CN104777206B - 一种检测土霉素的适体电极及其制备方法 - Google Patents
一种检测土霉素的适体电极及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于土霉素检测的适体电极,其特征在于在玻碳电极上自下而上依次修饰有石墨烯‑金纳米复合物、BSA‑OTC复合物。信号层为亚甲基蓝修饰的在RCA链扩增反应下折叠成G四连体结构的核酸适配体,通过亚甲基蓝的量反映目标物的含量,同时提供了其制备方法,本发明制备方法简单,性能稳定,电极的重复性好,适用于药品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。
Description
技术领域
本发明属于检测用传感器技术领域,具体涉及了在适配体上加入一段引物,引发RCA用RCA循环放大的方法制备的检测土霉素的适体电极。同时,本发明还涉及对土霉素检测的电化学适体电极的制备方法。
背景技术
土霉素(OTC)是一种四环素类物质,四环素类是由链霉菌产生的一类广谱抗生素,在化学结构上都属于多环并四苯羧基酰胺母核的衍生物,可分为天然品和四环素类抗生素, 一般通过与核蛋白体的30S亚单位结合, 阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合产生药理作用, 起到抑菌、杀菌作用。20世纪40年代末、50年代初, 金霉素、土霉素和四环素相继从链霉菌发酵液中分离得到,这3种四环素类抗生素都显示了完全的交叉抗性,有着相似的、广泛的抗菌谱, 对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌、支原体、立克次体和衣原体之类的微生物都有活性。确立一个灵敏的高选择性的方法临床诊断和在食品安全分析中检测四环素类是至关重要的。土霉素、金霉素、四环素的检测方法主要有高效液相色谱法、免疫学方法、毛细管电泳法和微生物学方法。
滚环扩增技术是一种等温信号扩增方法,DNA可在很短时间内实现指数扩增。因此,可用于痕量分子的检测。目前,该技术既可以扩增环状DNA、RNA,也可以扩增线性DNA,甚至全基因组DNA。目前该技术主要用于全基因组扩增、核酸测序、单核苷酸多态性以及DNA芯片、蛋白质芯片分析等广泛领域。
传统的土霉素残留分析方法大多是微生物法和仪器分析法,需要大型仪器,成本较高,或者检测步骤繁琐,难以满足实时检测的要求。因此,为应对全球性抗生素污染的现状,开发简单、快速、准确的土霉素检测方法愈发重要。
发明内容
为了解决以上现有技术中针对现有检测方法中检测成本高,仪器操作复杂,需要专业操作人员的缺点,本发明设计了基于核酸适配子的新型夹心构型的用于土霉素检测的电化学适体电极。
同时,本发明还提供了所述电化学适体电极的制备方法。
本发明提供的电化学适体电极,是通过以下步骤得到的:
1)氧化石墨稀-金纳米粒子复合物的制备;
氧化石墨烯(GO)的制备:
氧化石墨烯(GO)的制备是根据经典的方法。简而言之,1.0 g石墨粉加入到含有0.5 g 硝酸钠(NaNO3)和3.0 g 高锰酸钾(KMnO4)的质量分数98%的50 mL 浓硫酸(H2SO4)中。温度低于20 ℃下,反应1 h,升温到35℃,继续搅拌30 min。然后缓慢加入约100 mL的离子水,持续搅拌20 min 后,加入50 mL H2O2(30%),来还原残留的氧化剂,溶液渐渐变成亮黄色;趁热过滤,用HCl 溶液和去离子水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止。沉淀物在60℃的恒温箱中干燥,最终得到GO。
合成石墨烯-金纳米(rGO-Au)纳米复合物:
玻碳电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用二次水冲洗;20μL 1.0 mg mL-1氧化石墨烯滴加在已处理好的镜面裸电极上,干燥;之后电极浸入10 mL 含有2.8 mmolL-1 HAuCl4和0.1 molL-1的H2SO4溶液,通过循环伏安一步电化学共还原,得到rGO-Au复合物。其中循环伏安参数:电位设置为0.0到-1.5 V,扫描速率0.05 V/S。
所述还原石墨烯-金纳米复合物中石墨烯与金的质量比3.3:100;
所述氧化石墨稀-金纳米粒子复合物层的厚度为100 nm±15nm;
2)玻碳电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗。后将电极浸入在10 μL 已经制备的氧化石墨烯-金纳米粒子溶液中,保持3 h。待用二次水冲洗几次之后,10 μL买到的BSA-OTC耦合物(10μM)溶液滴加在电极表面,室温下保持150 min,使BSA-OTC复合物完全固定在电极上。
所述BSA-OTC耦合物层的厚度为1μm±0.2μm;
