具有将接头化合物溶液的体积33捕获在基底40与衬垫10之间的凹槽13内的效果，如图1中27所示。在存在布置在凹槽13的壁表面的目的化合物层31的情况下，将接头化合物放置于此。维持限制直至溶剂已渗透到衬垫10。在这一限制阶段期间，接头化合物的分子被迫使组装到基底40上。同时，目的化合物的分子从衬垫10的表面转移到接头化合物的分子上。

在该限制阶段结束时，在移出衬垫10之后，在基底40上获得接头化合物分子34与目的化合物分子31的堆叠，正如图1中28图示的。目的化合物由此以与衬垫10的凹槽13的轮廓相反的图案固定在基底40上。

所有这些步骤的实施有利地是简单且快速的。

图2图示了根据本发明可以使用的衬垫10的凹槽13的轮廓的不同实例。

在图2中(a)所示的第一实例中，衬垫101具有单个凹槽13。目的化合物则以点的形式固定在基底40上。

在第二实例和第三实例(二者都示于图2中的(b)中)中，两个不同的衬垫102、103分别示出了以下凹槽轮廓：具有圆形截面且直径为5μm、间距为10μm的凹槽的网络(衬垫102)；具有圆形截面且直径为20μm、间距为20μm的凹槽的网络(衬垫103)。

在第四实例和第五实例(二者都示于图2中的(c)中)中，四个独特的衬垫104、104’和105、105’分别示出了以下凹槽轮廓：宽度为15μm、间距为30μm的线形式的凹槽的网络(衬垫104、104’)；宽度为10μm、间距为20μm的线形式的凹槽的网络(衬垫105、105’)。

在图2中(d)所示的第六实例中，十六个独立且相同的衬垫106示出了由宽度为500nm、间距为1μm的线形式的凹槽的网络组成的凹槽轮廓。

以下在制造DNA生物芯片的背景下描述了实施根据本发明的方法的不同实施例，其中将寡核苷酸探针作为目的化合物固定在基底40上，所述寡核苷酸探针期望用于在给定样品中检测互补性靶寡核苷酸。

A/材料和方法

生物材料

用于以下实施例的所有寡核苷酸都在0.3M、pH 9的磷酸盐缓冲溶液(Na₂HPO₄)中使用。其各自的序列如下：

经荧光团标记的寡核苷酸(SEQ ID NO：1)：

F1：5＇-[NH₂]-TAT-ACT-CCG-GGA-AAC-TGA-CAT-CTA-G-[Cy5]-3′

寡核苷酸探针(HSP12基因片段)(SEQ ID NO：2)：

S：5＇-[AmC6F]-AATATGTTTCCGGTCGTCTC-3′

其中AmC6F表示由包含6个碳原子的链组成并且以NH₂胺官能团结束的间隔物。

荧光标记的互补性靶寡核苷酸(CC)(HSP12基因片段)(SEQ D NO：3)：

5′-[Cy5]-GAG-ACG-ACC-GGA-AAC-ATA-TT-3′

荧光标记的非互补性靶寡核苷酸(NC) (SEQ ID NO：4)：

5′-[Cy5]-TTT-AGC-TTT-TGC-TGG-CAT-ATT-TGG-GCG-GAC-A-3′

产品和溶剂

●对于所使刚的商业米源的每种产品和溶剂，供应商示于下表1中。

表1-所使用产品/溶剂的商业来源

●对应于以下通式(III)的第四代(G4)含磷树状聚合物以以下方式获得。

在第一步中，根据以下反应方案合成N-甲基二氯硫代磷酰肼(IV)，其是用于获得树状聚合物的基本合成子：

这通过在氩气下将甲基肼(1.9当量)在氯仿CHCl₃中的溶液逐滴加入到三氯硫代磷(1当量)在氯仿中的溶液中同时在整个加入过程中使混合物的温度维持在-60℃来进行。

