CN109298187A - 一种测定c反应蛋白的化学发光免疫方法 - Google Patents

一种测定c反应蛋白的化学发光免疫方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定C反应蛋白的化学发光免疫方法。本发明方法的流程示意图如摘要附图所示，该方法发光强度和发光效率高，对C反应蛋白的检测灵敏度高；通过将其他抗原、CRP以及CRP和其他抗原的混合物在CRP免疫传感阵列上进行温育，评价该免疫传感阵列和其他非特异性吸附分析物之间的交叉反应性，CRP免疫传感阵列只在目标CRP存在时才会产生强的信号响应，表明本法特异性良好，可忽略交叉反应的影响；将该法用于测定五组人血清样品中的CRP浓度，将测定结果与商业化的电致化学发光检测法进行比较，相对误差≤4.94％，表明本法结果准确可靠。

Description

一种测定C反应蛋白的化学发光免疫方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种测定C反应蛋白的化学发光免疫方法。
背景技术
国内外流行病学调查表明，脑血管疾病是一种严重威胁人类健康和寿命的常见疾病。在我国，每年因脑血管病死亡近100万人，在幸存者中约3/4的人留下偏瘫等后遗症状，部分病人丧失劳动能力和生活能力。鉴于脑血管疾病具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”的特点，应对之早诊断、早治疗。伴随脑血管疾病过程产生的生物标记物，能够直接或者间接反映脑血管系统的疾病状况，例如C反应蛋白(CRP)、人血管性血友病因子(VWF)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、肌钙蛋白T(cTnT)等，对这些标志物的含量进行准确可靠的检测，是脑血管疾病的诊断、危险分层及评估预后的关键。发展新型的简单、灵敏、可靠的脑血管疾病标志物检测方法，对我国脑血管疾病防治事业至关重要、意义深远。
近年来，化学发光成为检测生物标志物的有效分析工具。与荧光光谱、磷光光谱和紫外-可见光谱等其他光学技术相比，基于化学发光的检测无需外部光源，因此减少了光散射并消除了不必要的信号干扰。此外，它具有仪器简单、分析快速、检出限低、线性范围宽的优点。
但是，基于化学发光的检测通常受到反应产率和量子产率的经典光化学性质的限制，需要增加量子产率和加速化学发光反应，才能提高基于化学发光的生物测定的灵敏度和效率。
发明内容
本发明目的在于提供一种量子产率增加、化学发光反应加速的化学发光免疫方法测定C反应蛋白(CRP)，提高化学发光法测定CRP的灵敏度和效率。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种测定C反应蛋白CRP的化学发光免疫方法，包括如下步骤：
步骤S1，CRP免疫传感器芯片的制备：
在醛基片表面粘贴一层疏水、无光活性膜，构建出若干个传感池；取10μg/mL CRP的包被抗体Ab110μL滴加到传感池中，4℃下温育过夜，用冲洗缓冲液冲洗并干燥，实现将Ab1固定在醛基片表面，构建出具有若干个检测位点的CRP免疫传感器芯片；
步骤S2，探针A、B的合成：
探针A的合成：25μL 10μM DNA-A、25μL 10μM DNA-hemin、25μL 10μMbiotin-DNA缓慢加入1mL银纳米粒子溶液中，常温下缓慢搅拌反应18小时，其后，加入25μL 10μM SH-A15搅拌2小时来封闭还有活性位点的银纳米粒子，122μL0.01M PBS(pH 7.4)加入溶液反应6h，然后21μL 2M NaCl加入溶液，3h后重复将21μL 2M NaCl加入溶液；12h后，26μL 2M NaCl加入溶液，3h后重复将26μL 2M NaCl加入溶液；48小时后，溶液在14℃、15000rpm下离心15min，将沉淀分散在1mL 0.2M PBS+；
探针B的合成：25μL 10μM DNA-B、25μL 10μM DNA-hemin缓慢加入1mL银纳米粒子溶液中，常温下缓慢搅拌反应18小时，其余步骤同探针A的合成；
步骤S3，标准曲线的建立：
将不同浓度的CRP标准溶液8μL以及其对应的2μg/mLbiotin-Ab28μL分别滴到不同传感池中反应15min，用清洗缓冲液冲洗并干燥后，依次将8μL 2μg/mL链霉亲和素、4μL探针A、4μL探针B滴到各传感池，分别温育15min、30min、30min，冲洗干燥，最后，传感池中加入8μL化学发光底物，检测发光强度，建立CRP浓度与发光强度标准曲线；