3)室温下,所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后,分为两组,将第一组电极放入待检测土霉素的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h ;第二组电极放入不含待检测目标物的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h;
4)制备环状探针:
本实验共用到四段DNA序列:
引物(primer):5′-GTT GGA AGT GGT AGT GGA GTC-3′(SEQ ID NO:1);
OTC核酸适配体(aptamer):5′- GTT GGA AGT GGT AGT GGA GTC GGA ATT CGCTAG CAC GTT GAC GCT GGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCCACG TG-(CH2) 6-SH-3′(SEQ ID NO:2);
挂锁探针(padlock probe):5′-phosphate-CTA CTA CCT CAC CTC AGC AAC TATACA ACC TAC TAC CTC ACC TCA GCA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA CCT CAG CAA CTA TAC AAC-3′(SEQ ID NO:3);
连接探针(Ligation probe): 5′-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3′(SEQ IDNO:4)。
下划线部分是碱基互补成环序列。
所述的制备方法,优选环状探针是通过以下步骤得到的:
(1)取3uL挂锁探针9uL连接探针于已灭菌的100μL离心管内,加入6μLT4DNA连接酶缓冲溶液,50μL灭菌水,震荡均匀,生料带封闭;
(2)将此离心管放入95℃恒温10min,37℃恒温2h,使之杂交完全;
(3)加入2μL T4DNA连接酶,封口膜封口,16℃恒温2h,使挂锁探针连接完全后,65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性;
(4)加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性。
5)第一组电极中,10 μL 浓度为1μM一端带有OTC核酸适配体通过与游离目标物OTC之间的强识别能力,与其结合,剩余的核酸适配体则与固定在电极表面的BSA-OTC耦合物结合,孵育2 h;第二组电极中,相同的10 μL 相同浓度为1μM的核酸适配体全部与电极表面的BSA-OTC耦合物结合,孵育2 h;
6)用PBS冲洗,将游离的与适配体结合的目标物OTC洗去;放入制备好的10 μL环状探针(30μM),再放入1μLdNTP,0.4μL 100*BSA,1μL Phi29DNA聚合酶,2μL Phi29DNA聚合酶buffer,在37℃下,孵育1.5 h,使环形探针在引物的引发作用下进行滚环复制放大(RCA)反应。
7)加入10μL浓度为4 mM的亚甲基蓝,它是一种电活性物质,它能够嵌入G四连体中,表示电信号的大小。与RCA扩增出来的长链由于序列形成G四连体结构,即得检测土霉素的电化学适体电极。
首先制备一种用于检测土霉素OTC的电化学适体电极,将金纳米粒子修饰在氧化石墨烯表面,再将它修饰在玻碳电极上。再以牛血清白蛋白BSA为载体,与土霉素形成BSA-OTC耦合物。将耦合物修饰固定于电极上。
修饰好的电极分为两组,一组加入待检测目标物土霉素,另一组不加土霉素作为对照。然后加入等量的末端修饰有引物的适配体,在第一组电极中,该适配体优先与后加入的游离的目标土霉素结合,剩余的适配体与修饰在电极表面的土霉素结合;在第二组电极中,由于没有目标物的存在,该适配体只与修饰在电极表面的土霉素结合。
用溶液洗涤加入适配体后的电极,去除游离的目标土霉素OTC。然后加入合成好的环状探针,在带有适配体的引物的存在下,开始进行滚环复制扩增反应。
环状探针得到的长链折叠成G四连体结构,加入亚甲基蓝后,可与G四连体结合,由于亚甲基蓝的存在,通过电极检测到电信号。亚甲基蓝越多,电信号则越强。
所述的电化学适体电极,用于修饰的金纳米粒子大小约为30 nm,优选修饰有纳米金的石墨烯的厚度为100 nm左右,BSA-OTC耦合物的厚度为1μm左右,BSA的厚度为500 nm左右。目标物OTC的厚度约为500 nm。
所述的电化学适体电极的制备方法,优选包括以下步骤:
(1)氧化石墨稀-金纳米粒子复合物修饰玻碳电极修饰的传感器制备方法。
(2)将电极浸入BSA-OTC耦合物溶液中3 h,用二次水冲洗,干燥;
(3)将电极均匀分为两组,在第一组电极表面滴加OTC目标物溶液,室温下过夜;第二组不加OTC,与第一组置于相同环境中。
(4)将等量的浓度为10μM的aptamer溶液加入电极,与目标物OTC以及修饰在电极表面的BSA-OTC结合。