然后，在维持搅拌的同时使混合物过夜缓慢恢复至环境温度。第二天，通过³¹P{1H}NMR控制反应并且如有需要再搅拌1至2天。然后，将得到的单甲基肼盐酸盐使用过滤中空管在氩气下过滤。

将N-甲基二氯硫代磷酰肼以在氯仿中的溶液储存在低温(-20℃)下，并随后按原样使用。

在下一步中，制备为含磷树状聚合物(III)的前体的具有游离醛端基的树状聚合物(V)：

为此，将六氯环三磷腈(1当量)、4-羟基苯甲醛(6.6当量)和在氩气下获得的蒸馏THF在氩气下在圆底烧瓶中混合。搅拌该混合物直至固体完全溶解。

然后，逐勺加入碳酸钾(12当量)并将混合物在环境温度下搅拌过夜。

第二天，通过³¹P{1H}NMR控制反应。将碳酸钾通过滤纸过滤，并将滤液在旋转蒸发器中浓缩得到白色固体。在环境温度下，将固体吸收在甲醇中，通过烧结漏斗过滤，用甲醇清洗两次并用醚清洗两次。然后，获得与上述通式(V)对应的称为0代树状聚合物的树状聚合物，称为DP0。

然后，通过重复相同顺序的以下两个反应直至得到第四代来获得用于使载玻片官能化的“第四代”含磷树状聚合物，所述树状聚合物被称为DP4并与上述通式(III)对应：

1/将DPn(n代表树状聚合物的代数，并且n＝0至3)(1当量)、CHCl₃和按照上述制备的N-甲基二氯硫代磷酰肼(分别为7、13、27和53当量)在氩气下混合。

在于环境温度下搅拌(对于低代树状聚合物搅拌2小时，对于高代树状聚合物搅拌3小时)之后，通过³¹P{1H}NMR控制反应。

通过旋转蒸发器在减压下将混合物浓缩至一半，将其转移到滴液漏斗中，并逐滴加入到大体积戊烷中以使产物沉淀。

使用中空管将沉淀物滤出。将固体吸收在很少量的氯仿中，在4/1戊烷/乙醚混合物中再沉淀一次，然后使用中空管滤出。由此得到具有氯端的第1代、第2代、第3代和第4代树状聚合物，分别称为DP’1、DP’2、DP’3、DP’4。

2/在环境温度下，在氩气气氛下引入DP’n(n＝1至4)(1当量)和4-羟基苯甲醛(分别为13、28、55和110当量)，然后引入在氩气下获得的蒸馏THF。然后，逐勺加入碳酸铯(分别为20、40、60和120当量)。使混合物在环境温度下搅拌16小时(过夜)。

第二天，通过³¹P{1H}NMR控制反应。通过经滤纸过滤(对于低代树状聚合物)并随后使用离心机来除去盐，并将滤液在减压下蒸发以得到白色固体。

将固体溶解在很少量的氯仿中并逐滴加入到大体积的戊烷/醚混合物中以使产物沉淀。通过烧结漏斗将沉淀物滤出。将固体吸收在氯仿中，再沉淀并滤出。由此得到具有醛端的第1代、第2代、第3代和第4代树状聚合物，称为DP1、DP2、DP3和DP4。

●基底

环氧硅烷载片从Slide E，Schott获得。

载玻片从Delta Microscopies获得。

其如下通过硅烷化进行修饰。

首先，将载片在以25rpm搅拌下在一定温度下在2.5M氢氧化钠醇溶液(在200mlmilliQ H₂O和300ml 96％EtOH的混合物中的50g NaOH)中洗涤30分钟。在通过在以23rpm搅拌下用milliQ水连续洗涤三次恢复至中性之后，将载片浸没在96％乙醇中5分钟，然后浸没于在96％乙醇EtOH中包含5％v/v 3’-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的硅烷化浴中。将玻片在环境温度下在以23rpm搅拌下在该浴中放置30分钟。然后，如下将载片清洗几次：仍在以23rpm搅拌下在5分钟内将其浸没在96％EtOH的浴中，然后浸没在无水EtOH的浴中。然后，将载片通过离心干燥(500rpm下8分钟)。最后，将载片在120℃下在烘箱中保持1小时，以确保基于硅烷的涂层在载片上交联。