步骤S4，样品测定：
将8μL含有CRP的待测样品加入到传感池中，依步骤S3方法操作，检测发光强度，根据发光强度及前述建立的CRP浓度与发光强度标准曲线计算得出样品中CRP浓度。
优选地：
DNA-A序列为HS-AAAAAAAAAAAAAAACTGTGCATGCATTGTACG；
DNA-B序列为HS-AAAAAAAAAAAAAAACGTACAATGCATGCACAG。
优选地：
DNA-hemin序列为HS-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-hemin。
优选地，所述银纳米粒子溶液的浓度为8-12nM，银纳米粒子平均粒径为8-12nm。
更优选地，所述银纳米粒子溶液制备方法为：10mL 1mMAgNO3逐滴加入冰浴的30mL2.0mM NaBH4和2mL 34mM柠檬酸三钠中常温搅拌反应30min至溶液呈亮黄色，放入4℃冰箱冷藏待用。
优选地，步骤S1中构建出48个传感池，以4行×12列模式排列。
优选地，步骤S3所述化学发光底物为luminol-p-iodophenol和H2O2。
有益效果：
本发明方法流程示意图如图1所示，该方法发光强度和发光效率高，检测灵敏度大大提高；通过将其他抗原、CRP以及CRP和其他抗原的混合物在CRP免疫传感阵列上进行温育，评价该免疫传感阵列和其他非特异性吸附分析物之间的交叉反应性，CRP免疫传感阵列只在目标CRP存在时才会产生强的信号响应，表明本法特异性良好，可忽略交叉反应的影响；将该法用于测定五组人血清样品中的CRP浓度，将测定结果与商业化的电致化学发光检测法进行比较，相对误差≤4.94％，表明本法结果准确可靠。
附图说明
图1为本发明方法流程示意图；
图2为AgNPs的透射电镜谱图(A)和紫外吸收光谱(B)；
图3为裸醛基片(A)和包被抗体Ab1后的醛基片(B)的扫描电镜图像；
图4为探针A(A)、探针B(B)、探针AB(C)透射电镜谱图；
图5为探针A、探针B、探针AB分别混合0、15、30、60、120min后的紫外吸收光谱(A)和鲁米诺过氧化氢化学发光体系的化学发光光谱(B)；
图6中(A)探针AB与探针AA的化学发光强度比值(1)，探针AC与探针AA的化学发光比值(2)；(B)探针AB与探针AA在相同条件下的化学发光动力学曲线；
图7中(A)混合不同时间后的探针AB的化学发光噪声(1)和信号(2)及信噪比(S/N)，(B)不同温育时间下，探针A与纯DNA-hemin的化学发光比值(1)，探针AB与纯DNA-hemin的化学发光比值(2)；
图8为不同浓度下CRP的化学发光谱图(A)和CRP的标准曲线(B)；
图9为CRP免疫传感器对空白(A)、其它抗原(B)、CRP(C)和包括CRP在内多种抗原混合物(D)的化学发光值。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料和仪器
醛基基片购自上海百傲；CRP包被抗体Ab1、检测抗体Ab2均购自Abcam，biotin-Ab2委托北京博奥森合成；人cTnT、MB、CKMB抗原购自北京博奥森；实验涉及的DNA序列(见表1)均由上海生工生物合成；Tween-20、hemin购自Sigma-Aldrich；hemin储备液(5mM)溶解于DMSO中储存于暗处，反应前稀释；CRP抗原和化学发光底物(luminol-p-iodophenolandH2O2)购自北京科跃中楷；链霉亲和素购自Promega；牛血清白蛋白购自Biosharp；NaBH4购自南京化学试剂；磷酸盐缓冲液(PBS,0.01M,pH 7.4)用于Ab1的包被；0.05％Tween-20溶于0.01M PBS作为清洗缓冲液；包含5％牛血清白蛋白的0.01M PBS作为封闭溶液，封闭未反应的位点；超纯水由Milli-Q制备。血清样品来源于江苏省中医院。
自动化化学发光图像分析系统(Tanon 5200)，微量紫外分光光度计(Nano-100)，IFFM-E化学发光分析仪(Remax)，BPCL超微弱化学发光分析仪，JEM-200CX透射电镜，S-3400N II扫描电镜，E411电化学发光检测仪(Roche)，原子吸收光谱仪器(Model 180–80,Hitachi)。
表1实验涉及的DNA序列
二、实验方法
1、CRP免疫传感器芯片的制备