(5)用PBS溶液洗涤电极,去掉游离的OTC目标物。
(6)加入环状探针,aptamer尾部游离的引物沿着环状探针开始进行复制放大,放大产生的长链在亚甲基蓝的存在下形成G四连体的结构。亚甲基蓝是一种电活性物质,它能够嵌入G四连体中,表示电信号的大小。
本发明的工作原理:
在玻碳电极上首先修饰增效物质氧化石墨烯-金纳米粒子,能促进电极表面电子转移。牛清血白蛋白BSA和土霉素的复合物修饰到电极上,与后来加入的目标物土霉素形成对照。在加入aptamer后,aptamer优先与游离的土霉素结合,剩余的aptamer再与固定在电极上的BSA-OTC结合,因而结合上的亚甲基蓝个数较少,产生的电信号也较小。相反,不加入目标物的一组,BSA-OTC复合物全部与aptamer结合,从而产生结合多个亚甲基蓝,产生的电信号足够大。通过亚甲基蓝与电极发生氧化还原反应,产生电信号,连接电化学工作站,以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.4到-0.1 V,脉冲宽度0.05V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,根据电极表面产生的电流的大小起到对目标物检测的作用。
本发明的有益效果:
1、由于使用玻碳电极,其电极简便、小型化、易携带、可多次使用。
2、反应层是使用表面修饰技术固定在工作电极上,优化使用材料的用量与浓度,制得的夹心型电极对环境温度的要求不明显,室温下使用即可。
3、制备方法简单,性能稳定,电极的重复性好,适用于药品安全中土霉素的检测和生物传感器产业化的实际应用。
4、制作电极的工艺成本低,适用于产业化中价廉的要求。
5、以玻碳电极为固定载体固定基于核酸适配体的电化学传感系统,可实现对药品中土霉素的快速在线检测。
6、滚环扩增技术是一种等温信号扩增方法,DNA可在很短时间内实现指数扩增。运用RCA复制技术就可实现指数滚环扩增,具有快速、灵敏、特异性好的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明,下述说明仅是实例性的,不限定本发明的保护范围。
首先制备氧化石墨烯-金纳米粒子复合物
1、氧化石墨烯-金纳米粒子复合物的制备:
(1)氧化石墨烯(GO)的制备:
氧化石墨烯(GO)的制备是根据经典的方法。简而言之,1.0 g石墨粉加入到含有0.5 g 硝酸钠(NaNO3)和3.0 g 高锰酸钾(KMnO4)的质量分数98%的50 mL 浓硫酸(H2SO4)中。温度低于20 ℃下,反应1 h,升温到35℃,继续搅拌30 min。然后缓慢加入约100 mL的离子水,持续搅拌20 min 后,加入50 mL H2O2(30%),来还原残留的氧化剂,溶液渐渐变成亮黄色;趁热过滤,用HCl 溶液和去离子水洗涤直到滤液中无硫酸根被检测到为止。沉淀物在60℃的恒温箱中干燥,最终得到GO。
(2)合成石墨烯-金纳米(rGO-Au)纳米复合物:
玻碳电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用二次水冲洗;20μL 1.0 mg mL-1氧化石墨烯滴加在已处理好的镜面裸电极上,干燥;之后电极浸入 10 mL 含有2.8 mmolL-1 HAuCl4和0.1 molL-1的H2SO4溶液,通过循环伏安一步电化学共还原,得到rGO-Au复合物。其中循环伏安参数:电位设置为0.0到-1.5 V,扫描速率0.05 V/S。
(2)环状探针的制备:
本实验共用到四段DNA序列:
引物(primer):5′-GTT GGA AGT GGT AGT GGA GTC-3′(SEQ ID NO:1);
OTC核酸适配体(aptamer):5′- GTT GGA AGT GGT AGT GGA GTC GGA ATT CGCTAG CAC GTT GAC GCT GGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCCACG TG-(CH2) 6-SH-3′(SEQ ID NO:2);
挂锁探针(padlock probe):5′-phosphate-CTA CTA CCT CAC CTC AGC AAC TATACA ACC TAC TAC CTC ACC TCA GCA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA CCT CAG CAA CTA TAC AAC-3′(SEQ ID NO:3);
连接探针(Ligation probe): 5′-UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U-3′(SEQ IDNO:4)。
下划线部分是碱基互补成环序列。
所述的制备方法,优选环状探针是通过以下步骤得到的:
(1)取3μL挂锁探针9uL连接探针于已灭菌的100μL离心管内,加入6μLT4DNA连接酶缓冲溶液,50μL灭菌水,震荡均匀,生料带封闭;
(2)将此离心管放入95℃恒温10min,37℃恒温2h,使之杂交完全;
(3)加入2μL T4DNA连接酶,封口膜封口,16℃恒温2h,使挂锁探针连接完全后,65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性;
(4)加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性。
(5)所述的电化学传感器,优选RCA产物制备中挂锁探针和适配体-引物物质的量比为3:1。
实施例1
电极修饰过程主要包括以下步骤:
a、玻碳电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;玻碳电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗。后将电极浸入在10 μL 已经制备的氧化石墨烯-金纳米粒子溶液中,保持3 h。
b、待用二次水冲洗几次之后,10μL买到的BSA-OTC耦合物(10μM)溶液滴加在电极表面,室温下保持150 min,使BSA-OTC复合物完全固定在电极上。即电极修饰完毕。所述BSA-OTC耦合物层的厚度1μm ±0.2μm,
检测方法如下:
c、室温下,所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后,分为两组,将第一组电极放入待检测土霉素( OTC)的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h ;第二组电极放入不含待检测目标物的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h。
d、第一组电极中,10 μL 浓度为1μM一端带有引物的核酸适配体通过与游离目标物OTC之间的强识别能力,与其结合,剩余的核酸适配体则与固定在电极表面的BSA-OTC耦合物结合,孵育2 h;第二组电极中,相同的10 μL 相同浓度为1μM的核酸适配体全部与电极表面的BSA-OTC耦合物结合,孵育2 h。
e、用PBS冲洗,将游离的与适配体结合的目标物OTC洗去。放入10 μL环状探针(30μM),再放入1μLdNTP,0.4μL 100*BSA,1μL Phi29DNA聚合酶,2μL Phi29DNA聚合酶buffer,在37℃下,孵育1.5h,使环形探针在引物的引发作用下进行滚环复制放大(RCA)反应。
f、加入10μL浓度为4 mM的亚甲基蓝,与RCA扩增出来的长链由于序列形成G四连体结构,即得检测土霉素的电化学适体电极。
g、以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.4到-0.1 V,脉冲宽度0.05 V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,检测目标物。
上述方法中所用的PBS缓冲液是由如下方法配制:称取Na2HPO4 7.1 g,KCl 0.2 g和KH2PO4 6.8 g,KCl 0.2 g分别溶于500 mL二次水中,得到两种溶液用pH计混合调整,得到pH值为7.4,浓度为0.01 mol/L的PBS缓冲液。
实施例2
以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.2到0.6 V,脉冲宽度0.05 V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,检测目标物OTC。具体数据如下表,当浓度为0.1μM时,还符合线性关系,说明本发明可以准确的检测浓度为0.1μM的土霉素。其他步骤同实施例1。
。
实施例3
以Ag/AgCl为参比电极,以Pt电极为对电极,电位设置为-0.2到0.6 V,脉冲宽度0.05V,脉冲宽度扫描为0.06 S,采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化,检测目标物OTC。采用加标回收的方法,检测药品样品,平行测定3次,用以计算回收率,结果为97%-103%,说明处理后的药品中误差范围内没有目标物OTC,属于合格样品。其他步骤同实施例1。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受实施例的限制,其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种检测土霉素的适体电极,其特征在于,由以下步骤制备而成:
1)石墨稀-金纳米纳米复合物层的制备;
(1)制备氧化石墨烯,
(2)合成石墨烯-金纳米纳米复合物:
玻碳电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用二次水冲洗;20μL 1.0 mg mL-1氧化石墨烯滴加在已处理好的电极上,干燥;之后电极浸入 10 mL 含有2.8 mmolL-1 HAuCl4和0.1 molL-1的H2SO4溶液,通过循环伏安一步电化学共还原,得到石墨烯-金纳米纳米复合物溶液;
2)环状探针的制备
(1)取3μL挂锁探针,9μL连接探针于已灭菌的100μL离心管内,加入6μLT4DNA连接酶缓冲溶液,50μL灭菌水,震荡均匀,生料带封闭;
(2)将此离心管放入95℃恒温10min,37℃恒温2h,使之杂交完全;
(3)加入2μL T4DNA连接酶,封口膜封口,16℃恒温2h,使挂锁探针连接完全后,65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性;
(4)加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性,得环状探针;
3) 取玻碳电极,首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
后将电极浸入在10 μL 已经制备的石墨烯-金纳米纳米复合物溶液中,保持3 h;
待用二次水冲洗几次之后,10 μL,10μM的BSA-OTC耦合物溶液滴加在电极表面,室温下保持150 min,使BSA-OTC复合物完全固定在电极上;
室温下,所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后,放入待检测土霉素的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h ;
加入10 μL 浓度为1μM一端带有OTC核酸适配体,孵育2 h;
用PBS冲洗,将游离的与OTC核酸适配体结合的目标物OTC洗去;放入制备好的10 μL浓度为30μM环状探针,再放入1μLdNTP,0.4μL 100*BSA,1μL Phi29DNA聚合酶,2μL Phi29DNA聚合酶buffer,在37℃下,孵育1.5 h;
加入10μL浓度为4 mM的亚甲基蓝,即得检测土霉素的电化学适体电极;
所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述连接探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;
所述OTC核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的适体电极的制备方法,其特征在于,由以下方法制备而成:
1)石墨稀-金纳米纳米复合物层的制备;
(1)制备氧化石墨烯,
(2)合成石墨烯-金纳米(rGO-Au)纳米复合物:
玻碳电极首先在0.3和0.05μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用二次水冲洗;20μL 1.0 mg mL-1氧化石墨烯滴加在已处理好的电极上,干燥;之后电极浸入 10 mL 含有2.8 mmolL-1 HAuCl4和0.1 molL-1的H2SO4溶液,通过循环伏安一步电化学共还原,得到石墨烯-金纳米纳米复合物溶液;
2)环状探针的制备
(1)取3μL挂锁探针,9μL连接探针于已灭菌的100μL离心管内,加入6μLT4DNA连接酶缓冲溶液,50μL灭菌水,震荡均匀,生料带封闭;
(2)将此离心管放入95℃恒温10min,37℃恒温2h,使之杂交完全;
(3)加入2μL T4DNA连接酶,封口膜封口,16℃恒温2h,使挂锁探针连接完全后,65℃恒温20min使T4DNA连接酶变性;
(4)加入1μL核酸外切酶Ⅰ在37℃保温1h将连接探针水解后80℃恒温20min使核酸外切酶Ⅰ变性,得环状探针;
3) 取玻碳电极,首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理,直到呈镜面,用PBS和二次水反复冲洗;
后将电极浸入在10 μL 已经制备的石墨烯-金纳米纳米复合物溶液中,保持3 h;
待用二次水冲洗几次之后,10 μL,10μM的BSA-OTC耦合物溶液滴加在电极表面,室温下保持150 min,使BSA-OTC复合物完全固定在电极上;
室温下,所得电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后,放入待检测土霉素的PH=7.4的PBS缓冲液中孵育2 h ;
加入10 μL 浓度为1μM一端带有OTC核酸适配体,孵育2 h;
用PBS冲洗,将游离的与OTC核酸适配体结合的目标物OTC洗去;放入制备好的10 μL浓度为30μM环状探针,再放入1μLdNTP,0.4μL 100*BSA,1μL Phi29DNA聚合酶,2μL Phi29DNA聚合酶buffer,在37℃下,孵育1.5 h;
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