印刷衬垫的产生

衬垫由聚二甲基硅氧烷(PDMS，184)制成。PDMS是以下两种组分的混合物：低聚物(有机硅)和交联剂。将其以重量比10/1混合。然后，将该混合物以多种类型的图案沉积在硅模具上，脱气，然后在80℃下放置6小时，以使PDMS交联。

用目的化合物使印刷衬垫着墨

衬垫的着墨通过将目的化合物溶液的液滴沉积在衬垫上1分钟来进行。然后，移除该液滴，并将衬垫在氮气流下干燥。

去除衬垫之印刷面的不同于凹槽的区域中的目的化合物

使已着墨的衬垫与载玻片接触1分钟，以确保目的化合物从衬垫转移到该载片上。

通过微接触印刷技术的基底的表面官能化(现有技术)

衬垫由聚二甲基硅氧烷(PDMS，184)制成。通过将目的化合物溶液的液滴沉积在衬垫上1分钟来使衬垫着墨。然后，移除该液滴，并将衬垫在氮气流下干燥。

然后，使已着墨的衬垫与载玻片接触1分钟，以根据衬垫的图案将目的化合物从衬垫的表面转移到载片上。

通过限制树状聚合物的官能化

将60μl在四氢呋喃(THF)中的58μM G4含磷树状聚合物溶液的液滴捕获在PDMS衬垫结构(任选地已用目的化合物着墨)之下，然后将所有溶液限制在硅烷化载玻片上，直到溶剂已渗透进形成衬垫的聚合物材料中(在环境温度下5分钟)。在限制步骤期间，树状聚合物被迫使根据与衬垫之凹槽轮廓在几何上互补的图案组装在载片上。

寡核苷酸探针在用于DNA生物芯片设计的载片上的沉积(现有技术)

将寡核苷酸探针在磷酸盐缓冲溶液(0.3M Na₂HPO₄，pH 9)中稀释至不同浓度(1、5、10、20μM)。采用使用中空针的自动化沉积装置(Q-Array mini，Genetix)将每种浓度的63个样品以点的形式沉积。每个点的直径测量为约150μm。沉积是在50％的相对湿度和22℃的温度下进行的。

沉积后亚胺官能团的还原

在潮湿气氛中干燥过夜之后，使用硼氢化钠水溶液(NaBH₄，3.5mg/ml)将树状聚合物与寡核苷酸探针之间以及硅烷化基底的表面与树状聚合物之间存在的亚胺官能团还原3小时。然后，将其在milliQ水浴中清洗5分钟三次，并且最后在氮气流下或通过离心干燥。这一步使寡核苷酸探针与树状聚合物以及树状聚合物与基底共价键合成为可能。还原步骤还使得可以将树状聚合物的醛官能团转化为惰性醇官能团，从而有助于降低背景噪声。

生物芯片杂交方案

在还原后，使寡核苷酸探针与5X SSC缓冲液，0.1％SDS中浓度为100nM的(荧光标记的)互补性靶寡核苷酸CC在37℃下接触30分钟。

对于与非互补性靶标的杂交，使寡核苷酸探针与非互补性靶寡核苷酸NC接触，其也被荧光标记且在尺寸上与互补性靶寡核苷酸CC相同。其以相同浓度(100nm)使用。

在杂交步骤之后，将载片在搅拌(1200rpm)下在2X SSC，0.2％SDS的浴中洗涤2次(3分钟)，然后在0.1X SSC的浴中洗涤1次(3分钟)。最后，将载片在氮气流下干燥。

荧光的读取

使用荧光扫描仪(700，Innopsys)采用两种激发波长(532nm和635nm)对每个载片进行分析。根据杂交强度调节每种波长的光电倍增管(PMT)，使得荧光信号不饱和。