在醛基片表面以手工贴膜的方式粘贴一层疏水、无光活性膜，构建出48个传感池，以4行×12列模式排列。取10μg/mL CRP的包被抗体Ab110μL滴加到传感池中，4℃下温育过夜，用冲洗缓冲液冲洗并干燥。利用氨基与芳香醛基的相互作用，将Ab1固定在醛基片表面，构建具有48个检测位点的CRP免疫传感器芯片。
2、探针A、B的合成
探针A的合成：25μL 10μM DNA-A、25μL 10μM DNA-hemin、25μL 10μM biotin-DNA缓慢加入1mL银纳米粒子溶液中，常温下缓慢搅拌反应18小时，其后，加入25μL 10μM SH-A15搅拌2小时来封闭还有活性位点的银纳米粒子，122μL 0.01M PBS(pH 7.4)加入溶液反应6h，然后21μL 2M NaCl加入溶液，3h后重复将21μL 2M NaCl加入溶液；12h后，26μL 2MNaCl加入溶液，3h后重复将26μL 2M NaCl加入溶液；48小时后，溶液在14℃、15000rpm下离心15min，将沉淀分散在1mL 0.2M PBS+。
探针B的合成：25μL 10μM DNA-B、25μL 10μM DNA-hemin缓慢加入1mL银纳米粒子溶液中，常温下缓慢搅拌反应18小时，其余步骤同探针A的合成。
其中，银纳米粒子溶液制备方法为：
10mL 1mMAgNO3逐滴加入冰浴的30mL 2.0mM NaBH4和2mL 34mM柠檬酸三钠中常温搅拌反应30min至溶液呈亮黄色，放入4℃冰箱冷藏待用。
3、标准曲线的建立
将不同浓度的CRP标准溶液8μL以及其对应的2μg/mLbiotin-Ab28μL分别滴到不同传感池中反应15min，用清洗缓冲液冲洗并干燥后，依次将8μL 2μg/mL链霉亲和素、4μL探针A、4μL探针B滴到各传感池，分别温育15min、30min、30min，冲洗干燥，最后，传感池中加入8μL化学发光底物(luminol-p-iodophenol和H2O2)，检测发光强度，建立CRP浓度与发光强度标准曲线。
4、样品测定
将8μL含有CRP的待测样品加入到传感池中，依步骤S3方法操作，检测发光强度，根据发光强度及前述建立的CRP浓度与发光强度标准曲线计算得出样品中CRP浓度。
三、实验结果
银纳米粒子(AgNPs)溶液制备后，利用透射电子显微镜进行观察，所制AgNPs均为球形，平均粒径约为10nm(图2A)，紫外吸收峰在391nm(图2B)，浓度约为10nM。
通过扫描电镜，验证了免疫传感阵列上Ab1的成功包被。在连接Ab1之前，醛基片的表面光滑均匀，而连接了Ab1后，醛基片表面存在明显聚集的生物分子，即Ab1已被成功修饰在传感池表面(图3)。
借助透射电子显微镜对探针A、探针B、探针AB(探针A、B混合60min)分别进行表征，探针A、探针B粒径约13nm，探针AB聚集呈现出325nm粒径(图4)。
用紫外可见吸收光谱表征探针A、探针B以及它们混合0、15、30、60、120min后的紫外吸收峰。探针A和探针B相比纯的银纳米粒子，最大吸收峰发生了从391nm到398nm的红移(图5A)，表明DNA已经成功接到AgNPs表面；探针AB随着混合时间的增强，聚集越来越多所以最大吸收峰渐次红移(从398到403nm，图5A)，更接近鲁米诺过氧化氢化学发光体系的最大吸收峰(图5B)。
如图6A所示，相同浓度的探针AB比单独探针A引起的化学发光强了6.5倍，而如果将探针B换成没有修饰DNA-hemin的探针C、与探针A混合，那么探针AC比单独探针A引起的化学发光也强了1.5倍，这说明探针A、B的聚集以及hemin的富集显著放大了探针信号。探针AB和探针A的化学发光动力学曲线也通过化学发光方法进行了对比(CRP标准溶液浓度0.03mg/mL)，可看出探针AB的化学发光强度远远高于探针A、并且反应速率较快(图6B)，这说明探针AB的聚集以及hemin的富集显著提高了探针的化学发光强度和反应速率。
以0.003mg/mL CRP对免疫反应中探针A和探针B的混合时间进行优化，发现噪音和信号都随着混合时间的增加而增大，在60min(30min+30min)时达到最大信噪比(图7A)。将探针AB、探针A与DNA-hemin发光强度比值进行对比可发现，随着反应时间的增强，探针AB与纯DNA-hemin发光强度的比值从14倍放大到25倍之高(从混合0分钟到90分钟)，而探针A与纯DNA-hemin发光强度的比值一直保持在9(图7B)。