除非另有说明，否则扫描仪参数如下：PMT 635：100％，PMT 532：100％，光：50，对比度：15，平衡：0。

数据处理

对于每个点，用荧光扫描仪的专用软件(Mapix，Innopsys)计算减去背景噪声的强度的平均荧光强度。对于每个实验，杂交后的荧光强度为每个探针浓度的所有点的平均值。

荧光显微术图像

用Zeiss LSM 510NLO显微镜获得荧光显微术图像。激光波长λ：633nm。x 40浸没物镜。

原子力显微术分析

借助AFM Brucker Catalyst Mode 空气显微镜以以下参数进行基底的原子力显微术分析：fo：50-90Hz，k：0.4N/m。

通过光衍射的检测

通过衍射扫描仪在将生物芯片与靶分子孵育的步骤之前和之后收集衍射信号，所述衍射扫描仪使得可以确定间距为1μm的500nm线的光栅的一阶衍射光束的强度。衍射扫描仪的参数如下：功率(P)：1mW，增益(g)：0。

用Mapix软件(Innopsys)对来自衍射扫描仪的TIFF图像进行分析，所述软件使得可以确定图像精确区域的所有像素的平均强度或中值强度。

与靶分子在探针分子网络上的相互作用相联系的光栅周期性排布的任何改变(特别是光栅线的高度和宽度的增加)都会引起衍射信号强度的变化。这些变化通过根据下式计算增益来量化：

其中，I₁表示减去光栅周围的背景噪声的在与靶分子相互作用之后测量的光栅的一阶衍射光束的强度；I₀表示减去光栅周围的背景噪声的在与靶分子相互作用之前测量的光栅的一阶衍射光束的强度。

实施例1

在实施根据本发明的方法的该实施例中，使用包含直径为1.5cm具有圆形截面的单凹槽的衬垫。

目的化合物是浓度为10μm的在5’端具有胺官能团且在3’端标记有Cy5荧光团的F1寡核苷酸。

在用这种目的化合物使衬垫着墨后，将G4含磷树状聚合物的溶液限制在硅烷化载玻片与衬垫之间。

然后，对该载片进行还原存在于树状聚合物与寡核苷酸之间的亚胺官能团的步骤。

还还行其中用不含寡核苷酸的溶液使衬垫着墨或其中在限制阶段之前不对衬垫进行着墨的对照。

通过荧光扫描仪获得的图像示于图3中。对于根据本发明获得的载片，在图像中观察到具有基本上圆形的截面的荧光点(a)。相比之下，对对照未观察到荧光。

因此，根据本发明的方法使得可以在一个步骤(其还很短时间，即5分钟)通过含磷树状聚合物将寡核苷酸以期望图案固定在载玻片上。

还测量了荧光强度。得到的结果示于图4中。结果确定通过根据本发明的方法将目的化合物固定在基底上的效率。此外，在亚胺官能团被还原之后存在强度大于对照的荧光确定目的化合物在树状聚合物上的键合。

实施例2

在本实施例中，将根据本发明的方法应用于根据微米图案将目的化合物固定在基底上。

使用了两种衬垫T1和T2，所述衬垫具有包含线形式的凹槽的凹槽轮廓，对于衬垫T1，所述线的宽度为15μm，间距为30μm；对于衬垫T2，所述线的宽度为10μm，间距为20μm。在本说明书通篇，间距被限定为两条相邻线的非邻接边缘之间的距离，即一条线的宽度与将其与相邻线分开的区域的宽度的总和。

通过荧光扫描仪获得的图像示于图5中。对于衬垫T1和衬垫T2二者，都在图像中观察到负向重现衬垫的凹槽轮廓的荧光线光栅。

实施例3

在本实施例中，将根据本发明的方法应用于根据纳米图案将目的化合物固定在基底上。

使用了具有包含线形式的凹槽的凹槽轮廓的衬垫，所述线的宽度为500nm，间距为1μm。这种类型的轮廓允许制造适于通过衍射进行检测的生物芯片。

通过荧光显微镜获得的图像示于图6中。在图像中发现负向重现衬垫的凹槽轮廓的荧光线光栅。

还通过原子力显微术对载片进行检查。得到的图像示于图7中：(a)从上观察和(b)透视图。在图像中观察到，所获得的图案由具有对应于树状聚合物的堆叠的宽度的线组成。因此，在溶剂已被蒸发掉并通过PDMS排出之后，树状聚合物填充位于衬垫的凹槽内的空间。

实施例4

在本实施例中，使用具有包含线形状的凹槽的凹槽轮廓的衬垫，所述线的宽度为20μm，间距为40μm。

通过原子力显微术对获得的载片进行检查。得到的图像示于图8中：(a)从上观察和(b)透视图。在图像中观察到，所获得的图案由线组成，树状聚合物已沿衬垫的凹槽壁堆积，使得其再现这些凹槽的壁的轮廓。这可能是由于以下事实：当凹槽的宽度与所用树状聚合物的量之比较高时，限制在这些凹槽内的树状聚合物的量不足以填满其中的所有空间。树状聚合物则沿凹槽壁以定向方式堆积。

实施例5

在本实施例中，使用在甲苯中的1mg/ml 1，2-聚丁二烯-NH₂(平均摩尔质量15000g/mol)或在乙醇中的1mg/ml G4含磷树状聚合物作为接头化合物。

乙醇不具备渗透到PDMS中的能力。对于这种溶剂，在80℃下进行限制15分钟。

衬垫具有包含直径为20μm具有圆形截面的凹槽的凹槽轮廓。

对于本实施例，不使用目的化合物。

对于每种接头化合物溶液，将溶液限制在衬垫与环氧硅烷载片之间。

在限制5分钟或15分钟(对于乙醇)之后，通过原子力显微术检查获得的载片。得到的图像(从上观察)示于图9中：(a)甲苯中的1，2-聚丁二烯-NH₂，(b)乙醇中的G4含磷树状聚合物。

在图像中观察到，当溶剂是能够渗透到PDMS中的甲苯且接头化合物是1，2-聚丁二烯-NH₂时，根据本发明的方法允许以直径基本上等于20μm的圆柱体的网络的形式将接头化合物固定在基底上。接头化合物的堆积的确沿衬垫的凹槽壁发生。

在另一方面，当溶剂是乙醇时，在基底上未观察到图案。在基底上没有发生接头化合物的有序固定。

实施例6-DNA生物芯片

使用根据本发明的方法以G4含磷树状聚合物作为接头化合物制造适用于通过荧光和通过衍射二者检测的DNA生物芯片。

目的化合物是S寡核苷酸探针。

形成在硅烷化载玻片上的图案为由宽度为500nm、间距为1μm的线形成的衍射光栅。

在还原树状聚合物与寡核苷酸探针之间存在的亚胺官能团之后，在杂交条件下，一方面将载片与互补性靶寡核苷酸CC一起孵育，并且在另一方面，将载片与非互补性靶寡核苷酸NC一起孵育作为阴性对照。这些靶寡核苷酸均标记有Cy5荧光团。

在孵育步骤结束之后，用荧光扫描仪对载片进行分析使得可以在与互补性靶寡核苷酸CC孵育之后测量到强度729(AU)的荧光，并且在与非互补性靶寡核苷酸NC孵育之后测量到强度28(AU)的荧光(对每种条件10种不同相互作用得到的平均结果)。

这特别地表明，根据本发明固定在基底上的寡核苷酸探针与样品中存在的互补性寡核苷酸的杂交是可行且有效的。

对于通过衍射进行检测，获得的衍射增益在与互补性靶寡核苷酸CC孵育后为10.7％并且在与非互补性靶寡核苷酸NC孵育后为-2.3％(对每种条件10种不同相互作用得到的平均结果)。

因此，对于与完全互补的靶寡核苷酸的杂交，衍射增益为正，而与非互补性靶寡核苷酸孵育之后，衍射增益为负。该结果验证了根据本发明制造的生物芯片在光衍射检测技术方面的适当性。