对不同浓度CRP进行化学发光免疫分析，得到其化学发光谱图和标准曲线。免疫传感器上收集的化学发光强度随抗原浓度的增加而增加(图8A)，发光强度与CRP抗原的浓度对数值成正比(图8B)，线性检测范围超过5个数量级(7×10-7-0.07mg/mL)，由化学发光信号的3倍标准偏差得到检测限为0.05ng/mL，远低于其他高灵敏化学发光免疫分析方法。探针在4℃避光保存两周后，发光强度保持在原始强度的93％，表明探针的稳定性良好。
通过将其他抗原(人cTnT、MB、CKMB)、CRP以及CRP和其他抗原的混合物在CRP免疫传感阵列上进行温育，评价该免疫传感阵列和其他非特异性吸附分析物之间的交叉反应性(图9)，CRP免疫传感阵列只在目标CRP存在时才会产生强的信号响应，表明本法特异性良好，可忽略交叉反应的影响。将该法用于测定五组人血清样品中的CRP浓度，将测定结果与商业化的电致化学发光检测法进行比较，相对误差≤4.94％，表明本法结果准确可靠。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (7)

1.一种测定C反应蛋白CRP的化学发光免疫方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，CRP免疫传感器芯片的制备：
在醛基片表面粘贴一层疏水、无光活性膜，构建出若干个传感池；取10μg/mL CRP的包被抗体Ab110μL滴加到传感池中，4℃下温育过夜，用冲洗缓冲液冲洗并干燥，实现将Ab1固定在醛基片表面，构建出具有若干个检测位点的CRP免疫传感器芯片；
步骤S2，探针A、B的合成：
探针A的合成：25μL 10μM DNA-A、25μL 10μM DNA-hemin、25μL 10μM biotin-DNA缓慢加入1mL银纳米粒子溶液中，常温下缓慢搅拌反应18小时，其后，加入25μL 10μM SH-A15搅拌2小时来封闭还有活性位点的银纳米粒子，122μL 0.01M PBS(pH 7.4)加入溶液反应6h，然后21μL 2M NaCl加入溶液，3h后重复将21μL 2M NaCl加入溶液；12h后，26μL 2M NaCl加入溶液，3h后重复将26μL 2M NaCl加入溶液；48小时后，溶液在14℃、15000rpm下离心15min，将沉淀分散在1mL 0.2M PBS+；
探针B的合成：25μL 10μM DNA-B、25μL 10μM DNA-hemin缓慢加入1mL银纳米粒子溶液中，常温下缓慢搅拌反应18小时，其余步骤同探针A的合成；
步骤S3，标准曲线的建立：
将不同浓度的CRP标准溶液8μL以及其对应的2μg/mLbiotin-Ab28μL分别滴到不同传感池中反应15min，用清洗缓冲液冲洗并干燥后，依次将8μL 2μg/mL链霉亲和素、4μL探针A、4μL探针B滴到各传感池，分别温育15min、30min、30min，冲洗干燥，最后，传感池中加入8μL化学发光底物，检测发光强度，建立CRP浓度与发光强度标准曲线；
步骤S4，样品测定：
将8μL含有CRP的待测样品加入到传感池中，依步骤S3方法操作，检测发光强度，根据发光强度及前述建立的CRP浓度与发光强度标准曲线计算得出样品中CRP浓度。
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫方法，其特征在于：
DNA-A序列为HS-AAAAAAAAAAAAAAACTGTGCATGCATTGTACG；
DNA-B序列为HS-AAAAAAAAAAAAAAACGTACAATGCATGCACAG。
3.根据权利要求1所述的化学发光免疫方法，其特征在于：
DNA-hemin序列为HS-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-hemin。
4.根据权利要求1所述的化学发光免疫方法，其特征在于：所述银纳米粒子溶液的浓度为8-12nM，银纳米粒子平均粒径为8-12nm。
5.根据权利要求4所述的化学发光免疫方法，其特征在于，所述银纳米粒子溶液制备方法为：10mL 1mMAgNO3逐滴加入冰浴的30mL 2.0mM NaBH4和2mL 34mM柠檬酸三钠中常温搅拌反应30min至溶液呈亮黄色，放入4℃冰箱冷藏待用。
6.根据权利要求1所述的化学发光免疫方法，其特征在于：步骤S1中构建出48个传感池，以4行×12列模式排列。
7.根据权利要求1所述的化学发光免疫方法，其特征在于：步骤S3所述化学发光底物为luminol-p-iodophenol和H2O2。
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