实施例7

在本实施例中，评价与通过微接触印刷来制造生物芯片的现有技术相比根据本发明的方法在荧光DNA生物芯片的应用领域的性能水平。

为了进行根据本发明的方法，接头化合物是G4含磷树状聚合物并且溶剂是THF。在硅烷化载玻片上形成的图案是直径为1.5cm的点。

通过微接触印刷的目的化合物沉积以本身常规的方式在预先已附接G4含磷树状聚合物的硅烷化载玻片上进行。

对于两种技术(根据本发明的方法和微接触印刷)，目的化合物都是S寡核苷酸探针，其以以下不同浓度使用：1、2和5μM。

在还原存在于树状聚合物与寡核苷酸探针之间的亚胺官能团后，在杂交条件下在存在互补性靶寡核苷酸CC的情况下放置载片。

在存在互补性靶寡核苷酸CC的情况下进行孵育后，对每种载片的荧光信号进行分析。

得到的结果示于图10中。对于测试的每个寡核苷酸探针浓度，在图10中观察到与通过现有技术的微接触印刷技术获得的载片相比按照根据本发明的方法获得的载片的荧光信号都强烈增加。

序列表

<110> DENDRIS

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

<120> 用于以给定图案将目的化合物固定在基底上的方法以及用于实施所述方法的套件

<130> 30799 WO

<150> FR 1460398

<151> 2014-10-29

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸 F1

<400> 1

tatactccgg gaaactgaca tctag 25

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 寡核苷酸探针S

<400> 2

aatatgtttc cggtcgtctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 互补性靶寡核苷酸CC

<400> 3

gagacgaccg gaaacatatt 20

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 非互补性靶寡核苷酸NC

<400> 4

tttagctttt gctggcatat ttgggcggac a 31

Claims

1.根据给定图案将目的化合物固定在基底(40)的表面上的方法，其特征在于，所述方法包括以下连续步骤：

-在包含具有与所述图案在几何上互补之凹槽(13)轮廓的、称为印刷面(12)的面的由聚合物材料制成的印刷衬垫(10)上，将所述目的化合物沉积在至少一个凹槽(13)的壁表面上；

-以及将称为接头化合物的化合物在能够渗透进所述聚合物材料的溶剂中的溶液(32)限制(27)在所述基底(40)与所述衬垫(10)的印刷面(12)之间的所述凹槽(13)内，所述接头化合物能够同时与所述基底(40)形成键并且与所述目的化合物形成键；

所述限制在足以允许包含在所述凹槽(13)内的所述溶剂渗透进所述聚合物材料的温度和时间下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衬垫(10)由弹性体材料、优选地由交联的聚二甲基硅氧烷制成。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述溶剂选自甲苯和四氢呋喃。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述接头化合物是含磷树状聚合物，其具有中心核并且在其外周包含能够与所述基底(40)形成共价键的官能团和能够与所述目的化合物形成共价键的官能团。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述限制进行10秒至15分钟的时间。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述图案构成衍射光栅。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述目的化合物是核酸分子、肽、蛋白质、多糖或脂质。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述基底(40)由玻璃、由硅或由塑料制成。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法用于制造生物芯片、特别是DNA生物芯片的用途。

10.用于进行权利要求1至8中任一项所述的根据给定图案将目的化合物固定在基底(40)的表面上的方法的套件，其包含：

-由聚合物材料制成的印刷衬垫(10)，其包含具有与所述图案在几何上互补之凹槽(13)轮廓的、称为印刷面(12)的面，

-能够同时与所述基底(40)形成键并且与所述目的化合物形成键的化合物，其任选地在能够渗透进所述聚合物材料的溶剂中的溶液中。

11.根据权利要求10所述的套件，其包含：

-固体或半固体基底，

-和任选地，用于对所述基底进行预处理以使所述接头化合物附接在所述基底的表面上的试剂，特别是硅烷化试剂。

12.根据权利要求10和11中任一项所述的套件，其包含用于进行权利要求1至8中任一项所述方法的步骤的说明书。